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CN102648274B - 包含双呋脒腙的促进多能干细胞分化成心肌细胞的组合物 - Google Patents

包含双呋脒腙的促进多能干细胞分化成心肌细胞的组合物 Download PDF

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CN102648274B CN2010800553090A CN201080055309A CN102648274B CN 102648274 B CN102648274 B CN 102648274B CN 2010800553090 A CN2010800553090 A CN 2010800553090A CN 201080055309 A CN201080055309 A CN 201080055309A CN 102648274 B CN102648274 B CN 102648274B
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Abstract

本发明提供用于促进多能干细胞分化成心肌细胞的包含双呋脒腙的组合物，通过使用双呋脒腙诱导多能干细胞分化成心肌细胞的方法和通过使用双呋脒腙制备心肌细胞的方法。

Description

包含双呋脒腙的促进多能干细胞分化成心肌细胞的组合物
技术领域
本发明涉及促进多能干细胞分化成心肌细胞的组合物，诱导多能干细胞分化成心肌细胞的方法，以及由多能干细胞制备心肌细胞的方法。
背景技术
对于再生医学的实现，诱导多能干细胞分化成所需细胞的技术是必不可少的。此外，同样预期分化自多能干细胞的细胞对于体外药物筛选研究和药物安全评估是有价值的。尤其，非常需要的是开发用于再生医学和心脏病药物评估的诱导多能干细胞分化成心肌细胞的方法，原因在于目前在日本心脏病是第二位的死因。存在多种药物，其诱导严重的副作用，包括心脏停搏和心律不齐，因此导致增加的对提供同质心肌细胞(其可用于心脏毒性研究)的需要。
目前，已有报道，通过将人ES细胞和小鼠饲养细胞、END2细胞共培养来诱导人ES细胞分化为心肌细胞(非专利文献1)。然而，此方法的分化效率不令人满意并且它难以获得纯的人心肌细胞，因为所得的人心肌细胞通常被小鼠END2细胞污染。还有报道，可以通过由ES细胞制备胚胎体并向胚胎体中加入若干细胞因子(成纤维生长因子(bFGF)、骨形态发生蛋白4(BMP4)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、Dickkopf-1(DKK1)、活化素A)来诱导心肌细胞分化(非专利文献2和3)。然而，此方法需要大量的细胞因子并且成本太高，同时其分化效率不足。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Mummery，C.，等，Differentiation of human embryonicstem cells to cardiomyocytes：role of coculture with visceral endoderm-likecells(人胚胎细胞分化成心肌细胞：与内脏内胚层样细胞共培养的作用).Circulation(循环).107(21)，2733-40(2003)。
非专利文献2：Yang，L.，等，Human cardiovascular progenitor cellsdevelop from a KDR+embryonic-stem-cell-derived population(人心血管先祖细胞发育自KDR+胚胎干细胞源的种群).Nature(自然).453(7194)，524-8(2008)。
非专利文献3：Leschik，J.，等，Cardiac commitment of primate embryonicstem cells(灵长类胚胎干细胞的心脏定向).Nat Protoc.3(9)，1381-7(2008)。
这些文献通过引用结合于此。
发明概述
本发明要解决的问题
本发明的目的是提供以高效率低成本制备同质心肌细胞的方法。
解决问题的方式
本发明的发明人对9,600种库化合物的促进猴ES细胞分化成心肌细胞的活性进行了检验。结果，发现与常规的心肌细胞分化促进剂相比，双呋脒腙(其是一种已知作为抗生素和生长促进剂用于家畜的低分子量化合物)高效促进心肌细胞分化。因而，本发明已经得以实现。
本发明提供促进多能干细胞分化成心肌细胞的组合物，其包含双呋脒腙(nitrovin)。
此外，本发明提供诱导多能干细胞分化成心肌细胞的方法，该方法包括在包含双呋脒腙的培养基中培养多能干细胞。
此外，本发明提供由多能干细胞制备心肌细胞的方法，该方法包括在包含双呋脒腙的培养基中培养多能干细胞。
本发明的效果
根据本发明，已经可能诱导多能干细胞分化成心肌细胞而不使用饲养细胞以及之后获得纯的心肌细胞。此外，根据本发明，已经可能高效低成本地诱导心肌细胞分化以制备心肌细胞。本发明尤其适用于评估QT延长，这对于以高通量形式评估药物安全、大规模制备用于心脏病药物评估的同质且成熟的人心肌细胞以及生产用于移植以治疗心脏疾病的心肌细胞是重要的。
附图简述
图1.对促进心肌细胞分化的物质的筛选策略。
图2.筛选系统及对双呋脒腙的检测。
图3-1.在猴ES细胞中施用双呋脒腙(终浓度：1μM，5μM，20μM)后GFP的表达。
图3-2.在猴ES细胞中双呋脒腙诱导的GFP荧光强度和心肌细胞搏动集群(beating colonies)数目的增加。横轴表示双呋脒腙的浓度。在左图中，纵轴表示施用双呋脒腙后的GFP荧光强度，其表示为与对照(二甲亚砜，DMSO)相比的百分比(100％)。在右图中，纵轴表示搏动集群的数目/孔。
图4-1.施用双呋脒腙后人ES细胞中的GFP表达(终浓度：5μM)。
图4-2.人ES细胞中双呋脒腙(终浓度：5μM)诱导的GFP荧光强度的增加。纵轴表示施用双呋脒腙后GFP的荧光强度，其表达为与对照(DMSO)相比的百分比(100％)。
图5-1.在猴ES细胞中在施用双呋脒腙(终浓度：5μM)、细胞因子(bFGF、BMP4、VEGF、DKK1和活化素A)(终浓度分别为：5ng/ml、10ng/ml、10ng/ml、150ng/ml和3ng/ml)或双呋脒腙(终浓度：5μM)与上述细胞因子的组合后GFP的表达。
图5-2.在猴ES细胞中由双呋脒腙诱导的GFP荧光强度和心肌细胞搏动集群数目的增加。左图中，纵轴表示在施用双呋脒腙和/或细胞因子后GFP的荧光强度，其表达为与对照(DMSO)相比的百分比(100％)。右图中，纵轴表示搏动集群的数目/孔。
图5-3.在猴ES细胞中，由双呋脒腙诱导的GFP和肌钙蛋白T表达的增加。纵轴表示施用双呋脒腙和/或细胞因子后的表达水平，其表达为与对照(DMSO)相比的百分比(100％)。
实施方案描述
本发明提供促进多能干细胞分化成心肌细胞的组合物，其包含双呋脒腙。双呋脒腙是具有下式(C14H12N6O6)的低分子量化合物：
[式I]
Figure BDA00001731905500041
双呋脒腙是已知的化合物并且可以通过本领域中常规的有机合成方法制备。同样，双呋脒腙可以获得自供货商如KANTO CHEMICAL CO，INC(Tokyo，Japan)。
当在本文中使用时，术语″多能干细胞″是指能够分化成构成成人身体的任何类型细胞(多能性)并且能够在细胞分裂期间保持多能性的细胞(自我更新能力)。″多能干细胞″包括胚胎干细胞(ES细胞)，胚胎生殖细胞(EG细胞)以及诱导的多能干细胞(iPS细胞)。″多能干细胞″可以是任何物种的细胞，优选哺乳动物细胞，并且更优选啮齿类或灵长类动物细胞。本发明适用于猴或人多能干细胞。
ES细胞是源自早期胚胎的多能干细胞并且可以由早期胚胎中的胚泡或植入后外胚层的内细胞团建立。ES细胞的实例包括在以下文献中所述的那些：人(Thomson J.A.等，Science(科学)282：1145-1147(1998)；灵长类动物如恒河猴(rhesus macaque)和绒猴(marmoset)(Thomson J.A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.(美国科学院院刊)USA 92：7844-7848(1995)；Thomson J.A.等，Bio1.Reprod.(生殖生物学)55：254-259(1996))；兔(JP-A-2000-508919)；仓鼠(Doetshman T.等，Dev.Biol.(发育生物学)127：224-227(1988))，猪(Evans M.J.等，Theriogenology(动物生殖学)33：125128(1990)；PiedrahitaJ.A.等，Theriogenology(动物生殖学)34：879-891(1990)；Notarianni E.等，J.Reprod.Fert.(生殖学杂志)40：51-56(1990)；Talbot N.C.等，Cell.Dev.Biol.(细胞发育生物学)29A：546-554(1993))，羊(Notarianni E.等，J.Reprod.Fert.Suppl.43：255-260(1991))，牛(Evans M.J.等，Theriogenology(动物生殖学)33：125-128(1990)；Saito S.等，Roux.Arch.Dev.Biol.201：134-141(1992))，和貂(Sukoyan M.A.等，Mol.Reorod.Dev.(分子生殖发育)33：418-431(1993))(这些文献通过引用结合于此)。
EG细胞是源自原生生殖细胞的多能干细胞。EG细胞的实例包括人EG细胞(Shamblott，等，Proc.Natl.Acad.Sci USA(美国科学院院刊)92：7844-7848(1995))。
术语″iPS细胞″当在本文中使用时指自除多能干细胞外的细胞诱导得到的多能干细胞，如体细胞和组织干细胞。制备iPS细胞的方法描述于以下文献中，例如：WO2007/069666，WO2009/006930，WO2009/006997，WO2009/007852，WO2008/118820，Cell Stem Cell(细胞-干细胞)3(5)：568-574(2008)，Cell Stem Cell(细胞-干细胞)4(5)：381-384(2009)，Nature(自然)454：646-650(2008)，Cell(细胞)136(3)：411-419(2009)，NatureBiotechnology(自然-生物技术)26：1269-1275(2008)，Cell Stem Cell(细胞-干细胞)3：475-479(2008)，Nature Cell Biology(自然-细胞生物学)11：197-203(2009)，和Cell(细胞)133(2)：250-264(2008))(这些文献通过引用结合于此)。″iPS细胞″当在本文中使用时不应当限于在以上文献中所述的那些。″iPS细胞″包括通过任何方法制得的细胞只要该细胞是经人工由除多能干细胞外的细胞诱导的。
当由体细胞制备iPS细胞时，iPS细胞具有与体细胞相同的遗传信息。因此，由源自使用本发明组合物的患者的iPS细胞诱导出的心肌细胞不仅适用于再生医学而且还适用于药物效力或副作用的个体化评估。此外，预期由源自心脏病患者的iPS细胞诱导出的心肌细胞具有代表心脏病的遗传信息，并且因此可用于由遗传异常导致的心脏病的药物筛选。
可以按照1-5μM的双呋脒腙的终浓度将本发明的组合物加入到用于多能干细胞的心肌细胞分化的分化培养基中。分化培养基可以是用于多能干细胞的心肌细胞分化的任何常规培养基并且分化培养基的组分不受具体限制。分化培养基的实例包括用于本说明书的实施例中的基于IMDM的分化培养基以及由200ml DMEM/F12培养基(Sigma)、50ml胎牛血清(GIBCO)、2.5ml MEM非必须氨基酸溶液(Sigma)、2.5ml青霉素-链霉素(GIBCO)、2.5ml 200mM L-谷氨酰胺和2μl 2-巯基乙醇组成的基于DMDM的分化培养基，以及包含BMP4(10ng/ml)的StemPro-34SFM(GIBCO)。当使用本发明的组合物时，不一定要使用饲养细胞如END2细胞。可以取决于多能干细胞的类型和将使用的分化培养基的组成在适当的时间将本发明的组合物添加到分化培养基中。当将猴或人ES细胞在用于本说明书的实施例中的基于IMDM的分化培养基中培养时，可以在培养的第6-14天期间将本发明的组合物添加到分化培养基中。本发明的组合物可以与促进心肌细胞分化的其他物质一起组合使用，所述物质如细胞因子，包括bFGF、BMP4、VEGF、DKK1和活化素A。可以适当地决定将加入的其他物质的量和该物质的给药时间安排。
本发明的诱导心肌细胞分化的方法和制备心肌细胞的方法的特征在于将多能干细胞在包含双呋脒腙的培养基中培养。在一个实施方案中，本发明的方法包括以下步骤：将多能干细胞培养在用于心肌细胞分化的分化培养基中，在培养的第6-14天的期间将双呋脒腙加入到分化培养基中以使双呋脒腙的终浓度为1-5μM，并确认在培养的第18天多能干细胞分化为心肌细胞。可以取决于将使用的细胞来适当地确定使用双呋脒腙和确认心肌细胞分化的时间表。
在本发明的方法中，可以将双呋脒腙与促进心肌细胞分化的其他物质组合使用，所述物质如细胞因子，包括bFGF、BMP4、VEGF、DKK1和活化素A。将加入的其他物质的量和施用所述物质的时间表可以被适当地确定。
细胞的培养条件可以是用于培养动物细胞的任何常规培养条件，如但不限于在37℃，100％湿度和5％CO2。
可以由心肌细胞搏动集群的数目或心肌细胞分化的标记物(如α-MHC基因)的表达水平来检测向心肌细胞的分化。
可以将通过本发明的方法制备的心肌细胞用于在体外评估药物安全性或作为用于移植以治疗心脏病的心肌细胞使用。
实施例1
筛选促进猴ES细胞的心肌细胞分化的物质
如在图1中所述，对促进猴ES细胞的心肌细胞分化的物质进行筛选。将在α-MHC基因(心肌细胞分化的标记物)启动子控制下表达绿色荧光蛋白(GFP)的载体引入到猴ES细胞系(CMK 6.4食蟹猴(cynomolgus)ES细胞)中并将该细胞以5.0x103细胞/孔接种于96孔培养板上(Greiner/655090：96孔FIA黑板)，并在用于心肌细胞分化的分化培养基(200ml IMDM(Sigma 13390)，其包含50ml胎牛血清(GIBCO 10099-141)、2.5mlMEM非必须氨基酸溶液(Sigma M7145)、2.5ml青霉素-链霉素(GIBCO15140)、2.5ml 200mM L-谷氨酰胺、2μl 2-巯基乙醇(Sigma M7522)、255μl5N NaOH 255μl)中培养14天。在培养的第6-14天的期间内，将9,600种库化合物添加到单独的孔中(约1-5μM化合物/孔)。然后，在培养的第14天，通过使用HCS(高内涵筛选)系统(分子设备/MetaMorph成像系统)来测定GFP表达。结果，在加入有双呋脒腙的孔中GFP荧光强度高(图2)。
实施例2
双呋脒腙促进猴ES细胞的心肌细胞分化的效果
如在实施例1中所述，将表达绿色荧光蛋白(GFP)的载体引入到猴ES细胞系(CMK 6.4食蟹猴ES细胞)中。将猴ES细胞以4.0x105细胞/孔在6孔培养板(Asahi Glass/5816-006：Ezview培养板)上接种并培养。培养基与实施例1中所述相同。在培养的第6天，以1μM、5μM或20μM的终浓度加入双呋脒腙。在培养的第18天，测定GFP的荧光强度和心肌细胞搏动集群的数目。当添加双呋脒腙时，荧光强度和搏动集群的数目分别增加至高约5倍和约10倍(图3-1和3-2)。5μM的终浓度是最有效的。
实施例3
双呋脒腙促进人ES细胞的心肌细胞分化的效果
如在实施例1中所述，将表达绿色荧光蛋白(GFP)的载体引入到人ES细胞系(Kh-1)中。将人ES细胞以1.2x106细胞/孔在6孔培养板(AsahiGlass/5816-006：Ezview培养板)上接种并培养。培养基与实施例1中所述相同。在培养的第6天，以1μM、5μM或20μM的终浓度加入双呋脒腙。在培养的第18天，测定GFP的荧光强度。结果，在人ES细胞中也观察到由双呋脒腙导致的GFP荧光强度的增加(图4-1和4-2)。
实施例4
比较双呋脒腙和细胞因子
在GFP荧光强度的增加、心肌细胞搏动集群的数目以及肌钙蛋白T(心肌细胞分化标记物)的表达方面对双呋脒腙和已知为心肌细胞分化促进剂的细胞因子(bFGF、BMP4、VEGF、DKK1和活化素A)的混合物进行比较。
如在实施例1中所述，将表达绿色荧光蛋白(GFP)的载体引入到猴ES细胞系(CMK 6.4食蟹猴ES细胞)中。培养基与实施例1中所述相同。将猴ES细胞接种于6孔培养板上并在培养的第6-14天期间(双呋脒腙)或在培养的第1-14天期间(细胞因子)加入双呋脒腙(终浓度：5μM)或细胞因子(bFGF、BMP4、VEGF、DKK1和活化素A)的混合物(终浓度分别为：5ng/ml、10ng/ml、10ng/ml、150ng/ml和3ng/ml)。在培养的第18天，测定GFP荧光强度、心肌细胞搏动集群的数目以及肌钙蛋白T的表达水平。与细胞因子的混合物相比，在GFP荧光强度、搏动集群数目和肌钙蛋白T的表达水平中的任一方面，双呋脒腙都是高度有效的(图5-1至5-3)。此外，双呋脒腙和细胞因子的组合在GFP荧光强度的增加和搏动集群的数目方面显示协同效应(图5-1和5-3)。

Claims (6)

1.双呋脒腙用于制备促进多能干细胞分化成心肌细胞的组合物的用途。
2.根据权利要求1的用途，其中所述多能干细胞是哺乳动物细胞。
3.根据权利要求2的用途，其中所述多能干细胞是灵长类细胞。
4.根据权利要求3的用途，其中所述多能干细胞是人细胞。
5.诱导多能干细胞分化成心肌细胞的方法，所述方法包括在包含双呋脒腙的培养基中培养多能干细胞。
6.由多能干细胞制备心肌细胞的方法，所述方法包括在包含双呋脒腙的培养基中培养多能干细胞。
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