CN102645532A - β-激动剂类药物检测装置及方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物检测领域，公开了一种应用免疫层析技术检测一大类β-激动剂类药物的检测装置及检测方法。本发明利用与一大类β-激动剂类药物反应的抗体/受体制备免疫层析试纸条，实现一大类β-激动剂类药的同时检测。本发明与与现有技术相比，可实现一次对一大类β-激动剂类药物的检测，检测成本低，且方便快捷。

Description

β-激动剂类药物检测装置及方法

技术领域

本发明涉及生物检测领域，尤其涉及应用免疫层析技术检测β-激动剂类药物的检测方法及其装置。

背景技术

β-激动剂(β-agonists)，又称为β-兴奋剂，是一类人工合成药物，主要用于防治人、兽支气管哮喘和支气管痉挛，在药学上称为β-肾上腺素兴奋剂。此类药物添加到畜禽的饲料、饮用水中可促进瘦肉生长、抑制肥肉生长的药物，俗称瘦肉精。由于此类药物会在肝、肺等内脏积累，使食用者容易出现恶心、头晕、肌肉颤抖、心悸等中毒症状，严重影响了消费者的身体健康，甚至威胁到人的生命安全。欧美等国早已立法禁止在畜禽生产上使用β-激动剂类药物，我国农业部也于1997年作出相同的规定。尽管如此，受经济利益的驱使，违法滥用β-激动剂类药物现象仍然比较普遍。2002年，农业部、卫生部、国家食品药品监督管理局再次公告，明令禁止在饲料和动物饮用水中添加盐酸克伦特罗和莱克多巴胺等7种瘦肉精，但是在实际的操作中只检测盐酸克仑特罗，莱克多巴胺、沙丁胺醇等六种没有纳入常规的检测。于是导致市场上出现一种瘦肉精屡禁不止的现象，如我国严查盐酸克伦特罗，便出现以莱克多巴胺及沙丁胺醇取而代之的瘦肉精出现，以逃脱检测部门的检测。所以实现一类β-激动剂类药物的检测是彻底禁止瘦肉精事件的有力途径。

目前针对β-激动剂类药物的检测方法主要有HPLC、HPLC/MS和GC/MS，但由于分析仪器昂贵，检测费用高，步骤繁琐，耗时较长，所以并不适用于畜牧部门、监督管理部门和养殖单位。

免疫层析技术是上世纪80年代初期的一种简便快速检测技术，由该技术制成的免疫层析试纸条通常由以下几部分组成：底板及粘贴在底板上的样品垫、结合垫、纤维素膜、吸收垫等。检测时，将样品滴加到样品垫上，样品会通过毛细作用在层析条上迁移，在迁移的过程中，与结合垫上的标记物发生特异性反应，产生免疫复合物，该免疫复合物继续迁移，与纤维素膜上检测区域的相应抗原/抗体发生特异性结合，形成肉眼可见的检测带。该方法基于免疫层析及抗原抗体反应原理，应用于农兽药残留检测，可实现对药残的快速定量分析，非常适用于大批量样品的筛查工作。

但目前针对β-激动剂类药物的检测试剂盒多为β-激动剂类药物的单项检测，只有少量试剂盒可实现两种(盐酸克伦特罗和莱克多巴胺)或三种β-激动剂类药物(盐酸克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇)的联检。其方法均为应用一种β-激动剂类药物偶联大分子蛋白制备单抗或多抗，以制备抗体检测相应β-激动剂类药物。如专利02129704.X，其以盐酸克伦特罗-载体偶联蛋白作为抗原，免疫小鼠，制备单抗，应用免疫层析法制备检测盐酸克伦特罗胶体金试纸条，专利200510126415.4，其应用同样方法实现样品中对莱克多巴胺的检测。即一种抗体检测一种β-激动剂类药物，无法实现一类药物的同时检测。

发明内容

本发明提供一种可一次检测一大类β-激动剂类药物的免疫层析试纸条的制备及使用方法。

1)为了实现上述目的，本发明的一个技术方案是：

提供一种检测装置，包括试纸条和反应杯两部分。试纸条包括底板以及底板上依次搭接粘贴的样品垫、免疫层析复合膜、吸水纸，其中免疫层析复合膜上喷涂有质控区和检测区。反应杯内含有标记物-β-激动剂类药物抗体/受体复合物。

如上所述的标记物，其特征为可作为信号标记物的一类物质，如胶体金、胶体硒、乳胶颗粒、荧光颗粒、磁珠，以及其它任何可作为信号标记的物质。

如上所述的试纸条，其特征是由1-3个子试纸条组成，即用1-3个子试纸条检测一大类β-激动剂类药物。若由1个子试纸条组成，则试纸条的检测区由1-3个子检测区域组成，可对一大类β-激动剂类药物进行检测。

如上所述的反应杯，其特征为其中含有标记物-β-激动剂类药物抗体/受体复合物和适合生物分子反应的缓冲体系，该缓冲体系的pH在1-13之间。

如上所述的反应杯，其特征是内容物是冻干的粉末，还可以是液体。

本发明还提供一种检测方法，其特征是待检样品经前处理后，首先在反应池内与标记物-β-激动剂类药物抗体/受体复合物发生充分反应。

如上所述检测方法，其特征是加入样品后，样品中的目标物质与反应池内的β-激动剂类药物抗体/受体在15-60℃之间反应0-1h，反应结束后，将检测试纸条插入反应杯中，反应0-1h后判读检测结果。

如上所述的检测方法，其特征是可用肉眼直接进行结果判读，也可用相应的仪器进行判读。

2)本发明的另一个技术方案是：

提供一种免疫层析检测试纸条，该试纸条由底板以及底板上一次搭接粘贴的样品垫、标记物结合垫、免疫层析复合膜、吸水纸，其中免疫层析复合膜上有质控区和检测区。

如上所述的试纸条，其特征是由1-3个子试纸条组成，即用1-3个子试纸条检测一大类β-激动剂类药物。若由1个子试纸条组成，则试纸条的检测区由1-3个子检测区域组成，可对一大类β-激动剂类药物进行检测。

如上所述的标记物结合垫，其特征为喷涂有标记物-β-激动剂类药物抗体/受体复合物。

如上所述的标记物，其特征为可作为信号标记物的一类物质，如胶体金、胶体硒、乳胶颗粒、荧光颗粒、纳米磁珠，以及其它任何可作为信号标记的物质。

如上所述的检测区，其特征为该区域由1-3个子区域组成，这些子区域内喷涂有β-激动剂类药物-蛋白偶联物，可对一大类β-激动剂类药物进行检测。

本发明还提供一种检测方法，其特征是将检测试纸条插入待检样品中，在15-60℃之间反应0-1h，判读结果。

如上所述的检测方法，其特征是可用肉眼直接进行结果判读，还可以用相应的仪器设备进行判读。

本发明利用与一大类β-激动剂类药物反应的抗体/受体制备免疫层析试纸条，实现对一大类β-激动剂类药物的同时检测。与现有技术相比，既节省了检测成本，又缩短了检测时间。

具体实施方式

尽管本发明的内容是结合本实例进行说明，但是不能认为是对本发明专利的限制，本发明的范围由所附权利要求书限定。另外，本领域的技术人员在所附权利要求书限定的范围内对本发明进行各种改动或修饰，这些改动或修饰形式同样属本发明的保护范围。

实列1免疫层析检测装置(试纸条、反应杯模式)

1)试纸条的制备

样品垫的制备：将纤维素膜剪成1.5×30cm规格的条带，备用；

硝酸纤维素膜的制备：将硝酸纤维素膜剪成2.5×30cm规格的条带，在NC膜的不同位置喷涂β-激动剂类药物抗体/受体的抗体或β-激动剂类药物抗体/受体的二抗(质控线)、β-激动剂类药物配体(检测线)、室温晾干；

吸收垫的制备：将吸水纸裁成3.5×30cm的条带，备用；

试纸条的组装：将吸收垫、硝酸纤维素膜、样品垫依次贴在底板上，并切成5mm宽的试纸条，2-8℃干燥保存。

2)反应杯的制备

按照100μL/孔的量，往96孔微孔板中加入胶体金标记的β-激动剂类药物抗体/受体；

-80℃冷冻24h；

冷冻干燥孔内的胶体金标记的β-激动剂类药物抗体/受体；

将冻干后的胶体金标记的β-激动剂类药物抗体/受体置于干燥环境中保存。

3)检测尿样

取100ul尿样加入反应杯，40℃充分反应3min后，将试纸条插入反应杯内，继续反应5min后读取结果。

4)检测饲料样品中β-激动剂残留

用乳钵研碎饲料，称1g研碎的饲料样品加入10ml0.01M的盐酸，充分混合5分钟；调节pH值至6.5-8.0之间；3500rpm离心5min，转移出上清液；直接取100ul上清液加入反应杯，40℃充分反应3min后，将试纸条插入反应杯内，继续反应5min后读取结果。

实例2免疫层析检测装置(试纸条模式)

1)试纸条的制备

样品垫的制备：将纤维素膜剪成1.5×30cm规格的条带，备用；

结合垫的制备：将胶体金标记的β-激动剂类药物抗体/受体喷涂于玻璃纤维纸上，真空抽干，备用。

硝酸纤维素膜的制备：将硝酸纤维素膜剪成2.5×30cm规格的条带，在NC膜的不同位置喷涂β-激动剂类药物抗体/受体的抗体，β-激动剂类药物配体(检测线)、室温晾干；

吸收垫的制备：将吸水纸裁成3.5×30cm的条带，备用；

试纸条的组装：将吸收垫、标记物结合垫、硝酸纤维素膜、样品垫依次贴在底板上，并切成5mm宽的试纸条，2-8℃干燥保存。

2)检测肉品中β-激动剂

(1)低脂肪含量的肝、肌肉、组织

5g粉碎的样品与25ml 50mM盐酸混合，均质15min；取6g均质物，10-15℃离心15min，4000rpm或更高的转速；转移出上清液至另一个离心瓶中，加300μL 1M NaOH，混合15min；加入4ml 500mM磷酸二氢钾缓冲液(pH3.0)，简单混合并在4℃保存至少1.5小时或过夜。10-15℃，4000g离心15min。分离上清液，平衡至室温，将试纸条插入上清液中，5min后读取结果。

(2)高脂肪肉类组织

取5g样品到离心管中，加入25ml 50mM Tris-HCl(pH 8.5)，振荡30min；加入15ml庚烷振荡5min；4000g离心15min；用巴斯德吸管除去上面的庚烷层及中间薄薄的脂肪层；再用15ml庚烷重复步骤振荡、离心及吸去脂肪层操作；向均质的肉液中加入0.5ml 6M的盐酸，振荡1小时(或是振荡过夜)；4000g离心15min；移取上清液到另一个离心管中，加入300μl 1M NaOH，混合15min；加入4ml 500mM KH₂PO₄-缓冲液(pH3)，简单混合并在4℃存放至少1.5小时或过夜；4000g离心15min；移取上清液，平衡至室温；将试纸条直接插入上清液中，5min后读取结果。

Claims (9)

1.一种β-激动剂类药物免疫层析检测装置，包括检测试纸条和反应杯两部分，该试纸条包括底板，以及底板上依次搭接粘贴的样品垫、免疫层析复合膜、吸水纸。其中免疫层析复合膜上喷涂有检测区和质控区。反应杯内含有标记物-β-激动剂类药物抗体/受体复合物及缓冲体系。

2.如权利1所述的免疫层析检测装置，还可以是测试纸条，该试纸条由底板以及底板上依次搭接粘贴的样品垫、结合垫、免疫层析复合膜、吸水纸。其中免疫层析复合膜上喷涂有检测区和质控区，结合垫上喷涂有标记物-β-激动剂类药物抗体/受体复合物。

3.如权利要求1和2中所述的标记物，其特征为可以作为信号标记的一类物质，如胶体金、胶体硒、乳胶颗粒、荧光颗粒、磁性颗粒，以及其它任何可作为信号标记的物质。

4.如权利要求1和2中所述的试纸条，其特征是由1-3个子试纸条组成，即用1-3个子试纸条检测一大类β-激动剂类药物。若由1个子试纸条组成，则试纸条的检测区由1-3个子检测区域组成，可对一大类β-激动剂类药物进行检测。

5.如权利要求1所述的反应杯部分和权利要求2所述的结合垫部分，其特征为其中含有标记物-β-激动剂类药物抗体/受体复合物和适合生物分子反应的缓冲体系，该缓冲体系的pH在1-13之间。

6.如权利要求1所述的反应杯部分，其特征是内容物是冻干的粉末，还可以是液体。

7.如权利要求1所述的免疫层析检测装置，其特征是其检测β-激动剂类药物的方法是加入样品后，样品中的β-激动剂类药物与反应池内的β-激动剂类药物抗体/受体在15-60℃之间反应0-1h，反应结束后，将试纸条插入反应杯中，在15-60℃之间反应0-1h后判读检测结果。

8.如权利要求2所述的免疫层析检测装置，其特征是其检测β-激动剂类药物的方法是将试纸条直接插入待检样品，在15-60℃之间反应0-1h后判读检测结果。

9.如权利7和权利要求8所述的检测β-激动剂类药物的方法，其特征是检测结果可用肉眼直接判读，也可用相应的仪器进行判读。