CN102657612B

CN102657612B - 一种载gdnf微泡制剂及其制备方法

Info

Publication number: CN102657612B
Application number: CN 201210056979
Authority: CN
Inventors: 陈芸; 王峰; 石宇; 陆林; 孙成玉; 刘俐; 郑海荣
Original assignee: Peking University
Current assignee: Peking University
Priority date: 2012-03-06
Filing date: 2012-03-06
Publication date: 2013-06-12
Anticipated expiration: 2032-03-06
Also published as: CN102657612A

Abstract

本发明公开了一种载GDNF微泡及制备方法。该载GDNF微泡由内部包裹生物惰性气体的脂质双分子层和连接于所述脂质双分子层外侧的生物素化的GDNF组成。采用MRI实时引导低频聚焦超声联合载有GDNF微泡开放BBB辐照大鼠颅脑顶叶皮层区(最佳参数设定为探头频率1MHz，微泡量0.5ml，照射时间60s，声压0.8MPa，延时60s)，可促进GDNF透过血脑屏障，增加中枢神经系统内GDNF的有效药物浓度。通过低频聚焦超声联合靶向微泡技术，进行有效大分子突破BBB后的药理学研究，将进一步增加神经营养因子在治疗脑疾病方面的优势，提供GDNF治疗中枢神经疾病的科学依据。

Description

一种载GDNF微泡制剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种载GDNF微泡制剂及其制备方法。

背景技术

胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line derived neurotrophic factor，GDNF)是神经营养因子家族中最具代表性的成员之一，最初在大鼠的B49神经胶质细胞株中被发现，是分子量为24kDa的大分子蛋白。GDNF广泛存在于发育的中枢神经系统以及成熟的脑组织，高水平表达于在纹状体、丘脑、皮质及海马，对多种神经元如：神经胶质细胞、5-羟色胺能神经元和多巴胺能神经元都具有促进生长、保护和修复功能，而且也可以调节去甲肾上腺素能和γ-氨基丁酸能途径。GDNF对于帕金森病及阿尔茨海默病等神经变性疾病的作用已经得到了公认，近期的临床及动物实验表明GDNF在抗抑郁症治疗中起着重要作用。研究还发现GDNF与多种中枢神经系统疾病相关，如抑郁症、药物依赖、阿尔兹海默病等。

然而，由于GDNF分子量较大(24kDa)，难以透过血脑屏障(Blood-Brain Barrier，BBB)，其治疗效果受到了严重限制。因此，如何促进GDNF透过BBB、增加GDNF在中枢神系统内的有效药物浓度，将是应用GDNF治疗中枢神经系统疾病的一个关键科学问题。

BBB是指脑毛细血管阻止某些物质(多是有害的)进入脑循环血的结构，这种结构可使脑组织少受甚至不受循环血液中有害物质的损害，从而保持脑组织内环境的基本稳定，对维持中枢神经系统正常生理状态起着重要作用。近年研究结果提示，血脑屏障是一个复杂的细胞系统，其主要由内皮细胞、内皮细胞的紧密连接、星形细胞、周皮细胞和血管周围的小胶质细胞以及基膜等结构构成并维持了血脑屏障的特殊功能，保持了中枢神经系统内环境的稳定。BBB在有效阻挡血液中有害物质对脑的侵袭、保障其功能正常发挥的同时，也阻挡了98％以上小分子药物和100％的大分子药物，研究表明，只有高脂溶性的、低分子量(200-400Da)的小分子量物质才能通过BBB，这种限制阻挡了绝大多数治疗性药物的进入，使得脑恶性肿瘤、帕金森氏病、阿尔兹海默病、多发性硬化、中风、创伤性脑损伤等许多中枢神经系统疾病难以药物治疗，因此如何治疗性地开放BBB，是近年来研究的热点。

开放血脑屏障的传统方法较多，但均未能取得满意效果。如通过动脉内注入高渗溶液(如甘露醇)引起内皮细胞皱缩，导致广泛血脑屏障数小时的紧密连接开放；溶剂如高剂量的酒精或者二甲基亚砜(DMSO)烷基化物如左旋苯丙氨酸氮芥、免疫辅助剂和细胞活素也被用于开放BBB。渗透和化学方法都要求施行导管插管术，这种直接注射是侵入性的并且需要开放颅骨，容易引起非靶区脑组织的渗透性增加，甚至可能引起脑组织破坏、出血、感染；并且高渗溶液及化学试剂容易弥散，造成所注入动脉及分支所支配的BBB全部开放，因而缺乏选择性，限制了其在临床的应用。

大量研究显示，超声波能在一定条件下开放血组织屏障。Taniyama等在离体试验中成功实现DNA质粒转染入鼠颈动脉组织，体外证实了超声辐照能增加生物膜的通透性。随后Mesiwala等于2002年选用高功率聚焦超声研究证实，在一定超声强度下选择性开放BBB，并不引发明显的脑组织损伤。为降低超声能量，研究者发现用聚焦超声协同外源性的空化核(微泡)实现了在未引发急性神经元损伤的情况下短暂开放兔BBB，进而认为聚焦超声能实现高选择性、非侵入性地开放BBB；而在微泡存在的情况下，开放BBB所需的超声能量明显降低，这有利于实现用更低能量的超声达到选择性开放BBB而不损伤正常脑组织的目的。基于聚焦超声联合微泡有效无创地开放BBB，有学者在此基础上注入微泡optison后，用低频超声多点照射开窗的脑组织，采用多种手段(光镜、电镜及MRI)，均观察到BBB的开放。实验证实超声联合微泡能局部、可逆和无创的开放BBB，为临床应用有效治疗颅内疾病的药物提供了非常积极的应用价值。

在进行超声联合微泡开放BBB的可行性研究的同时，研究者并没有忽视安全性的评价。不同的研究小组都证实超声协同微泡开放血脑屏障存在安全域值，只是由于不同研究者使用的超声参数、辐照时间、微泡浓度、观察方法等不尽相同，因而得出的结论不尽一致。研究者发现采用发射频率1.5MHz、脉冲重复频率1Hz、瞬时峰值声压幅度2～12.7MPa超声辐照兔脑20s，MRI增强显像及组织学检查发现，当声压达6.3MPa时出现脑组织的损伤，表现为血管壁破坏、出血、偶见坏死。另一研究小组采用发射频率1.63MHz、脉冲重复频率1Hz、声压幅度0.7～1.0MPa的脉冲超声辐照兔脑20s，辐照后对整个脑组织进行组织病理学观察，发现在超声照射区仅见少数细胞凋亡；而且在超声辐照4周后无论进行增强MRI检查还是组织病理学检查都没有发现BBB损伤。以上多项研究中的结论均一致表明，现代影像学技术可以实时显示正常的BBB的完整性和被疾病损害的区域性BBB。同时，多种方法打开BBB的影像学研究未观测到脑组织受损。

随着聚焦超声联合微泡造影开放BBB研究的深入，有不少学者利用超声开放BBB，采取靶向释放的方式，治疗中枢神经系统的疾病。研究者用聚焦超声开放血脑屏障转运靶向多巴胺受体的抗体进入脑组织，结果显示在超声开放BBB后，所转运入脑的抗体能识别脑细胞膜上的多巴胺受体。总之，超声载药微泡的深入研究应用超声联合微泡开放BBB的同时，微泡携带药物或基因可靶向治疗颅内疾病，为颅内疾病的治疗提供了新的策略。但目前，关于核磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)引导聚焦超声联合载药微泡开放BBB，传递GDNF治疗各种中枢神经系统疾病的研究尚未报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种载GDNF微泡及其制备方法。

本发明所提供的载GDNF微泡，由内部包裹生物惰性气体的脂质双分子层和连接于所述脂质双分子层外侧的生物素化的GDNF组成。

其中，所述脂质双分子层具体可由下述质量份的物质组成：二硬脂酰磷脂酸胆碱4.9-5.1份、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000 0.9-1.2份、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-生物素0.9-1.2份；所述脂质双分子层与生物素化的GDNF通过生物素-抗生物素蛋白-生物素连接。

所述载GDNF微泡的平均粒径为2-3μm。

所述载GDNF微泡的载药量为46.54％-46.62％。

所述生物惰性气体可为六氟化硫或者全氟丙烷。

制备所述载GDNF微泡的方法，包括下述步骤：

1)将二硬脂酰磷脂酸胆碱4.9-5.1份、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇20000.9-1.2份、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-生物素0.9-1.2份溶解于三氯甲烷中混匀，在干燥的N₂流作用下除去三氯甲烷，使磷脂在容器壁上形成一层均匀的薄膜，真空干燥2小时以上；

2)在含有干燥磷脂薄膜的容器中加入脱气的pH值为7.4的Tris缓冲溶液，得到磷脂溶液，其中，所述Tris缓冲溶液中含体积分数为10％的甘油和体积分数为10％的丙二醇；

3)加热所述磷脂溶液到其相转变温度以上，并用水浴超声使磷脂溶液彻底分散直至透明，然后分装入西林瓶中，并将瓶中的空气置换成生物惰性气体，震荡，得到微泡；

4)离心漂浮法清洗微泡3-4次，除去未形成微泡的磷脂；在清洗后的微泡中加入抗生物素蛋白，室温下孵育15分钟以上，用PBS溶液离心漂浮法清洗3-4次，除去未耦合的抗生物素蛋白；然后在耦合抗生物素蛋白的微泡中加入生物素化的GDNF，室温下孵育10分钟以上，之后用漂浮法清洗3-4次除去未结合的生物素化GDNF，得到载GDNF微泡。

其中，所述步骤2)中所述磷脂溶液的浓度为2.8-3.1mg/ml。

步骤4)中所述微泡、抗生物素蛋白、生物素化的GDNF的配比为(0.85-1.1)ml∶(0.08-0.12)mg∶(0.9-1.2)mg。

本发明的再一个目的是提供一种载GDNF微泡的给药套装。

本发明所提供的载GDNF微泡的给药套装，包括本发明的载GDNF微泡和低频聚焦超声设备；其中，所述载GDNF微泡的给药量设定为0.5ml，所述低频聚焦超声设备的参数设置如下：探头频率1MHz，超声照射时间60s，声压0.8MPa，延迟时间60s。

本发明采用MRI实时引导聚焦超声联合载有GDNF微泡开放BBB辐照大鼠颅脑顶叶皮层区，促进GDNF透过血脑屏障，增加中枢神经系统内GDNF的有效药物浓度。通过低频聚焦超声联合靶向微泡技术，进行有效大分子突破BBB后的药理学研究，将进一步增加神经营养因子在治疗脑疾病方面的优势，提供GDNF治疗中枢神经疾病的科学依据。

附图说明

图1为自制微泡与声诺维在不同时间的粒径分析。

图2为聚焦超声联合不同微泡开放血脑屏障脑的脑组织大体观(左图)和切面观(右图)。

图3为聚焦超声联合不同微泡开放血脑屏障脑脑组织中EB的含量。

图4为聚焦超声联合不同微泡开放血脑屏障脑组织HE染色。

图5为正交试验各组超声联合微泡开放血脑屏障脑组织中的EB含量。

图6为正交试验各组超声联合微泡开放血脑屏障脑组织切片HE染色(400×)。

图7为正交试验各组超声联合微泡开放血脑屏障脑组织切片TUNEL染色(400×)。

图8为正交试验各组聚焦超声诱导血脑屏障细胞凋亡的作用。

图9为正交试验各组脑组织内皮细胞和神经细胞的超微结构变化。

图10为聚焦超声诱导血脑屏障破坏后超声组织中BSA浓度。

图11为聚焦超声诱导血脑屏障破坏后超声组织中的GDNF浓度。

图12为GDNF诱导的PC-12细胞的分化。A微泡组；B，GDNF靶向微泡组；C：GDNF蛋白组。

图13为MRI引导的低频聚焦超声联合微泡开放血脑屏障及EB显示的血脑屏障开放区域。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1、制备载GDNF微泡造影剂及其开放血脑屏障的研究

1)制备载GDNF微泡

按一定比例将一定量的DSPC(二硬脂酰磷脂酸胆碱，10.64mg)，DSPE-PEG2k(聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，2.10mg)、DSPE-PEG2k-Biotin(聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-生物素，2.26mg)溶解于0.5ml三氯甲烷中在涡旋混合器上混匀。在干燥的N₂流作用下除去三氯甲烷使磷脂在试管壁上形成一层均匀的薄膜，真空烘箱中干燥2小时以上。然后在含有干燥磷脂薄膜的试管中加入5ml脱气的pH7.4的Tris缓冲溶液：含有甘油(10％体积分数)和丙二醇(10％体积分数)得到一定浓度的磷脂溶液。加热磷脂溶液到其相转变温度(55-60℃)以上，并用水浴超声震荡器使牛奶状的磷脂溶液彻底分散直至透明，然后分成每毫升装入一2ml的西林瓶中，将瓶中的空气置换成六氟化硫或者全氟丙烷，然后进行用铝塑盖和橡胶塞封口后4℃存储备用。

使用时，用机械震荡法(震荡45s)制备出微泡之后，用PBS溶液离心漂浮法清洗3-4次，除去未形成微泡的磷脂。在1ml的微泡中加入0.1mg抗生物素蛋白(avidin)，轻轻摇动室温下孵育20分钟，继续用PBS溶液离心漂浮法清洗3-4次，除去未耦合的抗生物素蛋白avidin，然后在得到的微泡中混入1mg生物素化的GDNF(PeproTech公司，450-51)，轻轻摇动并室温下孵育15分钟，之后用漂浮法清洗3-4次除去未结合的生物素化GDNF，得到GDNF靶向性的微泡。

对制备的载GDNF微泡的性能检测：

颗粒计数仪(Accusizer 780/A，美国)对载GDNF微泡的粒径进行检测：其粒径分布为0.5-8μm，平均粒径为2.3μm。

载GDNF微泡中的载药量和包封率：分别为46.58％和81.52％。

将自制的空白微泡与声诺维在聚焦超声(探头频率1MHz，微泡量1ml，照射时间60s，声压0.8MPa)作用下开放血脑屏障(BBB)的效果进行比较，结果见图1-4。

图1为自制微泡与声诺维(Brocco公司，H20080059)不同时间粒径分析仪检测图，其中A：自制微泡0h组；B：自制微泡24h；C：声诺维0h组；D：声诺维24h组。

图2为聚焦超声联合不同微泡开放血脑屏障脑组织大体观和切面观，其中A：自制微泡0h组；B：自制微泡24h；C：声诺维0h组；D：声诺维24h组。

图3为各组脑组织中EB含量，其中A：自制微泡0h组；B：自制微泡24h；C：声诺维0h组；D：声诺维24h组。

图4为聚焦超声联合不同微泡开放血脑屏障脑组织HE染色，其中A：自制微泡0h组；B：声诺维0h组。

结果显示，自制微泡和声诺维在BBB的开放中没有显著性差异，并且自制微泡开放BBB的效果更加稳定。

实施例2、确定MRI引导的低频聚焦超声联合靶向微泡局部开放BBB的最佳参数

以超声照射时间、微泡剂量、延迟时间(微泡注射时间与声震时间间隔)、超声频率、声压为影响因素，每个因素选择三个水平，采用正交实验设计(见表1)，以伊文思蓝(EB，Evens blue，Sigma公司，E2129)渗出量作为血脑屏障通过率的指标(EB渗出量)，确定MRI引导的低频聚焦超声联合靶向微泡局部开放BBB，增加中枢GDNF水平的最佳参数。

试验方法：通透性的测定采用EB的渗出量定量估计。取PBS灌流后的大鼠脑组织，将局部蓝染的脑组织湿重按10ml/g浸入甲酰胺溶液，在60℃恒温水浴箱中抽提24h，甲酰胺溶液呈现深浅不同的蓝色，脑组织呈现无色透明状，然后在UV300紫外-可见光分光光度计下620nm波长处定量EB在甲酰胺中的OD值，定量分析样本脑组织中EB的含量。纯甲酰胺溶液设为空白对照，根据标准曲线，计算EB含量(μg/g)。

结果见表1。

表1MRI引导的低频聚焦超声联合靶向微泡局部开放BBB的最佳参数的因素和水平

表2MRI引导的低频聚焦超声联合靶向微泡局部开放BBB的最佳参数的正交设计及各组EB渗出量

结果见图5-9

图5为不同条件超声联合微泡开放血脑屏障脑组织中的EB含量，可见组6、组 11、组13和组14BBB通透性更强。

图6为不同条件超声联合微泡开放血脑屏障脑组织切片HE染色(A：对照组；B：组6；C：组11；D：组13；E：组14，400×)。

图7为不同条件超声联合微泡开放血脑屏障脑组织切片TUNEL染色(400×)(A：对照组；B：组6；C：组11；D：组13；E：组14，400×)。

图8为聚焦超声诱导血脑屏障细胞凋亡的作用。每个样本的凋亡细胞数目在五个独立实验中计数(与对照组和第6组比较*P＜0.01)。

图9为电子显微镜超微结构观察结果(A：对照组；B：组6；C：组11；D：组13；E：组14，400×)。在D组和E组，内皮细胞和神经细胞被严重破坏，但是在A、B、C组没有观察到变化。

以上结果表明：探头频率1MHz，微泡量0.5ml，照射时间60s，声压0.8MPa，延时60s是较好的参数条件，在该条件下BBB开放程度较大(EB渗出量表明其开放程度)，而组织学及电镜观察，没有明显的结构损伤。

实施例3、脑内蛋白含量的测定

该实施例的超声条件是实施例2中得出的最佳参数条件，即探头频率1MHz，微泡量0.5ml，照射时间60s，声压0.8MPa，延时60s。

超声联合微泡开放血脑屏障，静脉注射蛋白后，脑内蛋白含量测定及两种蛋白传输方式的比较。检测超声联合微泡开放BBB后，蛋白量与进入脑组织量。

(1)由于GDNF价格较高，用另一种价格低的替代蛋白BSA模拟实验条件，确定进入脑组织中的量。

分为两组：超声+微泡+蛋白(A组)；超声+载蛋白微泡(B组)；设定不同给药剂量：1)0μg/kg，1)100μg/kg，2)200μg/kg；3)400μg/kg，4)800μg/kg，5)1200μg/kg。

实验结果见图10，显示聚焦超声诱导血脑屏障破坏后超声组织中BSA浓度(*p＜0.05)。

(2)尾静脉注射载GDNF微泡，给药剂量为800μg/kg。

实验结果见图11，显示聚焦超声诱导血脑屏障破坏后超声组织中的GDNF浓度(*p＜0.05)。(图11中的A：GDNF(注射微泡后再注射GDNF)；B载GDNF微泡)

以上结果显示，1)脑组织中检测出的蛋白含量随静脉注射蛋白浓度的增加而增加；2)两种蛋白传递方式相比，载蛋白微泡更能促进蛋白进入脑组织。

实施例4、GDNF荧光微泡体外活性的检测

为检测靶向微泡制作过程中GDNF活性是否有影响，通过PC12(鼠嗜铬细胞瘤细胞)测其体外活性，PC-12细胞株来源于一种可移植的鼠嗜铬细胞瘤，该细胞对GDNF有可逆的神经元显形反应。

实验分组：A，微泡组；B，GDNF靶向微泡组；C，GDNF蛋白组。

方法：将细胞悬浮于含有5％HS与5％FBS的DMEM培养液中，接种于12孔板中浓度为2*10³cell/ml。C中加入50ng/ml重组的GDNF，B中加入含50ng/ml GDNF的GDNF靶向微泡，A加入相同量的微泡。培养7天后观察细胞变化。

结果见图12，GDNF诱导的PC-12细胞在分化。

结果表明，微泡所载的GDNF与重组的GDNF在诱导PC-12细胞的显形反应上效果是一致的，说明微泡所载的GDNF是有生物活性的。

实施例5、MRI监控下血脑屏障开放

MRI扫描器(SIEMENS)，德国采用临床标准3.0T信号系统。每次照射前校正系统焦点坐标。在照射前及实验中采用T1相扫描(TE：16ms，TR：1000ms，带宽：16kHz，矩阵：184×256，翻转角：90°，采集次数：4次，扫描层厚：1mm，)。用10％水合氯醛腹腔注射麻醉动物，麻醉起效后用脱毛剂去除照射区鼠毛。仰卧固定于MRI超声治疗系统中，动物头下部固定直径7.5cm的表面线圈，以减少干扰信号。根据MRIT1信息调整系统焦点至目标区域，照射前10秒，尾静脉注射0.5ml微泡(此处微泡是载GDNF的微泡)(5-8×10⁸/ml)(本实例中低频聚焦的参数为：探头频率1MHz，微泡量0.5ml，照射时间60s，声压0.8MPa，延时60s)，超声照射后15秒尾静脉注射马根维显(Magnevist)造影剂(0.2ml/kg)，T1相扫描后，尾静脉注射EB(100mg/kg)，来显示血脑屏障开放的区域。

结果见图13，为MRI引导的低频聚焦超声联合微泡开放血脑屏障及EB显示的血脑屏障开放区域。其中A：MRI横断位图像；B：MRI冠状位图像，图A和B箭头所示脑实质内增强显影的造影剂高信号，说明局部BBB开放，MRI造影剂进入脑实质；C：与图A相对应的脑组织切片观；D：与图B相对应的脑组织切片观，图C和D均见与MRI图像相对应的脑组织蓝染，表明局部血脑屏障打开，染料伊文斯蓝进入脑组织。

结果表明，超声联合微泡开放血脑屏障后MRI扫描下所显示的造影剂高信号区域(图13A，B)与大体观下EB蓝染区域(图13C，D)一致，说明MRI能够监控血脑屏障开放。

Claims

1.一种载GDNF微泡，由内部包裹生物惰性气体的脂质双分子层和连接于所述脂质双分子层外侧的生物素化的GDNF组成；所述脂质双分子层由下述质量份的物质组成：二硬脂酰磷脂酸胆碱4.9-5.1份、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇20000.9-1.2份、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-生物素0.9-1.2份；所述脂质双分子层与生物素化的GDNF通过生物素-抗生物素蛋白-生物素连接。

2.根据权利要求1所述的载GDNF微泡，其特征在于：所述载GDNF微泡的平均粒径为2-3μm。

3.根据权利要求1或2所述的载GDNF微泡，其特征在于：所述生物惰性气体为六氟化硫或者全氟丙烷。

4.制备权利要求1-3中任一项所述载GDNF微泡的方法，包括下述步骤：

4)离心漂浮法清洗微泡3-4次，除去未形成微泡的磷脂；在清洗后的微泡中加入抗生物素蛋白，室温下孵育20分钟，用PBS溶液离心漂浮法清洗3-4次，除去未耦合的抗生物素蛋白；然后在耦合抗生物素蛋白的微泡中加入生物素化的GDNF，室温下孵育15分钟，之后用漂浮法清洗3-4次除去未结合的生物素化GDNF，得到载GDNF微泡。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中所述磷脂溶液的浓度为2.8-3.1mg/ml。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：步骤4)中所述微泡、抗生物素蛋白、生物素化的GDNF的配比为(0.85-1.1)ml∶(0.08-0.12)mg∶(0.9-1.2)mg。

7.一种载GDNF微泡的给药套装，包括权利要求1-3中任一项所述的载GDNF微泡和聚焦超声设备；所述载GDNF微泡的给药量设定为0.5ml，所述聚焦超声设备的参数设置如下：探头频率1MHz，超声照射时间60s，声压0.8MPa，延迟时间60s。