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CN102625850B - 多重核酸检测方法和系统 - Google Patents

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CN102625850B CN201080024654.8A CN201080024654A CN102625850B CN 102625850 B CN102625850 B CN 102625850B CN 201080024654 A CN201080024654 A CN 201080024654A CN 102625850 B CN102625850 B CN 102625850B
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Abstract

本发明涉及基于单分子克隆扩增和后续检测核酸分子的方法和系统，且本发明尤其涉及判断单核苷酸多态性(SNPs)、突变和诊断与这些核酸分子变化有关的疾病。

Description

多重核酸检测方法和系统
相关专利申请案的交叉参考 
本申请要求2009年4月3日提交的美国临时专利申请第61/166,479号和第61/166,553号、2009年4月24日提交的美国临时专利申请第61/172,660号和2009年12月2日提交的美国临时专利申请第61/266,037号的权益和优先权，所述美国临时专利申请的全部内容列为本文的参考文献。 
技术领域
本发明涉及基于单分子克隆扩增和核酸分子后续检测的方法和系统，且本发明尤其涉及判断单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms;SNPs)、突变和诊断与这些核酸分子变化有关的疾病。 
背景技术
数十年来，聚合酶链反应(Polymerase chain reaction;PCR)已被广泛地用于核酸分析的许多领域。单分子PCR（也称为数字PCR）是PCR技术相对较新的发展。在单分子PCR中，样品被稀释且分配至许多单个核酸扩增反应中，平均每一个反应具有少于一个的拷贝模板。一些反应没有模板分子，一些反应具有大于一个拷贝的模板分子，且一定百分比的反应刚好具有一个拷贝的模板。所有反应平行进行。在这些反应中,始于一个拷贝的模板分子的克隆扩增子可使用本领域已知的方法检测到。关于样品中是否具有特定的目标分子，分析结果提供“是”或“否”二进制信号，例如0或1的数字格式。数字PCR中所有反应的结果，通过统计分析对目标分子进行定量。数字PCR将传统PCR的指数扩增转换为线性关系，且数字PCR将传统模拟信号转换为数字格式。Vogelstein等人于1999年在Proc.Natl Acad.Sci.USA第96期第9236-9241页和美国专利第6,143,496号对于数字PCR有更详细说明，所述论文和美国专利列为本文的参考文献。 
数字PCR的应用包括：早期癌症诊断的基因突变检测、评估等位基因不平衡、产前基因测试、基因表达的定量分析和DNA甲基化状态分析。Pohl等人Expert Rev.Mol. Diagn，2004，4(l)：41-47；Blow,Nature Methods，2007，4(10)：869-875；Diel等人Curr Opin Oncol，2007，19：36-42；Dressman等人PNAS，2003，100(15)：8817-8822；Weisenberger等人Nucleic Acids Res.，2008，36(14)：4689-4698；所有论文列为本文的参考文献。数字PCR所基于的单分子扩增原理还用于当前的第二代DNA测序技术中，诸如，Roche Life Sciences的DNA焦磷酸测序技术，Life Technologies的SOLiD DNA测序技术和Illumina的DNA边合成边测序技术，用于测序模板制备。 
数字PCR的一个优点为数字PCR在类似模板分子的较大背景下仍能检测和定量罕见序列变化（诸如，突变）的能力。这是因为每一个扩增反应可独立于样品中的其他目标分子，因为通过限制稀释模板分子被分配至单个PCR反应中。此种能力可用于对体液（诸如，来自结肠直肠癌患者的血浆样品和大便样品）进行非侵入性早期癌症检测，如Diehl等人PNAS，2005，102(45)：16368-16373；Diehl等人Gastroenterol.，2008，135(2)：489-498中所描述，所有论文列为本文的参考文献。本技术还能够在母亲DNA存在的情况下进行非侵入性产前基因测试，如Lo等人PNAS，2007，104(32)：13116-13121中所描述，所述论文列为本文的参考文献。 
通过统计样品中的阳性PCR反应，可使用数字PCR进行定量。通过判断所得扩增子的标识，可对变种DNA分子与野生型DNA分子之间的区别。根据这些结果统计计算变种DNA分子与野生型DNA分子的比率。数字PCR还可以用于目标分子的绝对定量。可在Dube等人PLoS ONE，2008，3(8)，e2876；Warren等人的“The Digital Array Response Curve”（未发表，见斯坦福大学网页thebigone.stanford.edu/quake/publications/DigResCurve.pdf）中发现数字PCR定量的更多细节，所有论文列为本文的参考文献。可通过增加被分析的目标分子的数量（即对更多PCR反应进行平行筛选），以改进数字PCR的精确度和准确性。 
当前，位于美国加利福尼亚州南圣弗朗西斯科(South San Francisco)的Fluidigm公司的384孔芯片或48×770数字阵列微流生物芯片(Digital Array Nanofluidic Biochip)可用于数字PCR。这些应用中的大部分应用利用实时PCR来分析每一个反应中的扩增子。文献中名称为BEAMing的方法通过乳胶PCR在磁珠上产生克隆扩增子且使用流式细胞计量术来检测和计数那些具有扩增子的小珠。然而，这些数字PCR方法因为受可用荧光染剂的光学分辨率的限制而具有有限的多重检测能力。 
从单分子产生克隆扩增子的其他方式包括滚环扩增(rolling circle amplification;RCA)。RCA为等温扩增方法，在所述方法中核酸探针经杂交或连接到目标核酸分子上，接着，使用引物多次复制所述目标核酸分子的序列，所述引物与探针序列部分互补。可在Eriksson等人，J.Microbiol.Methods，2009，78，195-202；Baner等人，Nucl.Acids Res.，1998，26(22)：5073-5078；Baner等人，Curr.Opinion Biotech.，2001，12，11-15中发现RCA和RCA应用的更多详细说明；所有论文列为本文的参考文献。RCA还可用于第二代DNA测序技术的样品制备中，Drmanac等人，Science，2010，327：78-81，所述论文列为本文的参考文献。
发明内容
在一个方面，本发明提供一种用于判断多个标识序列(IS)标签的标识码(ID码)的方法，所述方法包含：(a)在表面上固定多个分析物分子，其中每一个分析物分子包含一标识序列标签(IS标签)，且所述标识序列标签可与探针进行杂交；(b)将来自标记IS探针(设定LISP)探针库的一对标识序列标记IS探针(LISP)与所述IS标签的碱基审视位置处进行杂交，进而并置所述一对LISP，其中所述的每一个LISP包含：(i)与探针杂交的所述IS标识签序列互补的序列，以及(ii)与所述碱基审视位置处的指定碱基相关的标记；(c)用DNA连接酶连接所述一对并置的LISP；(d)在所述分析物分子的所述IS标签上检测所述一对连接LISP上的所述标记的存在，且根据所述一对连接的LISP的所述标记组合，以判定所述IS标签的所述碱基审视位置处的碱基组成；(e)使所述一对连接的LISP变性而脱离所述分析物分子；(f)重复步骤(b)至步骤(e)，直到不重复地审视所述IS标签中的所有碱基位置，且判定所述IS标签的所有碱基组成为止；(g)通过所述IS标签碱基组成与预设ID码的比较，判断所述分析物分子上的所述IS标签的ID码。 
在一些实施方式中，在每一个连接循环中，可判定所述IS标签上的两个指定碱基位置，其中包括在所述配对LISP探针的每一侧上的一个所述指定碱基位置。在一些实施方式中，在每一个LISP库中存在两组探针，其中一组为所述3'端标记IS探针(3'-LISP)，所述3'端标记IS探针包含5'端磷酸基和3'端标记，且另一组为所述5'端标记IS探针(5'-LISP)，所述5'端标记IS探针包含5'端标记和3'端羟基。 
在一些实施方式中，在两组LISP上存在四个不同的标记，其中每一个标记代表所述碱基审视位置处的一个指定碱基(A、C、G、T)。在每一个LISP库中包含所有所述审视位置处可能碱基组合所需要的所有探针。在一些实施方式中，在每一个连接循环中使用不同LISP库；且在每一个连接循环中依序审视所述IS标签上的不同碱基位置。 
在一些实施方式中，所述LISP上的所述标记为荧光染剂、电化学标记或纳米颗粒。 
在一些实施方式中，所述碱基审视位置处在从每一个LISP的连接点起的5个碱基内，且优选地在3个碱基内，以在所述成对探针连接步骤中保持所述碱基识别特异性。 
在另一个方面，本发明提供分析样品中的目标核酸序列的方法，所述方法包含：(a)从样品中产生多个第一模板分子和多个第二模板分子，其中所述第一模板分子包含第一目标核酸序列和第一标识序列(IS)标签，且所述第二模板分子包含第二目标核酸序列和第二IS标签，且其中所述第一IS标签构成第一标识(ID)码且所述第二IS标签构成第二ID码；(b)利用克隆扩增所述第一模板分子以产生第一群组克隆扩增子，且利用克隆扩增所述第二模板分子以产生第二群组克隆扩增子，其中所述第一群组克隆扩增子和所述第二群组克隆扩增子在空间上分开定位；以及(c)识别所述克隆扩增子的所述IS标签的所述ID码，以判断所述克隆扩增子代表的所述目标核酸序列。 
在一些实施方式中，所述方法进一步包含：通过分析所述第一群组克隆扩增子和所述第二群组克隆扩增子的序列状态，判断所述目标核酸序列的相应序列状态。 
在一些实施方式中，所述方法进一步包含：定量来自每一个模板分子的克隆扩增子的群组数量，以推断所述样品中的每一个目标核酸序列的量。 
在一些实施方式中，所述方法进一步包含：在表面上固定所述第一群组克隆扩增子和第二群组克隆扩增子。 
在一些实施方式中，所述目标核酸序列选自由以下组成的群组：基因体DNA、cDNA和RNA。 
在一些实施方式中，使用引物通过酶促反应，以产生所述第一和第二模板分子，其中所述引物包含所述IS标签和序列，所述序列与所述目标核酸序列中的至少一部分为互补的序列，且其中维持所述样品中的所述两个目标核酸序列的数量比。 
在一些实施方式中，通过酶促扩增或复制，在所述表面上产生所述第一和第二群组克隆扩增子，其中用于克隆扩增或复制的至少两个引物接合于所述表面上且在空间上分开。 
在一些实施方式中，在多个水性液滴中进行所述克隆扩增，每一个水性液滴包含：DNA扩增试剂，所述DNA扩增试剂包括多个引物；以及微粒，其中至少一个引物接合于所述微粒的表面上。在一些实施方式中，所述水性液滴由油包水型乳胶形成，且所述水性液滴含于反应容器中，其中所述反应容器含有油相，且所述油相包含与水不混溶的液体。 
在一些实施方式中，所述DNA扩增为聚合酶链反应(PCR)。 
在一些实施方式中，在亲水反应点上进行模板分子的所述克隆扩增，而所述亲水反应点在疏水表面上形成图案化，其中每一个亲水反应点包含所述水性液滴。在一些实施方式中，所述亲水反应点由所述与水不混溶的液体覆盖，以在所述克隆扩增期间防止水相蒸发且隔离各单个亲水反应点。 
在一些实施方式中，所述克隆扩增通过所述单链模板分子的环化，且由DNA聚合酶在延伸寡核苷酸上进行后续的等温滚环扩增(RCA)，其中所述延伸寡核苷酸在5'末端接合于所述表面上且其3'末端处与所述环化模板分子互补，且所述延伸寡核苷酸包含用于酶促延伸的3'端羟基(3'-OH基)。在一些实施方式中，通过酶促延伸产生至少两个拷贝的所述环化模板分子序列。在一些实施方式中，通过在所述延伸寡核苷酸上连接所述模板分子的两个末端，进行所述模板分子的所述环化，所述模板分子含有特定的核酸序列，且所述核酸序列为所述模板分子制备时所用引物序列中的一部分。在一些实施方式中，所述环化模板分子的长度介于40个碱基与400个碱基之间，且长度优选地介于60个碱基与200个碱基之间。 
在一些实施方式中，对所述不同模板分子中的至少两个模板分子来说，所述两个末端处的所述特定的核酸序列为相同的或不同的。 
在一些实施方式中，所述克隆扩增子直接连合至磁性微粒的所述表面，且其中通过物理力或通过化学键结，在所述表面上固定所述磁性微粒。 
在一些实施方式中，通过标记探针的依序连接循环或通过DNA测序技术，同时判断所述克隆扩增子的所述ID码，且所述ID码显示出每一群组克隆扩增子所代表的所述目标核酸序列。 
本发明的另一个方面提供一种用于涵盖多重核酸分析的试剂盒。所述试剂盒的一实施方式包含：酶促反应引物，其中所述引物含有各种IS标签，以在模板分子制备中进行基因特异性预扩增；以及标记探针库，其中所述标记探针库包含多个LISP探针。 
附图说明
图1a为将IS标签嵌入模板分子和克隆扩增的方法示意图。图1b为将IS标签嵌入模板分子和克隆扩增的另一个方法示意图。图1c为通过单分子滚环扩增将IS标签嵌入模板分子和克隆扩增的方法示意图。 
图2为流动室和流动室内部磁性微粒分布的示意图。 
图3图示一系列单个PCR反应液滴，该等反应液滴在图案化表面上含有磁性微粒，所述图案化表面由油层覆盖，在过度去除油后由外部磁力将这些磁性微粒维持于表面上。 
图4示出用于IS标签测定的依序成对探针连接化学作用的原理。 
图5a：表1显示来自IS标签的可能ID码的色码和相应的碱基组成的实例。 
图5b：表2显示特定的碱基码。表3显示同义的碱基码。 
图6示出转移ID窗口以供依序成对探针连接的原理。 
图7图示系统的实例。 
图8图示使用多重核酸分析进行非侵入性癌症早期检测的实例。 
图9示出本发明的示范性实施方式。 
具体实施方式
本发明提供用于同时分析多个目标核酸序列的方法和系统，诸如用于发现和验证以及临床诊断的多个生物标记检测。 
A.由标识序列标签进行多重核酸分析 
在一个方面，本发明提供分析样品中的目标核酸序列的方法。 
如本文中所概述，在一些实施方式中，目标序列包含需要序列信息的位置，在本文中通常称为“检测位置”或“检测位点”。在一个实施方式中，检测位置为单核苷酸，但是在一些实施方式中，检测位置可包含多个核苷酸，既可彼此接近也可由一或更多个核苷酸分离开来。如本文所用的“多个”表示至少两个。 
如本文所用，与杂合体中的检测位置碱基进行碱基配对的碱基称为“读出位置”或“审视位置”；因此本发明的许多探针包含审视位置。在一些实施方式中，如本文中所概述，目标序列可能不是样品目标序列而是扩增反应产物，在本文中有时称为“衍生”目标序列、“模板分子”或扩增子。本文中，用“扩增子”表示核酸分子，所述核酸分子通过扩增方法生成。通常，由PCR方法（包括多重PCR）进行扩增。扩增子可能为双链DNA分子或单链DNA分子。如下所述，可使用能增加其中一链的扩增反应技术。 
在一个实施方式中，本发明的扩增子包括目标核酸序列。在另一个实施方式中，扩增子含有核酸目标链和第二核酸目标链，所述核酸目标链由本文所述的方法扩增，所述核酸目标链含有如下文所述的两个或两个以上目标域，所述第二核酸目标链与第一核酸链互补。用“单链目标核酸”、“单链目标”、“单链目标序列”或所述术语语法上 的等效物表示用于本发明的扩增方法的起始材料。在另一个实施方式中，本发明的目标序列含有与探针序列大体上互补的区域，如本文中所定义。 
包含目标序列的样品可实际上来自任意有机体和任意源，所述有机体和源包括但不限于体液（包括但不限于，实际上任意有机体样品的血液、骨髓、尿、排泄物、泪液、血清、淋巴液、唾液、肛门和阴道分泌物、汗液、精液和其他体液，任意有机体诸如包括人类的哺乳动物）；细菌和病菌（包括病毒）的细胞裂解物；硬组织（例如器官，诸如肝脏、脾脏、肾、心脏、肺等）；环境样品（包括但不限于，空气样品、农业样品、水样品和土壤样品）；生物战剂样品；研究样品（即，样品可为扩增反应产物，所述扩增反应包括诸如PCR扩增反应的目标扩增和信号扩增，如通常在WO99/037819中所描述，所述专利列为本文的参考文献）；纯化样品，诸如纯化基因体DNA、RNA、蛋白质等；原样（细菌、病毒、基因体DNA等）；如将为本领域技术人员所认知，可对样品进行任意实验操作。如果需要的话，那么使用已知的技术来制备目标序列。例如，可使用已知的裂解液、电穿孔等，处理样品以溶解细胞，其中根据需要进行纯化和/或扩增，如将为本领域技术人员所认识。 
在一个方面，本发明提供基因特异性预扩增的方法，将设定的IS标签和IS码嵌入基于目标核酸序列所产生的扩增子。 
基因特异性预扩增已广泛用于核酸分析，诸如，基因分型、基因表达分析和临床诊断中的样品制备。Li等人，Nucleic Acids Res.，1996，24：538-539；Mengual等人，BMC Research Notes，2008年6月，1：21；Xia等人，Genet.Mol.Biol.；2009：20-24；Arneson等人，Cold Spring Harb.Protoc，“Whole-Genome Amplification by Improved Primer Extension Preamplification PCR(I-PEP-PCR)”，2008；所有论文列为本文的参考文献。 
在一些实施方式中，本发明的方法包含：从样品中产生多个第一模板分子和多个第二模板分子，第一模板分子包含第一目标核酸序列和第一标识序列(IS)标签，且第二模板分子包含第二目标核酸序列和第二IS标签，并且第一IS标签构成第一ID码且第二IS标签构成第二ID码。 
在一些实施方式中，使用引物，通过酶促反应产生第一和第二模板分子，所述引物包含IS标签和序列，所述序列与目标核酸序列中的至少一部分互补，其中保留样品中的两个目标核酸序列的数量比。 
本文中，用“标识序列(IS)标签”表示较短人造DNA序列，所述较短人造DNA序列 用于样品分析物间识别特定目标分子的编码。在一些实施方式中，IS的长度小于6个碱基或小于10个碱基。IS标签还可包含额外的核酸序列，所述额外的核酸序列在解码处理期间为探针杂交所需要。通常，将IS标签设计为不同于核酸分析中目标基因体序列。在一些实施方式中，引入这些IS标签作为样品制备中的一部分。 
本文中，用“标识(ID)码”表示分配给IS标签的代码。每一个IS标签的碱基组成对应于一个特定的ID码。 
在一些实施方式中，第一和第二目标核酸序列的丰度类似。在一些实施方式中，第一目标核酸序列比第二目标核酸序列丰富至少100倍、1000倍或10,000倍。 
在一些实施方式中，本发明的方法包含：通过第一模板分子的克隆扩增产生第一群组克隆扩增子，且通过第二模板分子的克隆扩增产生第二群组克隆扩增子，其中第一群组克隆扩增子和第二群组克隆扩增子在空间上分离定位。 
本文中，用“克隆扩增子”或“扩增子克隆”表示扩增子群组，扩增子群组可直接或间接地追溯到分离的多核苷酸。本文中，用“克隆扩增”表示分离且扩增多核苷酸以产生“扩增子克隆”或“克隆扩增子”的方法。 
本文中，用“在空间上分离定位”表示两个或两个以上群组扩增子在空间上定位不同。例如，不同群组扩增子可定位于相同表面上的不同点上、或定位于不同表面上，诸如本文所述的不同微粒表面上。 
在一些实施方式中，通过酶促扩增或复制，在表面上产生第一和第二群组克隆扩增子，其中在克隆扩增期间，用于扩增或复制的至少两个引物连接至表面且在空间上分离开来。 
在一些实施方式中，多簇克隆扩增子接合至表面上。克隆扩增子直接或间接地连接至表面。在一些实施方式中，克隆扩增子接合至磁性微粒的表面，且通过本文所述或本领域已知的物理力（例如，磁场）或通过化学键结，在表面上固定磁性微粒。 
在一些实施方式中，识别所述克隆扩增子的IS标签的ID码，以判定由本文所述的克隆扩增子代表的目标核酸序列。 
在一些实施方式中，通过分析克隆扩增子的所述群组序列状态，判断目标核酸序列的相应序列状态。 
本文中，用“序列状态”表示序列特征，诸如单核苷酸多态、突变或甲基化。序列状态可由本领域已知或本文中所公开的方法进行判断，方法包括但不限于标记探针连接、单碱基延伸、DNA测序和熔解曲线分析。 
在一些实施方式中，本发明的方法进一步包含：通过累加含有同一IS标签的克隆扩增子群组数，定量来自每一个模板分子的克隆扩增子的簇组数量，根据已知的用于样品制备中的稀释倍率，以推断样品中的每一个目标核酸序列的量。 
通常，单分子克隆扩增中的模板分子的随机分布遵循泊桑(Poisson)分布。C反应腔室中的M模板分子的随机分布遵循泊桑分布。在给定反应腔室中具有至少一个模板分子的概率表示为p， 
p = 1 - ( 1 - 1 C ) M
且每一个反应腔室中的模板分子的平均浓度表示为λ：λ=MC. 
由于反应腔室的数量可任意变大，所以可得到：λ=-ln(1-p). 
可通过计数数字PCR中的阳性反应腔室数，估计概率p。因此，可统计计算每一个反应腔室中的模板分子的平均浓度和样品中的相应目标分子量。 
对95%的置信区间来说，概率p的置信极限可表达为 
p ± 1.96 p ( 1 - p ) C .
在一些实施方式中，本发明的方法包含：使用某些目标序列作为分析中的定量参考序列，所述参考目标序列在每一个所关注基因体（诸如，管家基因）中具有已知的拷贝数。 
B.制备具有嵌入标识序列标签的模板分子 
在图1a至图1c中示出一些示范性实施方式，图1a至图1c中图示产生合并有IS标签的模板分子和模板分子后续在表面上克隆扩增的方法。可使用IS标签嵌入引物通过基因特异性预扩增从目标序列制备模板分子，如图1a中所示；或者可通过基因特异性5'核酸酶裂解预扩增制备模板分子，如图1b中所示。101为具有至少一个目标序列的目标分子，诸如基因体DNA。如目标序列T1的引物102（图1a中）和152（图1c中）所示，基因特异性预扩增中的一个引物含有特定的IS标签序列以及序列(PMB1)，所述IS标签序列具有标识码ID1和通用引物序列(UPMB)，所述序列(PMB1)与目标序列T1中的一部分互补。目标序列T1的预扩增引物组中的另一个引物也含有通用引物序列(UPMA)的和序列(PMA1)的序列，所述另一个引物为103（图1a中）和153（图1c中），所述序列(PMA1)与目标序列T1中的一部分互补。类似地，另一个引物含有另一特定的IS标签序列与目标序列T2中的一部分互补的序列，所述另一个引物为104（图1a中）和154（图1c中），所述IS标签序列具有标识码ID2和通用引物序列UPMB；并且引物105（图 1a中）和引物155（图1c中）含有通用引物序列UPMA和与目标序列T2中的一部分互补的序列。从基因特异性预扩增中获得的模板分子为106（图1a中）和156（图1c中），由IS标签ID1识别；并且所述模板分子为107（图1a中）和157（图1c中），由IS标签ID2识别。 
在一些实施方式中，不对称PCR预扩增用于产生单链模板分子，以在延伸寡核苷酸上由RCA进行连接和克隆扩增。 
可以用相对较小的PCR循环数完成本发明中所描述的模板分子制备中的基因特异性预扩增，优选地为小于30次循环、25次循环或20次循环，以提供足够的模板分子且保留原始样品中不同目标序列间的比率。 
在一些实施方式中，在图lb中示出从目标序列产生IS标签嵌入模板分子的方法。目标序列T1和T2的基因特异性探针125和126分别具有5'翼，所述5'翼含有基因特异性IS标签ID1和ID2以及通用引物序列UPMA和UMPB。类似于TaqMan实时PCR探针，在基因特异性5'核酸外切酶裂解预扩增期间，这些5'翼被从探针上切割下来。所述5'核酸外切酶裂解反应，需要目标序列T1的基因特异性引物组121和122以及目标序列T2的基因特异性引物组123和124。所述聚合酶具有5'至3'核酸外切酶活性，诸如Taq聚合酶，在PCR期间降解所述探针125和126中的一部分，从而将5'翼释放于溶液中。图1b中所示此种切割下来的5'翼127和128则变为原始目标序列T1和T2的替代物且用作后续分析中的模板分子，所述切割下来的5'翼127和128含有嵌入IS标签ID1和ID2。 
因为用于5'核酸外切酶裂解预扩增的探针是专门为目标序列所设计，所以在最终结果中是否存在或所述的IS标签序列ID1和ID2，可揭示原始样品中这些目标序列的序列信息。例如，如果图1b中的基因体DNA101经亚硫酸氢钠处理用于DNA甲基化分析，那么甲基化特异引物和探针可用于目标序列的5'核酸外切酶裂解预扩增中。在最终分析中指定的IS标签是否存在（取决于试验设计）将表示原始样品中的目标序列是否为甲基化了的。 
C.表面上的单分子克隆扩增 
接着，根据基于单分子克隆扩增来扩增由本文所述的方法获得的模板分子，其中从单拷贝模板开始扩增，以产生用于进一步分析的克隆扩增子簇。在扩增之后，表面上每一个阳性微粒或反应点上的扩增子量可以大于几万或几十万。如本文所公开，在试验中可在表面上产生几十万或几百万的阳性微粒或反应点，取决于所要的分析尺寸。本文所述的单分子克隆扩增可由多种方法完成。 
在一些实施方式中，由聚合酶链反应(polymerase chain reaction;PCR)进行克隆扩增，所述聚合酶链反应(PCR)在微粒或连续表面上产生扩增子，如图1a和图1b所示。模板分子被分布至大量的平行单个PCR扩增反应中，其中平均各单个PCR反应少于一个拷贝的模板分子。可能需要稀释模板分子，来实现各单个PCR少于一个拷贝的模板分子的目的。一个通用引物序列可连接至固体载体表面，诸如磁性微粒108或平坦表面112，所述一个通用引物序列与图1a和图1b中的UPMA和UPMB互补，以便在表面上空间分离所得克隆扩增子簇。基因T1和T2的所得扩增子109和111分别含有目标序列和相应IS标签。使用通用引物序列可简化试验设计。在本发明的另一个实施方式中，可在克隆扩增中使用基因特异性引物序列，而不使用通用引物序列。克隆扩增子簇可相对地降低对检测技术的要求。 
在一些实施方式中，在多个水性液滴中进行所述克隆扩增，每一个水性液滴滴包含：DNA扩增试剂，所述DNA扩增试剂包括多个引物；以及微粒，其中至少一个引物接合于所述微粒的表面上。 
在一些实施方式中，微粒为磁性粒子。这些磁性粒子的大小可在从小于1微米到100微米的范围，优选地为小于30微米，优选地为小于20微米且更优选地为介于1微米与10微米之间。微粒表面包含诸如二氧化硅或聚苯乙烯等材料。 
在一些实施方式中，水性液滴由油包水型乳胶形成，且所述水性液滴含于反应容器中，其中所述反应容器含有油相，所述油相包含与水不混溶的液体。 
在一些实施方式中，在亲水反应点上进行模板分子的克隆扩增，而所述亲水反应点图案化在疏水表面上，其中每一个亲水反应点包含水性液滴。在一些实施方式中，亲水反应点由与水不混溶的液体（例如，矿物油）覆盖，以在克隆扩增期间防止水相蒸发且隔离各单个亲水反应点。 
在一些实施方式中，DNA扩增为聚合酶链反应(PCR)，且在克隆扩增期间反应容器或所述的表面处在热循环中。 
在一些实施方式中，磁性微粒包括于含水PCR反应混合物中，且所述磁性微粒与制备好的模板分子一起被分布至大量的单个PCR反应中。 
在一些实施方式中，引物集簇在固体载体表面上设定的位置（称为反应点）并直接接合于表面上，且这些反应点上的单个扩增反应在所述表面上彼此被隔离开来。这些反应点的大小可在从10微米到200微米的范围，优选地为小于100微米，且更优选地为小于50微米。固体载体材料可包括玻璃、硅、聚合材料和本领域已知的其他材料， 所述材料与PCR反应和荧光检测兼容。 
可通过本领域已知的各种表面化学作用，实现引物连接到磁性微粒或固体载体，参见Hermanson的“Bioconjugate Techniques”，Academic Press，1996，所述论文列为本文的参考文献。磁性微粒上的或表面上的通用引物可用作克隆扩增的一个引物。优选地，所述互补的UPMA序列结合于固体载体表面，从而导致扩增子IS标签远离表面，，以供探针在随后的检测步骤中进行有效杂交。然而，如果试验设计需要此种方法，那么互补的UMPB也可结合于固体载体表面。少量引物可包括于含水PCR反应混合物中，以有助于扩增的初始循环，所述引物连接至磁性微粒或表面。已在文献中报道了引物的此种用途。 
在一些实施方式中，由滚环扩增(rolling circle amplification;RCA)在表面上进行克隆扩增。诸如图1c中所示模板分子156和157，在克隆RCA扩增中，单链模板分子在延伸寡核苷酸162和164上被环化并延伸。所述延伸寡核苷酸162和164含有邻接序列，所述序列与模板分子的5'和3'末端互补，在这种情况下可进行模板分子的环化。这些延伸寡核苷酸在5'末端处连接至微粒或表面，且这些延伸寡核苷酸在3'末端处具有自由-OH基，所述3'末端与环化模板分子167和169互补，且其中可由聚合酶进行序列延伸。环化模板分子用作由各种聚合酶进行的克隆RCA的模板，所述聚合酶包括Φ29DNA聚合酶或Klenow片段。RCA可有效地产生多达1,000nt/min的目标序列。克隆RCA的产物可包含数千个连续线性的环化模板分子的序列。此外，本发明需要在表面上或在不同微粒上空间分离这些克隆扩增子。 
在一些实施方式中，由油包水型乳胶PCR(emulsion PCR;emPCR)进行单分子克隆扩增。磁性微粒与为PCR所需要的其他试剂一起可包括于emPCR的水相中，一个通用引物与所述磁性微粒接合，当反应液滴中仅存在一个模板分子时，在磁性微粒的表面上产生克隆扩增子。乳胶中的小滴可在从5微米到200微米的范围内，且更优选地为介于10微米与50微米之间，取决于所用微粒的大小。通常，去污剂包括于油相中，以在PCR热循环期间使乳胶保持稳定。制造乳胶所需要的方法和装置已为本领域所知。美国专利第7,323,305号和美国专利申请公开案第2009/0035825号均列为本文的参考文献。可在商业热循环器上的96孔板或384孔板的孔中进行热循环。PCR的热循环技术为本领域所熟知。 
在本发明的一些实施方式中，在热循环之后，乳胶直接转移至流动室组件中，诸如图2中所示的一个流动室组件。流动室包含检测窗口208、流动室外壳206、流体进 口202、流体出口204、基板216、乳胶滴220和磁性微粒218。流动室放置于导热板210上，所述导热板210连接至电子热加热和冷却装置222。永磁体214放置于下方，绝热层212分离永磁体214与导热板210。通过导热板来调节基板216的温度。基板216可由各种可将热量转移通过基板的材料制成、具有较低背景荧光且与表面上的酶促反应兼容。基板实例可为玻璃、石英和硅。导热板由良导热体制成，诸如铜和铝。可通过本领域已知的各种方法来执行将乳胶转移至流动室中，诸如手动移液管和注射泵。 
当第一次填充流动室时，乳胶在流动室中浮动，所述乳胶保持单个小滴。在本步骤中，可选择性地从基板216上去除磁体214。可通过流体进口和出口将乳胶分解剂抽吸至流动室中，从而反乳化乳胶滴且导致磁性微粒沉淀到基板表面上，如图2中所示。流动室下方的磁体有助于将这些微粒分布且保持在基板表面上。乳胶分解剂为本领域所熟知且被广泛使用，诸如丁醇和过度去污剂。 
在乳胶分解后，流动室中的磁性微粒任意地分布在基板表面上。取决于流动室中的微粒密度，一些微粒将会聚集起来。然而，大部分微粒将在表面上分离开来，且由磁场保持在适当位置。微粒聚集为不良的现象且可能对成像分析造成困难。由于在emPCR中有大量水性液滴，所以可在流动室中的基板表面上沉积几百万磁性微粒。在彻底洗涤之后，保留在表面上的磁性微粒上的扩增子可用于进一步序列分析。 
在一些实施方式中，在图案化表面上直接执行单分子克隆扩增，所述图案化表面包含亲水反应点，所述亲水反应点由疏水区域环绕，即，疏水区域使亲水反应点在空间上彼此分离。亲水反应点可通过表面改性而使PCR兼容。可在WO2005/029041A2和US2008/0153135Al中发现此种专门图案化表面的示范性应用，所有专利列为本文的参考文献。 
在图3中示出图案化的亲水反应点的实例，所述图案化的亲水反应点由疏水表面环绕，其中240为基板，在所述基板上一系列亲水反应点241由疏水区域242环绕。在一些实施方式中，亲水反应点包含基板的疏水表面的物理或化学改性。在其他实施方式中，疏水区域包含基板的亲水表面的物理或化学改性。此种表面改性可为基板表面的化学衍生或物理涂敷。若干方法可用于制作此种图案化表面，诸如由光刻进行的表面化学衍生，如美国专利第5,985,551号和第5,474,796号；以及通过表面物理吸收进行的改性，如US2008/0268440，所有专利列为本文的参考文献。 
水溶液可自动聚集到亲水反应点，所述亲水反应点由疏水表面区域环绕，从而在表面上形式一系列单个水性液滴，所述单个水性液滴图示为图3中的243。这归因于水 溶液与此种图案化表面之间的表面相互作用。亲水反应点与高度疏水区域之间的表面张力差异可规定水溶液在表面上的分布。仅仅通过用过量水溶液注满此种图案化表面且接着从此种图案化表面中抽取过量液体，水性液滴将仅仅停留在亲水反应点上，从而有效地将含水样品分配至大量的分隔的亲水反应点中。这种样品分隔方法比使用机器人系统的传统液体分配方法更快更经济。 
在一些实施方式中，密封液体可快速地覆盖于分布在图案化表面上的单个水性液滴上，以在PCR的热循环期间防止蒸发。通常，密封液体与水不混溶、与酶促反应兼容且在热循环之后易从表面上去除。本发明中优选的密封液体包含矿物油（覆盖油），如图3中所示244。 
图案化亲水反应点的半径大小可在1微米到1000微米之间变化，半径优选地为从5微米到200微米，且更优选地为从10微米到100微米。假设小滴为半球且间距为表面上亲水性点的1.5倍半径，可在常规的显微镜载玻片的足迹（2英寸x3英寸，即50mmx76mm）上形成小滴体积和小滴总数的实例计算如下。这个表在单个反应的数量方面显示了本发明的高超能力和灵活性，所述单个反应可在单个试验中平行处理。 
亲水反应点的半径(μm) 小滴体积小滴总数
5 0.26pL24×10^6
10 2pL6×10^6
25 32pL9.7×10^5
50 262pL1.7×10^5
100 2nL6×10^4
200 16nL1.5×10^4
在一些实施方式中，图3中的磁性微粒245可包括于PCR反应混合物中且可与IS标签嵌入模板分子和其他PCR试剂一起被分隔至图案化表面上的水性液滴中，一个通用引物连接到磁性微粒245上。这些磁性微粒在图案化表面上的所有亲水反应点间任意分布。一些含水反应液滴将没有磁性微粒，一些含水反应液滴将刚好含有一个磁性微粒，且一些含水反应液滴将具有多于一个磁性微粒，取决于初始PCR反应混合物中所包括的磁性微粒量。然而，在特定的亲水反应点中存在多于一个磁性微粒不一定使这些磁性微粒没有用。通常，在克隆扩增中极重要的是，单个反应中的所有扩增子均为单个模板分子的复制物。 
在一些实施方式中，磁场施加于图案化表面的下方，如图3中所示，以在后续分 析中将磁性微粒245限制在图案化亲水反应点241上。可通过本领域已知的各种技术来施加磁场，诸如通过永磁体247。 
在一些实施方式中，在表面上，单分子克隆扩增与用滚环扩增(RCA)一起执行。如图1c中所示，模板分子在延伸寡核苷酸上经环化且延伸，所述延伸寡核苷酸接合在微粒或表面上。延伸寡核苷酸既用作环化模板且用作模板分子的滚环延伸引物。极重要的是，在每一个微粒上或在单分子滚环扩增中表面上的每一个反应点刚好有一个拷贝的环化模板分子，以确保延伸产物的定量可反映原始样品中的模板分子量。 
环化模板分子的长度介于40个碱基与400个碱基之间，且长度优选地介于60个碱基与200个碱基之间。 
在一些实施方式中，于溶液中的微粒上，模板分子在延伸寡核苷酸上连接且由RCA延伸，其中调节模板分子与微粒的比率以确保微粒上的单分子RCA。随后，将图1c中的延伸微粒160和161引入图2中所示的流动室中，以供进一步分析。在一些实施方式中，模板分子的环化和等温延伸是在分布于流动室表面上的微粒上进行。 
在一些实施方式中，对至少两个不同的模板分子来说，每一个模板分子两端处的特定的核酸序列为相同的或不同的。 
在一些实施方式中，图1c中所示基因特异性预扩增中的引物152和154经设计为在末端处具有IS标签序列，以使每一个模板分子连接且延伸于特定微粒上。微粒的类型数量至少需要和试验中的目标序列的类型数量一样。此种设计确保RCA产物为每一个微粒上的相同序列的拷贝。 
在一些实施方式中，图1c中所示基因特异性预扩增中的引物152和154经设计为在模板分子的末端处具有通用引物序列。在试验中，此种引物设计仅仅需要一类微粒，而不管目标序列的数量。 
D.依序成对探针连接(Sequential paired-probe ligation) 
在本发明中，分析IS标签碱基组成。 
本领域已知的若干方法可用于测定IS标签碱基组成，方法诸如探针杂交和DNA测序。当前第二代DNA测序技术（包括，焦磷酸测序、SOLiD测序和边合成边测序方法）可用于碱基序列测定。然而，这些方法耗时且昂贵。本发明提供新颖的依序成对探针连接方法，在一个连接循环中可同时测定两个位置处的碱基组成。 
在一个方面，本发明提供用于判断标识序列标签的标识码的方法，所述方法包含以下步骤：(a)在表面上固定多个分析物分子，其中每一个分析物分子包含一标识序列 (IS)标签，所述标识序列(IS)标签可易于探针接近进行杂交；(b)杂交来自设定LISP探针库的一对标记IS探针(LISP)与碱基审视位置处的IS标签，进而并置这对LISP，其中每一个LISP探针包含：(i)序列，所述序列与所述序列杂交至的IS标签序列互补，和(ii)标记，所述标记与审视位置处的指定碱基有关；(c)利用DNA连接酶连接这对并置LISP；(d)在分析物分子的IS标签上检测所述一对连接LISP上标记的存在，且根据所述一对连接LISP的标记组合，判定所述IS标签的所述碱基审视位置处的碱基组成；(e)使所述一对连接LISP变性而脱离所述分析物分子；(f)重复步骤(b)至步骤(e)，直到不重复地审视所述IS标签中的所有碱基位置，且判定所述IS标签的所有碱基组成为止；以及(g)通过比较所述碱基组成与指定ID码，判断所述分析物分子上IS标签的ID码。 
在一些实施方式中，审视所述IS标签上的两个设定碱基位置，在所述配对探针的每一侧上有一个所述设定碱基位置。在每一个连接循环中相继而不重复地审视IS标签上的不同碱基位置。 
在一些实施方式中，在每一个LISP库中存在两组探针，其中一组为3'端标记IS探针(3'-LISP)，所述3'端标记IS探针包含5'端磷酸基和3'端标记，且另一组为5'端标记IS探针(5'-LISP)，所述5'端标记IS探针包含5'端标记和3'端羟基。LISP库可判定审视位置处的所有可能碱基组成。在一些实施方式中，使用简并碱基(Ns)来制造这些LISP，以节约时间和成本，如图4中所示。在寡核苷酸合成中使用简并碱基为本领域所知。 
在一些实施方式中，在两组LISP上存在四个不同的标记，其中每一个标记代表碱基审视位置处的一指定碱基(A、C、G、T)。在一些实施方式中，LISP上的标记为荧光染剂、电化学标记或纳米颗粒。 
在一些实施方式中，在每一个连接循环中使用一设定LISP库。本文中，用“设定LISP库”表示经设计为审视来自连接点的特定碱基位置的LISP库。举例来说，如图4中所示，用于第一连接循环中的设定LISP库包含被设计为审视连接点处的第一碱基的LISP。用于第二连接循环中的设定LISP库包含被设计为审视连接点处的第二碱基的LISP。 
在一些实施方式中，在图4中示出依序成对探针连接方法，所述依序成对探针连接方法用于测定IS标签的碱基组成，所述IS标签嵌入表面上的克隆扩增子中。通过执行3个成对探针连接循环，判断图4中所示示范性6-碱基IS标签250的ID码。在依序成对探针连接化学作用的每一个循环中，存在两组标记IS探针(LISP)。一组探针，即5'端标记IS探针5'-LISP；而另一组探针，即3'端标记IS探针3'-LISP，在图4中分别地表示 为第一循环、第二循环和第三循环的251、252和253。LISP包含与特定的IS标签互补的碱基序列和上游或下游已知序列中的一部分，所述已知序列位于IS标签的两侧。5'-LISP的3'末端和3'-LISP的5'末端皆含有3个碱基序列，所述3个碱基序列被设计成共同杂交至并置位置中的IS标签处，然后利用诸如T4连接酶或Tth连接酶的DNA连接酶，将5'-LISP的3'末端和3'-LISP的5'末端连接在一起。 
在一些实施方式中，连接后的成对连接探针可保留在模板分子上，且其两个标记可由检测器在表面上检测。通过严格洗涤从表面上去除未连接探针。在一个成对探针连接循环之后，从目标分子上去除成对连接探针，以供继续进行下一个连接循环。成对连接探针的Tm显然不同于未连接探针的Tm。可通过变性操作，诸如通过加热或碱性溶液，执行去除成对连接LISP。相继进行连接循环，直到审视所有碱基位置为止。 
在本领域中，已研究了“辨识编码(zipcode)”序列设计的基本原理，参见Gerry等人，J.Mol.Biol.，1999，292，251-262，所述论文列为本文的参考文献。并不是所有可能的碱基序列组合均适合作为IS标签，归因于与目标分子序列的自我配对或互相作用。例如，以回文序列(ACGT)作为IS标签可能不是个好选择。因此，可用IS标签的数量可能小于理论数量。LISP的长度可在6个碱基到40个碱基之间变化，更优选地介于8个碱基与20个碱基之间。在成对探针连接期间，所述碱基序列可优选地具有类似Tm，以具有更好的杂交特异性。 
若干小组已研究了DNA连接酶的特异性和足迹，参见Luo等人，Nucleic Acids Res.，1996，24(14)：3071-3078；Odell等人，1999，274(20)：14032-14039；所有论文列为本文的参考文献。通常，DNA连接酶根据模板碱基序列选择连接位点任一侧上的大于三个碱基。在远离连接位点的碱基位置，可能存在更多由连接酶造成的错误，取决于连接酶和连接条件。只要微粒上IS标签序列的测定一致，所述微粒可具有多达几十万扩增子，那么可容许有一些干扰。 
在一些实施方式中，标记1(L1)为与碱基审视位置处的A-LISP有关的标记；标记2(L2)为与碱基审视位置处的C-LISP有关的标记；标记3(L3)为与碱基审视位置处的G-LISP有关的标记；以及标记4(L4)为与碱基审视位置处的T-LISP有关的标记。碱基审视位置为来自第一连接循环中5'-LISP的3'末端的第一碱基和来自第一连接循环中3'-LISP的5'末端的第一碱基，图4中图示为251。碱基审视位置为来自第二连接循环中5'-LISP的3'末端的第二碱基和来自第二连接循环中3'-LISP的5'末端的第二碱基，图4中图示为252。类似地，碱基审视位置为来自第三连接循环中5'-LISP的3'末端的第三 碱基和来自第三连接循环中3'-LISP的5'末端的第三碱基，图4中图示为253。可遵循本发明的精神设计其他解码方案。 
在一些实施方式中，四个检测标记包含四个不同的荧光染剂，所述荧光染剂的吸收和发射光谱与检测装置兼容。许多荧光染剂标记为本领域已知且市场上可买到。选择这些荧光染剂应考虑的一个因素为，这些荧光染剂之间应具有最小荧光能量转移，因为LISP在磁性微粒上的目标分子扩增子上被紧紧地连接在一起。由于在成对探针连接的每一个连接循环中审视一对碱基，所以标记的每个颜色组合代表IS标签序列中两个碱基的组合。 
然而，由于颜色组合不能判断这两个碱基的序列，所以AC和CA的碱基序列将产生相同的检测信号。图5a中所示表1总结了颜色组合和相应的碱基对组合，假设在5'-LISP和3'-LISP中皆用L1、L2、L3和L4标记碱基A、C、G、T。随后，为用户方便性起见，色码可由ID码代表。在表1的编码方案中，总共存在10个可区别的标记组合，其中包括4个独特的碱基对组合，如图5b中的表2所示；并且存在6个同义(equivalent)的碱基组合，如图5b中的表3所示。因此，IS标签中的每一对碱基可提供10个ID码。如果IS标签长度为6个碱基，如图6中所示，那么可用的ID码的理论数量为10×10×10=1,000。一旦判定碱基组成，则可识别IS标签的ID码。 
在一些实施方式中，使用较短IS标签，诸如长度为4个碱基。在每一个LISP中仅仅存在两个碱基审视位置。构造和设计原理和上文图4中的所述内容一样。可由LISP实现较好的连接特异性，归因于以下事实，这些碱基审视位置更接近连接位点。仅仅需要两个成对探针连接循环来判定4-碱基IS标签。然而，来自这些LISP的可用色码变得更小，在分析理论中ID码总共为10×10=100个。 
在其他实施方式中，嵌入较长IS标签，以增加可用ID码的数量，同时可移动不对称的5'-LISP探针组和3'-LISP探针组。在图6中示出了实例。在此情况下，320为8-碱基IS标签，所述8-碱基IS标签嵌入模板分子中。第一ID窗口指的是IS标签320的5'末端上的四个碱基，所述IS标签320为碱基审视对象，由使用LISP321和322的第一和第二连接循环进行所述碱基审视。第二ID窗口指的是IS标签320的3'末端上的其他四个碱基，所述IS标签320为碱基审视对象，由使用LISP323和324的第三和第四连接连接循环进行所述碱基审视。这些LISP为不对称的，因为需要ID窗口在连接循环之间移动，以保持连接特异性。当审视相应ID窗口的四个碱基组成时，LISP321、322、323和324通过上述相同原理起作用，如图6中所示。然而，仅仅一对LISP可连接于特定IS标签上。 来自示范性8-碱基IS标签的可用ID码可为10×10×10×10=10,000，在公开的发明中，可刚好在4个连接循环中判断所述可用ID码。 
图6中所示IS标签设计方案提供了大量的可用ID码，同时保持较好的连接特异性，归因于连接位点处较好的碱基辨别。可遵循本发明的精神设计其他类似方案。 
E.目标序列分析 
判断IS标签可提供克隆扩增子簇处那些目标序列的基因或位点特异标识。使用本领域已知的核酸分析方法，可在固定于表面的这些扩增子上进行进一步序列特异性分析，以获得特定目标基因的序列状态（包括但不限于突变、SNP或甲基化），所述核酸分析方法包括但不限于标记探针连接、单碱基延伸、DNA测序或熔解曲线分析。 
F.用于多重核酸分析的设备 
在另一个方面，本发明提供用于多重核酸分析的系统。 
在一些实施方式中，所述系统包含：可移动的流动室，所述流动室包含第一反应表面和第二表面，在第一反应表面中实施生物反应，所述第二表面包含检测窗口，通过所述检测窗口检测所述流动室内部的生物反应。在一些实施方式中，可移动的流动室能够与温度控制单元分离开来，以在必要时减小所述磁场对所述流动室的所述第一反应表面的效应。 
在一些实施方式中，系统包含：温度控制单元，所述温度控制单元包含导热层和相关的加热元件和冷却元件，所述相关的加热元件和冷却元件连接到导热层上；和磁性单元，所述磁性单元施加磁场穿过所述导热层；以及任选地，绝热层，所述绝热层介于导热层与磁性单元之间，其中流动室定位于导热层上，以调节第一反应表面的温度，且所述流动室受磁场影响，所述磁场由磁性单元提供。通过热电冷却器、电阻加热器以及冷却风扇或热水和冷水的循环，执行温度调节。在一些实施方式中，磁性单元包含永磁体。 
各种材料可用于导热板，材料诸如铝和铜。通常，流动室与导热板之间的接触需要足够紧，以确保较好的热转移。 
在一些实施方式中，系统包含：流体控制单元，所述流体控制单元连接至流动室，以控制试剂传输至所述流动室且控制试剂从所述流动室去除。 
在一些实施方式中，系统包含：检测单元，所述检测单元用于检测流动室所述第一表面上的适当标记的存在且判断流动室第一表面上的适当标记的位置。在一些实施方式中，检测单元包含光学器件和检测器，以通过所述流动室的检测窗口进行荧光检 测。 
在一些实施方式中，系统包含：电子控制单元，所述电子控制单元用于控制且协调所述系统元件，且执行资料分析。 
在一些实施方式中，在图7中示出用于实施本发明的系统。在上文的图2中描述了流动室363和流动室363的元件340、342、343、345、360、361和362。流动室放置于导热板371上，所述导热板317具有一个或（任选地）两个热电加热和冷却单元370，所述热电加热和冷却单元370经连接以调节流动室内部反应表面的温度。绝热层372任选地放置于导热板371与永磁体380之间，所述永磁体380与流动室中的反应表面对准。整个组件安装于x-y精密移动平台385上，所述移动平台385可调节流动室中检测窗口的扫描区域。流体系统395连接至试剂单元390，其中用于试验的所有必需试剂存储且视情况保持在指定温度下。流体系统控制来自流动室的进口和出口的试剂传输和去除，以及废物控制。检测单元375安装为直接面向流动室的检测窗口，并且所述检测单元375能够自动地保持聚焦且能够检测用于试验中的所有光学标记。荧光成像的方法为本领域所熟知。一个实例为荧光显微镜，所述荧光显微镜具有滤色块，以用于不同的激发和发射光谱。检测单元包含CCD成像照相机。计算单元398进行所有控制和资料处理。 
在一些实施方式中，多于一个流动室可安装于上述系统上，以最佳化系统效率且提供样品分析的灵活性。在此种系统上，可为不同的流动室编程，以运行不同的试验。例如，可在系统上的一个流动室中运行依序连接化学作用，同时可在系统上的另一个流动室中处理荧光成像。也可包括大于一个流体控制单元或检测单元。 
应了解，本文所述的实例和实施方式仅仅出于说明性目的，并且应了解，向本领域专业人员建议对本文所述的实例和实施方式进行的各种修改和变化都应包括于本申请的精神和范围以及所附权利要求书的范围内。本文中所引用的所有公开案、专利和专利申请均列为本文的参考文献。 
实例 
实例1 
用于早期癌症检测的多重基因测试 
普遍认为，致癌基因、肿瘤抑制基因和稳定基因（包括这些基因的突变和甲基化）的基因变化累积会引起癌症。到现在为止，许多基因变化被判断为癌症生物标记。从过去的癌症生物标记研究来看，癌症检测的较好方法为，同时测试特定癌症中所涉及的一组基因而不仅是单个基因。本发明提供的高度多重检测方法可用于在较大背景下检测较低丰度的生物标记物。 
结肠直肠癌的早期检测 
当分别考虑男性和女性时，结肠直肠癌(Colorectal cancer;CRC)在美国为癌症相关死亡的第三大致死原因；而当结合考虑两种性别时，结肠直肠癌为第二大致死原因。美国癌症协会(ACS)建议在50岁时开始定期检查。如果早期检测到，那么CRC的治愈率很高。非侵入性检查为促进患者定期检查为早期检测到癌症且拯救生命的极重要工具。 
关于乳腺癌和结肠直肠癌的全基因体分析的最新综合研究，揭示了一组涉及结肠直肠癌的69个基因，其中在个体结肠直肠癌中癌症基因变化的平均数为9，参见Sjoblom等人的“The Consensus Coding Sequences of Human Breast and Colorectal Cancers”，Science，2006，314，第268-274页。在研究中发现的极大部分体细胞突变为单碱基突变。可通过本发明的方法，相对于样品中的野生型DNA来定量此种突变DNA。在图8中示出一实例。主要步骤描述如下。 
(1)大便DNA样品制备，图8中的810和812：可根据QiaAmp DNA Stool套组之使用手册(Handbook)中所概述的程序，使用QiaAmp DNA Stool Kit（加州的Qiagene公司），从大便样品中提取人DNA。来自这个样品制备方法的大部分DNA片段的大小小于200bp。 
(2)基因特异性预扩增和嵌入IS标签814：来自步骤812的一小部分纯化的人DNA片段用于基因特异性预扩增，其中一组18个引物含有通用引物序列和特定的IS标签序列，从而产生18个扩增子，导致通用引物序列位于所述扩增子的二端，所述扩增子涵盖目标基因的所有33个突变（APC(20)、TP53(5)、KRAS(4)和PIK3CA(4)，其中突变数量表示于圆括号中），比较Diel等人，Gastroenterology，2008，135：489-498，所述论文列为本文的参考文献。每一个IS标签分配给一特异性目标基因，即，在这个试验中存在18个IS标签（ID1至ID18）。在表A1中示出IS标签分配给的目标基因。在PCR热循环器上执行此操作。 
(3)任选地，在步骤815，通过实时PCR来定量来自预扩增814的扩增子，以决定用 于下一个步骤的模板分子的稀释倍率。 
(4)在步骤816，在图案化载玻片上进行单分子克隆扩增：来自上述预扩增的模板分子与其他试剂（包括磁性微粒）一起分布于亲水/疏水图案化载玻片上，以在表面上产生单分子反应液滴，其中一个通用引物与所述磁性微粒连接，所述亲水/疏水图案化载玻片安装于流动室中。平均每一个反应液滴中存在小于一个拷贝的模板分子。反应液滴覆盖有矿物油且经热循环，以在系统上进行克隆扩增。从流动室去除PCR试剂，且用缓冲液洗涤具有磁性微粒的载玻片，所述磁性微粒通过磁场维持在表面上。载玻片上的一小部分微粒将具有单个模板分子的克隆扩增子。 
(5)IS标签判断818：通过本发明中所公开的依序成对探针连接化学方法，判定所有嵌入接合于微粒上的扩增子中的IS标签。通过预先设定的IS标签标识(ID)，判定每一个微粒上的扩增子所代表的目标基因。然而，在一些基因中可能存在多于一个突变。当不可针对特定微粒判定其ID时，那么所述特定微粒不可用于进一步分析。 
(6)磁性微粒的突变分析820：可通过探针连接评估33个结肠直肠癌基因突变。两个或两个以上不同的标记探针可用于区分野生型基因与突变基因。然而，这些不同的标记探针可以用相同或不相同的标记，因为在分开的磁性微粒上进行突变分析，而且在上文步骤(5)已判断了所述磁性微粒与特定基因的关联。在图9中，L1和L2分别为针对野生型目标和突变目标的探针。在成像分析之前，升高温度，将未连接寡核苷酸探针从载玻片上洗掉。标记揭示这些基因的突变状态。当在一个特定基因的扩增子上存在多于一个突变时，可针对不同突变位点在相同微粒上进行多个连接循环。例如，如图9中所示，来自TP53的Exon7的扩增子ID17具有两个单碱基突变（表A1）。第一和第二探针连接判断相同微粒上两个单碱基突变的相应突变状态。 
(7)在步骤822，通过比较样品中的突变基因与野生型基因，定量突变分析。 
(8)在步骤824，如果已知疾病的相关性，那么受过训练的专业人员可判断可能的癌症诊断。 
表A1.结肠直肠癌检测的突变基因* 
IS标签 基因 扩增子 突变
ID1 APC APC-1 单碱基突变
ID2 APC APC-2 缺失
ID2 APC APC-2 缺失
ID3 APC APC-3 单碱基突变
ID3 APC APC-3 缺失
ID3 APC APC-3 单碱基突变
ID4 APC APC-4 插入
ID4 APC APC-4 单碱基突变
ID4 APC APC-4 单碱基突变
ID5 APC APC-5 单碱基突变
ID5 APC APC-5 缺失
ID6 APC APC-6 缺失
ID7 APC APC-7 单碱基突变
ID7 APC APC-7 缺失
ID8 APC APC-8 单碱基突变
ID9 APC APC-9 缺失
ID10 APC APC-10 缺失
ID10 APC APC-10 缺失
ID10 APC APC-10 缺失
ID11 APC APC-11 插入
ID12 KRAS KRAS 单碱基突变
ID12 KRAS KRAS 单碱基突变
ID12 KRAS KRAS 单碱基突变
ID12 KRAS KRAS 单碱基突变
ID13 PIK3CA PIK3CA Exon9 单碱基突变
ID13 PIK3CA PIK3CA Exon9 单碱基突变
ID14 PIK3CA PIK3CA Exon20-1 单碱基突变
ID15 PIK3CA PIK3CA Exon20-2 单碱基突变
ID16 TP53 TP53Exon5 单碱基突变
ID17 TP53 TP53Exon7 单碱基突变
ID17 TP53 TP53Exon7 单碱基突变
ID18 TP53 TP53Exon8 单碱基突变
ID18 TP53 TP53Exon8 单碱基突变
  *Gastroenterology，2008，135：489-498。 
实例2 
定量的多重核酸分析 
基因体DNA上20个单碱基突变的定量分析如下所述。步骤1.目标编码：使用嵌入4-碱基IS标签（ID1至ID20）的引物，通过基因特异性预扩增制备基因体DNA上目标序列的20个模板分子，参见图1c。不对称PCR用于预扩增中，以产生单链模板分子，所述单链模板分子可简化克隆扩增。步骤2.克隆扩增：随后，在延伸寡核苷酸上环化由步骤1制备好的模板分子，且通过20种磁性微粒的滚环扩增来克隆扩增所述制备好的模板分子。磁性微粒上的延伸寡核苷酸含有特定的反IS标签序列（与IS标签互补序列），所述反IS标签序列可确保，在这个试验中，只在一个给定的磁性微粒上专一性连接且一个扩增目标序列。通过Φ29聚合酶，在溶液中等温进行RCA。优化磁性微粒与模板量的比率，以实现每个微粒有至多一个模板分子。通过染剂标记通用引物探针来识别阳性微粒，由此可判断微粒上扩增产物的存在。步骤3.IS标签LISP的依序成对探针连接：步骤2中获得的磁性微粒可任意分布至系统上的流动室中，如图7中所示，以使用4-碱基IS标签的2个成对探针连接循环来判断表面上每一个磁性微粒的诸ID。有必要在连接循环之间用洗涤缓冲液彻底洗涤磁性微粒。步骤4.目标序列分析和定量：使用单碱基延伸方法与标记三磷酸脱氧核糖核苷(deoxy-ribonucleoside triphosphate;dNTPs)，针对微粒上所有20个突变执行后续的多重测试。成像分析可识别阳性磁性微粒上的所有20个突变。 
通过统计每一个突变序列或野生型序列的阳性磁性微粒数量，实现每一个突变目标序列或野生型目标序列的定量。 

Claims (7)

1.一种用于判断多个标识序列标签的标识码的方法，所述方法包含以下步骤：
(a)在一表面上固定多个分析物分子，其中每一个分析物分子包含一标识序列标签，所述标识序列标签的长度小于10个碱基，且所述标识序列标签可与探针进行杂交；
(b)将来自标记的标识序列探针库的一对标记的标识序列探针与所述标识序列标签的碱基审视位置处进行杂交，进而并置所述一对标记的标识序列探针，其中每一个所述标记的标识序列探针包含：(i)与所述探针杂交的所述标识序列标签序列互补的序列，以及(ii)与所述碱基审视位置处的指定碱基相关的检测标记，其中在每一个标记的标识序列探针库中存在两组探针，其中一组为3'端标记的标识序列探针，所述3'端标记的标识序列探针包含5'端磷酸基和3’端标记，且另一组为5'端标记的标识序列探针，所述5'端标记标识序列探针包含5'端标记和3'端羟基；
(c)进行成对探针连接步骤，以连接所述一对并置的标记的标识序列探针；
(d)在所述分析物分子的所述标识序列标签上检测所述一对连接的标记的标识序列探针上所述检测标记的存在，且根据所述一对连接的标记的标识序列探针的所述检测标记组合，判定所述标识序列标签的所述碱基审视位置处的碱基组成，且审视所述标识序列标签上的两个指定碱基位置，包括在所述一对连接的标记的标识序列探针的每一侧上的一个所述指定碱基位置；
(e)使所述一对连接的标记的标识序列探针变性而脱离所述分析物分子；
(f)重复步骤(b)至步骤(e)，直到不重复地审视所述标识序列标签中的所有碱基审视位置处的所有碱基，且判定所述标识序列标签的所有碱基组成为止；和
(g)通过比较所述碱基组成与预定标识码，判断所述分析物分子上的所述标识序列标签的所述标识码，以在n个成对探针连接循环中区别10^n个碱基组成。
2.如权利要求1所述的方法，其中在所述成对探针连接步骤中，所述一对连接的标记的标识序列探针上的所述检测标记是相同或不同的检测标记。
3.如权利要求1所述的方法，其中在两组标记的标识序列探针上存在四个不同的检测标记，其中每一个检测标记代表所述碱基审视位置处的一个指定碱基，该指定碱基是腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤或胸腺嘧啶，且其中在每一个标记的标识序列探针库中包含所述碱基审视位置处的所有可能碱基组合所需要的所有探针。
4.如权利要求1所述的方法，其中在每一个连接循环中使用不同标记的标识序列探针库，且其中在每一个连接循环中依序审视所述标识序列标签上的不同碱基位置。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述标记的标识序列探针上的所述标记包含荧光染剂、电化学标记或纳米颗粒。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述碱基审视位置处在距每一个标记的标识序列探针的连接点起的5个碱基内，以在所述成对探针连接步骤中保持碱基识别特异性。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述碱基审视位置在从每一个标记的标识序列探针的一连接点起的3个碱基内，以在所述成对探针连接步骤中保持碱基识别特异性。
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