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CN102625845A - 协同产生异丙醇与伯醇，二元醇和酸的微生物和方法 - Google Patents

协同产生异丙醇与伯醇，二元醇和酸的微生物和方法 Download PDF

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CN102625845A
CN102625845A CN2010800504376A CN201080050437A CN102625845A CN 102625845 A CN102625845 A CN 102625845A CN 2010800504376 A CN2010800504376 A CN 2010800504376A CN 201080050437 A CN201080050437 A CN 201080050437A CN 102625845 A CN102625845 A CN 102625845A
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A·P·博加德
罗宾·E·奥斯特豪特
M·J·伯克
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Genomatica Inc
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Abstract

本发明提供一种具有正丙醇和异丙醇途径，1,4-丁二醇（1,4-BDO）和异丙醇途径，1,3-丁二醇（1,3-BDO）和异丙醇途径，或者甲基丙烯酸（MAA）和异丙醇途径的非天然存在的微生物有机体。该微生物有机体包括至少一种编码正丙醇，1,4-BDO，1,3-BDO或MAA和异丙醇途径中每种途径各自的一种酶的外源核酸。本发明还提供一种协同产生正丙醇和异丙醇，1,4-BDO和异丙醇，1,3-BDO和异丙醇或者MAA和异丙醇的方法。该方法可包括在一定条件下培养一种协同产生正丙醇和异丙醇的微生物有机体并持续足以分别产生每种产物的时间，其中该微生物有机体表达至少一种编码正丙醇，异丙醇，1,4丁二醇，1,3-BDO和/或MAA途径酶并以足以分别产生每种产物的外源核酸。

Description

协同产生异丙醇与伯醇,二元醇和酸的微生物和方法
发明背景
本发明一般涉及生物合成的方法，更具体地涉及具有正丙醇和异丙醇，1,4-丁二醇和异丙醇，1,3-丁二醇和异丙醇，或者甲基丙烯酸和异丙醇生物合成能力的生物。
异丙醇(IPA)是一种无色的易燃液体，与大多数溶剂混合完全，包括水。IPA的最大用途是作为溶剂，包括众所周知的但用量很小的“外用酒精”，这是一种IPA和水的混合物。作为溶剂，IPA见于许多日常产品中，例如涂料，油漆，稀释剂，油墨，粘合剂，通用清洁剂，消毒剂，化妆品，盥洗用品，除冰剂和药品。低级IPA也用于发动机油中。第二个最大作用是作为异丙胺，异丙醚和异丙酯生产的化工中间体。异丙醇可被脱水形成丙烯，丙烯是一种具有超过200万吨的年度市场的聚合物前体。
目前异丙醇（IPA）的全球产生能力大约60亿磅/年，大约74%的全球IPA产量集中在美国，欧洲和日本。异丙醇由两种石化路线生产。主要过程需要在有或没有硫酸催化下使丙烯水合。其次，IPA由丙酮氢化生产，这是在苯酚和环氧丙烷生产中形成的副产品。高价的丙烯目前在整个化学产业中正推动成本上升和利润下降，因而正需要扩大低成本原料的范围。
正丙醇可能用作汽油代用品。目前在制药工业中用作多能溶剂，用于表面涂层和墨水配方中。它用作树脂和酯，丙胺和卤丙烷的结构单元。它也用于包装和接触食物的用途。2005年正丙醇的全球产量超过140，000吨。
正丙醇由丙醛的催化氢化生产。
丙醛本身通过氧化法生产，通过在催化剂例如八羰基钴或者铑配合物存在下用一氧化碳和氢使乙烯醛化。在很多发酵过程中它以少量自然形成。例如，产生非常小量的正丙醇的微生物已经从通过苏氨酸分解代谢的梭菌属（Clostridium）的某些种和啤酒发酵中的酵母中检测到。还不存在已经报道的大量由糖产生1-丙醇的微生物。
1,4-丁二醇（1,4-BDO）是一种聚合物中间体和工业溶剂，具有大约30亿磅/年的全球市场。BDO目前由石化前体（主要是乙炔，苹果酸酐和环氧丙烷）生产。例如，在Reppe合成反应中乙炔与2分子甲醛反应（Kroschwitz and Grant，Encyclopedia of Chem.Tech.，John Wiley and Sons，Inc.，New York(1999)），随后经催化氢化形成1,4-丁二醇。在下游，1,4-BDO可以被进一步转化；例如，通过氧化形成γ-丁内酯，其可更进一步转化为吡咯烷酮和N-甲基吡咯烷酮或者氢解成四氢呋喃。这些化合物具有各种用途，作为聚合物中间体，溶剂和添加剂，并且具有近20亿磅/年总的市场。1,3-丁二醇（1,3-BDO）是一个四碳二元醇，通常用作食品调味剂的有机溶剂。也用作聚氨酯和聚酯树脂的共聚单体，并且广泛用作降血糖药。
光学活性1,3-BDO是合成生物活性化合物和液晶的一种有用的起始原料。1,3-丁二醇的大量商业用途是随后脱水提供1,3-丁二烯（Ichikawa，J.Mol.Catalysis.256:106-112(2006)），250亿磅/年石油化工业用来生产合成橡胶（例如，轮胎），胶乳和树脂。1,3-BDO传统上由乙炔通过其水合生产。得到的乙醛然后转化成3-羟基丁醛，其随后被还原形成1,3-BDO。特别近几年，作为乙醛的来源乙炔已经被乙烯代替。
甲基丙烯酸（MAA）是甲基丙烯甲酯（MMA）的一个关键前体，甲基丙烯甲酯是一种全球需求超过每年45亿磅的化工中间体，其大部分转化为聚丙烯酸酯。合成甲基丙烯甲酯（即，丙酮氰醇路线）的惯用方法包括将丙酮和氰化氢（HCN）转化成丙酮氰醇，其然后经酸催化水解和用甲醇酯化产生MAA。可能致命的HCN运输困难与副产品处置的高昂费用（每吨MAA形成2吨硫酸氢铵）一起已经引起了大量针对更清洁和更经济的方法的研究。作为一种起始原料，MAA可容易通过甲醇酯化转化为MAA。还没有报道由糖大量生产MAA的微生物。
本发明描述了有效地协同产生商业量的正丙醇和异丙醇，1,4-BDO和异丙醇，1,3-BDO和异丙醇或者MAA和异丙醇的微生物有机体和方法，并且其包括相关的优势。
发明概述
本发明提供具有正丙醇途径和异丙醇途径的非天然存在的微生物有机体。一方面，本发明公开的实施方式涉及一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有正丙醇和异丙醇途径的微生物有机体，其中正丙醇途径包括至少一种编码一种正丙醇途径酶并以足以产生正丙醇的量表达的外源性核酸，并且其中异丙醇途径包括至少一种编码一种异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的外源性核酸。一方面，该正丙醇途径包括丙醛脱氢酶，丙醇脱氢酶，丙酰-CoA:磷酸丙酰基转移酶，丙酰-CoA水解酶，丙酰-CoA转移酶，丙酰-CoA合成酶，丙酸激酶，丙酸还原酶或者丙酰磷酸还原酶，和该异丙醇途径包括乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶，乙酰乙酰-CoA水解酶，乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶或者异丙醇脱氢酶。
在另一个实施方式中，本发明提供一种非天然存在的微生物有机体，包括具有正丙醇和异丙醇途径的微生物有机体，其中该正丙醇途径包括编码正丙醇途径酶并以足以产生正丙醇的量表达的第一组外源性核酸，并且所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸。一方面，该第一组编码正丙醇途径酶包括丙醛脱氢酶和丙醇脱氢酶；或者丙酰-CoA:磷酸丙酰基转移酶，丙酰磷酸还原酶和丙醇脱氢酶；或者丙酰-CoA水解酶或者丙酰-CoA转移酶或者丙酰-CoA合成酶，丙酸激酶，丙酰磷酸还原酶和丙醇脱氢酶；或者丙酰-CoA水解酶或者丙酰-CoA转移酶或者丙酰-CoA合成酶，丙酸还原酶和丙醇脱氢酶。另一方面，第二组编码异丙醇途径酶包括乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶，乙酰乙酰-CoA水解酶，乙酰乙酰-CoA合成酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
另一方面，本发明提供一种非天然存在的微生物有机体，其具有编码正丙醇途径酶的第一组外源性核酸和编码异丙醇途径酶的第二组外源性核酸，其中第一组编码PEP羧激酶或者PEP羧化酶，苹果酸脱氢酶，延胡索酸酶，延胡索酸还原酶，琥珀酰-CoA转移酶或者琥珀酰-CoA合成酶，甲基丙二酰-CoA变位酶，甲基丙二酰-CoA脱羧酶，以及丙醛脱氢酶和丙醇脱氢酶；或者丙酰-CoA:磷酸丙酰基转移酶和丙酰磷酸还原酶；或者丙酰-CoA水解酶或者丙酰-CoA转移酶或者丙酰-CoA合成酶，丙酸激酶，丙酰磷酸还原酶和丙醇脱氢酶；或者丙酰-CoA水解酶或者丙酰-CoA转移酶或者丙酰-CoA合成酶，丙酸还原酶和丙醇脱氢酶；和第二组编码丙酮酸激酶，丙酮酸脱氢酶或者丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶；或者丙酮酸甲酸裂解酶，丙酮酸甲酸裂解酶激活酶和甲酸脱氢酶，乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
另一方面，本发明提供一种非天然存在的微生物有机体，其具有编码正丙醇途径酶的第一组外源性核酸和编码异丙醇途径酶的第二组外源性核酸，其中第一组编码PEP羧激酶或者PEP羧化酶，苏氨酸脱氨酶，以及2-氧代丁酸脱羧酶和丙醇脱氢酶；或者2-氧代丁酸脱氢酶，丙醛脱氢酶和丙醇脱氢酶；或者2-氧代丁酸脱氢酶，丙酰-CoA:磷酸丙酰基转移酶，丙酰磷酸还原酶和丙醇脱氢酶；或者2-氧代丁酸脱氢酶，丙酰-CoA水解酶或者丙酰-CoA转移酶或者丙酰-CoA合成酶，丙酸激酶，丙酰磷酸还原酶和丙醇脱氢酶；或者2-氧代丁酸脱氢酶，丙酰-CoA水解酶或者丙酰-CoA转移酶或者丙酰-CoA合成酶，丙酸还原酶和丙醇脱氢酶；和第二组编码丙酮酸激酶，丙酮酸脱氢酶或者丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶；或者丙酮酸甲酸裂解酶，丙酮酸甲酸裂解酶激活酶和甲酸脱氢酶，乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
另一方面，本发明提供一种非天然存在的微生物有机体，其具有编码正丙醇途径酶的第一组外源性核酸和编码异丙醇途径酶的第二组外源性核酸，该第一组编码丙酮酸激酶，丙酮酸脱氢酶或者丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶；或者丙酮酸甲酸裂解酶，丙酮酸甲酸裂解酶激活酶和甲酸脱氢酶，乙酰-CoA羧化酶，丙二酰-CoA还原酶，丙二酸半醛还原酶，丙酰-CoA合成酶，以及丙醛脱氢酶和丙醇脱氢酶；或者丙酰-CoA:磷酸丙酰基转移酶，丙酰磷酸还原酶和丙醇脱氢酶；或者丙酰-CoA水解酶或者丙酰-CoA转移酶或者丙酰-CoA合成酶，丙酸激酶，丙酰磷酸还原酶和丙醇脱氢酶；或者丙酰-CoA水解酶或者丙酰-CoA转移酶或者丙酰-CoA合成酶，丙酸还原酶和丙醇脱氢酶；和第二组编码乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
另一方面，本发明提供一种非天然存在的微生物有机体，其具有编码正丙醇途径酶的第一组外源性核酸和编码异丙醇途径酶的第二组外源性核酸，其中第一组编码乳酸脱氢酶，乳酰-CoA转移酶，乳酰-CoA脱水酶，丙烯酰-CoA还原酶，以及丙醛脱氢酶和丙醇脱氢酶；或者丙酰-CoA:磷酸丙酰基转移酶，丙酰磷酸还原酶和丙醇脱氢酶；或者丙酰-CoA水解酶或者丙酰-CoA转移酶或者丙酰-CoA合成酶，丙酸激酶，丙酰磷酸还原酶和丙醇脱氢酶；或者丙酰-CoA水解酶或者丙酰-CoA转移酶或者丙酰-CoA合成酶，丙酸还原酶和丙醇脱氢酶；和第二组编码丙酮酸脱氢酶或者丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶；或者丙酮酸甲酸裂解酶，丙酮酸甲酸裂解酶激活酶和甲酸脱氢酶，乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
在另一个实施方式中，本发明提供一种具有正丙醇途径的非天然存在的微生物有机体，该正丙醇途径包括至少一种编码一种正丙醇途径酶并以足以产生正丙醇的量表达的外源性核酸。一方面该正丙醇途径包括丙醛脱氢酶，丙醇脱氢酶，丙酰-CoA:磷酸丙酰基转移酶，丙酰-CoA水解酶，丙酰-CoA转移酶，丙酰-CoA合成酶，丙酸激酶，丙酸还原酶或者丙酰磷酸还原酶。
在另一个实施方式中，本发明提供一种具有正丙醇途径的非天然存在的微生物有机体，该正丙醇途径包括编码正丙醇途径酶并以足以产生正丙醇的量表达的一组外源性核酸，该组外源性核酸编码丙醛脱氢酶和丙醇脱氢酶；或者丙酰-CoA:磷酸丙酰基转移酶，丙酰磷酸还原酶和丙醇脱氢酶；或者丙酰-CoA水解酶或者丙酰-CoA转移酶或者丙酰-CoA合成酶，丙酸激酶，丙酰磷酸还原酶和丙醇脱氢酶；或者丙酰-CoA水解酶或者丙酰-CoA转移酶或者丙酰-CoA合成酶，丙酸还原酶和丙醇脱氢酶。
在其它方面，本发明公开的实施方式涉及一种生产正丙醇和异丙醇的方法，其包括培养前述的非天然存在的微生物有机体。在其它方面，本发明公开的实施方式涉及一种生产正丙醇的方法，其包括培养前述的非天然存在的微生物有机体。
在一个实施方式中，本发明提供具有异丙醇途径和1,4-丁二醇（1,4-BDO）途径，1,3-丁二醇（1,3-BDO）途径或者甲基丙烯酸（MAA）途径的非天然存在的微生物有机体。一方面，本发明公开的实施方式涉及一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有1,4-丁二醇和异丙醇途径的微生物有机体，其中该1,4-丁二醇途径包括至少一种编码一种1,4-丁二醇途径酶并以足以产生1,4-丁二醇的量表达的外源性核酸，并且，其中该异丙醇途径包括至少一种编码一种异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的外源性核酸。一方面，本发明公开的实施方式涉及一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有1,3-丁二醇和异丙醇途径的微生物有机体，其中该1,3-丁二醇途径包括至少一种编码一种1,3-丁二醇途径酶并以足以产生1,3-丁二醇的量表达的外源性核酸，并且，其中该异丙醇途径包括至少一种编码一种异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的外源性核酸。一方面，本发明公开的实施方式涉及一种非天然存在的微生物有机体，包括具有甲基丙烯酸和异丙醇途径的微生物有机体，其中该甲基丙烯酸途径包括至少一种编码一种甲基丙烯酸途径酶并以足以产生甲基丙烯酸的量表达的外源性核酸，并且，其中该异丙醇途径包括至少一种编码一种异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的外源性核酸。
在一个实施方式中，该异丙醇途径包括乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶，乙酰乙酰-CoA水解酶，乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶或者异丙醇脱氢酶。
在一个实施方式中，1,4-BDO途径包括琥珀酰-CoA还原酶，琥珀酸还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酰-CoA转移酶，4-羟基丁酰-CoA合成酶，4-羟基丁酰-CoA还原酶（形成醛)，4-羟基丁醛还原酶，4-羟基丁酸还原酶，4-羟基丁酸激酶，磷酸转-4-羟基丁酸化酶，4-羟基丁酰基-磷酸还原酶，或者4-羟基丁酰-CoA还原酶（形成醇）。
在一个实施方式中，该1,3-BDO途径包括琥珀酰-CoA还原酶，琥珀酸还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酰-CoA转移酶，4-羟基丁酰-CoA合成酶，4-羟基丁酸激酶，磷酸转-4-羟基丁酸化酶，4-羟基丁酰-CoA脱水酶，巴豆酸酶，3-羟基丁酰-CoA还原酶（形成醛)，3-羟基丁醛还原酶，3-羟基丁酰-CoA还原酶（形成醇），3-羟基丁酰-CoA转移酶，3-羟基丁酰-CoA合成酶，3-羟基丁酰-CoA水解酶或者3-羟基丁酸还原酶。
在一个实施方式中，MAA途径包括琥珀酰-CoA还原酶，琥珀酸还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酰-CoA转移酶，4-羟基丁酰-CoA合成酶，4-羟基丁酸激酶，磷酸转-4-羟基丁酸化酶，4-羟基丁酰-CoA变位酶，3-羟基异丁酰-CoA脱水酶，甲基丙烯酰-CoA转移酶，甲基丙烯酰-CoA合成酶，甲基丙烯酰-CoA水解酶，3-羟基异丁酰-CoA转移酶，3-羟基异丁酰-CoA合成酶，3-羟基异丁酰-CoA水解酶，3-羟基异丁酸脱水酶，甲基丙二酰-CoA变位酶，甲基丙二酰-CoA转移酶，甲基丙二酰-CoA合成酶，甲基丙二酰-CoA水解酶，甲基丙二酸还原酶，甲基丙二酰-CoA还原酶（形成醛)，3-羟基异丁酸脱氢酶，甲基丙二酰-CoA还原酶（形成醇）或者3-羟基异丁酸脱水酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有1,4-BDO和异丙醇途径的微生物有机体，该1,4-BDO途径包括编码1,4-BDO途径酶并以足以产生1,4-BDO的量表达的第一组外源性核酸，并且其中所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸。
在一个实施方式中，本发明提供一种非天然存在的微生物有机体，其包括含有1,3-BDO和异丙醇途径的微生物有机体，该1,3-BDO途径包括编码1,3-BDO途径酶并以足以产生1,3-BDO的量表达的第一组外源性核酸，并且，其中所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸。
在一个实施方式中，本发明提供一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有甲基丙烯酸和异丙醇途径的微生物有机体，该甲基丙烯酸途径包括编码甲基丙烯酸途径酶并以足以产生甲基丙烯酸的量表达的第一组外源性核酸，并且，其中所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸。
可以理解，如果下游酶即脱水酶缺失，通过3-羟基异丁酸中间体的甲基丙烯酸途径可以应用于3-羟基异丁酸生产而不是甲基丙烯酸（参见附图7和8）。在这种情况下，非天然存在的有机体可产生3-羟基异丁酸而不是甲基丙烯酸。非天然存在的有机体或者可生产3-羟基异丁酸和甲基丙烯酸的混合物。不管是产生甲基丙烯酸还是3-羟基异丁酸，ATP和产品的最大摩尔收率是不变的。
还可以理解，如果需要，通过本发明的微生物有机体表达的3-羟基异丁酸可以化学转化成甲基丙烯酸。例如，3-羟基异丁酸或者β-羟基异丁酸可以脱水形成甲基丙烯酸，如例如美国专利No.7,186,856所述。
在其它方面，本发明公开的实施方式涉及生产1,4-BDO和异丙醇，1,3-BDO和异丙醇，或者MAA和异丙醇的方法，其包括培养前述的非天然存在的微生物有机体。
附图的简要说明
图1显示由葡萄糖协同产生正丙醇和异丙醇的一种示例性途径。缩写:Glc-葡萄糖，PEP-磷酸烯醇式丙酮酸，PYR-丙酮酸，FOR-甲酸，ACCOA-乙酰-CoA，AACOA-乙酰乙酰-CoA，ACAC-乙酰乙酸，AC-丙酮，PPOH-2-异丙醇，OAA-草酰乙酸，MAL-苹果酸，FUM-延胡索酸，SUCC-琥珀酸，SUCCOA-琥珀酰-CoA，MMCOA-甲基丙二酰-CoA，PPCOA-丙酰-CoA，PPA-丙酸，PPAL-丙醛，PPPi-丙酰磷酸，PPOH-1-正丙醇。
图2显示由葡萄糖协同产生正丙醇和异丙醇的一种示例性途径。缩写:Glc-葡萄糖，PEP-磷酸烯醇式丙酮酸，PYR-丙酮酸，FOR-甲酸，ACCOA-乙酰-CoA，AACOA-乙酰乙酰-CoA，ACAC-乙酰乙酸，AC-丙酮，PPOH-2-异丙醇，OAA-草酰乙酸，THR-苏氨酸，2-OBUT-2-氧代丁酸，PPCOA-丙酰-CoA，PPA-丙酸，PPAL-丙醛，PPPi-丙酰磷酸，PPOH-1-正丙醇。
图3显示由葡萄糖协同产生正丙醇和异丙醇的一种示例性途径。缩写:Glc-葡萄糖，PEP-磷酸烯醇式丙酮酸，PYR-丙酮酸，FOR-甲酸，ACCOA-乙酰-CoA，AACOA-乙酰乙酰-CoA，ACAC-乙酰乙酸，AC-丙酮，PPOH-2-异丙醇，MALCOA-丙二酰-CoA，MALAL-丙二酸半醛，3HP-3-羟基丙酸，PPCOA-丙酰-CoA，PPA-丙酸，PPAL-丙醛，PPPi-丙酰磷酸，PPOH-1-正丙醇。
图4显示由葡萄糖协同产生正丙醇和异丙醇的一种示例性途径。缩写:Glc-葡萄糖，PEP-磷酸烯醇式丙酮酸，PYR-丙酮酸，FOR-甲酸，ACCOA-乙酰-CoA，AACOA-乙酰乙酰-CoA，ACAC-乙酰乙酸，AC-丙酮，PPOH-2-异丙醇，LAC-D-乳酸，LACCOA-乳酰-CoA，ACRYLCOA-丙烯酰-CoA，PPCOA-丙酰-CoA，PPA-丙酸，PPAL-丙醛，PPPi-丙酰磷酸，PPOH-1-正丙醇。
图5显示由葡萄糖协同产生1,4-BDO和异丙醇的一种示例性途径。缩写:Glc-葡萄糖，PEP-磷酸烯醇式丙酮酸，PYR-丙酮酸，FOR-甲酸，ACCOA-乙酰-CoA，AACOA-乙酰乙酰-CoA，ACAC-乙酰乙酸，AC-丙酮，PPOH-2-异丙醇，OAA-草酰乙酸，MAL-苹果酸，FUM-延胡索酸，SUCC-琥珀酸，SUCCOA-琥珀酰-CoA，SUCSAL-琥珀酸半醛，4-HB-4-羟基丁酸，4-HBCOA-4-羟基丁酰-CoA，4-HBALD-4-羟基丁醛，1,4-BDO-1,4-丁二醇，4-HBP-4-羟基丁酰磷酸。
图6显示由葡萄糖协同产生1,3-BDO和异丙醇的一种示例性途径。缩写:Glc-葡萄糖，PEP-磷酸烯醇式丙酮酸，PYR-丙酮酸，FOR-甲酸，ACCOA-乙酰-CoA，AACOA-乙酰乙酰-CoA，ACAC-乙酰乙酸，AC-丙酮，PPOH-2-异丙醇，OAA-草酰乙酸，MAL-苹果酸，FUM-延胡索酸，SUCC-琥珀酸，SUCCOA-琥珀酰-CoA，SUCSAL-琥珀的半醛，3-HB-3-羟基丁酸，4-HB-4-羟基丁酸，4-HBCOA-4-羟基丁酰-CoA，CRTCOA-巴豆酰-CoA，3-HBCOA-3-羟基丁酰-CoA，3-HBALD-3-羟基丁醛，1,3-BDO-1,3-丁二醇。
图7显示由葡萄糖协同产生甲基丙烯酸和异丙醇的一种示例性途径。缩写:Glc-葡萄糖，PEP-磷酸烯醇式丙酮酸，PYR-丙酮酸，FOR-甲酸，ACCOA-乙酰-CoA，AACOA-乙酰乙酰-CoA，ACAC-乙酰乙酸，AC-丙酮，PPOH-2-异丙醇，OAA-草酰乙酸，MACOA-甲基丙烯酰-CoA，MAL-苹果酸，FUM-延胡索酸，SUCC-琥珀酸，SUCCOA-琥珀酰-CoA，SUCSAL-琥珀酸半醛，4-HB-4-羟基丁酸，4-HBCOA-4-羟基丁酰-CoA，3-HIBCOA-3-羟基异丁酰-CoA，3-HIB-3-羟基异丁酸，MAA-甲基丙烯酸。
图8显示由葡萄糖协同产生甲基丙烯酸和异丙醇的一种示例性途径。缩写:Glc-葡萄糖，PEP-磷酸烯醇式丙酮酸，PYR-丙酮酸，FOR-甲酸，ACCOA-乙酰-CoA，AACOA-乙酰乙酰-CoA，ACAC-乙酰乙酸，AC-丙酮，PPOH-2-异丙醇，OAA-草酰乙酸，MAL-苹果酸，FUM-延胡索酸，SUCC-琥珀酸，SUCCOA-琥珀酰-CoA，MM-甲基丙二酸酯，MMCOA-甲基丙二酰-CoA，MMSA-甲基丙二酸半醛，3-HIB-3-羟基异丁酸，MAA-甲基丙二酸。
本发明的详细说明
本发明的实施方式提供具有氧化还原平衡的厌氧途径的非天然存在的微生物有机体，如附图1-4所示，用于从3分子磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）协同产生正丙醇和异丙醇。此协同产生策略的一些优点包括：（1）该协同产生能提供正丙醇和异丙醇的最高理论产量为总共1.33摩尔/摩尔葡萄糖；和（2）该协同产生途径完全氧化还原平衡，并且具有净的ATP正产量。这有利于完全厌氧生产C3醇，而不需要单独培养具有异丙醇途径的微生物有机体，其需要通气来进行NAD再生。
本发明的实施方式还提供能从可再生资源协同产生正丙醇和异丙醇的非天然存在的微生物有机体，如附图1-4中所示。具体地，该有机体包括在由乙酰-CoA和丙酰-CoA协同产生正丙醇和异丙醇中利用的所有酶。甲酸可以被甲酸脱氢酶转化成二氧化碳，其提供一个附加的可以用于正丙醇和异丙醇合成的还原当量。另外，还原当量可以从该途径中的其它步骤获得，例如，在葡萄糖转化为磷酸烯醇式丙酮酸期间的糖酵解途径，丙酮酸转化为乙酰-CoA期间的丙酮酸脱氢酶或者丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶，或者2-氧代丁酸转化为丙酰-CoA期间的2-氧代丁酸脱氢酶。
本发明的实施方式还提供能通过丙酰-CoA生产正丙醇的非天然存在的微生物有机体。这种转化通过两种不同的酶进行：醛和醇脱氢酶，或者通过双官能醛/醇脱氢酶在一个步骤中进行。或者，丙酰-CoA可以转化为丙酰磷酸，然后通过酰磷酸还原酶转化为丙醛。或者，丙酰-CoA可以分别通过丙酰-CoA水解酶，转移酶或者合成酶和丙酸激酶（propionate dinase）转化成丙酸然后转化成丙酸磷酸。或者，丙酸可以通过丙酸还原酶转化成丙醛。生产丙酰-CoA的途径例举在附图1-4中。在一个实施方式中，生产丙酰-CoA的这种途径通过草酰乙酸进行，如附图1所述。草酰乙酸通过还原性TCA循环的方式，甲基变位酶，脱羧酶和脱羧酶转化为丙酰-CoA。可能需要差向异构酶将甲基丙二酰-CoA的(R)立体异构体转变为(S)构型。在另一个实施方式中，这种生产丙酰-CoA的途径通过苏氨酸进行，如附图2所述。草酰乙酸通过设计成高收率的天然苏氨酸途径转化为苏氨酸，其然后脱氨基形成2-氧代丁酸，接着转化为丙酰-CoA。在一种替代方式中，2-氧代丁酸被脱羧酶转化成丙醛，其然后被丙醇脱氢酶还原为正丙醇。在又一实施方式中，生产丙酰-CoA的途径通过丙二酰-CoA进行，如附图3所述。乙酰-CoA羧化形成丙二酰-CoA。其然后被还原为丙二酸半醛，并且随后转化为3-羟基丙酸（3HP）。3HP通过丙酰-CoA合成酶转化为丙酰-CoA。在又一实施方式中，生产丙酰-CoA的途径通过乳酸进行，如附图4所述。丙酮酸被还原形成乳酸然后被活化形成乳酰-CoA。乳酰-CoA脱水形成丙烯酰-CoA，并且然后还原产生丙酰-CoA。
本发明的实施方式还提供非天然存在的微生物有机体，其能通过乙酰-CoA生产异丙醇。异丙醇的生产通过乙酰乙酰-CoA硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶（一种乙酰乙酸脱羧酶），和异丙醇脱氢酶转化乙酰-CoA获得，如附图1-4所述。在一个实施方式中，由葡萄糖生产乙酰-CoA的途径通过磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）进行。葡萄糖通过微生物有机体的天然糖酵途径被转化为PEP。PEP通过丙酮酸激酶转化成丙酮酸，然后通过丙酮酸脱氢酶或者丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶转化为乙酰-CoA。或者，丙酮酸被丙酮酸甲酸裂解酶转化成乙酰-CoA和甲酸。甲酸然后被甲酸脱氢酶转化为二氧化碳和氢。
本发明的实施方式提供异丙醇与化合物1,4-BDO，1,3-BDO和MAA协同产生的替代方法。异丙醇的生产通过如上所述的乙酰-CoA进行。该路线单独不是氧化还原平衡的，因此需要通气来获得高的异丙醇收率。本发明所述的实施方式采用这条路线并且将其与合成协同产物1,4-丁二醇（1,4-BDO），1,3-丁二醇（1,3-BDO）和甲基丙烯酸（MAA）的途径结合起来。协同产生路线在厌氧条件下是氧化还原平衡的，与之相反，如果异丙醇单独通过丙酮生产需要氧气。协同产生也提供有关的优点，例如，由于其相对于1,4-BDO（230℃），1,3-BDO（203℃）和MAA（163℃）较低的沸点（82℃），异丙醇易于从其它发酵产品分离，并且使用本发明所述的任何微生物有机体，协同产生提供从所加载的葡萄糖的最高理论碳收率。
本发明的实施方式提供能通过琥珀酰-CoA或者某在些方面通过琥珀酸生产1,4-BDO的非天然存在的微生物有机体。为了生产1,4-BDO，琥珀酰-CoA被琥珀酰-CoA还原酶转化成琥珀酸半醛。或者，琥珀酸可被琥珀酸还原酶转化成琥珀酸半醛。下一步，琥珀酸半醛被4-羟基丁酸脱氢酶还原为4-羟基丁酸。将4-HB活化为它的酰基-CoA由CoA转移酶或者合成酶催化。或者，通过磷酸转-4-羟基丁酸化酶4-HB可以转化为4-羟基丁酰磷酸并且随后转化成4-HB-CoA。4-HB-CoA然后通过双功能CoA-依赖的醛/醇脱氢酶，或者通过具有醛和醇脱氢酶活性的两种独立酶转化成1,4-BDO。4-HBCoA中间体旁路的另一种替代路线是通过羧酸还原酶将4-HB直接还原为4-羟基丁醛。4-羟基丁醛随后被醇脱氢酶还原为1,4-BDO。4-HB-CoA旁路的又一路线包括通过磷酸还原酶将4-羟基丁酰磷酸还原为4-羟基丁醛。
本发明的实施方式提供能通过琥珀酰-CoA或者在某些方面通过琥珀酸生产1,3-BDO的非天然存在的微生物有机体。1,3-BDO的生产也通过4-羟基丁酰-CoA进行，按如上所述的路线形成。在此路线中，4-羟基丁酰-CoA经脱水和异构化形成巴豆酰-CoA。脱水和乙烯基异构化反应由双功能酶4-羟基丁酰基-CoA脱水酶催化。然后巴豆酰-CoA水合成3-羟基丁酰-CoA。去除CoA部分和同时还原得到3-羟基丁醛。或者，3-羟基丁酰-CoA被3-羟基丁酰-CoA转移酶，水解酶或合成酶转化成3-羟基丁酸，然后被3-羟基丁酸还原酶还原得到3-羟基丁醛。最后通过3-羟基丁醛还原酶还原该醛得到1,3-BDO。
本发明的实施方式提供能通过两条可替代途径生产MAA的非天然存在的微生物有机体。第一条路线通过4-羟基丁酰-CoA进行，按如上所述的路线形成。4-羟基丁酰-CoA通过甲基变位酶转化为3-羟基异丁酰基-CoA。然后3-羟基异丁酰-CoA通过CoA转移酶，水解酶或者合成酶去除CoA部分。最后，3-羟基基团经脱水获得MAA。或者，3-羟基异丁酰-CoA通过3-羟基异丁酰-CoA脱水酶转化为甲基丙烯酰-CoA，然后CoA部分通过CoA转移酶，水解酶或者合成酶去除获得MAA。在可替代的MAA生产路线中，琥珀酰-CoA通过甲基丙二酰-CoA变位酶转化为甲基丙二酰-CoA。将甲基丙二酰-CoA的(R)立体异构体转化为(S)构型可能需要差向异构酶。CoA-依赖的醛脱氢酶然后将甲基丙二酰-CoA转化为甲基丙二酸半醛。或者，(R)-甲基丙二酰的CoA或(S)-甲基丙二酰-CoA的CoA部分被CoA转移酶，水解酶或者合成酶去除以形成甲基丙二酸，然后其被还原酶转化成半醛。将醛还原成3-羟基异丁酸，随后脱水，得到MAA。可替换地，甲基丙二酰-CoA被形成醇的CoA还原酶转化成3-羟基异丁酸。
本发明的实施方式提供具有生产琥珀酰CoA途径的非天然存在的微生物有机体，如附图5-8所述。在一个实施方式中，生产琥珀酰CoA的途径通过草酰乙酸进行。草酰乙酸通过还原性TCA循环转化为琥珀酰-CoA，包括苹果酸脱氢酶，延胡索酸酶（fumerase），延胡索酸还原酶（reducatase）和琥珀酰-CoA转移酶或者琥珀酰-CoA合成酶。
将这些途径改造进微生物包括克隆适当的编码一组酶的一组基因进入本发明所述的生产宿主，优化发酵条件，以及发酵之后分析产品的形成。为了改造适合生产正丙醇和异丙醇，1,4-BDO和异丙醇，1,3-BDO和异丙醇或者MAA和异丙醇的生产宿主，可在微生物中表达一种或多种外源性DNA序列。另外，该微生物可能具有功能破坏，缺失，或者过表达的内源性基因。本发明公开的代谢修饰使得采用可再生原料生产正丙醇和异丙醇，1,4-BDO和异丙醇，1,3-BDO和异丙醇或者MAA和异丙醇成为可能。
在某些实施方式中，本发明提供包括至少一种外源性核酸的非天然存在的微生物有机体，该外源性核酸编码正丙醇途径酶并以足以产生正丙醇的量表达。
在另一个实施方式中，本发明提供包括至少一种外源性核酸的非天然存在的微生物有机体，该外源性核酸编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达。在其它实施方式中，本发明提供协同产生正丙醇和异丙醇，1,4-BDO和异丙醇，1,3-BDO和异丙醇或者MAA和异丙醇的方法。该方法包括培养本发明所述的微生物有机体。
如本发明中所使用的，术语“非天然存在的”当用于提及本发明的微生物有机体或者微生物时意指该微生物有机体具有在天然存在的所提及物种（包括所提及物种的野生型菌株）中通常未发现的至少一种基因变异。基因变异包括，例如引入可表达的编码代谢多肽的核酸的修饰，其它核酸添加，核酸缺失和/或微生物遗传物质的其它功能性破坏。所述修饰包括，例如所提及物种的异源，同源或异源与同源多肽的编码区和其功能片段。其它修饰包括例如非编码调控区，其中修饰会改变基因或操纵子的表达。示例性代谢多肽包括正丙醇，异丙醇，1,4-BDO，1,3-BDO和/或MAA生物合成途径内的酶或者蛋白质。
代谢修饰是指从天然存在的状态发生改变的生化反应。因此，非天然存在的微生物可具有对编码代谢多肽的核酸或其功能片段的基因修饰。本发明公开了示例性代谢修饰。
当用于提及微生物有机体时，如本发明所用的术语“经分离的”意指有机体基本上不含在自然界中发现所提及的微生物有机体时所伴随的至少一种组分。该术语包括移除自然环境中所伴随的部分或所有组分的微生物有机体。该术语还包括移除非天然存在的环境中伴随微生物有机体的部分或所有组分的微生物有机体。因此，经分离的微生物有机体与在自然界中发现时或在非天然存在的环境中生长，储存或生存时与其它物质部分或完全分离。经分离的微生物有机体的具体例子包括部分纯的微生物，基本上纯的微生物和在非天然存在的培养基中培养的微生物。
如本发明所用的术语“微生物的”，“微生物有机体”或“微生物”意指以古菌领域，细菌领域或真核领域内所包括的显微细胞形式存在的任何有机体。因此，该术语意图涵盖具有显微尺寸的原核或真核细胞或有机体，且包括所有种类的细菌，古细菌和真细菌，以及真核微生物，例如酵母和真菌。该术语还包括可经培养以用于产生生化物质的任何种类的细胞培养物。
如本发明所用的，“正丙醇”意指具有分子式C3H8O和分子量60.1g/mol的伯醇。正丙醇在本领域也称为1-丙醇，1-丙基醇，正丙醇，丙-1-醇或者简单称为丙醇。正丙醇是异丙醇的一种异构体。
如本发明所用的，“异丙醇”意指具有分子式C3H8O和分子量60.1g/mol的仲醇，其中醇碳原子与其它两个碳原子相连。这种连接有时可表示为(CH3)2CHOH所示。异丙醇在本领域也称为丙-2-醇，2-丙醇或者缩写为IPA。异丙醇是正丙醇的一种异构体。
如本发明所使用的术语“1,4-丁二醇”意指丁烷的醇衍生物，带有两个羟基，其具有化学式C4H10O2和分子量90.12g/mol。化合物1,4-丁二醇在本领域也称为1,4-BDO，并且是通常称为BDO化合物族的化合物族的化学中间体或前体。
如本发明所使用的术语“1,3-丁二醇”意指具有化学式C4H10O2和分子量90.12g/mol的丁二醇的四种稳定异构体之一。化合物1,3-丁二醇在本领域也称为1,3-BDO或者β-丁二醇，并且也是通常称为BDO化合物族的化合物族的化学中间体或前体。
如本发明所使用的“甲基丙烯酸”具有化学式CH2=C(CH3)CO2（也称为甲基丙烯酸和IUPAC名为2-甲基-2-丙酸），是甲基丙烯酸的酸形式，并且可以理解甲基丙烯酸（methylacrylic acid）和甲基丙烯酸（methylacrylate）可以完全互换使用来指代该化合物的任何中性或者离子形式，包括其任何盐形式。熟练技术人员可以理解，具体形式取决于pH值。与此类似，3-羟基异丁酸（3-hydroxyisobutyrate）和3-羟基异丁酸（3-hydroxyisobutyric acid）可以完全互换使用来指代该化合物的任何中性或者离子形式，包括其任何盐形式。
如本发明所用的术语“CoA”或“辅酶A”意指有机辅因子或辅基（酶的非蛋白部分），它的存在对于许多酶（脱辅酶）形成活性酶系统的活性是必需的。辅酶A在某些缩合酶中发挥功能，在乙酰基或其它酰基转移中，以及在脂肪酸合成和氧化，丙酮酸酯氧化和其它乙酰化中发挥作用。
当用于提及培养或生长条件时，如本发明所用的术语“基本上厌氧的”意指液体培养基中的含氧量小于溶解氧饱和含量的约10％。该术语还意图包括维持在小于约1％氧气的气氛下的液体或固体培养基的密封室。
如本发明所用的“外源性”意指所提及的分子或所提及的活性被引入到宿主微生物有机体中。分子可例如通过将编码核酸引入到宿主遗传物质中而引入，例如通过整合到宿主染色体中，或者作为非染色体遗传物质（例如质粒）。因此，在用于提及编码核酸的表达时，该术语是指将编码核酸以可表达形式引入到微生物有机体中。当用于提及生物合成活性时，该术语是指被引入到宿主参考有机体中的活性。来源可为例如同源或异源编码核酸，其在引入到宿主微生物有机体中之后表达所提及的活性。因此，术语“内源性”是指存在于宿主中的所提及的分子或活性。类似地，当用于提及编码核酸的表达时该术语是指表达包含在微生物有机体内的编码核酸。术语“异源”是指分子或活性来源于除所提及的物种以外的原料，而“同源”是指分子或活性来源于所述宿主微生物有机体。因此，本发明的编码核酸的外源性表达可利用异源或者同源编码核酸，或者这两者。
本发明的非天然存在的微生物有机体可包含稳定的基因变异，这是指微生物在培养超过5代后仍不会损失所述变异。一般来说，稳定的基因变异包括持续超过10代的修饰，具体地，稳定的修饰将持续超过约25代，更具体地，稳定的基因修饰将持续超过50代，包括无限持续下去。
本领域技术人员将理解，基因变异（包括本发明示例的代谢修饰）描述成关于合适的宿主有机体（例如E.coli）和其对应的代谢反应，或者产生期望的遗传物质（例如针对期望代谢途径的基因）的合适来源有机体。然而，鉴于多种有机体的完整基因组测序和基因组学领域中的高度技术水平，本领域技术人员能够容易地将本发明提供的教导和指导应用于基本上所有其它有机体。例如，通过并入来自除所提及物种以外的物种的相同或类似的编码核酸，本发明示例的大肠杆菌代谢变异可容易地应用于其它物种。所述基因变异一般包括例如种间同源物的基因变异，特别是直系同源物，旁系同源物或非直系同源基因置换。
直系同源物是通过垂直家系产生关联且在不同有机体中负责基本上相同或一致的功能的基因。例如，小鼠环氧化物水解酶和人类环氧化物水解酶可被视为环氧化物水解的生物功能的直系同源物。例如，当基因共有足量的序列相似性以指示其是同源的时，所述基因通过垂直家系产生关联，或通过从共同祖先进化而产生关联。如果基因具有足量的三维结构相似性但未必具有足量的序列相似性，从而在无法鉴别到一级序列相似性的范围内表明其是进化自共同祖先，那么所述基因也可被视为直系同源物。直系同源的基因可编码序列相似性为氨基酸序列同一性的约25%到100%的蛋白。如果编码共有氨基酸相似性小于25%的蛋白的基因的三维结构也显示相似性，那么其也被视为是由垂直家系产生的。丝氨酸蛋白酶家族的成员（包括组织纤溶酶原激活物和弹性蛋白酶）被视为是通过垂直家系从共同祖先产生的。
直系同源物包括通过例如进化而在结构或总体活性上趋异的基因或其编码的基因产物。例如，在一种物种编码展现两种功能的基因产物的情况下，以及在所述功能分离成第二物种中的不同基因的情况下，这三种基因和其对应产物被视为直系同源物。为了产生生物化学产物，本领域技术人员将理解，可对具有欲引入或破坏的代谢活性的直系同源基因进行选择，以便构建非天然存在的微生物。展现可分离活性的直系同源物的例子是不同活性已在两种或两种以上物种之间或在单一物种内被分离成不同基因产物。具体例子是弹性蛋白酶蛋白水解和纤溶酶原蛋白水解(两种类型的丝氨酸蛋白酶活性)被分离成作为纤溶酶原激活物和弹性蛋白酶的不同分子。另一例子是支原体5′-3′外切核酸酶和果蝇dna聚合酶III活性的分离。第一物种的dna聚合酶可被视为第二物种的外切核酸酶或聚合酶中一者或两者的直系同源物，且反之亦然。
相反，旁系同源物是通过例如复制和随后的进化趋异而产生关联且具有相似或共同，但不完全相同的功能的同源物。旁系同源物可来源于或衍生于例如相同物种或不同物种。例如，微粒体环氧化物水解酶（环氧化物水解酶I）和可溶性环氧化物水解酶（环氧化物水解酶II）可被视为旁系同源物，因为其代表两种共同进化自共同祖先的不同酶，催化不同反应且在相同物种中具有不同功能。旁系同源物是来自相同物种的彼此具有显著序列相似性的蛋白，表明其是同源的或通过共同进化自共同祖先而产生关联。旁系同源蛋白家族的分组包括HipA同源物，荧光素酶基因，肽酶等。
非直系同源基因置换是来自一个物种的非直系同源基因，可取代不同物种中的参考基因功能。取代包括例如能够在起源物种中进行与不同物种中的参考功能相比基本上相同或类似的功能。虽然一般来说，非直系同源基因置换可被鉴别为在结构上与编码参考功能的已知基因相关，但是结构相关性较小但功能类似的基因和其对应的基因产物在本发明中使用时仍然处于该术语的含义内。功能相似性需要例如非直系同源基因产物的活性位点或结合区域与编码设法取代的功能的基因相比具有至少一些结构相似性。因此，非直系同源基因包括例如旁系同源物或无关基因。
因此，在鉴别和构建具有正丙醇和异丙醇，1,4-BDO和异丙醇，1,3-BDO和异丙醇或者MAA和异丙醇生物合成能力的本发明的非天然存在的微生物有机体的过程中，本领域技术人员将理解，通过对特定物种应用本发明提供的教导和指导，代谢修饰的鉴别可包括直系同源物的鉴别和纳入或失活。只要参考微生物中存在旁系同源物和/或非直系同源基因置换以用于编码催化类似或基本上类似的代谢反应的酶，那么本领域技术人员也可利用这些进化上相关的基因。
直系同源物，旁系同源物和非直系同源基因置换可通过本领域技术人员熟知的方法来确定。例如，检查两种多肽的核酸或氨基酸序列将会揭示所比较序列之间的序列同一性和相似性。基于所述相似性，如果相似性足够高，那么本领域技术人员可确定蛋白是通过进化自共同祖先而产生关联。本领域技术人员熟知的算法，例如ALign，BLAST，Clustal W和其它算法，比较和确定粗略序列相似性或同一性，并且确定序列中可被指派权重或分数的空位的存在或显著性。所述算法在本领域中也是已知的，且类似地可用于确定核苷酸序列相似性或同一性。足以确定关联性的相似性的参数是基于用于计算统计相似性的熟知方法，或在随机多肽中发现类似匹配的概率和所确定匹配的显著性来计算得出。两种或两种以上序列的计算机比较在必要时也可由本领域技术人员目测优化。预期相关的基因产物或蛋白可具有高相似性，例如25%到100%序列同一性。如果扫描足够大小的数据库，那么无关的蛋白可具有与预期偶然发生的概率基本上相同的同一性(约5%)。5%-24%之间的序列可能代表或可能不代表足以推断所比较序列是相关序列的同源性。可进行鉴于数据集的大小确定所述匹配的显著性的其它统计分析，以便确定这些序列的相关性。
使用BLAST算法确定两种或两种以上序列的关联性的示例性参数例如可说明如下。简言之，氨基酸序列比对可使用2.0.8版(1999年1月5日)BLASTP和以下参数来进行：矩阵：0BLOSUM62；空位开放：11；空位延伸：1；x_扣分：50；期望值：10.0；字长：3；过滤器：开。核酸序列比对可使用2.0.6版(1998年9月16日)BLASTN和以下参数来进行：匹配：1；错配：-2；空位开放：5；空位延伸：2；x_扣分：50；期望值：10.0；字长：11；过滤器：关。本领域技术人员将理解，例如，为了增加或降低比较的严格度并确定两种或两种以上序列的关联性，可对上述参数作哪些修改。
在一个实施方式中，本发明提供了一种非天然存在的微生物有机体，包括具有正丙醇途径和异丙醇途径的微生物有机体，该正丙醇途径具有至少一种编码正丙醇途径酶并以足以产生正丙醇的量表达的外源性核酸，该正丙醇途径包括丙醛脱氢酶，丙醇脱氢酶，丙酰-CoA:磷酸丙酰基转移酶，丙酰-CoA水解酶，丙酰-CoA转移酶，丙酰-CoA合成酶，丙酸激酶，丙酸还原酶或丙酰磷酸还原酶，该异丙醇途径包括至少一种编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的外源性核酸，该异丙醇途径包括乙酰乙酰-CoA硫解酶，乙酰-CoA转移酶，乙酰-CoA水解酶，乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶或异丙醇脱氢酶。
在上述实施方式中的另一方面，该微生物有机体具有至少一种编码乙酰-CoA途径酶并以足以产生乙酰-CoA的量表达的外源性核酸，该乙酰-CoA途径包括丙酮酸激酶，丙酮酸脱氢酶，丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶，丙酮酸甲酸裂解酶，丙酮酸甲酸裂解酶激活酶，或甲酸脱氢酶。
在另一个实施方式中，该微生物有机体具有丙酰-CoA途径，该途径具有至少一种编码丙酰-CoA途径酶并以足以产生丙酰-CoA的量表达的外源性核酸，该丙酰-CoA途径包括PEP羧激酶，PEP羧化酶，苹果酸脱氢酶，延胡索酸酶，延胡索酸还原酶，琥珀酰-CoA转移酶，琥珀酰-CoA合成酶，甲基丙二酰-CoA变位酶，甲基丙二酰-CoA异构酶或甲基丙二酰-CoA脱羧酶。在另一方面，该丙酰-CoA途径包括丙酮酸羧化酶或丙二酰-CoA羧基转移酶。
在另一实施方式中，该微生物有机体具有丙酰-CoA途径，该途径具有至少一种编码丙酰-CoA途径酶并以足以产生丙酰-CoA的量表达的外源性核酸，该丙酰-CoA途径包括PEP羧激酶，PEP羧化酶，苏氨酸脱氨酶，或2-氧代丁酸脱氢酶。在另一方面，正丙醇途径包括2-氧代丁酸脱羧酶。
在另一实施方式中，该微生物有机体具有丙酰-CoA途径，该途径具有至少一种编码丙酰-CoA途径酶并以足以产生丙酰-CoA的量表达的外源性核酸，该丙酰-CoA途径包括乙酰-CoA羧化酶，丙二酰-CoA还原酶，丙二酸半醛还原酶或丙酰-CoA合成酶。
在另一实施方式中，该微生物有机体具有丙酰-CoA途径，该途径具有至少一种编码丙酰-CoA途径酶并以足以产生丙酰-CoA的量表达的外源性核酸，该丙酰-CoA途径包括乳酸脱氢酶，乳酰-CoA转移酶，乳酰-CoA脱水或丙烯酰-CoA还原酶。
在又一实施方式中，本发明提供一种非天然存在的微生物有机体，包括具有正丙醇途径和异丙醇途径的微生物有机体，该正丙醇途径具有编码正丙醇途径酶并以足以产生正丙醇的量表达的第一组外源性核酸，该第一组外源性核酸编码丙醛脱氢酶和丙醇脱氢酶；或者丙酰-CoA:磷酸丙酰基转移酶，丙酰磷酸还原酶和丙醇脱氢酶；或者丙酰-CoA水解酶或丙酰-CoA转移酶或丙酰-CoA合成酶；或者丙酸激酶，丙酰磷酸还原酶和丙醇脱氢酶；或者丙酰-CoA水解酶或丙酰-CoA转移酶或丙酰-CoA合成酶，丙酸还原酶和丙醇脱氢酶，并且该异丙醇途径具有编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，该第二组外源性核酸编码乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或乙酰乙酰-CoA水解酶或乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
在上述实施方式的另一方面，该微生物有机体具有乙酰-CoA途径，该途径具有编码乙酰-CoA途径酶并以足以产生乙酰-CoA的量表达的第三组外源性核酸，该第三组外源性核酸编码丙酮酸激酶，以及丙酮酸脱氢酶或者丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶；或者丙酮酸甲酸裂解酶，丙酮酸甲酸裂解酶激活酶和甲酸脱氢酶。
在另一实施方式中，该微生物有机体具有丙酰-CoA途径，该途径具有编码丙酰-CoA途径酶并以足以产生丙酰-CoA的量表达的第三组外源性核酸，该第三组外源性核酸编码PEP羧激酶或者PEP羧化酶，苹果酸脱氢酶，延胡索酸酶，延胡索酸还原酶，琥珀酰-CoA转移酶或者琥珀酰-CoA合成酶，甲基丙二酰-CoA变位酶，以及甲基丙二酰-CoA脱羧酶。在另一方面，该第三组外源性核酸还编码甲基丙二酰-CoA差向异构酶，丙酮酸羧化酶或者甲基丙二酰-CoA羧基转移酶。
在又一实施方式中，该微生物有机体具有丙酰-CoA途径，该途径具有编码丙酰-CoA途径酶并以足以产生丙酰-CoA的量表达的第三组外源性核酸，所述的第三组外源性核酸编码PEP羧激酶或者PEP羧化酶，苏氨酸脱氨酶，以及2-氧代丁酸脱氢酶。在另一方面，该第三组外源性核酸还编码甲基丙二酰-CoA脱羧酶或者丙酮酸羧化酶。在又一方面，第二组外源性核酸还编码2-氧代丁酸脱羧酶。
在又一实施方式中，该微生物有机体具有丙酰-CoA途径，该途径具有编码丙酰-CoA途径酶并以足以产生丙酰-CoA的量表达的第三组外源性核酸，该第三组外源性核酸编码乙酰-CoA羧化酶，丙二酰-CoA还原酶，丙二酸半醛还原酶，和丙酰-CoA合成酶。
在又一实施方式中，该微生物有机体具有丙酰-CoA途径，该途径具有编码乳酸脱氢酶，乳酰-CoA转移酶，乳酰-CoA脱水酶，和丙烯酰-CoA还原酶的第三组外源性核酸。
在一个实施方式中，本发明提供一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有正丙醇途径和异丙醇途径的微生物有机体，该正丙醇途径包括编码正丙醇途径酶并以足以产生正丙醇的量表达的第一组外源性核酸，该第一组外源性核酸编码PEP羧激酶或者PEP羧化酶，苹果酸脱氢酶，延胡索酸酶，延胡索酸还原酶，琥珀酰-CoA转移酶或者琥珀酰-CoA合成酶，甲基丙二酰-CoA变位酶，甲基丙二酰-CoA脱羧酶，以及丙醛脱氢酶和丙醇脱氢酶；或者丙酰-CoA:磷酸丙酰基转移酶和丙酰磷酸还原酶；或者丙酰-CoA水解酶或者丙酰-CoA转移酶或者丙酰-CoA合成酶，丙酸激酶，丙酰磷酸还原酶和丙醇脱氢酶；或者丙酰-CoA水解酶或者丙酰-CoA转移酶或者丙酰-CoA合成酶，丙酸还原酶和丙醇脱氢酶，并且所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，该第二组外源性核酸编码丙酮酸激酶，丙酮酸脱氢酶或者丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶；或者丙酮酸甲酸裂解酶，丙酮酸甲酸裂解酶激活酶和甲酸脱氢酶，乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有正丙醇途径和异丙醇途径的微生物有机体，该正丙醇途径包括编码正丙醇途径酶并以足以产生正丙醇的量表达的第一组外源性核酸，该第一组外源性核酸编码PEP羧激酶或者PEP羧化酶，苏氨酸脱氨酶，以及2-氧代丁酸脱羧酶和丙醇脱氢酶；或者2-氧代丁酸脱氢酶，丙醛脱氢酶和丙醇脱氢酶；或者2-氧代丁酸脱氢酶，丙酰-CoA:磷酸丙酰基转移酶，丙酰磷酸还原酶和丙醇脱氢酶；2-氧代丁酸脱氢酶，丙酰-CoA水解酶或者丙酰-CoA转移酶或者丙酰-CoA合成酶，丙酸激酶，丙酰磷酸还原酶和丙醇脱氢酶；或者2-氧代丁酸脱氢酶，丙酰-CoA水解酶或者丙酰-CoA转移酶或者丙酰-CoA合成酶，丙酸还原酶和丙醇脱氢酶，并且所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，该第二组外源性核酸编码丙酮酸激酶，丙酮酸脱氢酶或者丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶；或者丙酮酸甲酸裂解酶，丙酮酸甲酸裂解酶激活酶和甲酸脱氢酶，乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。在另一方面，该第二组外源性核酸还编码丙酮酸羧化酶或者甲基丙二酰-CoA羧基转移酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有正丙醇途径和异丙醇途径的微生物有机体，该正丙醇途径包括编码正丙醇途径酶并以足以产生正丙醇的量表达的第一组外源性核酸，该第一组外源性核酸编码丙酮酸激酶，丙酮酸脱氢酶或者丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶；或者丙酮酸甲酸裂解酶，丙酮酸甲酸裂解酶激活酶和甲酸脱氢酶，乙酰-CoA羧化酶，丙二酰-CoA还原酶，丙二酸半醛还原酶，丙酰-CoA合成酶，以及丙醛脱氢酶和丙醇脱氢酶；或者丙酰-CoA:磷酸丙酰基转移酶，丙酰磷酸还原酶和丙醇脱氢酶；或者丙酰-CoA水解酶或者丙酰-CoA转移酶或者丙酰-CoA合成酶，丙酸激酶，丙酰磷酸还原酶和丙醇脱氢酶；或者丙酰-CoA水解酶或者丙酰-CoA转移酶或者丙酰-CoA合成酶，丙酸还原酶和丙醇脱氢酶，并且所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，该第二组外源性核酸编码乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有正丙醇途径和异丙醇途径的微生物有机体，该正丙醇途径包括编码正丙醇途径酶并以足以产生正丙醇的量表达的第一组外源性核酸，该第一组外源性核酸编码乳酸脱氢酶，乳酰-CoA转移酶，乳酰-CoA脱水酶，丙烯酰-CoA还原酶，以及丙醛脱氢酶和丙醇脱氢酶；或者丙酰-CoA:磷酸丙酰基转移酶，丙酰磷酸还原酶和丙醇脱氢酶；或者丙酰-CoA水解酶或者丙酰-CoA转移酶或者丙酰-CoA合成酶，丙酸激酶，丙酰磷酸还原酶和丙醇脱氢酶；或者丙酰-CoA水解酶或者丙酰-CoA转移酶或者丙酰-CoA合成酶，丙酸还原酶和丙醇脱氢酶，并且所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，该第二组外源性核酸编码丙酮酸脱氢酶或者丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶；或者丙酮酸甲酸裂解酶，丙酮酸甲酸裂解酶激活酶和甲酸脱氢酶，乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有正丙醇途径的微生物有机体，该正丙醇途径包括至少一种编码正丙醇途径酶并以足以产生正丙醇的量表达的外源性核酸，该正丙醇途径包括丙醛脱氢酶，丙醇脱氢酶，丙酰-CoA:磷酸丙酰基转移酶，丙酰-CoA水解酶，丙酰-CoA转移酶，丙酰-CoA合成酶，丙酸激酶，丙酸还原酶或者丙酰磷酸还原酶。
在另一个实施方式中，本发明提供一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有正丙醇途径的微生物有机体，该正丙醇途径包括一组编码正丙醇途径酶并以足以产生正丙醇的量表达的外源性核酸，该组外源性核酸编码丙醛脱氢酶和丙醇脱氢酶；或者丙酰-CoA:磷酸丙酰基转移酶，丙酰磷酸还原酶和丙醇脱氢酶；或者丙酰-CoA水解酶或者丙酰-CoA转移酶或者丙酰-CoA合成酶，丙酸激酶，丙酰磷酸还原酶和丙醇脱氢酶；或者丙酰-CoA水解酶或者丙酰-CoA转移酶或者丙酰-CoA合成酶，丙酸还原酶和丙醇脱氢酶。
在上述实施方式的另一方面，具有正丙醇途径的非天然存在的微生物有机体还具有丙酰-CoA途径，该丙酰-CoA途径包括编码丙酰-CoA途径酶并以足以产生丙酰-CoA的量表达的外源性核酸。例如，在某些方面，该外源性核酸编码PEP羧激酶，PEP羧化酶，苹果酸脱氢酶，延胡索酸酶，延胡索酸还原酶，琥珀酰-CoA转移酶，琥珀酰-CoA合成酶，甲基丙二酰-CoA变位酶或者甲基丙二酰-CoA脱羧酶。另一方面，该外源性核酸还编码甲基丙二酰-CoA差向异构酶。另外，在上述实施方式的又一方面，具有正丙醇途径的非天然存在的微生物有机体可具有编码正丙醇途径酶并以足以产生正丙醇的量表达的第一组外源性核酸，其中该第一组外源性核酸编码PEP羧激酶或者PEP羧化酶，苹果酸脱氢酶，延胡索酸酶，延胡索酸还原酶，琥珀酰-CoA转移酶或者琥珀酰-CoA合成酶，甲基丙二酰-CoA变位酶，甲基丙二酰-CoA差向异构酶，甲基丙二酰-CoA脱羧酶，丙醛脱氢酶和丙醇脱氢酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有1,4-BDO途径和异丙醇途径的微生物有机体，该1,4-BDO途径具有至少一种编码1,4-BDO途径酶并以足以产生1,4-BDO的量表达的外源性核酸，该1,4-BDO途径包括琥珀酰-CoA还原酶，琥珀酸还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酰-CoA转移酶，4-羟基丁酰-CoA合成酶，4-羟基丁酰-CoA还原酶（形成醛），4-羟基丁醛还原酶，4-羟基丁酸还原酶，4-羟基丁酸激酶，磷酸转-4-羟基丁酸化酶，4-羟基丁酰磷酸还原酶或者4-羟基丁酰-CoA还原酶（形成醇），该异丙醇途径包括至少一种编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的外源性核酸，该异丙醇途径包括乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶，乙酰乙酰-CoA水解酶，乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶或者异丙醇脱氢酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有1,3-BDO途径和异丙醇途径的微生物有机体，该1,3-BDO途径具有至少一种编码1,3-BDO途径酶并以足以产生1,3-BDO的量表达的外源性核酸，该1,3-BDO途径包括琥珀酰-CoA还原酶，琥珀酸还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酰-CoA转移酶，4-羟基丁酰-CoA合成酶，4-羟基丁酸激酶，磷酸转-4-羟基丁酸化酶，4-羟基丁酰-CoA脱水酶，巴豆酸酶，3-羟基丁酰-CoA还原酶（形成醛)，3-羟基丁醛还原酶，3-羟基丁酰-CoA转移酶，3-羟基丁酰-CoA合成酶，3-羟基丁酰-CoA水解酶或者3-羟基丁酸还原酶或者3-羟基丁酰-CoA还原酶（形成醇），该异丙醇途径包括至少一种编码一种异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的外源性核酸，该异丙醇途径包括乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶，乙酰乙酰-CoA水解酶，乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶或者异丙醇脱氢酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有MAA途径和异丙醇途径的微生物有机体，该MAA途径具有至少一种编码MAA途径酶并以足以产生MAA的量表达的外源性核酸，该MAA途径包括琥珀酰-CoA还原酶，琥珀酸还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酰-CoA转移酶，4-羟基丁酰-CoA合成酶，4-羟基丁酸激酶，磷酸转-4-羟基丁酸化酶，4-羟基丁酰-CoA变位酶，3-羟基异丁酰-CoA脱水酶，甲基丙烯酰-CoA转移酶，甲基丙烯酰-CoA合成酶，甲基丙烯酰-CoA水解酶，3-羟基异丁酰-CoA转移酶，3-羟基异丁酰-CoA合成酶，3-羟基异丁酰-CoA水解酶，3-羟基异丁酸脱水酶，甲基丙二酰-CoA变位酶，甲基丙二酰-CoA差向异构酶，甲基丙二酰-CoA转移酶，甲基丙二酰-CoA合成酶，甲基丙二酰-CoA水解酶，甲基丙二酸还原酶，甲基丙二酰-CoA还原酶（形成醛)，3-羟基异丁酸脱氢酶，甲基丙二酰-CoA还原酶（形成醇）或者3-羟基异丁酸脱水酶，该异丙醇途径包括至少一种编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的外源性核酸，该异丙醇途径包括乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶，乙酰乙酰-CoA水解酶，乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶或者异丙醇脱氢酶。
在上述实施方式的另一方面，微生物有机体具有乙酰-CoA途径，其具有至少一种编码乙酰-CoA途径酶并以足以产生乙酰-CoA的量表达的外源性核酸，该乙酰-CoA途径包括丙酮酸激酶，丙酮酸脱氢酶，丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶，丙酮酸甲酸裂解酶，丙酮酸甲酸裂解酶激活酶或者甲酸脱氢酶。
在上述实施方式的另一方面，该微生物有机体具有琥珀酰-CoA有至少一种外源性核酸编码的途径琥珀酰-CoA表达足够的量途径酶生产琥珀酰-CoA，琥珀酰-CoA途径包括PEP羧激酶，PEP羧化酶，苹果酸脱氢酶，延胡索酸酶，延胡索酸还原酶，琥珀酰-CoA转移酶或者琥珀酰-CoA合成酶。在另一方面，琥珀酰-CoA途径包括丙酮酸羧化酶或者甲基丙二酰-CoA羧基转移酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有1,4-BDO途径和异丙醇途径的微生物有机体，该1,4-BDO途径包括编码1,4-BDO途径酶并以足以产生1,4-BDO的量表达的第一组外源性核酸，该第一组外源性核酸编码琥珀酰-CoA还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酰-CoA转移酶或者4-羟基丁酰-CoA合成酶，4-羟基丁酰-CoA还原酶（形成醛)，以及4-羟基丁醛还原酶，并且所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，该第二组外源性核酸编码乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有1,4-BDO途径和异丙醇途径的微生物有机体，该1,4-BDO途径包括编码1,4-BDO途径酶并以足以产生1,4-BDO的量表达的第一组外源性核酸，该第一组外源性核酸编码琥珀酰-CoA还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酸还原酶，以及4-羟基丁醛还原酶，并且所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，该第二组外源性核酸编码乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有1,4-BDO途径和异丙醇途径的微生物有机体，该1,4-BDO途径包括编码1,4-BDO途径酶并以足以产生1,4-BDO的量表达的第一组外源性核酸，该第一组外源性核酸编码琥珀酰-CoA还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酸激酶，磷酸转-4-羟基丁酸化酶，4-羟基丁酰-CoA还原酶（形成醛)，以及4-羟基丁醛还原酶，并且所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，该第二组外源性核酸编码乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有1,4-BDO途径和异丙醇途径的微生物有机体，该1,4-BDO途径包括编码1,4-BDO途径酶并以足以产生1,4-BDO的量表达的第一组外源性核酸，该第一组外源性核酸编码琥珀酰-CoA还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酸激酶，4-羟基丁酰磷酸还原酶，以及4-羟基丁醛还原酶，并且所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，该第二组外源性核酸编码乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有1,4-BDO途径和异丙醇途径的微生物有机体，该1,4-BDO途径包括编码1,4-BDO途径酶并以足以产生1,4-BDO的量表达的第一组外源性核酸，该第一组外源性核酸编码琥珀酰-CoA还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酸激酶，磷酸转-4-羟基丁酸化酶，以及4-羟基丁酰-CoA还原酶（形成醇），并且所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，该第二组外源性核酸编码乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有1,4-BDO途径和异丙醇途径的微生物有机体，该1,4-BDO途径包括编码1,4-BDO途径酶并以足以产生1,4-BDO的量表达的第一组外源性核酸，该第一组外源性核酸编码琥珀酰-CoA还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酰-CoA转移酶或者4-羟基丁酰-CoA合成酶，以及4-羟基丁酰-CoA还原酶（形成醇），并且所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，该第二组外源性核酸编码乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有1,4-BDO途径和异丙醇途径的微生物有机体，该1,4-BDO途径，包括编码1,4-BDO途径酶并以足以产生1,4-BDO的量表达的第一组外源性核酸，该第一组外源性核酸编码琥珀酸还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酰-CoA转移酶或者4-羟基丁酰-CoA合成酶，4-羟基丁酰-CoA还原酶（形成醛)，以及4-羟基丁醛还原酶，并且所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，该第二组外源性核酸编码乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有1,4-BDO途径和异丙醇途径的微生物有机体，该1,4-BDO途径包括编码1,4-BDO途径酶并以足以产生1,4-BDO的量表达的第一组外源性核酸，该第一组外源性核酸编码琥珀酸还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酸还原酶，以及4-羟基丁醛还原酶，并且所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，该第二组外源性核酸编码乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有1,4-BDO途径和异丙醇途径的微生物有机体，该1,4-BDO途径包括编码1,4-BDO途径酶并以足以产生1,4-BDO的量表达的第一组外源性核酸，该第一组外源性核酸编码琥珀酸还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酸激酶，磷酸转-4-羟基丁酸化酶，4-羟基丁酰-CoA还原酶（形成醛)，以及4-羟基丁醛还原酶，并且所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，该第二组外源性核酸编码乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有1,4-BDO途径和异丙醇途径的微生物有机体，该1,4-BDO途径包括编码1,4-BDO途径酶并以足以产生1,4-BDO的量表达的第一组外源性核酸，该第一组外源性核酸编码琥珀酸还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酸激酶，4-羟基丁酰磷酸还原酶，以及4-羟基丁醛还原酶，并且所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，该第二组外源性核酸编码乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有1,4-BDO途径和异丙醇途径的微生物有机体，该1,4-BDO途径包括编码1,4-BDO途径酶并以足以产生1,4-BDO的量表达的第一组外源性核酸，该第一组外源性核酸编码琥珀酸还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酸激酶，磷酸转-4-羟基丁酸化酶，以及4-羟基丁酰-CoA还原酶（形成醇），并且所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，该第二组外源性核酸编码乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有1,4-BDO途径和异丙醇途径的微生物有机体，该1,4-BDO途径包括编码1,4-BDO途径酶并以足以产生1,4-BDO的量表达的第一组外源性核酸，该第一组外源性核酸编码琥珀酸还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酰-CoA转移酶或者4-羟基丁酰-CoA合成酶，以及4-羟基丁酰-CoA还原酶（形成醇），并且所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，该第二组外源性核酸编码乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有1,3-BDO途径和异丙醇途径的微生物有机体，该1,3-BDO途径包括编码1,3-BDO途径酶并以足以产生1,3-BDO的量表达的第一组外源性核酸，该第一组外源性核酸编码琥珀酰-CoA还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酰-CoA转移酶或者4-羟基丁酰-CoA合成酶，4-羟基丁酰-CoA脱水酶，巴豆酸酶，3-羟基丁酰-CoA还原酶（形成醛)，和3-羟基丁醛还原酶，并且所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，该第二组外源性核酸编码乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有1,3-BDO途径和异丙醇途径的微生物有机体，该1,3-BDO途径包括编码1,3-BDO途径酶并以足以产生1,3-BDO的量表达的第一组外源性核酸，该第一组外源性核酸编码琥珀酰-CoA还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酰-CoA转移酶或者4-羟基丁酰-CoA合成酶，4-羟基丁酰-CoA脱水酶，巴豆酸酶，3-羟基丁酰-CoA转移酶或者3-羟基丁酰-CoA合成酶或者3-羟基丁酰-CoA水解酶，3-羟基丁酸还原酶，和3-羟基丁醛还原酶，并且所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，该第二组外源性核酸编码乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有1,3-BDO途径和异丙醇途径的微生物有机体，该1,3-BDO途径包括编码1,3-BDO途径酶并以足以产生1,3-BDO的量表达的第一组外源性核酸，该第一组外源性核酸编码琥珀酰-CoA还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酸激酶，磷酸转-4-羟基丁酸化酶，4-羟基丁酰-CoA脱水酶，巴豆酸酶，3-羟基丁酰-CoA还原酶（形成醛)，和3-羟基丁醛还原酶，并且所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，该第二组外源性核酸编码乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有1,3-BDO途径和异丙醇途径的微生物有机体，该1,3-BDO途径包括编码1,3-BDO途径酶并以足以产生1,3-BDO的量表达的第一组外源性核酸，该第一组外源性核酸编码琥珀酰-CoA还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酸激酶，磷酸转-4-羟基丁酸化酶，4-羟基丁酰-CoA脱水酶，巴豆酸酶，3-羟基丁酰-CoA转移酶或者3-羟基丁酰-CoA合成酶或者3-羟基丁酰-CoA水解酶，3-羟基丁酸还原酶，和3-羟基丁醛还原酶，并且所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，该第二组外源性核酸编码乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有1,3-BDO途径和异丙醇途径的微生物有机体，该1,3-BDO途径包括编码1,3-BDO途径酶并以足以产生1,3-BDO的量表达的第一组外源性核酸，该第一组外源性核酸编码琥珀酰-CoA还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酸激酶，磷酸转-4-羟基丁酸化酶，4-羟基丁酰-CoA脱水酶，巴豆酸酶，和3-羟基丁酰-CoA还原酶（形成醇），并且所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，该第二组外源性核酸编码乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有1,3-BDO途径和异丙醇途径的微生物有机体，该1,3-BDO途径包括编码1,3-BDO途径酶并以足以产生1,3-BDO的量表达的第一组外源性核酸，该第一组外源性核酸编码琥珀酰-CoA还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酰-CoA转移酶，或4-羟基丁酰-CoA合成酶，4-羟基丁酰-CoA脱水酶，巴豆酸酶，和3-羟基丁酰-CoA还原酶（形成醇），并且所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，该第二组外源性核酸编码乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有1,3-BDO途径和异丙醇途径的微生物有机体，该1,3-BDO途径包括编码1,3-BDO途径酶并以足以产生1,3-BDO的量表达的第一组外源性核酸，该第一组外源性核酸编琥珀酸还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酰-CoA转移酶或者4-羟基丁酰-CoA合成酶，4-羟基丁酰-CoA脱水酶，巴豆酸酶，3-羟基丁酰-CoA还原酶（形成醛)，和3-羟基丁醛还原酶，并且所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，该第二组外源性核酸编码乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种非天然存在的微生物有机体，包括具有1,3-丁二醇途径和异丙醇途径的微生物有机体，该1,3-丁二醇途径包括编码1,3-丁二醇途径酶并以足以产生1,3-丁二醇的量表达的第一组外源性核酸，该第一组外源性核酸编码琥珀酸还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酰-CoA转移酶或者4-羟基丁酰-CoA合成酶，4-羟基丁酰-CoA脱水酶，巴豆酸酶，3-羟基丁酰-CoA转移酶或者3-羟基丁酰-CoA合成酶或者3-羟基丁酰-CoA水解酶，3-羟基丁酸还原酶，和3-羟基丁醛还原酶，并且所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，该第二组外源性核酸编码乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种非天然存在的微生物有机体，包括具有1,3-丁二醇途径和异丙醇途径的微生物有机体，该1,3-丁二醇途径包括编码1,3-丁二醇途径酶并以足以产生1,3-丁二醇的量表达的第一组外源性核酸，该第一组外源性核酸编码琥珀酸还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酸激酶，磷酸转-4-羟基丁酸化酶，4-羟基丁酰-CoA脱水酶，巴豆酸酶，3-羟基丁酰-CoA还原酶（形成醛)，和3-羟基丁醛还原酶，所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，该第二组外源性核酸编码乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种非天然存在的微生物有机体，包括具有1,3-丁二醇途径和异丙醇途径的微生物有机体，该1,3-丁二醇途径包括编码1,3-丁二醇途径酶并以足以产生1,3-丁二醇的量表达的第一组外源性核酸，该第一组外源性核酸编码琥珀酸还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酸激酶，磷酸转-4-羟基丁酸化酶，4-羟基丁酰-CoA脱水酶，巴豆酸酶，3-羟基丁酰-CoA转移酶或者3-羟基丁酰-CoA合成酶或者3-羟基丁酰-CoA水解酶，3-羟基丁酸还原酶，和3-羟基丁醛还原酶，所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，该第二组外源性核酸编码乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
64，在一个实施方式中，本发明提供一种非天然存在的微生物有机体，包括具有1,3-丁二醇途径和异丙醇途径的微生物有机体，该1,3-丁二醇途径包括编码1,3-丁二醇途径酶并以足以产生1,3-丁二醇的量表达的第一组外源性核酸，该第一组外源性核酸编码琥珀酸还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酸激酶，磷酸转-4-羟基丁酸化酶，巴豆酸酶，和3-羟基丁酰-CoA还原酶（形成醇），所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，该第二组外源性核酸编码乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种非天然存在的微生物有机体，包括具有1,3-丁二醇途径和异丙醇途径的微生物有机体，该1,3-丁二醇途径包括编码1,3-丁二醇途径酶并以足以产生1,3-丁二醇的量表达的第一组外源性核酸，该第一组外源性核酸编码琥珀酸还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酰-CoA转移酶或者4-羟基丁酰-CoA合成酶，4-羟基丁酰-CoA脱水酶，巴豆酸酶，和3-羟基丁酰-CoA还原酶（形成醇），所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，该第二组外源性核酸编码乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有MAA途径和异丙醇途径的微生物有机体，该MAA途径包括编码MAA途径酶并以足以产生MAA的量表达的第一组外源性核酸，该第一组外源性核酸编码琥珀酰-CoA还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酰-CoA转移酶或者4-羟基丁酰-CoA合成酶，4-羟基丁酰-CoA变位酶，3-羟基异丁酰-CoA转移酶，3-羟基异丁酰-CoA合成酶或者3-羟基异丁酰-CoA水解酶，和3-羟基异丁酸脱水酶，并且所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，该第二组外源性核酸编码乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有MAA途径和异丙醇途径的微生物有机体，该MAA途径包括编码MAA途径酶并以足以产生MAA的量表达的第一组外源性核酸，该第一组外源性核酸编码琥珀酰-CoA还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酰-CoA转移酶或者4-羟基丁酰-CoA合成酶，4-羟基丁酰-CoA变位酶，3-羟基异丁酰-CoA脱水酶，以及甲基丙烯酰-CoA转移酶，甲基丙烯酰-CoA合成酶或者甲基丙烯酰-CoA水解酶，并且所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，该第二组外源性核酸编码乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有MAA途径和异丙醇途径的微生物有机体，该MAA途径包括编码MAA途径酶并以足以产生MAA的量表达的第一组外源性核酸，该第一组外源性核酸编码琥珀酰-CoA还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酸激酶，磷酸转-4-羟基丁酸化酶，4-羟基丁酰-CoA变位酶，3-羟基异丁酰-CoA转移酶，3-羟基异丁酰-CoA合成酶或者3-羟基异丁酰-CoA水解酶，和3-羟基异丁酸脱水酶，并且所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，该第二组外源性核酸编码乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有MAA途径和异丙醇途径的微生物有机体，该MAA途径包括编码MAA途径酶并以足以产生MAA的量表达的第一组外源性核酸，该第一组外源性核酸编码琥珀酰-CoA还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酸激酶，磷酸转-4-羟基丁酸化酶，4-羟基丁酰-CoA变位酶，3-羟基异丁酰-CoA脱水酶，以及甲基丙烯酰-CoA转移酶，甲基丙烯酰-CoA合成酶或者甲基丙烯酰-CoA水解酶，并且所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，该第二组外源性核酸编码乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有MAA途径和异丙醇途径的微生物有机体，该MAA途径包括编码MAA途径酶并以足以产生MAA的量表达的第一组外源性核酸，该第一组外源性核酸编码琥珀酸还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酰-CoA转移酶或者4-羟基丁酰-CoA合成酶，4-羟基丁酰-CoA变位酶，3-羟基异丁酰-CoA转移酶，3-羟基异丁酰-CoA合成酶或者3-羟基异丁酰-CoA水解酶，和3-羟基异丁酸脱水酶，并且所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，该第二组外源性核酸编码乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有MAA途径和异丙醇途径的微生物有机体，该MAA途径包括编码MAA途径酶并以足以产生MAA的量表达的第一组外源性核酸，该第一组外源性核酸编码琥珀酸还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酰-CoA转移酶或者4-羟基丁酰-CoA合成酶，4-羟基丁酰-CoA变位酶，3-羟基异丁酰-CoA脱水酶，以及甲基丙烯酰-CoA转移酶，甲基丙烯酰-CoA合成酶或者甲基丙烯酰-CoA水解酶，并且所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，该第二组外源性核酸编码乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有MAA途径和异丙醇途径的微生物有机体，该MAA途径包括编码MAA途径酶并以足以产生MAA的量表达的第一组外源性核酸，该第一组外源性核酸编码琥珀酸还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酸激酶，磷酸转-4-羟基丁酸化酶，4-羟基丁酰-CoA变位酶，3-羟基异丁酰-CoA转移酶，3-羟基异丁酰-CoA合成酶或者3-羟基异丁酰-CoA水解酶，和3-羟基异丁酸脱水酶，并且所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，该第二组外源性核酸编码乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有MAA途径和异丙醇途径的微生物有机体，该MAA途径包括编码MAA途径酶并以足以产生MAA的量表达的第一组外源性核酸，该第一组外源性核酸编码琥珀酸还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酸激酶，磷酸转-4-羟基丁酸化酶，4-羟基丁酰-CoA变位酶，3-羟基异丁酰-CoA脱水酶，以及甲基丙烯酰-CoA转移酶，甲基丙烯酰-CoA合成酶或者甲基丙烯酰-CoA水解酶，并且所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，该第二组外源性核酸编码乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有MAA途径和异丙醇途径的微生物有机体，该MAA途径包括编码MAA途径酶并以足以产生MAA的量表达的第一组外源性核酸，该第一组外源性核酸编码甲基丙二酰-CoA变位酶，甲基丙二酰-CoA还原酶（形成醛)；3-羟基异丁酸脱氢酶，和3-羟基异丁酸脱水酶，并且所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，该第二组外源性核酸编码乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有MAA途径和异丙醇途径的微生物有机体，该MAA途径包括编码MAA途径酶并以足以产生MAA的量表达的第一组外源性核酸，该第一组外源性核酸编码甲基丙二酰-CoA变位酶，甲基丙二酰-CoA差向异构酶，甲基丙二酰-CoA转移酶，甲基丙二酰-CoA合成酶或者甲基丙二酰-CoA水解酶，甲基丙二酸还原酶，3-羟基异丁酸脱氢酶，和3-羟基异丁酸脱水酶，并且所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，该第二组外源性核酸编码乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有MAA途径和异丙醇途径的微生物有机体，该MAA途径包括编码MAA途径酶并以足以产生MAA的量表达的第一组外源性核酸，该第一组外源性核酸编码甲基丙二酰-CoA变位酶，甲基丙二酰-CoA转移酶，甲基丙二酰-CoA合成酶或者甲基丙二酰-CoA水解酶，甲基丙二酸还原酶，3-羟基异丁酸脱氢酶，和3-羟基异丁酸脱水酶，并且所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，该第二组外源性核酸编码乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有MAA途径和异丙醇途径的微生物有机体，该MAA途径包括编码MAA途径酶并以足以产生MAA的量表达的第一组外源性核酸，该第一组外源性核酸编码甲基丙二酰-CoA变位酶，甲基丙二酰-CoA差向异构酶，甲基丙二酰-CoA还原酶（形成醇），和3-羟基异丁酸脱水酶，并且所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，该第二组外源性核酸编码乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
在上述实施方式的另一方面，该微生物有机体具有乙酰-CoA途径，该乙酰-CoA途径具有编码乙酰-CoA途径酶并以足以产生乙酰-CoA的量表达的第三组外源性核酸，该第三组外源性核酸编码丙酮酸激酶，和丙酮酸脱氢酶或者丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶；或者丙酮酸甲酸裂解酶，丙酮酸甲酸裂解酶激活酶和甲酸脱氢酶。
在又一实施方式中，该微生物有机体具有琥珀酰-CoA途径，该琥珀酰-CoA途径具有编码琥珀酰-CoA途径酶并以足以产生琥珀酰-CoA的量表达的第三组外源性核酸，该第三组外源性核酸编码PEP羧激酶，PEP羧化酶，苹果酸脱氢酶，延胡索酸酶，延胡索酸还原酶，琥珀酰-CoA转移酶和琥珀酰-CoA合成酶。在另一方面，该第三组外源性核酸还编码丙酮酸羧化酶或者甲基丙二酰-CoA羧基转移酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有1,4-BDO途径和异丙醇途径的微生物有机体，该1,4-BDO途径包括编码1,4-BDO途径酶并以足以产生1,4-BDO的量表达的第一组外源性核酸，该第一组外源性核酸编码PEP羧激酶，PEP羧化酶，苹果酸脱氢酶，延胡索酸酶，延胡索酸还原酶，琥珀酰-CoA转移酶，琥珀酰-CoA合成酶，丙酮酸羧化酶，甲基丙二酰-CoA羧基转移酶，琥珀酰-CoA还原酶，琥珀酸还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酰-CoA转移酶，4-羟基丁酰-CoA合成酶，4-羟基丁酰-CoA还原酶（形成醛），4-羟基丁醛还原酶，4-羟基丁酸还原酶，4-羟基丁酸激酶，磷酸转-4-羟基丁酸化酶，4-羟基丁酰磷酸还原酶，4-羟基丁酰-CoA还原酶（形成醇），以及4-羟基丁醛还原酶，并且所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，该第二组外源性核酸编码丙酮酸激酶，丙酮酸脱氢酶，丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶，丙酮酸甲酸裂解酶，丙酮酸甲酸裂解酶激活酶，甲酸脱氢酶，乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶，乙酰乙酰-CoA水解酶，乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶和异丙醇脱氢酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有1,3-BDO途径和异丙醇途径的微生物有机体，该1,3-BDO途径包括编码1,3-BDO途径酶并以足以产生1,3-BDO的量表达的第一组外源性核酸，该第一组外源性核酸编码PEP羧激酶，PEP羧化酶，苹果酸脱氢酶，延胡索酸酶，延胡索酸还原酶，琥珀酰-CoA转移酶，琥珀酰-CoA合成酶，丙酮酸羧化酶，甲基丙二酰-CoA羧基转移酶，琥珀酰-CoA还原酶，琥珀酸还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酰-CoA转移酶，4-羟基丁酰-CoA合成酶，4-羟基丁酸激酶，磷酸转-4-羟基丁酸化酶，4-羟基丁酰-CoA脱水酶，巴豆酸酶，3-羟基丁酰-CoA还原酶（形成醛)，3-羟基丁醛还原酶，3-羟基丁酰-CoA转移酶，3-羟基丁酰-CoA合成酶，3-羟基丁酰-CoA水解酶，3-羟基丁酸还原酶和3-羟基丁酰-CoA还原酶（形成醇），并且所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，该第二组外源性核酸编码丙酮酸激酶，丙酮酸脱氢酶，丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶，丙酮酸甲酸裂解酶，丙酮酸甲酸裂解酶激活酶，甲酸脱氢酶，乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶，乙酰乙酰-CoA水解酶，乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶和异丙醇脱氢酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有MAA途径和异丙醇途径的微生物有机体，该MAA途径包括编码MAA途径酶并以足以产生MAA的量表达的第一组外源性核酸，该第一组外源性核酸编码PEP羧激酶，PEP羧化酶，苹果酸脱氢酶，延胡索酸酶，延胡索酸还原酶，琥珀酰-CoA转移酶，琥珀酰-CoA合成酶，丙酮酸羧化酶，甲基丙二酰-CoA羧基转移酶，琥珀酰-CoA还原酶，琥珀酸还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酰-CoA转移酶，4-羟基丁酰-CoA合成酶，4-羟基丁酸激酶，磷酸转-4-羟基丁酸化酶，4-羟基丁酰-CoA变位酶，3-羟基异丁酰-CoA转移酶，3-羟基异丁酰-CoA合成酶，3-羟基异丁酰-CoA水解酶，3-羟基异丁酰-CoA脱水酶，甲基丙烯酰-CoA转移酶，甲基丙烯酰-CoA合成酶，甲基丙烯酰-CoA水解酶和3-羟基异丁酸脱水酶，并且所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，该第二组外源性核酸编码丙酮酸激酶，丙酮酸脱氢酶，丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶，丙酮酸甲酸裂解酶，丙酮酸甲酸裂解酶激活酶，甲酸脱氢酶，乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶，乙酰乙酰-CoA水解酶，乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶和异丙醇脱氢酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有MAA途径和异丙醇途径的微生物有机体，该MAA途径包括编码MAA途径酶并以足以产生MAA的量表达的第一组外源性核酸，该第一组外源性核酸编码PEP羧激酶，PEP羧化酶，苹果酸脱氢酶，延胡索酸酶，延胡索酸还原酶，琥珀酰-CoA转移酶，琥珀酰-CoA合成酶，丙酮酸羧化酶，甲基丙二酰-CoA羧基转移酶，甲基丙二酰-CoA变位酶，甲基丙二酰-CoA差向异构酶，甲基丙二酰-CoA转移酶，甲基丙二酰-CoA合成酶，甲基丙二酰-CoA水解酶，甲基丙二酸还原酶，甲基丙二酰-CoA还原酶（形成醛)，3-羟基异丁酸脱氢酶，甲基丙二酰-CoA还原酶（形成醇）和3-羟基异丁酸脱水酶，并且所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，该第二组外源性核酸编码丙酮酸激酶，丙酮酸脱氢酶，丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶，丙酮酸甲酸裂解酶，丙酮酸甲酸裂解酶激活酶，甲酸脱氢酶，乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶，乙酰乙酰-CoA水解酶，乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶和异丙醇脱氢酶。
上述每个实施方式的另一方面，所述的外源性核酸是异源核酸。
在每个所述实施方式的另一方面，所述的非天然存在的微生物有机体在基本上厌氧的培养基中。
在另外的实施方式中，本发明提供一种具有正丙醇和异丙醇途径的非天然存在的微生物有机体，其中该非天然存在的微生物有机体包括至少一种编码一种酶或者蛋白质的外源性核酸，其中该酶或者蛋白质将选自如下的底物转化成产物：
磷酸烯醇式丙酮酸转化成草酰乙酸，草酰乙酸转化成苹果酸，苹果酸转化成延胡索酸，延胡索酸转化成琥珀酸，琥珀酸转化成琥珀酰-CoA，琥珀酰-CoA转化成(R)-甲基丙二酰-CoA，(R)-甲基丙二酰-CoA转化成(S)-甲基丙二酰-CoA，(S)-甲基丙二酰-CoA转化成丙酰-CoA，丙酰-CoA转化成丙醛，丙醛转化成正丙醇，丙酰-CoA转化成丙酰磷酸，丙酰-CoA转化成丙酸，丙酸转化成丙酰磷酸，丙酸转化成丙醛，丙酰磷酸转化成丙醛，磷酸烯醇式丙酮酸转化成丙酮酸，丙酮酸转化成草酰乙酸，丙酮酸转化成乙酰-CoA，丙酮酸转化成乙酰-CoA和甲酸，甲酸转化成CO2，2分子乙酰-CoA底物转化成1分子乙酰乙酰-CoA产物，乙酰乙酰-CoA转化成乙酰乙酸，乙酰乙酸转化成丙酮，丙酮转化成异丙醇。本领域技术人员将理解这些仅仅是举例性的，并且本发明公开的任何底物产物对都适合生产目标产物，并且可有效将底物转化成产物的合适的活性对于本领域技术人员来说基于本发明的教导很容易确定。因此，本发明提供一种非天然存在的微生物有机体，其包括至少一种编码一种酶或者蛋白质的外源性核酸，其中该酶或者蛋白质转化正丙醇和异丙醇途径中底物和产物，如附图1所示。
在另外的实施方式中，本发明提供一种具有正丙醇和异丙醇途径的非天然存在的微生物有机体，其中该非天然存在的微生物有机体包括至少一种编码一种酶或者蛋白质的外源性核酸，其中该酶或者蛋白质将选自如下组成的组的底物转化成产物:磷酸烯醇式丙酮酸转化成草酰乙酸，草酰乙酸转化成苏氨酸，苏氨酸转化成2-氧代丁酸，2-氧代丁酸转化成丙酰-CoA，丙酰-CoA转化成丙醛，丙醛转化成正丙醇，2-氧代丁酸转化成丙醛，丙酰-CoA转化成丙酰磷酸，丙酰-CoA转化成丙酸，丙酸转化成丙酰磷酸，丙酸转化成丙醛，丙酰磷酸转化成丙醛，磷酸烯醇式丙酮酸转化成丙酮酸，丙酮酸转化成草酰乙酸，丙酮酸转化成乙酰-CoA，丙酮酸转化成乙酰-CoA和甲酸，甲酸转化成CO2，2分子乙酰-CoA底物转化成1分子乙酰乙酰-CoA产物，乙酰乙酰-CoA转化成乙酰乙酸，乙酰乙酸转化成丙酮，丙酮转化成异丙醇。本领域技术人员将理解这些仅仅是举例性的，并且本发明公开的任何底物产物对都适合生产目标产物，并且其中可有效将底物转化成产物的合适的活性对于本领域技术人员来说基于本发明的教导很容易确定。因此，本发明提供一种非天然存在的微生物有机体，其包括至少一种编码一种酶或者蛋白质的外源性核酸，其中该酶或者蛋白质转化正丙醇和异丙醇途径中底物和产物，如附图2所示。
在另外的实施方式中，本发明提供一种具有正丙醇和异丙醇途径的非天然存在的微生物有机体，其中该非天然存在的微生物有机体包括至少一种编码一种酶或者蛋白质的外源性核酸，其中该酶或者蛋白质将选自如下组成的组的底物转化成产物:磷酸烯醇式丙酮酸转化成丙酮酸，丙酮酸转化成乙酰-CoA，丙酮酸转化成乙酰-CoA和甲酸，甲酸转化成CO2，乙酰-CoA转化成丙二酰-CoA，丙二酰-CoA转化成丙二酸半醛，丙二酸半醛转化成3-羟基丙酸，3-羟基丙酸转化成丙酰-CoA，丙酰-CoA转化成丙醛，丙醛转化成正丙醇，丙酰-CoA转化成丙酰磷酸，丙酰-CoA转化成丙酸，丙酸转化成丙酰磷酸，丙酸转化成丙醛，丙酰磷酸转化成丙醛，2分子乙酰-CoA底物转化成1分子乙酰乙酰-CoA产物，乙酰乙酰-CoA转化成乙酰乙酸，乙酰乙酸转化成丙酮，丙酮转化成异丙醇。本领域技术人员将理解这些仅仅是举例性的，并且本发明公开的任何底物产物对都适合生产目标产物，并且其中可有效将底物转化成产物的合适的活性对于本领域技术人员来说基于本发明的教导很容易确定。因此，本发明提供一种非天然存在的微生物有机体，其包括至少一种编码一种酶或者蛋白质的外源性核酸，其中该酶或者蛋白质转化正丙醇和异丙醇途径中底物和产物，如附图3所示。
在另外的实施方式中，本发明提供一种具有正丙醇和异丙醇途径的非天然存在的微生物有机体，其中该非天然存在的微生物有机体包括至少一种编码一种酶或者蛋白质的外源性核酸，其中该酶或者蛋白质将选自如下组成的组的底物转化成产物:丙酮酸转化成D-乳酸，D-乳酸转化成乳酰-CoA，乳酰-CoA转化成丙烯酰-CoA，丙烯酰-CoA转化成丙酰-CoA，丙酰-CoA转化成丙醛，丙醛转化成正丙醇，丙酰-CoA转化成丙酰磷酸，丙酰-CoA转化成丙酸，丙酸转化成丙酰磷酸，丙酸转化成丙醛，丙酰磷酸转化成丙醛，丙酮酸转化成乙酰-CoA，丙酮酸转化成乙酰-CoA和甲酸，甲酸转化成CO2，2分子乙酰-CoA底物转化成1分子乙酰乙酰-CoA产物，乙酰乙酰-CoA转化成乙酰乙酸，乙酰乙酸转化成丙酮，丙酮转化成异丙醇。本领域技术人员将理解这些仅仅是举例性的，并且本发明公开的任何底物产物对都适合生产目标产物，并且其中可有效将底物转化成产物的合适的活性对于本领域技术人员来说基于本发明的教导很容易确定。因此，本发明提供一种非天然存在的微生物有机体，其包括至少一种编码一种酶或者蛋白质的外源性核酸，其中该酶或者蛋白质转化正丙醇和异丙醇途径中底物和产物，如附图4所示。
在另外的实施方式中，本发明提供一种具有正丙醇途径的非天然存在的微生物有机体，其中该非天然存在的微生物有机体包括至少一种编码一种酶或者蛋白质的外源性核酸，其中该酶或者蛋白质将选自如下组成的组的底物转化成产物:丙酰-CoA转化成丙醛，丙醛转化成正丙醇，丙酰-CoA转化成丙酰磷酸，丙酰-CoA转化成丙酸，丙酸转化成丙酰磷酸，丙酸转化成丙醛，和丙酰磷酸转化成丙醛。本领域技术人员将理解这些仅仅是举例性的，并且本发明公开的任何底物产物对都适合生产目标产物，并且其中可有效将底物转化成产物的合适的活性对于本领域技术人员来说基于本发明的教导很容易确定。因此，本发明提供一种非天然存在的微生物有机体，其包括至少一种编码一种酶或者蛋白质的外源性核酸，其中该酶或者蛋白质转化正丙醇和异丙醇途径中底物和产物，如附图1-4所示。
在另外的实施方式中，本发明提供一种具有1,4-BDO和异丙醇途径的非天然存在的微生物有机体，其中该非天然存在的微生物有机体包括至少一种编码一种酶或者蛋白质的外源性核酸，其中该酶或者蛋白质将选自如下组成的组的底物转化成产物:磷酸烯醇式丙酮酸转化成草酰乙酸，草酰乙酸转化成苹果酸，苹果酸转化成延胡索酸，延胡索酸转化成琥珀酸，琥珀酸转化成琥珀酰-CoA，琥珀酰-CoA转化成琥珀酸半醛，琥珀酸半醛转化成4-羟基丁酸，4-羟基丁酸转化成4-羟基丁酰-CoA，4-羟基丁酰-CoA转化成4-羟基丁醛，4-羟基丁醛转化成1,4-BDO，琥珀酸转化成琥珀酸半醛，4-羟基丁酸转化成4-羟基丁醛，4-羟基丁酸转化成4-羟基丁酰磷酸，4-羟基丁酰磷酸转化成4-羟基丁酰-CoA，4-羟基丁酰磷酸转化成4-羟基丁醛，4-羟基丁酰-CoA转化成1,4-BDO，丙酰-CoA转化成丙酰磷酸，丙酰磷酸转化成丙醛，磷酸烯醇式丙酮酸转化成丙酮酸，丙酮酸转化成草酰乙酸，丙酮酸转化成乙酰-CoA，丙酮酸转化成乙酰-CoA和甲酸，甲酸转化成CO2，2分子乙酰-CoA底物转化成1分子乙酰乙酰-CoA产物，乙酰乙酰-CoA转化成乙酰乙酸，乙酰乙酸转化成丙酮，丙酮转化成异丙醇。本领域技术人员将理解这些仅仅是举例性的，并且本发明公开的任何底物产物对都适合生产目标产物，并且其中可有效将底物转化成产物的合适的活性对于本领域技术人员来说基于本发明的教导很容易确定。因此，本发明提供一种非天然存在的微生物有机体，其包括至少一种编码一种酶或者蛋白质的外源性核酸，其中该酶或者蛋白质转化正丙醇和异丙醇途径中底物和产物，如附图5所示。
在另外的实施方式中，本发明提供一种具有1,3-BDO和异丙醇途径的非天然存在的微生物有机体，其中该非天然存在的微生物有机体包括至少一种编码一种酶或者蛋白质的外源性核酸，其中该酶或者蛋白质将选自如下组成的组的底物转化成产物:磷酸烯醇式丙酮酸转化成草酰乙酸，草酰乙酸转化成苹果酸，苹果酸转化成延胡索酸，延胡索酸转化成琥珀酸，琥珀酸转化成琥珀酰-CoA，琥珀酰-CoA转化成琥珀酸半醛，琥珀酸半醛转化成4-羟基丁酸，4-羟基丁酸转化成4-羟基丁酰-CoA，琥珀酸转化成琥珀酸半醛，4-羟基丁酸转化成4-羟基丁酰磷酸，4-羟基丁酰磷酸转化成4-羟基丁酰-CoA，4-羟基丁酰-CoA转化成巴豆酰-CoA，巴豆酰-CoA转化成3-羟基丁酰-CoA，3-羟基丁酰-CoA转化成3-羟基丁醛，3-羟基丁酰-CoA转化成3-羟基丁酸，3-羟基丁酸转化成3-羟基丁醛，3-羟基丁醛转化成1,3-BDO，3-羟基丁酰-CoA转化成1,3-BDO，丙酰-CoA转化成丙酰磷酸，丙酰磷酸转化成丙醛，磷酸烯醇式丙酮酸转化成丙酮酸，丙酮酸转化成草酰乙酸，丙酮酸转化成乙酰-CoA，丙酮酸转化成乙酰-CoA和甲酸，甲酸转化成CO2，2分子乙酰-CoA底物转化成1分子乙酰乙酰-CoA产物，乙酰乙酰-CoA转化成乙酰乙酸，乙酰乙酸转化成丙酮，丙酮转化成异丙醇。本领域技术人员将理解这些仅仅是举例性的，并且本发明公开的任何底物产物对都适合生产目标产物，并且其中可有效将底物转化成产物的合适的活性对于本领域技术人员来说基于本发明的教导很容易确定。因此，本发明提供一种非天然存在的微生物有机体，其包括至少一种编码一种酶或者蛋白质的外源性核酸，其中该酶或者蛋白质转化正丙醇和异丙醇途径中底物和产物，如附图6所示。
在另外的实施方式中，本发明提供一种具有MAA和异丙醇途径的非天然存在的微生物有机体，其中该非天然存在的微生物有机体包括至少一种编码一种酶或者蛋白质的外源性核酸，其中该酶或者蛋白质将选自如下组成的组的底物转化成产物:磷酸烯醇式丙酮酸转化成草酰乙酸，草酰乙酸转化成苹果酸，苹果酸转化成延胡索酸，延胡索酸转化成琥珀酸，琥珀酸转化成琥珀酰-CoA，琥珀酰-CoA转化成琥珀酸半醛，琥珀酸半醛转化成4-羟基丁酸，4-羟基丁酸转化成4-羟基丁酰-CoA，琥珀酸转化成琥珀酸半醛，4-羟基丁酸转化成4-羟基丁酰磷酸，4-羟基丁酰磷酸转化成4-羟基丁酰-CoA，4-羟基丁酰-CoA转化成3-羟基异丁酰-CoA，3-羟基异丁酰-CoA转化成3-羟基异丁酸，3-羟基异丁酰-CoA转化成甲基丙烯酰-CoA，甲基丙烯酰-CoA转化成MAA，3-羟基异丁酸转化成MAA，琥珀酰-CoA转化成(R)-甲基丙二酰-CoA，(R)-甲基丙二酰-CoA转化成(S)-甲基丙二酰-CoA，(S)-甲基丙二酰-CoA转化成甲基丙二酸半醛，(S)-甲基丙二酰-CoA转化成3-羟基异丁酸，甲基丙二酸半醛转化成3-羟基异丁酸，丙酰-CoA转化成丙酰磷酸，丙酰磷酸转化成丙醛，磷酸烯醇式丙酮酸转化成丙酮酸，丙酮酸转化成草酰乙酸，丙酮酸转化成乙酰-CoA，丙酮酸转化成乙酰-CoA和甲酸，甲酸转化成CO2，2分子乙酰-CoA底物转化成1分子乙酰乙酰-CoA产物，乙酰乙酰-CoA转化成乙酰乙酸，乙酰乙酸转化成丙酮，丙酮转化成异丙醇。本领域技术人员将理解这些仅仅是举例性的，并且本发明公开的任何底物产物对都适合生产目标产物，并且其中可有效将底物转化成产物的合适的活性对于本领域技术人员来说基于本发明的教导很容易确定。因此，本发明提供一种非天然存在的微生物有机体，其包括至少一种编码一种酶或者蛋白质的外源性核酸，其中该酶或者蛋白质转化正丙醇和异丙醇途径中底物和产物，如附图7和8所示。
当本发明一般地描述包括正丙醇和异丙醇，1,4-BDO和异丙醇，1,3-BDO和异丙醇或者MAA和异丙醇途径的微生物有机体时，可以理解本发明还提供一种包括至少一种外源性核酸的非天然存在的微生物有机体，该外源性核酸编码正丙醇，异丙醇，1,4-BDO，1,3-BDO和/或MAA途径酶，并且以足以产生正丙醇，异丙醇，1,4-BDO，1,3-BDO和/或MAA途径的中间体的量表达。例如，如本发明所公开的，正丙醇，异丙醇，1,4-BDO，1,3-BDO和/或MAA途径在附图1-8中举例说明。因此，除包括正丙醇和异丙醇，1,4-BDO和异丙醇，1,3-BDO和异丙醇或者MAA和异丙醇途径的微生物有机体之外，其中所述途径产生正丙醇和异丙醇，1,4-BDO和异丙醇，1,3-BDO和异丙醇或者MAA和异丙醇，本发明还提供一种包括至少一种外源性核酸的非天然存在的微生物有机体，该外源性核酸编码正丙醇，异丙醇，1,4-BDO，1,3-BDO和/或MAA途径酶，其中该微生物有机体产生正丙醇，异丙醇，1,4-BDO，1,3-BDO和/或MAA途径中间体，例如，丙酮，甲基丙二酰-CoA，丙酰磷酸，2-氧代丁酸，3-羟基丙酸，乳酰-CoA，4-羟基丁酸，4-羟基丁酰磷酸，巴豆酰-CoA，琥珀酰-CoA，琥珀酸半醛或者3-羟基异丁酰-CoA。
可以理解的是，任何本发明公开的途径，如在实施例中所描述和在附图中所举例说明的，包括附图1-8的途径，可用于产生非天然存在的微生物有机体，其按需要生产任何途径中间体或者产品。如本发明所公开的，这种产生中间体的微生物有机体可以与另一种表达下游途径酶的微生物有机体相结合使用，来生产需要的产品。然而可以理解的是，产生正丙醇，异丙醇，1,4-BDO，1,3-BDO和/或MAA中间体的非天然存在的微生物有机体可用于生产期望产品的中间体。
本文描述的发明一般涉及代谢反应，反应物或其产物，或者具体涉及一种或多种核酸或基因，所述核酸或基因编码与所提及代谢反应，反应物或产物相关的酶或蛋白质，或者催化所提及代谢反应的酶。除非本发明另外明确说明，本领域技术人员将理解提及反应也表示提及该反应的反应物和产物。类似地，除非本发明另外明确说明，提及反应物或产物时也表示提及该反应，并且提及任何这些代谢组成时也表示提及一种或多种编码包括在所提及反应，反应物或产物中的催化酶或蛋白质的基因。同样，考虑到公知领域代谢生物化学，酶学和基因组学，本发明提及基因或编码核酸也等同于提及相应的编码酶和其催化的反应，或者与反应相关的蛋白，以及该反应的反应物和产物。
本发明的非天然存在的微生物有机体可通过引入编码一种或多种酶或蛋白质的可表达核酸来产生，所述酶或蛋白质参与一种或多种异丙醇，4-羟基丁酸酯或1,4-丁二醇生物合成途径。取决于为生物合成所选的宿主微生物有机体，可表达部分或所有的特定异丙醇，4-羟基丁酸酯或1,4-丁二醇生物合成途径的核酸。例如，如果所选宿主缺乏期望的生物合成途径的一种或多种酶或蛋白质，那么将用于所缺乏酶或蛋白质的可表达核酸引入到宿主中供随后的外源性表达。或者，如果所选宿主展现出内源性表达一些途径基因，但是缺乏其它基因，那么需要编码所缺乏东西酶或蛋白质的核酸以便实现正丙醇，异丙醇，1,4-BDO，1,3-BDO和/或MAA的生物合成。因此，本发明的非天然存在的微生物有机体可通过引入外源性酶或蛋白质活性以获得期望的生物合成途径来产生，或者期望的生物合成途径可通过引入一种或多种外源性酶或蛋白质活性来获得，所述的一种或多种外源性酶或蛋白质活性与一种或多种内源性酶或蛋白质一起产生例如正丙醇，异丙醇，1,4-BDO，1,3-BDO和/或MAA。
取决于所选宿主微生物有机体的正丙醇，异丙醇，1,4-BDO，1,3-BDO和/或MAA生物合成途径的组分，本发明的非天然存在的微生物有机体将包括至少一种外源性表达的编码正丙醇，异丙醇，1,4-BDO，1,3-BDO和/或MAA途径的核酸，并且最多包括正丙醇，异丙醇，1,4-BDO，1,3-BDO和/或MAA生物合成途径中一种或多种的所有编码核酸。例如，正丙醇，异丙醇，1,4-BDO，1,3-BDO和/或MAA生物合成可在缺乏途径酶或蛋白质的宿主中通过外源性表达相应的编码核酸来实现。在缺乏正丙醇，异丙醇，1,4-BDO，1,3-BDO和/或MAA途径的所有酶或蛋白质的宿主中，可包括该途径中的所有酶或蛋白质的外源性表达，但应理解，即使宿主含有至少一种途径酶或蛋白质，也可表达途径的所有酶或蛋白质。例如，可包括产生正丙醇和异丙醇的途径的所有酶或蛋白质的外源性表达，例如PEP羧激酶或者PEP羧化酶，苹果酸脱氢酶，延胡索酸酶，延胡索酸还原酶，琥珀酰-CoA转移酶或者琥珀酰-CoA合成酶，甲基丙二酰-CoA变位酶，甲基丙二酰-CoA差向异构酶，甲基丙二酰-CoA脱羧酶，以及丙醛脱氢酶和丙醇脱氢酶；或者丙酰-CoA:磷酸丙酰基转移酶和丙酰磷酸还原酶，丙酮酸激酶，丙酮酸脱氢酶或者丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶；或者丙酮酸甲酸裂解酶，丙酮酸甲酸裂解酶激活酶和甲酸脱氢酶，乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶，如附图1所述。
考虑到本发明提供的教导和指导，本领域熟练的技术人员将理解，以可表达形式内导入的编码核酸的数量将（至少）与所选宿主微生物有机体的正丙醇，异丙醇，1,4-BDO，1,3-BDO和/或MAA途径缺失数相当。因此，本发明的非天然存在的微生物有机体可具有1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20或者21，最多所有的编码酶或者蛋白质的核酸，所述的酶或者蛋白质组成本发明公开的正丙醇，异丙醇，1,4-BDO，1,3-BDO和/或MAA生物合成途径。在某些实施方式中，非天然存在的微生物有机体也可包括其它基因修饰，便于或者优化正丙醇，异丙醇，1,4-BDO，1,3-BDO和/或MAA生物合成或者给宿主微生物有机体赋予其它有用功能。一种该其它功能可包括，例如，增加一种或多种正丙醇，异丙醇，1,4-BDO，1,3-BDO和/或MAA途径前体的合成，例如磷酸烯醇式丙酮酸或者丙酮酸。
一般来说，对宿主微生物有机体进行选择，以便其能产生正丙醇，异丙醇，1,4-BDO，1,3-BDO和/或MAA途径的前体，该前提作为天然产生的分子或工程产物，该工程产物既可提供期望前体的从头产生，或者增加由宿主微生物有机体天然产生的前体的产生。例如，磷酸烯醇式丙酮酸和丙酮酸在宿主有机体如大肠杆菌中天然产生。宿主有机体可经工程改造以便增加前体的产量，如本发明所公开。此外，已经工程改造以产生期望前体的微生物有机体可用作宿主有机体，并且进一步经工程改造以表达正丙醇，异丙醇，1,4-BDO，1,3-BDO和/或MAA途径的酶或蛋白质。
在一些实施方式中，本发明的非天然存在的微生物有机体是从包含合成正丙醇，异丙醇，1,4-BDO，1,3-BDO和/或MAA的酶促能力的宿主产生。在此具体实施方式中，增加正丙醇，异丙醇，1,4-BDO，1,3-BDO和/或MAA途径产物的合成或积累，对于例如促使正丙醇，异丙醇，1,4-BDO，1,3-BDO和/或MAA途径反应朝产生正丙醇，异丙醇，1,4-BDO，1,3-BDO和/或MAA的方向进行可能是有用的。增加的合成或积累可通过例如编码一种或多种上述正丙醇，异丙醇，1,4-BDO，1,3-BDO和/或MAA途径酶或蛋白质的核酸的过度表达来实现。正丙醇，异丙醇，1,4-BDO，1,3-BDO和/或MAA途径的一种或多种酶和/或蛋白的过度表达可例如通过内源基因的外源表达或通过异源基因的外源表达来进行。因此，天然存在的有机体可容易地产生本发明的非天然存在的微生物有机体，从而例如通过过度表达一种，两种，三种，四种，五种，六种，七种，八种，九种，十种，十一种，十二种，十三种，十四种，十五种，十六种，十七种，十八种，十九种，二十种或二十一种，至多所有的编码正丙醇，异丙醇，1,4-BDO，1,3-BDO和/或MAA生物合成途径酶或蛋白质的核酸，来产生正丙醇，异丙醇，1,4-BDO，1,3-BDO和/或MAA。此外，非天然存在的有机体可通过诱发内源基因的突变，从而导致正丙醇，异丙醇，1,4-BDO，1,3-BDO和/或MAA生物合成途径中的酶活性增加来产生。
在尤其有用的实施方式中，利用编码核酸的外源表达。外源表达赋予宿主定制表达和/或调控元件的能力，以及实现由使用者控制的期望表达水平的应用。然而，在其它实施方式中也可利用内源表达，例如当连接于可诱导的启动子或其它调控元件时通过移除负调控因子或诱导基因的启动子。因此，具有天然存在的可诱导启动子的内源基因可通过提供适当的诱导剂而得到上调，或内源基因的调控区可经工程改造以整合可诱导的调控元件，从而允许在期望时对内源基因增加的表达进行调控。类似地，可包含可诱导的启动子作为将外源基因导入非天然存在的微生物有机体的调控元件。
应理解，在本发明的方法中，一种或多种外源核酸中的任一种都可导入到微生物有机体中以产生本发明的非天然存在的微生物有机体。可将核酸导入以便赋予微生物有机体例如正丙醇，异丙醇，1,4-BDO，1,3-BDO和/或MAA生物合成途径。或者，可导入编码核酸以产生中间微生物有机体，该中间微生物有机体具有催化一些期望的反应的生物合成能力，以赋予正丙醇，异丙醇，1,4-BDO，1,3-BDO和/或MAA生物合成能力。例如，具有正丙醇和异丙醇，1,4-BDO和异丙醇，1,3-BDO和异丙醇，或者MAA和异丙醇生物合成途径的非天然存在的微生物有机体，可包括至少两种编码期望的酶或蛋白质的外源核酸。例如丙醛脱氢酶和异丙醇脱氢酶的组合，或者丙酰-CoA合成酶和乙酰-CoA乙酰基硫解酶的组合，或者乳酸脱氢酶和乙酰-CoA硫解酶的组合，或者琥珀酰-CoA还原酶和4-羟基丁酰-CoA还原酶（形成醇）的组合，或者巴豆酸酶和乙酰乙酸脱羧酶的组合，或者4-羟基丁酸激酶和磷酸转-4-羟基丁酸化酶的组合，或者甲基丙二酰-CoA还原酶（形成醇）和丙酮酸激酶的组合等等。因此应理解，本发明的非天然存在的微生物有机体可包括生物合成途径的两种或两种以上酶或蛋白质的任意组合。类似地，应理解，本发明的非天然存在的微生物有机体根据需要可包括生物合成途径的三种或三种以上酶或蛋白质的任何组合，例如，PEP羧激酶，乙酰-CoA乙酰基硫解酶和丙醇脱氢酶，或者丙酮酸激酶，乙酰乙酸脱羧酶和2-氧代丁酸脱氢酶，或者丙酰-CoA:磷酸丙酰基转移酶，丙酰磷酸还原酶和异丙醇脱氢酶，或者乳酰-CoA转移酶和乳酰-CoA脱水酶和丙酮酸甲酸裂解酶，或者琥珀酰-CoA脱氢酶，4-羟基丁酸还原酶和4-羟基丁醛还原酶，或者巴豆酸酶，PEP羧化酶和乙酰乙酸脱羧酶，或者3-羟基异丁酰-CoA合成酶，延胡索酸酶和异丙醇脱氢酶，或者乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酸脱羧酶和甲基丙二酰-CoA还原酶（形成醇）等等，只要期望的生物合成途径的酶和/或蛋白的组合导致产生对应的目标产物即可。类似地，本发明的非天然存在的微生物有机体根据需要可包括如本发明所公开的生物合成途径的四种或以上的酶或蛋白质的任何组合，例如，丙酮酸羧化酶，苹果酸脱氢酶，甲基丙二酰-CoA差向异构酶和乙酰乙酰-CoA水解酶，或者乙酰-CoA乙酰基硫解酶，异丙醇脱氢酶，丙醛脱氢酶和丙醇脱氢酶，或者乙酰-CoA羧化酶，丙二酰-CoA还原酶，丙二酸半醛和乙酰乙酸脱羧酶，或者，丙烯酰-CoA还原酶，乙酰乙酰-CoA转移酶，乙酰乙酸脱羧酶和异丙醇脱氢酶，或者琥珀酰-CoA脱氢酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酰-CoA转移酶和异丙醇脱氢酶，或者琥珀酸还原酶，3-羟基异丁酰-CoA合成酶，3-羟基异丁酸脱水酶和丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶，或者乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶，甲基丙二酰-CoA变位酶和羟基异丁酸脱水酶，只要期望的生物合成途径的酶和蛋白质组合导致产生相应目标产品即可。
应理解，当在微生物有机体中包括多个外源核酸时，该多个外源核酸是指提及的编码核酸或生物合成活性，如上所述。能进一步理解，如本发明所公开的，多个外源核酸可以被导入到宿主微生物有机体中的独立核酸分子，多顺反子核酸分子，或者其组合上，但仍然被认为是多个外源核酸。例如，所本发明所公开，微生物有机体可以设计成表达两个或两个以上编码期望的途径酶或蛋白质的外源核酸。在两个编码期望活性的外源核酸导入到宿主微生物有机体的情况下，应理解，该两个外源核酸可以作为单一核酸导入到（例如）单一质粒上，独立的质粒上，可以整合到宿主染色体的单一位点或多位点，仍然被认为是两个外源核酸。同样，应理解，两个以上的外源核酸可以任何需要的组合导入到宿主生物体中的（例如）单一质粒上，单独质粒上，可在单一位点或多个为整合到宿主的染色体中，仍然被认为是两个或两个以上的外源核酸，例如三个外源核酸。因此，所提及外源核酸的数量和生物合成活性是指编码核酸的数量或者生物合成活性的数量，而不是导入到宿主生物体的独立核酸的数量。
除了本发明所述的正丙醇，异丙醇，1,4-BDO，1,3-BDO和/或MAA的生物合成外，本发明的非天然存在的微生物有机体和方法也可以彼此之间以及与本领域公知的其它微生物有机体和方法进行各种组合来利用，以便通过其它途径实现产物的生物合成。例如，除了使用正丙醇，异丙醇，1,4-BDO，1,3-BDO和/或MAA的产生菌外，一种产生正丙醇，异丙醇，1,4-BDO，1,3-BDO和/或MAA的替代方案是添加另一种能够将正丙醇，异丙醇，1,4-BDO，1,3-BDO和/或MAA途径的中间体转化为正丙醇，异丙醇，1,4-BDO，1,3-BDO和/或MAA的微生物有机体。一种所述程序包括例如发酵可产生正丙醇，异丙醇，1,4-BDO，1,3-BDO和/或MAA途径中间体的微生物有机体。然后正丙醇，异丙醇，1,4-BDO，1,3-BDO和/或MAA途径中间体可用作底物以供第二微生物有机体将正丙醇，异丙醇，1,4-BDO，1,3-BDO和/或MAA途径中间体转化为正丙醇，异丙醇，1,4-BDO，1,3-BDO和/或MAA。正丙醇，异丙醇，1,4-BDO，1,3-BDO和/或MAA途径中间体可直接添加到第二有机体的另一培养物中，或者正丙醇，异丙醇，1,4-BDO，1,3-BDO和/或MAA途径中间体产生菌的原始培养物可通过例如细胞分离从这些微生物有机体中移除，然后可向发酵液中连续添加第二有机体，以便用于最终产物的产生而无需中间体纯化步骤。
在其它实施方式中，本发明的非天然存在的微生物有机体和方法可以众多亚途径装配以便实现例如正丙醇，异丙醇，1,4-BDO，1,3-BDO和/或MAA的生物合成。在这些实施方式中，本发明目标产物的生物合成途径可分配到不同的微生物有机体中，并且不同的微生物有机体可共培养以便产生最终产物。在这种生物合成方案中，一种微生物有机体的产物是第二种微生物有机体的底物，直到最终产物合成为止。例如，正丙醇，异丙醇，1,4-BDO，1,3-BDO和/或MAA的生物合成可通过构建含有用于将一种途径中间体转化为另一种途径中间体或产物的生物合成途径的微生物有机体来实现。或者，正丙醇，异丙醇，1,4-BDO，1,3-BDO和/或MAA也可通过使用两种有机体在同一容器中共培养或共发酵而从微生物有机体生物合成产生，其中第一微生物有机体产生丙酰-CoA，琥珀酰-CoA和/或乙酰-CoA中间体，而第二微生物有机体将所述中间体转化为正丙醇，异丙醇，1,4-BDO，1,3-BDO和/或MAA。
根据本发明提供的教导和指导，本领域技术人员将理解，本发明的非天然存在的微生物有机体和方法，与其它微生物有机体一起，与具有亚途径的其它非天然存在的微生物有机体的共同培养物一起，以及与本领域中公知的用于产生正丙醇，异丙醇，1,4-BDO，1,3-BDO和/或MAA的其它化学和/或生物化学程序的组合一起，存在众多组合和置换。
正丙醇，异丙醇，1,4-BDO，1,3-BDO和/或MAA途径酶或蛋白质的编码核酸的来源可包括例如其中所编码基因产物能够催化所提及反应的任何物种。这种物种包括原核和真核有机体，包括但不限于细菌（包括古细菌和真细菌）和真核生物（包括酵母，植物，昆虫，动物和哺乳动物，包括人类）。所述来源的示例性物种包括例如大肠杆菌（Escherichiacoli），醋酸菌（Acetobacter pasteurians），布氏酸菌（Acidanus brierleyi），贝氏不动杆菌（Acinetobacter baylyi），醋酸钙不动杆菌（Acinetobactercalcoaceticus），不动杆菌M-1菌株（Acinetobacter sp.Strain M-1），琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes），琥珀酸厌氧螺杆菌（Anaerobiospirillum succiniciproducens），Anaerostipes caccae DSM14662，拟南芥（Arabidopsis thaliana），蜡样芽胞杆菌ATCC 14579（Bacillus cereus ATCC 14579），枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），枯草芽孢杆菌亚种菌株168（Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168），牛（Bostaurus），慢生型大豆根瘤菌USDA110（Bradyrhizobium japonicumUSDA110），秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans），空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni），莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii），橙色绿屈挠菌（Chloroflexus aurantiacus），丙酮丁酸梭菌（Clostridiumacetobutylicum），丙酮丁酸梭菌ATCC 824（Clostridium acetobutylicumATCC 824），拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii），C型肉毒杆菌埃克隆德菌株（Clostridium botulinum C str.Eklund），克氏梭状芽孢杆菌（Clostridiumkluyveri），克氏梭状芽孢杆菌DSM 555（Clostridium kluyveri DSM 555），诺维氏梭状芽胞杆菌-NT（Clostridium novyi-NT)，丙酸梭菌（Clostridiumpropionicum），糖丁酸梭菌（Clostridium saccharobutylicum），糖乙酸多丁醇梭菌（Clostridium saccharoperbutyl-acetonicum），谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum），非洲脱硫弧菌（Desulfovibrio africanus），赤杆菌NAP1（Erythrobacter sp.NAP1），大肠杆菌K12，大肠杆菌K12菌株MG1655，大肠杆菌O157:H7，热糖苷酶地芽孢杆菌M10EXG（Geobacillus thermoglucosidasius M10EXG），流感嗜血杆菌（Haemohilusinfluenza，），幽门螺杆菌（Helicobacter pylori），智人（Homo sapiens），肺炎杆菌MGH78578（Klebsiella pneumonia MGH78578），乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis），干酪乳杆菌（Lactobacillus casei），植物乳杆菌WCFS1（Lactobacillus plantarum WCFS1），乳酸乳球菌（Lactococcuslactis），肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides），产琥珀酸曼氏杆菌（Mannheimia succiniciproducens），海洋γ蛋白菌HTCC2080（marinegamma proteobacterium HTCC2080），百脉根慢生根瘤菌（Mesorhizobiumloti），勤奋金属球菌（Metallosphaera sedula），扭曲甲基杆菌（Methylobacterium extorquens），热乙酸菌（Moorella thermoacetica），耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis），结核分支杆菌(Mycobacteriumtuberculosis），欧洲兔（Oryctolagus cuniculus），卵形疟原虫（Plasmodiumovale），牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis），疮疱丙酸杆菌（Propionibacterium acnes），费氏丙酸杆菌谢氏亚种（Propionibacteriumfredenreichii sp.shermanii），费氏丙酸杆菌（Propionibacteriumfreudenreichii），中度产丙酸菌（Propionigenium modestum），铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa），铜绿假单胞菌PAO1（Pseudomonasaeruginosa PAO1），荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens），恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida），恶臭假单胞菌E23（Pseudomonas putidaE23），恶臭假单胞菌KT2440（Pseudomonas putida KT2440），假单胞菌属（Pseudomonas sp），斯氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri），真氧产碱杆菌（Ralstonia eutropha），真氧产碱杆菌H16（Ralstonia eutropha H16），褐家鼠（Rattus norvegicus），球形红杆菌（Rhodobacter spaeroides），红假单胞菌DSM 15236（Rhodoferax ferrireducens DSM 15236），深红红螺菌（Rhodospirillum rubrum），Roseiflexus castenholzii，啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），肠道沙门氏菌（Salmonella enterica），鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium），福氏志贺氏菌（Shigella flexneri），希蒙德木（Simmondsia chinensis），变形链球菌（Streptococcus mutans），嗜酸热硫化叶菌（Sulfolobus acidocaldarius），硫磺矿硫化叶菌（Sulfolobussolfataricus），超嗜热古菌（Sulfolobus tokodaii），Syntrophobacterfumaroxidans，嗜热球菌（Thermococcus litoralis），海栖热袍菌（Thermotogamaritime），嗜热栖热菌（Thermus thermophilus），阴道毛滴虫G3（Trichomonas vaginalisG3），布氏锥虫（Trypanosoma brucei），极小韦永氏球菌（Veillonella parvula），弗氏耶尔森菌（Yersinia frederiksenii），运动发酵单孢菌（Zymomonas mobilis），巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium），丁酸产生菌L2-50（butyrate-producing bacterium L2-50），氨基丁酸梭菌（Clostridium aminobutyricum），热糖苷酶地芽孢杆菌（Geobacillusthermoglucosidasius），牛分枝杆菌BCG（Mycobacterium bovis BCG），皮疽诺卡氏菌IFM 10152（Nocardia farcinica IFM 10152），Nocardia iowensis(sp.NRRL 5646)，产黄青霉菌（Penicillium chrysogenum），牙龈卟啉单胞菌ATCC 33277（Porphyromonas gingivalis ATCC 33277），门多萨假单胞菌（Pseudomonas mendocina），灰色链霉菌NBRC 13350（Streptomycesgriseus subsp.griseus NBRC 13350），以及本发明公开的其它示例性物种，可作为相应基因的来源有机体获得。然而，目前可获得具有完整基因组序列的物种超过550种(其中超过一半可从例如NCBI等公开数据库获得)，包括395种微生物基因组和多种酵母，真菌，植物和哺乳动物基因组，从近缘或远缘物种中的一种或多种基因鉴定编码必需的正丙醇，异丙醇，1,4-BDO，1,3-BDO和/或MAA生物合成活性的基因是本领域常规的和众所周知的，包括例如已知基因的同源物，直系同源物，旁系同源物和非直系同源基因置换，以及有机体之间基因变异的交换。因此，允许提及的具体有机体（例如大肠杆菌）生物合成本发明所述的正丙醇，异丙醇，1,4-BDO，1,3-BDO和/或MAA的代谢变异可容易地应用于其它微生物，同样包括原核和真核有机体。根据本发明所提供的教导和指导，本领域技术人员将知悉在一种有机体中示例的代谢变异可同样地应用于其它有机体。
在某些情况下，例如当非亲缘物种中存在可替代的正丙醇，异丙醇，1,4-BDO，1,3-BDO和/或MAA生物合成途径时，可给宿主物种赋予正丙醇，异丙醇，1,4-BDO，1,3-BDO和/或MAA生物合成，通过例如从非亲缘物种外源表达一种或多种旁系同源物，其催化类似但不完全相同的代谢反应以替代所提及的反应。因为不同有机体的代谢网络之间存在某些差别，所以本领域技术人员将理解，不同有机体之间的实际基因用法可以不同。然而，根据本发明所提供的教导和指导，本领域技术人员还将理解，本发明的教导和方法可应用于所有的微生物有机体，其中给本发明所示例的物种使用同源代谢变异以在可合成正丙醇，异丙醇，1,4-BDO，1,3-BDO和/或MAA的感兴趣物种中构建微生物有机体。
宿主微生物有机体可选自（并且非天然存在的微生物有机体可从中产生）：例如细菌，酵母，真菌或任何适用于发酵过程的各种其它微生物中。示例性的细菌包括选自以下的物种：大肠杆菌，产酸克雷伯氏菌，琥珀酸厌氧螺菌，琥珀酸放线杆菌，琥珀酸曼海姆氏菌，菜豆根瘤菌，枯草芽孢杆菌，谷氨酸棒杆菌，Gluconobacter oxydans，运动发酵单孢菌，乳酸乳球菌，植物乳杆菌，天蓝色链霉菌，丙酮丁酸梭菌，荧光假单胞菌和恶臭假单胞菌。示例性的酵母或真菌包括选自以下的物种：啤酒酵母，粟酒裂殖酵母，乳酸克鲁维酵母，马克斯克鲁维酵母，土曲霉，黑曲霉和毕赤酵母。大肠杆菌是尤其有用的宿主有机体，因为它是得到充分表征的适用于基因工程的微生物有机体。其它尤其有用的宿主有机体包括酵母，例如啤酒酵母。其它特别有用的宿主有机体包括自然生产足量的丙酰-CoA和/或乙酰-CoA协同产生正丙醇和异丙醇的微生物有机体。这种有机体的实例包括但不限于，Clostrium propionicum，大肠杆菌和费氏丙酸杆菌谢氏亚种。
用于构建非天然存在的产生正丙醇，异丙醇，1,4-BDO，1,3-BDO和/或MAA的宿主和测试其表达水平的方法可通过例如本领域公知的重组和检测方法来进行。描述于例如Sambrook等，Molecular Cloning:ALaboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory，NewYork(2001)；和Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，JohnWiley和Sons，Baltimore，MD(1999)中可找到这种方法。
在产生正丙醇和异丙醇，1,4-BDO和异丙醇，1,3-BDO和异丙醇或者MAA和异丙醇的途径中所涉及的外源核酸序列，可使用本领域公知的技术稳定地或暂时地导入宿主细胞中，所述技术包括但不限于接合，电穿孔，化学转化，转导，转染和超声波转化。对于在大肠杆菌或其它原核细胞中的外源表达，真核核酸的基因或cDNA中的某些核酸序列可编码导向信号，例如N末端线粒体或其它导向信号，必要时其可在转化到原核宿主细胞之前被移除。例如，移除线粒体前导序列会导致在大肠杆菌中的表达有所增加（Hoffmeister等，J.Biol.Chem.280:4329-4338(2005)）。对于在酵母或其它真核细胞中的外源表达，基因可在胞浆中表达而无需添加前导序列，或者通过添加合适的导向序列（例如适于宿主细胞的线粒体导向或分泌信号）而导入线粒体或其它细胞器或导向分泌。因此，应理解为了移除或包括导向序列而对核酸序列所作的适当修饰可整合到外源核酸序列中以便赋予期望的性质。此外，可使用本领域公知的技术对基因进行密码子优化以获得蛋白的优化表达。
可构建一种或多种表达载体以包括如本发明所示例的一种或多种正丙醇，异丙醇，1,4-BDO，1,3-BDO和/或MAA生物合成途径编码核酸，所述编码核酸可操控性连接到在宿主有机体中具有功能的表达控制序列上。适用于本发明的微生物宿主有机体的表达载体包括例如质粒，噬菌体载体，病毒载体，游离基因和人工染色体，其包括可用于稳定整合到宿主染色体中的载体和选择序列或标记。另外，表达载体可包括一种或多种选择性标记基因和适当的表达控制序列。也可包括选择标记基因，其例如提供抗生素或毒素抗性，补充营养缺乏或供应培养基中没有的关键营养物。表达控制序列可包括本领域公知的组成型和诱导型启动子，转录增强子，转录终止子等。当要共表达两种或两种以上外源编码核酸时，这两种核酸皆可插入例如单一表达载体中或单独的表达载体中。对于单一载体表达，编码核酸可操控性地连接于一种常用表达控制序列或连接于不同的表达控制序列，例如一种诱导型启动子和一种组成型启动子。代谢或合成途径中所涉及的外源核酸序列的转化可使用本领域公知的方法进行证实。所述方法包括例如核酸分析，例如mRNA的Northern印迹或聚合酶链反应（PCR）扩增，或基因产物表达的免疫印迹技术，或其它用于测试所导入核酸序列或其对应基因产物的表达的合适分析方法。本领域技术人员应理解外源核酸是足量表达以产生目标产物，并且应进一步理解可使用本领域公知且如本发明所公开的方法优化表达水平以获得充分表达。
定向进化是一种有效方法，其包括为了改进和/或改变酶的性质引入导向特定基因的突变。改进或改变的酶可以通过发展或进行敏感的高通量筛选方法鉴定，所述方法允许自动筛选很多酶变异体（例如＞104）。通常进行重复的突变和筛选循环来提供具有优化性质的酶。能帮助鉴定基因的突变区的计算算法已经开发出来，并且能显著减少需要产生和筛选的酶变异的数量。
许多定向进化技术（其综述参见Hibbert等，Biomol.Eng 22:11-19(2005)；Huisman和Lalonde，In Biocatalysis in the pharmaceutical and biotechnologyindustries第717-742页(2007)，Patel(ed.)，CRC Press；Otten和Quax，Biomol.Eng22:1-9(2005)；以及Sen等，Appl Biochem.Biotechnol 143:212-223(2007)）已经被开发成有效产生完全不同的变异库，并且这些方法已经成功应用于在很多类酶之间改进各种范围的性质。
已经由定向进化技术改进和/或改变的酶特性包括例如，选择性/特异性——用于转化非天然的底物；温度稳定性-耐高温过程；pH值稳定性——用于在更低或者更高pH值条件下的生物过程；底物或产物耐受性——以便获得高的产品效价；结合力（Km）——扩大结合的底物范围，包括非天然底物；抑制率（Ki）-清除产物，底物，或者关键中间体的抑制作用；活性（kcat）——增加酶促反应速率以获得需要的通量；表达水平——增加蛋白质产量和总的途径通量；氧稳定性——用于在有氧条件下操作空气敏感的酶，以及厌氧活性——用于在缺氧条件下操作需氧酶。
以下示例的方法已经开发用于基因的突变和多样化，以定向获得具体酶的期望性质。任何这些都可用来改变/优化脱羧酶的活性。EpPCR（Pritchard等，JJ Theor.Biol 234:497-509(2005)）通过添加Mn2+离子，偏倚dNTP浓度，或者通过其它条件变量，减少PCR反应中DNA聚合成酶的保真度引入随机点突变。把突变限制在感兴趣目标基因的五步克隆方法包括：1）易错的PCR扩增目的基因；2）限制性内切酶消化；3）所需DNA片段的凝胶纯化；4）连接到载体；5）将基因变异体转化进合适的宿主，和筛选性能改进的库。这种方法能在单一基因内同时产生多个突变，这可能是有用的。通过EpPCR可以产生许多突变，因此高通量筛选方法或者选择方法（尤其是使用机器人）对于鉴定那些具有需要的性质的基因是有用的。
除了整个环形质粒用作模板外，易于出错的滚环扩增（epRCA）（Fujii等，Nucleic Acids Res 32:e145(2004)；和Fujii等，Nat.Protoc.1:2493-2497(2006)）与epPCR具有很多相同单元，并且在最后2个核苷酸具有抗外切核酸酶硫代磷酸连接体的随机6碱基用于扩增质粒，随后转化到细胞中，其中质粒在串联重复序列重新循环。调节Mn2+浓度可在一定程度改变突变率。此技术使用简单的易错的一步法来产生具有3-4突变/kbp的质粒的完整副本。不需要无限制性内切酶的消化或者特异的引物。另外，此方法通常作为试剂盒供应。
DNA或者家族改组（Stemmer，Proc Natl Acad Sci U.S.A.91:10747-10751(1994)；和Stemmer，Nature 370:389-391(1994)）通常包括消化具有核酸酶例如DNA酶I或者EndoV的两个或多个变异基因，以产生一批随机片，其在DNA聚合成酶存在下通过退火和延伸循环重组，以构建一个嵌合基因库。当一个副本与另一副本（模板开关）配对时片段相互配对并重组。这种方法可用于＞lkbp的DNA序列。除了由片段重组构建的变异重组体之外，这种方法在延伸步骤以类似于易错PCR的比率导入点突变。此方法可用于清除可能引起抗原性的有害的，随机的和中性的突变。
交错延伸（StEP）（Zhao等，Nat.Biotechnol 16:258-261(1998)）需要启动模板，随后重复变性和极短的退火/延伸期间（短达5秒）的2步PCR循环。增长的片段对不同的模板退火并进一步延长，其重复直到生成全长序列。模板转换意味着大多数产生的片段具有多个亲本。因为相反的突变谱，低保真聚合酶（Taq和Mutazyme）的组合还减少易错的偏倚。
在随机引发重组中（RPR）随机序列引物用来产生很多与模板不同部分互补的短DNA片段。（Shao等，Nucleic Acids Res 26:681-683(1998)）通过epPCR的碱基错参和错配产生点突变。基于同源的短DNA片段彼此配对，并且通过重复的热循环重组和重组成全长。在此步骤之前模板的移除保证低的亲本重组。与其它大多数方法一样，这种方法可通过多次迭代来进行以逐步形成独特性质。这项技术避免序列偏倚，不依赖于基因长度，应用时需要非常少的亲本DNA。
在异源双链重组中线性化的质粒DNA用来形成异源双链，其通过错配修复来修复。（Volkov等，Nucleic Acids Res 27:e18(1999)；和Volkov等，Methods Enzymol.328:456-463(2000)）该错配修复步骤至少有一些突变。异源双链转化比直链同源双链体更有效。这种方法适于大的基因和整个操纵子。
过渡模板随机嵌合生长（RACHITT）（Coco等，Nat.Biotechnol19:354-359(2001)）使用DNA酶I断裂和按大小分级ssDNA。同源片段在缺乏聚合酶的情况下与补充ssDNA脚手架杂交。任何重叠的非杂交片段末端被外切核酸酶向下配平。插入片段之间的缺口，然后连接到一批与脚手架杂交的全长多样性链（包括妨碍扩增的U）。该脚手架然后被破坏，并且被与通过PCR扩增的多样性链互补的新链替换。这种方法包括一个链（脚手架），其来自仅一个亲本，而引发片段来自其它基因；亲本脚手架相对选择。因此，亲本片段没有重退火发生。重叠片段用外切核酸酶配平。另外，这在概念上类似于DNA改组和StEP。因此，应该没有同胞种，很少无活性和没有未改组的亲本。这种技术优点是相对于标准DNA改组很少或者没有亲本基因产生和导致更多交叉。
截短模板重组延伸（RETT）需要使用一批模板在单向ssDNA片段存在下模板调控从引物单向生长链。（Lee等，J.Molec.Catalysis 26:119-129(2003)）不使用DNA内切核酸酶。单向ssDNA由DNA聚合酶与随机引物或者系列缺失与外切核酸酶制造。单向ssDNA仅是模板而非引物。随机引发和外切核酸酶作为实际的DNA改组/RACHITT的酶解不导入序列偏倚。RETT可能比StEP容易优化，因为其使用正常的PCR条件而不是非常短的延伸。重组作为PCR步骤的一个组分发生--而不直接改组。由于缺乏暂停这种方法也可能比StEP更随机。
简并寡核苷酸基因改组（DOGS）使用简并引物用来控制分子之间的重组；（Bergquist and Gibbs，Methods Mol.Biol352:191-204(2007)；Bergquist等，Biomol.Eng 22:63-72(2005)；Gibbs等，Gene 271:13-20(2001)）这可用来控制其它方法的趋势，例如DNA改组以再生亲本基因。这种方法可以与选择基因片段的随机突变（epPCR）结合。这可能是阻断亲本序列重新形成的一种好方法。不需要内切核酸酶。通过调整所制片段的输入浓度，一个能向需要的主链偏倚。此方法可使DNA从非亲缘亲本改组而没有限制性的酶消化，并且可以选择随机突变方法。
渐增切割法产生杂和酶（ITCHY）构建一个具有1个碱基缺失的目的基因或者基因片段的组合文库。（Ostermeier等，Proc Natl Acad Sci U.S.A.96:3562-3567(1999)；和Ostermeier等，Nat.Biotechnol 17:1205-1209(1999)）在2种不同的基因的相反方向上进行截短。它们彼此连接并且融合分子被克隆。这种技术在2种亲本基因之间不需要同源。当ITCHY与DNA改组结合时，该系统称为SCRATCHY（见下）。主要优点都是在亲本基因之间不需要同源；例如，在大肠杆菌和人类基因之间的功能融合通过ITCHY来构建。当建立ITCHY文库时，所有可能的交叉都被捕获。
硫代磷酸dNTPs用来产生截短除了外，硫代渐增切割法产生杂和酶（THIO-ITCHY）类似于ITCHY。（Lutz等，Nucleic Acids Res 29:E16(2001)）相对于ITCHY来说，THIO-ITCHY可能更容易优化，提供更多的再现性和可调性。
SCRATCHY与两种方法ITCHY和DNA改组结合用于基因重组。（Lutz等，Proc Natl Acad Sci U.S.A.98:11248-11253(2001)）SCRATCHY与ITCHY和DNA改组的最好特征相结合。首先，ITCHY用来在基因片段之间以DNA同源依赖的方式创建一整套融合。这种人造家族然后经过一个DNA改组步骤以增加交叉的数量。计算预测可用于优化。当序列同源性低于80%时，SCRATCHY比DNA改组更有效。
在随机漂移突变（RNDM）中突变通过epPCR产生，随后筛选/选择保留可用活性的那些（Bergquist等，Biomol.Eng 22:63-72(2005)）。然后，将它们用于DOGS与多活性突变之间或者活性突变和某些其它期望的亲本之间的融合物产生重组体。旨在促进中性突变的分离；其目的是筛选保留的催化活性，不论该活性比原始基因中的更高或者更低。当筛选能在背景上检测活性时，RNDM可用于高通量方法。RNDM已经在产生多样性中用于DOGS前端。这种技术在改组或者其它后续过程之前对活性需要产生影响；中性漂移文库表明导致更高/更快的从小分子文库中的活性改进。虽然已公开使用epPCR，但是这可适用于其它大规模的突变方法。
序列饱和突变（SeSaM）是一种随机突变方法，其:1）使用随机掺入硫代核苷酸和分裂产生随机长度的片段池；2）在“普通”碱基例如次黄嘌呤核苷存在下所述的池用作延长的模板；3）复制含次黄嘌呤核苷的补体，得随机的碱基掺入以及，从而，发生突变（Wong等，Biotechnol J 3:74-82(2008)；Wong等，Nucleic Acids Res 32:e26(2004);以及Wong等人，Anal.Biochem.341:187-189(2005)）。使用这种技术，用简单方法在2-3天内产生一个大的突变体文库是可能的。这种技术与DNA聚合酶的突变偏倚相比是非定向的。此方法中的差别使这种技术是对epPCR的补充（或者替代）。
在合成改组中，重叠的核苷酸被设计成编码“所有的目的基因多样性”，并且允许经改组的后代有非常高的多样性（Ness等，Nat.Biotechnol 20:1251-1255(2002)）。在这种技术中，技术人员可设计待改组的片段。这有助于增加所得后代的多样性。技术人员可设计序列/密码子偏倚以使更远亲缘关系的序列以接近于具有更近亲缘关系的序列所观察到的比率重新结合。另外，这种技术不需要物理上拥有模板基因。
核苷酸交换和剪切技术NexT利用dUTP整合与哌啶进行端点DNA片段的结合，其中dUTP整合之后通过用尿嘧啶DNA糖基化酶处理（Muller等，NucleicAcids Res 33:e117(2005)）。基因用校对聚合酶延伸内部PCR引物重组。改组的大小用不同dUPT::dTTP比率直接可控。这是将简单方法用于尿嘧啶结合和分裂的一种反应端点。其它核苷酸类似物可用于这种方法，例如8-氧代鸟嘌呤。另外，这种技术用非常短的片段（86bp）很有效，并且具有低的错误率。用于这种技术的DNA化学切割导致非常少的未改组克隆。
在序列同源-独立的蛋白质重组（SHIPREC）中，连接体用于促进在两种远亲/非亲缘基因之间融合。核酸酶处理用于在两个之间产生很多嵌合体。这些融合导致单点交叉的杂交文库（Sieber等，Nat.Biotechnol 19:456-460(2001)）。这产生有限类型的改组并且独立过程法是突变所必需的。另外，由于不需要同源性，此技术可构建两条非亲缘亲本基因中每一条的各种大小片段的嵌合体文库。SHIPREC采用细菌CP450的血红素结合域与哺乳动物CP450的N末端区域的融合进行检验；这在更易溶解的酶中产生哺乳动物活性。
在基因位点饱和突变TM（GSSMTM）中，起始原料是含有一个插入物和两个引物的超螺旋dsDNA质粒，所述引物在突变所期望的位点简并（Kretz等，Methods Enzymol.388:3-11(2004)）。引物携带有目的突变，在相反的DNA链退火成相同序列。突变通常在引物的中间，并且通过正确序列的～20个核苷酸与每边侧面相接。引物中的序列是NNN或者NNK（编码）和MNN（非编码）（N=全部4个碱基，K=G，T，M=A，C）。在延伸之后，DpnI用来消化dam-甲基化的DNA以消除野生型模板。这种技术在给定的基因座（即一个密码子）寻找全部可能的氨基酸替换。该技术有利于不需要无义密码子在单一位点产生全部可能的替换，并且导致与最大可能等位基因的接近等价的代表相等。这种技术不需要事先知晓目标酶的结构，机理或者结构域。如果继而进行改组或者基因重组，这项技术产生一个包括单位点向上突变的所有可能组合的重组体的多样性文库。应用这项技术的组合已经证明成功进化超过50种不同的酶，并且也证明了目标酶超过一种特性。
组合盒式突变（CCM）包括使用短的寡核苷酸盒子替换限制区域，使大量可能的氨基酸序列改变（Reidhaar-Olson等，Methods Enzymol.208:564-586(1991)；和Reidhaar-Olson等，Science 241:53-57(1988)）。同时在两个或三个位点替换可用到这种技术。此外，该方法检验在位点的有限范围内可能的序列改变的巨大多样性。这项技术已经被用于探索DNA结合域的λ抑制子信息含量。
组合多重盒式诱变（CMCM）除了其用作一个更大程序的一部分外基本上类似于CCM:1）将epPCR以高突变率应用于2）ID热点和热点区，然后3）通过CMCM延伸至覆盖蛋白质序列空间的定义区域（Reetz，M.T.，S.Wilensek，D.Zha，和K.E.Jaeger，2001，Directed Evolution of anEnantioselective Enzyme through Combinatorial Multiple-CassetteMutagenesis.Angew.Chem.Int.Ed Engl.40:3589-3591）。正如CCM，这种方法可以检验在目标区域的几乎所有可能的改变。如果随产生随机突变和基因改组的方法一起使用，其提供了一种产生多样性的，改组蛋白质的极好手段。这种方法成功增加酶的对映选择性51倍。
在突变株中技术条件ts突变质粒允许在选择和阻断积累有害突变的过程中当不需要选择时增加20-至4000-X随机性和自然突变频率（Selifonova等，ApplEnviron Microbiol 67:3645-3649(2001)）。这种技术是基于质粒来源的mutd5基因，其编码DNA聚合酶III的突变亚基。在含质粒的任何菌株中此亚基结合到内源性DNA聚合酶III并妨碍聚合酶III的校对能力。发生广谱的碱基替换和移码突变。为了有效利用，一旦获得所需的表型应删除突变质粒，这通过温度敏感的复制起点完成，其可使质粒在41℃固化。应当指出，突变株已经被找到相当一段时间（例如，参见Low等，J.Mol.Biol.260:359-3680(1996)）。在这种技术中观察到非常高的自发突变率。条件的特性使不期望的背景突变降到最小。这项技术可以与适应性进化相结合，以提高突变率和更快获得预期的表型。
“精确突变（LTM）是一种多维突变方法，其评估和优化组合所选氨基酸的突变。”（Rajpal等，Proc Natl Acad Sci U.S.A.102:8466-8471(2005)），与其用所有可能的氨基酸变化饱和每个位点，不如选择一组九个来覆盖氨基酸R-基团化学的范围。每个位点很少的变化可使多个位点受到这种类型的突变。通过这种方法已经实现抗体的亲和力增加＞800倍，从低纳摩尔到皮摩尔。这是一种合理的方法，通过极大地降低待筛选的克隆数使随机组合最小化并且可以增加发现改进性状的能力。这已应用到抗体工程，尤其是增加亲和力和/或减少解离。该技术可与筛选或选择相结合。
基因重组是一种DNA改组方法，其可同时应用于多个基因或者产生单一基因的嵌合体（多个突变）的大型文库。（可调的基因重组TM（TGRTM）技术由Verenium公司提供），通常这项技术用于与超高通量筛选组合，以查询期望的改进所代表的序列空间。这种技术可以让多基因重组独立于同源性。交叉事件的确切数量和位置可使用通过生物信息学分析设计的片段预先确定。这项技术导致非常高的水平的多样性，几乎没有亲本基因的再形成，以及低水平的无效基因。与GSSMTM相结合，可以检测到改进活性的大范围的突变。该方法可“协调”和“微调”DNA改组，例如:密码子的使用可以得到优化。
计算机蛋白质设计自动化（PDA）是一种优化算法，其锚着于具有特定折叠的结构定义的蛋白质骨架，搜寻序列空间的氨基酸替代物，其能够稳定折叠和总的蛋白质能量（Hayes等，Proc Natl Acad Sci U.S.A.99:15926-15931(2002)）。该技术用于计算机基于结构的熵预测，目的是寻找对蛋白质的氨基酸变化的结构耐受性。统计力学应用于计算每个位置的耦合作用。对氨基酸替代的结构耐受性是一种耦合的测量方法。最终，这项技术设计成产生蛋白质性质所需的修饰而保持结构特点的完整性。方法进行计算评估并可过滤极大量的可能的序列变异（1050）。选择测试的序列变异与基于最有利热力学的预测有关。表面上只有与稳定性有关的稳定性或性质可以用这一技术有效地解决。该方法已成功地用于一些治疗性蛋白质，尤其是工程免疫球蛋白。计算机预测避免测试极大量的潜在变异。基于现有的三维结构预测很可能比基于假定结构的预测更容易成功。这种技术可以很容易地预测，并且可定向筛选多个同时发生的突变，这对于纯粹的实验技术几乎是不可能的，因为数量成指数上升。
重复饱和突变（ISM）包括：1）使用结构/功能知识选择可能的改善酶的位点；2）使用Stratagene QuikChange（或其它合适的手段)在选择的位点饱和突变；3）筛选/选择期望的属性；和4）用改良的克隆在另一位点开始，并继续重复。（Reetz等，Nat.Protoc 2:891-903(2007)；和Reetz等，Angew.Chem.Int.Ed Engl45:7745-7751(2006)）这是一个行之有效的方法，其确保在指定位置所有可能的替代都用来筛选/选择。
任何前述的突变方法都可以单独或者以任何组合方式使用。另外，任何一种或者组合的定向进化方法都可用于与合适的进化技术结合。
在一个实施方式中，本发明提供一种产生正丙醇和异丙醇的方法，包括培养一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有正丙醇途径和异丙醇途径的微生物有机体，该正丙醇途径具有至少一种编码正丙醇途径酶并以足以产生正丙醇的量表达的外源性核酸，该正丙醇途径包括丙醛脱氢酶，丙醇脱氢酶，丙酰-CoA:磷酸丙酰基转移酶，丙酰-CoA水解酶，丙酰-CoA转移酶，丙酰-CoA合成酶，丙酸激酶，丙酸还原酶或者丙酰磷酸还原酶，该异丙醇途径包括至少一种编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的外源性核酸，该异丙醇途径包括乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶，乙酰乙酰-CoA水解酶，乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶或者异丙醇脱氢酶。
在上述实施方式的另一方面，该方法包括具有乙酰-CoA途径的微生物有机体，所述乙酰-CoA途径具有至少一种编码乙酰-CoA途径酶并以足以产生乙酰-CoA的量表达的外源性核酸，该乙酰-CoA途径包括丙酮酸激酶，丙酮酸脱氢酶，丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶，丙酮酸甲酸裂解酶，丙酮酸甲酸裂解酶激活酶或者甲酸脱氢酶。
在又一实施方式中，这种方法包括具有丙酰CoA途径的微生物有机体，所述的丙酰CoA途径具有至少一种编码丙酰-CoA途径酶并以足以产生丙酰-CoA的量表达的外源性核酸，该丙酰-CoA途径包括PEP羧激酶，PEP羧化酶，苹果酸脱氢酶，延胡索酸酶，延胡索酸还原酶，琥珀酰-CoA转移酶，琥珀酰-CoA合成酶，甲基丙二酰-CoA变位酶，甲基丙二酰-CoA差向异构酶或者甲基丙二酰-CoA脱羧酶。另一方面，该丙酰-CoA途径包括丙酮酸羧化酶或者甲基丙二酰-CoA羧基转移酶。
在又一实施方式中，这种方法包括具有丙酰-CoA途径的微生物有机体，所述的丙酰-CoA途径具有至少一种编码丙酰-CoA途径酶并以足以产生丙酰-CoA的量表达的外源性核酸，该丙酰-CoA途径包括PEP羧激酶，PEP羧化酶，苏氨酸脱氨酶，或者2-氧代丁酸脱氢酶。另一方面，该正丙醇途径包括2-氧代丁酸脱羧酶。
在又一实施方式中，这种方法包括具有丙酰-CoA途径的微生物有机体，所述的丙酰-CoA途径具有至少一种编码丙酰-CoA途径酶并以足以产生丙酰-CoA的量表达的外源性核酸，该丙酰-CoA途径包括乙酰-CoA羧化酶，丙二酰-CoA还原酶，丙二酸半醛还原酶或者丙酰-CoA合成酶。
在又一实施方式中，这种方法包括具有丙酰-CoA途径的微生物有机体，所述的丙酰-CoA途径具有至少一种编码丙酰-CoA途径酶并以足以产生丙酰-CoA的量表达的外源性核酸，该丙酰-CoA途径包括乳酸脱氢酶，乳酰-CoA转移酶，乳酰-CoA脱水酶或者丙烯酰-CoA还原酶。
在又一实施方式中，本发明提供一种产生正丙醇和异丙醇的方法，包括培养一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有正丙醇途径和异丙醇途径的微生物有机体，该正丙醇途径具有编码正丙醇途径酶并以足以产生正丙醇的量表达的第一组外源性核酸，该第一组外源性核酸编码丙醛脱氢酶和丙醇脱氢酶；或者丙酰-CoA:磷酸丙酰基转移酶，丙酰磷酸还原酶和丙醇脱氢酶；或者丙酰-CoA水解酶或者丙酰-CoA转移酶或者丙酰-CoA合成酶，丙酸激酶，丙酰磷酸还原酶和丙醇脱氢酶；或者丙酰-CoA水解酶或者丙酰-CoA转移酶或者丙酰-CoA合成酶，丙酸还原酶和丙醇脱氢酶，并且该异丙醇途径具有编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，该第二组外源性核酸编码乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
在上述实施方式的另一方面，该方法包括具有乙酰-CoA途径的微生物有机体，所述的乙酰-CoA途径具有编码乙酰-CoA途径酶并以足以产生乙酰-CoA的量表达的第三组外源性核酸，该第三组外源性核酸编码丙酮酸激酶，以及丙酮酸脱氢酶或者丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶；或者丙酮酸甲酸裂解酶，丙酮酸甲酸裂解酶激活酶和甲酸脱氢酶。
在又一实施方式中，该方法包括具有丙酰-CoA途径的微生物有机体，该丙酰-CoA途径具有编码丙酰-CoA途径酶并以足以产生丙酰-CoA的量表达的第三组外源性核酸，该第三组外源性核酸编码PEP羧激酶或者PEP羧化酶，苹果酸脱氢酶，延胡索酸酶，延胡索酸还原酶，琥珀酰-CoA转移酶或者琥珀酰-CoA合成酶，甲基丙二酰-CoA变位酶，以及甲基丙二酰-CoA脱羧酶。另一方面，该第三组外源性核酸还编码甲基丙二酰-CoA差向异构酶或者丙酮酸羧化酶。
在又一实施方式中，该方法包括具有丙酰-CoA途径的微生物有机体，该丙酰-CoA途径具有编码丙酰-CoA途径酶并以足以产生丙酰-CoA的量表达的第三组外源性核酸，所述的第三组外源性核酸编码PEP羧激酶或者PEP羧化酶，苏氨酸脱氨酶，以及2-氧代丁酸脱氢酶。另一方面，该第三组外源性核酸还编码甲基丙二酰-CoA脱羧酶或者丙酮酸羧化酶。又一方面，第二组外源性核酸还编码2-氧代丁酸脱羧酶。
在又一实施方式中，该方法包括具有丙酰-CoA途径的微生物有机体，所述的丙酰-CoA途径具有编码丙酰-CoA途径酶并以足以产生丙酰-CoA的量表达的第三组外源性核酸，该第三组外源性核酸编码乙酰-CoA羧化酶，丙二酰-CoA还原酶，丙二酸半醛还原酶，以及丙酰-CoA合成酶。
在又一实施方式中，该方法包括具有丙酰-CoA途径的微生物有机体，该丙酰-CoA途径具有编码乳酸脱氢酶，乳酰-CoA转移酶，乳酰-CoA脱水酶，以及丙烯酰-CoA还原酶的第三组外源性核酸。
在一个实施方式中，本发明提供一种产生正丙醇和异丙醇的方法，包括培养一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有正丙醇途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的正丙醇途径包括编码正丙醇途径酶并以足以产生正丙醇的量表达的第一组外源性核酸，该第一组外源性核酸编码PEP羧激酶或者PEP羧化酶，苹果酸脱氢酶，延胡索酸酶，延胡索酸还原酶，琥珀酰-CoA转移酶或者琥珀酰-CoA合成酶，甲基丙二酰-CoA变位酶，甲基丙二酰-CoA脱羧酶，以及丙醛脱氢酶和丙醇脱氢酶；或者丙酰-CoA:磷酸丙酰基转移酶和丙酰磷酸还原酶；或者丙酰-CoA水解酶或者丙酰-CoA转移酶或者丙酰-CoA合成酶，丙酸激酶，丙酰磷酸还原酶和丙醇脱氢酶；或者丙酰-CoA水解酶或者丙酰-CoA转移酶或者丙酰-CoA合成酶，丙酸还原酶和丙醇脱氢酶，并且所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，该第二组外源性核酸编码丙酮酸激酶，丙酮酸脱氢酶或者丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶；或者丙酮酸甲酸裂解酶，丙酮酸甲酸裂解酶激活酶和甲酸脱氢酶，乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种产生正丙醇和异丙醇的方法，包括培养一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有正丙醇途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的正丙醇途径包括编码正丙醇途径酶并以足以产生正丙醇的量表达的第一组外源性核酸，该第一组外源性核酸编码PEP羧激酶或者PEP羧化酶，苏氨酸脱氨酶，以及2-氧代丁酸脱羧酶和丙醇脱氢酶；或者2-氧代丁酸脱氢酶，丙醛脱氢酶和丙醇脱氢酶；或者2-氧代丁酸脱氢酶，丙酰-CoA:磷酸丙酰基转移酶，丙酰磷酸还原酶和丙醇脱氢酶；或者2-氧代丁酸脱氢酶，丙酰-CoA水解酶或者丙酰-CoA转移酶或者丙酰-CoA合成酶，丙酸激酶，丙酰磷酸还原酶和丙醇脱氢酶；或者2-氧代丁酸脱氢酶，丙酰-CoA水解酶或者丙酰-CoA转移酶或者丙酰-CoA合成酶，丙酸还原酶和丙醇脱氢酶，并且所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，该第二组外源性核酸编码丙酮酸激酶，丙酮酸脱氢酶或者丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶；或者丙酮酸甲酸裂解酶，丙酮酸甲酸裂解酶激活酶和甲酸脱氢酶，乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。另一方面，该第二组外源性核酸还编码丙酮酸羧化酶或者甲基丙二酰-CoA羧基转移酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种产生正丙醇和异丙醇的方法，包括培养一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有正丙醇途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的正丙醇途径包括编码正丙醇途径酶并以足以产生正丙醇的量表达的第一组外源性核酸，该第一组外源性核酸编码丙酮酸激酶，丙酮酸脱氢酶或者丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶；或者丙酮酸甲酸裂解酶，丙酮酸甲酸裂解酶激活酶和甲酸脱氢酶，乙酰-CoA羧化酶，丙二酰-CoA还原酶，丙二酸半醛还原酶，丙酰-CoA合成酶，以及丙醛脱氢酶和丙醇脱氢酶；或者丙酰-CoA:磷酸丙酰基转移酶，丙酰磷酸还原酶和丙醇脱氢酶；或者丙酰-CoA水解酶或者丙酰-CoA转移酶或者丙酰-CoA合成酶，丙酸激酶，丙酰磷酸还原酶和丙醇脱氢酶；或者丙酰-CoA水解酶或者丙酰-CoA转移酶或者丙酰-CoA合成酶，丙酸还原酶和丙醇脱氢酶，并且所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，该第二组外源性核酸编码乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种产生正丙醇和异丙醇的方法，包括培养一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有正丙醇途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的正丙醇途径包括编码正丙醇途径酶并以足以产生正丙醇的量表达的第一组外源性核酸，该第一组外源性核酸编码乳酸脱氢酶，乳酰-CoA转移酶，乳酰-CoA脱水酶；烯丙酰-CoA还原酶，以及丙醛脱氢酶和丙醇脱氢酶；或者丙酰-CoA:磷酸丙酰基转移酶，丙酰磷酸还原酶和丙醇脱氢酶；或者丙酰-CoA水解酶或者丙酰-CoA转移酶或者丙酰-CoA合成酶，丙酸激酶，丙酰磷酸还原酶和丙醇脱氢酶；或者丙酰-CoA水解酶或者丙酰-CoA转移酶或者丙酰-CoA合成酶，丙酸还原酶和丙醇脱氢酶，并且所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，该第二组外源性核酸编码丙酮酸脱氢酶或者丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶；或者丙酮酸甲酸裂解酶，丙酮酸甲酸裂解酶激活酶和甲酸脱氢酶，乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种产生正丙醇的方法，包括培养一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有正丙醇途径的微生物有机体，所述的正丙醇途径包括至少一种编码正丙醇途径酶并以足以产生正丙醇的量表达的外源性核酸，该正丙醇途径包括丙醛脱氢酶，丙醇脱氢酶，丙酰-CoA:磷酸丙酰基转移酶，丙酰-CoA水解酶，丙酰-CoA转移酶，丙酰-CoA合成酶，丙酸激酶，丙酸还原酶或者丙酰磷酸还原酶。
在另一个实施方式中，本发明提供一种产生正丙醇的方法，包括培养一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有正丙醇途径的微生物有机体，所述的正丙醇途径包括一组编码正丙醇途径酶并以足以产生正丙醇的量表达的外源性核酸，该组外源性核酸编码丙醛脱氢酶和丙醇脱氢酶；或者丙酰-CoA:磷酸丙酰基转移酶，丙酰磷酸还原酶和丙醇脱氢酶；或者丙酰-CoA水解酶或者丙酰-CoA转移酶或者丙酰-CoA合成酶，丙酸激酶，丙酰磷酸还原酶和丙醇脱氢酶；或者丙酰-CoA水解酶或者丙酰-CoA转移酶或者丙酰-CoA合成酶，丙酸还原酶和丙醇脱氢酶。
在上述实施方式的另一方面，产生丙醇的方法包括培养具有正丙醇途径的非天然存在的微生物有机体，该有机体还具有丙酰-CoA途径，所述的丙酰-CoA途径包括编码丙酰-CoA途径酶并以足以产生丙酰-CoA的量表达的外源性核酸。例如，在某些方面外源性核酸编码PEP羧激酶，PEP羧化酶，苹果酸脱氢酶，延胡索酸酶，延胡索酸还原酶，琥珀酰内-CoA转移酶，琥珀酰-CoA合成酶，甲基丙二酰-CoA变位酶或者甲基丙二酰-CoA脱羧酶。另一方面，外源性核酸还编码甲基丙二酰-CoA差向异构酶。另外，在上述实施方式的又一方面，该产生丙醇的方法包括培养具有正丙醇途径的非天然存在的微生物有机体，该正丙醇途径具有编码正丙醇途径酶并以足以产生正丙醇的量表达的第一组外源性核酸，其中第一组外源性核酸编码PEP羧激酶或者PEP羧化酶，苹果酸脱氢酶，延胡索酸酶，延胡索酸还原酶，琥珀酰-CoA转移酶或者琥珀酰-CoA合成酶，甲基丙二酰-CoA变位酶，甲基丙二酰-CoA差向异构酶，甲基丙二酰-CoA脱羧酶，丙醛脱氢酶和丙醇脱氢酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种产生1,4-BDO和异丙醇的方法，包括培养一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有1,4-BDO途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的1,4-BDO途径具有至少一种编码1,4-BDO途径酶并以足以产生1,4-BDO的量表达的外源性核酸，该1,4-BDO途径包括琥珀酰-CoA还原酶，琥珀酸还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酰-CoA转移酶，4-羟基丁酰-CoA合成酶，4-羟基丁酰-CoA还原酶（形成醛)，4-羟基丁醛还原酶，4-羟基丁酸还原酶，4-羟基丁酸激酶，磷酸转-4-羟基丁酸化酶，4-羟基丁酰磷酸还原酶或者4-羟基丁酰-CoA还原酶（形成醇），该异丙醇途径包括至少一种编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的外源性核酸，该异丙醇途径包括乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶，乙酰乙酰-CoA水解酶，乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶或者异丙醇脱氢酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种产生1,3-BDO和异丙醇的方法，包括培养一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有1,3-BDO途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的1,3-BDO途径具有至少一种编码1,3-BDO途径酶并以足以产生1,3-BDO的量表达的外源性核酸，该1,3-BDO途径包括琥珀酰-CoA还原酶，琥珀酸还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酰-CoA转移酶，4-羟基丁酰-CoA合成酶，4-羟基丁酸激酶，磷酸转-4-羟基丁酸化酶，4-羟基丁酰-CoA脱水酶，巴豆酸酶，3-羟基丁酰-CoA还原酶（形成醛)，3-羟基丁醛还原酶，3-羟基丁酰-CoA转移酶，3-羟基丁酰-CoA合成酶，3-羟基丁酰-CoA水解酶或者3-羟基丁酸还原酶或者3-羟基丁酰-CoA还原酶（形成醇），该异丙醇途径包括至少一种编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的外源性核酸，该异丙醇途径包括乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶，乙酰乙酰-CoA水解酶，乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶或者异丙醇脱氢酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种产生MAA和异丙醇的方法，包括培养一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有MAA途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的MAA途径具有至少一种编码MAA途径酶并以足以产生MAA的量表达的外源性核酸，该MAA途径包括琥珀酰-CoA还原酶，琥珀酸还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酰-CoA转移酶，4-羟基丁酰-CoA合成酶，4-羟基丁酸激酶，磷酸转-4-羟基丁酸化酶，4-羟基丁酰-CoA变位酶，3-羟基异丁酰-CoA脱水酶，甲基丙烯酰-CoA转移酶，甲基丙烯酰-CoA合成酶，甲基丙烯酰-CoA水解酶，3-羟基异丁酰-CoA转移酶，3-羟基异丁酰-CoA合成酶，3-羟基异丁酰-CoA水解酶，3-羟基异丁酸脱水酶，甲基丙二酰-CoA变位酶，甲基丙二酰-CoA差向异构酶，甲基丙二酰-CoA转移酶，甲基丙二酰-CoA合成酶，甲基丙二酰-CoA水解酶，甲基丙二酸还原酶，甲基丙二酰-CoA还原酶（形成醛)，3-羟基异丁酸脱氢酶，甲基丙二酰-CoA还原酶（形成醇）或者3-羟基异丁酸脱水酶，该异丙醇途径包括至少一种编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的外源性核酸，该异丙醇途径包括乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶，乙酰乙酰-CoA水解酶，乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶或者异丙醇脱氢酶。
在上述实施方式的另一方面，该微生物有机体具有一种乙酰-CoA途径，所述的乙酰-CoA途径具有至少一种编码乙酰-CoA途径酶并以足以产生乙酰-CoA的量表达的外源性核酸，该乙酰-CoA途径包括丙酮酸激酶，丙酮酸脱氢酶，丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶，丙酮酸甲酸裂解酶，丙酮酸甲酸裂解酶激活酶或者甲酸脱氢酶。
在上述实施方式的另一方面，该微生物有机体具有一种琥珀酰-CoA途径，所述的琥珀酰-CoA途径具有至少一种编码琥珀酰-CoA途径酶并以足以产生琥珀酰-CoA的量表达的外源性核酸，该琥珀酰-CoA途径包括PEP羧激酶，PEP羧化酶，苹果酸脱氢酶，延胡索酸酶，延胡索酸还原酶，琥珀酰-CoA转移酶或者琥珀酰-CoA合成酶。另一方面，该琥珀酰-CoA途径包括丙酮酸羧化酶或者甲基丙二酰-CoA羧基转移酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种产生1,4-BDO和异丙醇的方法，包括培养一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有1,4-BDO途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的1,4-BDO途径包括编码1,4-BDO途径酶并以足以产生1,4-BDO的量表达的第一组外源性核酸，该第一组外源性核酸编码琥珀酰-CoA还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酰-CoA转移酶或者4-羟基丁酰-CoA合成酶，4-羟基丁酰-CoA还原酶（形成醛)，以及4-羟基丁醛还原酶，并且所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，该第二组外源性核酸编码乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种产生1,4-BDO和异丙醇的方法，包括培养一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有1,4-BDO途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的1,4-BDO途径包括编码1,4-BDO途径酶并以足以产生1,4-BDO的量表达的第一组外源性核酸，该第一组外源性核酸编码琥珀酰-CoA还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酸还原酶，以及4-羟基丁醛还原酶，并且所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，该第二组外源性核酸编码乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种产生1,4-BDO和异丙醇的方法，包括培养一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有1,4-BDO途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的1,4-BDO途径包括编码1,4-BDO途径酶并以足以产生1,4-BDO的量表达的第一组外源性核酸，该第一组外源性核酸编码琥珀酰-CoA还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酸激酶，磷酸转-4-羟基丁酸化酶，4-羟基丁酰-CoA还原酶（形成醛)，以及4-羟基丁醛还原酶，并且所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，该第二组外源性核酸编码乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种产生1,4-BDO和异丙醇的方法，包括培养一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有1,4-BDO途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的1,4-BDO途径包括编码1,4-BDO途径酶并以足以产生1,4-BDO的量表达的第一组外源性核酸，该第一组外源性核酸编码琥珀酰-CoA还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酸激酶，4-羟基丁酰磷酸还原酶，以及4-羟基丁醛还原酶，并且所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，该第二组外源性核酸编码乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种产生1,4-BDO和异丙醇的方法，包括培养一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有1,4-BDO途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的1,4-BDO途径包括编码1,4-BDO途径酶并以足以产生1,4-BDO的量表达的第一组外源性核酸，该第一组外源性核酸编码琥珀酰-CoA还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酸激酶，磷酸转-4-羟基丁酸化酶，以及4-羟基丁酰-CoA还原酶（形成醇），并且所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，该第二组外源性核酸编码乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种产生1,4-BDO和异丙醇的方法，包括培养一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有1,4-BDO途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的1,4-BDO途径包括编码1,4-BDO途径酶并以足以产生1,4-BDO的量表达的第一组外源性核酸，该第一组外源性核酸编码琥珀酰-CoA还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酰-CoA转移酶或者4-羟基丁酰-CoA合成酶，以及4-羟基丁酰-CoA还原酶（形成醇）；以及4-羟基丁酰-CoA还原酶（形成醇），并且所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，该第二组外源性核酸编码乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种产生1,4-BDO和异丙醇的方法，包括培养一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有1,4-BDO途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的1,4-BDO途径包括编码1,4-BDO途径酶并以足以产生1,4-BDO的量表达的第一组外源性核酸，该第一组外源性核酸编码琥珀酸还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酰-CoA转移酶或者4-羟基丁酰-CoA合成酶，4-羟基丁酰-CoA还原酶（形成醛)，以及4-羟基丁醛还原酶，并且所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，该第二组外源性核酸编码乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种产生1,4-BDO和异丙醇的方法，包括培养一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有1,4-BDO途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的1,4-BDO途径包括编码1,4-BDO途径酶并以足以产生1,4-BDO的量表达的第一组外源性核酸，该第一组外源性核酸编码琥珀酸还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酸还原酶，以及4-羟基丁醛还原酶，并且所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，该第二组外源性核酸编码乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种产生1,4-BDO和异丙醇的方法，包括培养一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有1,4-BDO途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的1,4-BDO途径包括编码1,4-BDO途径酶并以足以产生1,4-BDO的量表达的第一组外源性核酸，该第一组外源性核酸编码琥珀酸还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酸激酶，磷酸转-4-羟基丁酸化酶，4-羟基丁酰-CoA还原酶（形成醛)，以及4-羟基丁醛还原酶，并且所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，该第二组外源性核酸编码乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种产生1,4-BDO和异丙醇的方法，包括培养一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有1,4-BDO途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的1,4-BDO途径包括编码1,4-BDO途径酶并以足以产生1,4-BDO的量表达的第一组外源性核酸，该第一组外源性核酸编码琥珀酸还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酸激酶，4-羟基丁酰磷酸还原酶，以及4-羟基丁醛还原酶，并且所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，该第二组外源性核酸编码乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种产生1,4-BDO和异丙醇的方法，包括培养一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有1,4-BDO途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的1,4-BDO途径包括编码1,4-BDO途径酶并以足以产生1,4-BDO的量表达的第一组外源性核酸，该第一组外源性核酸编码琥珀酸还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酸激酶，磷酸转-4-羟基丁酸化酶，以及4-羟基丁酰-CoA还原酶（形成醇），并且所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，该第二组外源性核酸编码乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种产生1,4-BDO和异丙醇的方法，包括培养一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有1,4-BDO途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的1,4-BDO途径包括编码1,4-BDO途径酶并以足以产生1,4-BDO的量表达的第一组外源性核酸，该第一组外源性核酸编码琥珀酸还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酰-CoA转移酶或者4-羟基丁酰-CoA合成酶，以及4-羟基丁酰-CoA还原酶（形成醇），并且所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，该第二组外源性核酸编码乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种产生1,3-BDO和异丙醇的方法，包括培养一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有1,3-BDO途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的1,3-BDO途径包括编码1,3-BDO途径酶并以足以产生1,3-BDO的量表达的第一组外源性核酸，该第一组外源性核酸编码琥珀酰-CoA还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酰-CoA转移酶或者4-羟基丁酰-CoA合成酶，4-羟基丁酰-CoA脱水酶，巴豆酸酶，3-羟基丁酰-CoA还原酶（形成醛)，和3-羟基丁醛还原酶，并且所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，该第二组外源性核酸编码乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种产生1,3-BDO和异丙醇的方法，包括培养一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有1,3-BDO途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的1,3-BDO途径包括编码1,3-BDO途径酶并以足以产生1,3-BDO的量表达的第一组外源性核酸，该第一组外源性核酸编码琥珀酰-CoA还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酰-CoA转移酶或者4-羟基丁酰-CoA合成酶，4-羟基丁酰-CoA脱水酶，巴豆酸酶，3-羟基丁酰-CoA转移酶或者3-羟基丁酰-CoA合成酶或者3-羟基丁酰-CoA水解酶，3-羟基丁酸还原酶，和3-羟基丁醛还原酶，并且所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，该第二组外源性核酸编码乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种产生1,3-BDO和异丙醇的方法，包括培养一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有1,3-BDO途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的1,3-BDO途径包括编码1,3-BDO途径酶并以足以产生1,3-BDO的量表达的第一组外源性核酸，该第一组外源性核酸编码琥珀酰-CoA还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酸激酶，磷酸转-4-羟基丁酸化酶，4-羟基丁酰-CoA脱氢酶，巴豆酸酶，3-羟基丁酰-CoA还原酶（形成醛)，和3-羟基丁醛还原酶和异丙醇的途径，并且所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，该第二组外源性核酸编码乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或乙酰乙酰-CoA水解酶或乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种产生1,3-BDO和异丙醇的方法，包括培养一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有1,3-BDO途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的1,3-BDO途径包括编码1,3-BDO途径酶并以足以产生1,3-BDO的量表达的第一组外源性核酸，该第一组外源性核酸编码琥珀酰-CoA还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酸激酶，磷酸转-4-羟基丁酸化酶，4-羟基丁酰-CoA脱氢酶，巴豆酸酶，3-羟基丁酰-CoA转移酶或3-羟基丁酰-CoA合成酶或3-羟基丁酰-CoA水解酶，3-羟基丁酸还原酶和3-羟基丁醛还原酶，并且所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，该第二组外源性核酸编码乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或乙酰乙酰-CoA水解酶或乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶和异丙醇脱氢酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种产生1,3-BDO和异丙醇的方法，包括培养一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有1,3-BDO途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的1,3-BDO途径包括编码1,3-BDO途径酶并以足以产生1,3-BDO的量表达的第一组外源性核酸，该第一组外源性核酸编码琥珀酰-CoA还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酸激酶，磷酸转-4羟基丁酸化酶，4-羟基丁酰-CoA脱水酶，巴豆酸酶，3-羟基丁酰-CoA还原酶（形成醇），并且所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，该第二组外源性核酸编码乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或乙酰乙酰-CoA水解酶或乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种产生1,3-BDO和异丙醇的方法，包括培养一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有1,3-BDO途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的1,3-BDO途径包括编码1,3-BDO途径酶并以足以产生1,3-BDO的量表达的第一组外源性核酸，该第一组外源性核酸编码琥珀酰-CoA还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酰-CoA转移酶或4-羟基丁酰-CoA合成；4-羟基丁酰-CoA脱水酶，巴豆酸酶，和3-羟基丁酰-CoA还原酶（形成醇），并且所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，该第二组外源性核酸编码乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或乙酰乙酰-CoA水解酶或乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种产生1,3-BDO和异丙醇的方法，包括培养一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有1,3-BDO途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的1,3-BDO途径包括编码1,3-BDO途径酶并以足以产生1,3-BDO的量表达的第一组外源性核酸，该第一组外源性核酸编码琥珀酸还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酰-CoA转移酶或4-羟基丁酰-CoA合成酶，4-羟基丁酰-CoA脱水酶，巴豆酸酶，3-羟基丁酰-CoA还原酶（形成醛)，和3-羟基丁醛还原酶，并且所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，该第二组外源性核酸编码乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或乙酰乙酰-CoA水解酶或乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种产生1,3-BDO和异丙醇的方法，包括培养一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有1,3-BDO途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的1,3-BDO途径包括编码1,3-BDO途径酶并以足以产生1,3-BDO的量表达的第一组外源性核酸，该第一组外源性核酸编码琥珀酸还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酰-CoA转移酶或4-羟基丁酰-CoA合成酶，4-羟基丁酰-CoA脱水酶，巴豆酸酶，3-羟基丁酰-CoA转移酶或3-羟基丁酰-CoA合成酶或3-羟基丁酰-CoA水解酶，3-羟基丁酸还原酶，和3-羟基丁醛还原酶，并且所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，该第二组外源性核酸编码乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或乙酰乙酰-CoA水解酶或乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种产生1,3-BDO和异丙醇的方法，包括培养一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有1,3-BDO途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的1,3-BDO途径包括编码1,3-BDO途径酶并以足以产生1,3-BDO的量表达的第一组外源性核酸，该第一组外源性核酸编码琥珀酸还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酸激酶编码的外源核酸1磷酸转-4-羟基丁酸化酶4-羟基丁酰-CoA脱水酶，巴豆酸酶，3-羟基丁酰-CoA还原酶（形成醛)，和3-羟基丁醛还原酶，并且所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，该第二组外源性核酸编码乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或乙酰乙酰-CoA水解酶或乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种产生1,3-BDO和异丙醇的方法，包括培养一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有1,3-BDO途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的1,3-BDO途径包括编码1,3-BDO途径酶并以足以产生1,3-BDO的量表达的第一组外源性核酸，该第一组外源性核酸编码琥珀酸还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酸激酶，磷酸转-4-羟基丁酸化酶；4-羟基丁酰-CoA脱水酶，巴豆酸酶，3-羟基丁酰-CoA转移酶或3-羟基丁酰-CoA合成酶或3-羟基丁酰-CoA水解酶，3-羟基丁酸还原酶，和3-羟基丁醛还原酶，并且所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，该第二组外源性核酸编码乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或乙酰乙酰-CoA水解酶或乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种产生1,3-BDO和异丙醇的方法，包括培养一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有1,3-BDO途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的1,3-BDO途径包括编码1,3-BDO途径酶并以足以产生1,3-BDO的量表达的第一组外源性核酸，该第一组外源性核酸编码琥珀酸还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酸激酶，磷酸转-4-羟基丁酸化酶；巴豆酸酶，和3-羟基丁酰-CoA还原酶（形成醇），并且所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，该第二组外源性核酸编码乙酰乙酰-CoA硫解；乙酰乙酰-CoA转移酶或乙酰乙酰-CoA水解酶或乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种产生1,3-BDO和异丙醇的方法，包括培养一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有1,3-BDO途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的1,3-BDO途径包括编码1,3-BDO途径酶并以足以产生1,3-BDO的量表达的第一组外源性核酸，该第一组外源性核酸编码琥珀酸还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酰-CoA转移酶或者4-羟基丁酰-CoA合成酶，4-羟基丁酰-CoA脱水酶，巴豆酸酶，3-羟基丁酰-CoA还原酶（形成醇），并且所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，该第二组外源性核酸编码乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种产生MAA和异丙醇的方法，包括培养一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有MAA途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的MAA途径包括编码MAA途径酶并以足以产生MAA的量表达的第一组外源性核酸，该第一组外源性核酸编码琥珀酰-CoA还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酰-CoA转移酶或4-羟基丁酰-CoA合成酶，4-羟基丁酰-CoA变位酶，3-羟基异丁酰-CoA转移酶，3-羟基异丁酰-CoA合成酶或3-羟基异丁酰-CoA水解酶，和3-羟基异丁酸脱水酶，并且所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，该第二组外源性核酸编码乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种产生MAA和异丙醇的方法，包括培养一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有MAA途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的MAA途径包括编码MAA途径酶并以足以产生MAA的量表达的第一组外源性核酸，该第一组外源性核酸编码琥珀酰-CoA还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酰-CoA转移酶或4-羟基丁酰-CoA合成酶，4-羟基丁酰-CoA变位酶，3-羟基异丁酰-CoA脱水酶，和甲基丙烯酰-CoA转移酶，甲基丙烯酰-CoA合成，或甲基丙烯酰-CoA水解酶，并且所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，该第二组外源性核酸编码乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种产生MAA和异丙醇的方法，包括培养一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有MAA途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的MAA途径包括编码MAA途径酶并以足以产生MAA的量表达的第一组外源性核酸，该第一组外源性核酸编码琥珀酰-CoA还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酸激酶，磷酸转-4-羟基丁酸化酶，4-羟基丁酰-CoA变位酶，3-羟基异丁酰-CoA转移酶，3-羟基异丁酰-CoA合成酶或者3-羟基异丁酰-CoA水解酶，和3-羟基异丁酸脱水酶，并且所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，该第二组外源性核酸编码乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种产生MAA和异丙醇的方法，包括培养一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有MAA途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的MAA途径包括编码MAA途径酶并以足以产生MAA的量表达的第一组外源性核酸，该第一组外源性核酸编码琥珀酰-CoA还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酸激酶，磷酸转-4-羟基丁酸化酶，4-羟基丁酰-CoA变位酶，3-羟基异丁酰-CoA脱水酶，以及甲基丙烯酰-CoA转移酶，甲基丙烯酰-CoA合成酶或者甲基丙烯酰-CoA水解酶，并且所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，该第二组外源性核酸编码乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种产生MAA和异丙醇的方法，包括培养一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有MAA途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的MAA途径包括编码MAA途径酶并以足以产生MAA的量表达的第一组外源性核酸，该第一组外源性核酸编码琥珀酸还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酰-CoA转移酶或者4-羟基丁酰-CoA合成酶，4-羟基丁酰-CoA变位酶，3-羟基异丁酰-CoA转移酶，3-羟基异丁酰-CoA合成酶或者3-羟基异丁酰-CoA水解酶，和3-羟基异丁酸脱水酶，并且所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，该第二组外源性核酸编码乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种产生MAA和异丙醇的方法，包括培养一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有MAA途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的MAA途径包括编码MAA途径酶并以足以产生MAA的量表达的第一组外源性核酸，该第一组外源性核酸编码琥珀酸还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酰-CoA转移酶或者4-羟基丁酰-CoA合成酶，4-羟基丁酰-CoA变位酶，3-羟基异丁酰-CoA脱水酶，以及甲基丙烯酰-CoA转移酶，甲基丙烯酰-CoA合成酶或者甲基丙烯酰-CoA水解酶，并且所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，该第二组外源性核酸编码乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种产生MAA和异丙醇的方法，包括培养一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有MAA途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的MAA途径包括编码MAA途径酶并以足以产生MAA的量表达的第一组外源性核酸，该第一组外源性核酸编码琥珀酸还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酸激酶，磷酸转-4-羟基丁酸化酶，4-羟基丁酰-CoA变位酶，3-羟基异丁酰-CoA转移酶，3-羟基异丁酰-CoA合成酶或者3-羟基异丁酰-CoA水解酶，和3-羟基异丁酸脱水酶，并且所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，该第二组外源性核酸编码乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种产生MAA和异丙醇的方法，包括培养一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有MAA途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的MAA途径包括编码MAA途径酶并以足以产生MAA的量表达的第一组外源性核酸，该第一组外源性核酸编码琥珀酸还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酸激酶，磷酸转-4-羟基丁酸化酶，4-羟基丁酰-CoA变位酶，3-羟基异丁酰-CoA脱水酶，以及甲基丙烯酰-CoA转移酶，甲基丙烯酰-CoA合成酶或者甲基丙烯酰-CoA水解酶，并且所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，该第二组外源性核酸编码乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种产生MAA和异丙醇的方法，包括培养一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有MAA途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的MAA途径包括编码MAA途径酶并以足以产生MAA的量表达的第一组外源性核酸，该第一组外源性核酸编码甲基丙二酰-CoA变位酶，甲基丙二酰-CoA还原酶（形成醛)；3-羟基异丁酸脱氢酶，和3-羟基异丁酸脱水酶，并且所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，该第二组外源性核酸编码乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种产生MAA和异丙醇的方法，包括培养一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有MAA途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的MAA途径包括编码MAA途径酶并以足以产生MAA的量表达的第一组外源性核酸，该第一组外源性核酸编码甲基丙二酰-CoA变位酶，甲基丙二酰-CoA差向异构酶，甲基丙二酰-CoA转移酶，甲基丙二酰-CoA合成酶或者甲基丙二酰-CoA水解酶，甲基丙二酸还原酶，3-羟基异丁酸脱氢酶，和3-羟基异丁酸脱水酶，并且所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，该第二组外源性核酸编码乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种产生MAA和异丙醇的方法，包括培养一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有MAA途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的MAA途径包括编码MAA途径酶并以足以产生MAA的量表达的第一组外源性核酸，该第一组外源性核酸编码甲基丙二酰-CoA变位酶，甲基丙二酰-CoA转移酶，甲基丙二酰-CoA合成酶或者甲基丙二酰-CoA水解酶，甲基丙二酸还原酶，3-羟基异丁酸脱氢酶，和3-羟基异丁酸脱水酶，并且所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，该第二组外源性核酸编码乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种产生MAA和异丙醇的方法，包括培养一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有MAA途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的MAA途径包括编码MAA途径酶并以足以产生MAA的量表达的第一组外源性核酸，该第一组外源性核酸编码甲基丙二酰-CoA变位酶，甲基丙二酰-CoA还原酶（形成醇），和3-羟基异丁酸脱水酶，并且所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，该第二组外源性核酸编码乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
在上述实施方式的另一方面，该微生物有机体具有乙酰-CoA途径，所述的乙酰-CoA途径具有编码乙酰-CoA途径酶并以足以产生乙酰-CoA的量表达的第三组外源性核酸，该第三组外源性核酸编码丙酮酸激酶，以及丙酮酸脱氢酶或者丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶；或者丙酮酸甲酸裂解酶，丙酮酸甲酸裂解酶激活酶和甲酸脱氢酶。
在又一实施方式中，该微生物有机体具有琥珀酰-CoA途径，所述的琥珀酰-CoA途径具有编码琥珀酰-CoA途径酶并以足以产生琥珀酰-CoA的量表达的第三组外源性核酸，该第三组外源性核酸编码PEP羧激酶，PEP羧化酶，苹果酸脱氢酶，延胡索酸酶，延胡索酸还原酶，琥珀酰-CoA转移酶和琥珀酰-CoA合成酶。另一方面，该第三组外源性核酸还编码甲基丙二酰-CoA差向异构酶，丙酮酸羧化酶或者甲基丙二酰-CoA羧基转移酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种产生1,4-BDO和异丙醇的方法，包括培养一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有1,4-BDO途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的1,4-BDO途径包括编码1,4-BDO途径酶并以足以产生1,4-BDO的量表达的第一组外源性核酸，该第一组外源性核酸编码PEP羧激酶，PEP羧化酶，苹果酸脱氢酶，延胡索酸酶，延胡索酸还原酶，琥珀酰-CoA转移酶，琥珀酰-CoA合成酶，丙酮酸羧化酶，甲基丙二酰-CoA羧基转移酶，琥珀酰-CoA还原酶，琥珀酸还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酰-CoA转移酶，4-羟基丁酰-CoA合成酶，4-羟基丁酰-CoA还原酶（形成醛)，4-羟基丁醛还原酶，4-羟基丁酸还原酶，4-羟基丁酸激酶，磷酸转-4-羟基丁酸化酶，4-羟基丁酰磷酸还原酶，4-羟基丁酰-CoA还原酶（形成醇），以及4-羟基丁醛还原酶，并且所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，该第二组外源性核酸编码丙酮酸激酶，丙酮酸脱氢酶，丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶，丙酮酸甲酸裂解酶，丙酮酸甲酸裂解酶激活酶，甲酸脱氢酶，乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶，乙酰乙酰-CoA水解酶，乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶和异丙醇脱氢酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种产生1,3-BDO和异丙醇的方法，包括培养一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有1,3-BDO途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的1,3-BDO途径包括编码1,3-BDO途径酶并以足以产生1,3-BDO的量表达的第一组外源性核酸，该第一组外源性核酸编码PEP羧激酶，PEP羧化酶，苹果酸脱氢酶，延胡索酸酶，延胡索酸还原酶，琥珀酰-CoA转移酶，琥珀酰-CoA合成酶，丙酮酸羧化酶，甲基丙二酰-CoA羧基转移酶，琥珀酰-CoA还原酶，琥珀酸还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酰-CoA转移酶，4-羟基丁酰-CoA合成酶，4-羟基丁酸激酶，磷酸转-4-羟基丁酸化酶，4-羟基丁酰-CoA脱水酶，巴豆酸酶，3-羟基丁酰-CoA还原酶（形成醛)，3-羟基丁醛还原酶，3-羟基丁酰-CoA转移酶，3-羟基丁酰-CoA合成酶，3-羟基丁酰-CoA水解酶，3-羟基丁酸还原酶和3-羟基丁酰-CoA还原酶（形成醇），并且所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，该第二组外源性核酸编码丙酮酸激酶，丙酮酸脱氢酶，丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶，丙酮酸甲酸裂解酶，丙酮酸甲酸裂解酶激活酶，甲酸脱氢酶，乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶，乙酰乙酰-CoA水解酶，乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶和异丙醇脱氢酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种产生MAA和异丙醇的方法，包括培养一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有MAA途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的MAA途径包括编码MAA途径酶并以足以产生MAA的量表达的第一组外源性核酸，该第一组外源性核酸编码PEP羧激酶，PEP羧化酶，苹果酸脱氢酶，延胡索酸酶，延胡索酸还原酶，琥珀酰-CoA转移酶，琥珀酰-CoA合成酶，丙酮酸羧化酶，甲基丙二酰-CoA羧基转移酶，琥珀酰-CoA还原酶，琥珀酸还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酰-CoA转移酶，4-羟基丁酰-CoA合成酶，4-羟基丁酸激酶，磷酸转-4-羟基丁酸化酶，4-羟基丁酰-CoA变位酶，3-羟基异丁酰-CoA转移酶，3-羟基异丁酰-CoA合成酶，3-羟基异丁酰-CoA水解酶，3-羟基异丁酰-CoA脱水酶，甲基丙烯酰-CoA转移酶，甲基丙烯酰-CoA合成酶，甲基丙烯酰-CoA水解酶和3-羟基异丁酸脱水酶，并且所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，该第二组外源性核酸编码丙酮酸激酶，丙酮酸脱氢酶，丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶，丙酮酸甲酸裂解酶，丙酮酸甲酸裂解酶激活酶，甲酸脱氢酶，乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶，乙酰乙酰-CoA水解酶，乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶和异丙醇脱氢酶。
在一个实施方式中，本发明提供一种产生MAA和异丙醇的方法，包括培养一种非天然存在的微生物有机体，其包括具有MAA途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的MAA途径包括编码MAA途径酶并以足以产生MAA的量表达的第一组外源性核酸，该第一组外源性核酸编码PEP羧激酶，PEP羧化酶，苹果酸脱氢酶，延胡索酸酶，延胡索酸还原酶，琥珀酰-CoA转移酶，琥珀酰-CoA合成酶，丙酮酸羧化酶，甲基丙二酰-CoA羧基转移酶，甲基丙二酰-CoA变位酶，甲基丙二酰-CoA差向异构酶，甲基丙二酰-CoA转移酶，甲基丙二酰-CoA合成酶，甲基丙二酰-CoA水解酶，甲基丙二酸还原酶，甲基丙二酰-CoA还原酶（形成醛)，3-羟基异丁酸脱氢酶，甲基丙二酰-CoA还原酶（形成醇）和3-羟基异丁酸脱水酶，并且所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，该第二组外源性核酸编码丙酮酸激酶，丙酮酸脱氢酶，丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶，丙酮酸甲酸裂解酶，丙酮酸甲酸裂解酶激活酶，甲酸脱氢酶，乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶，乙酰乙酰-CoA水解酶，乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶和异丙醇脱氢酶。
上述每个实施方式的另一方面，所述的外源性核酸是异源核酸。
上述每个实施方式的另一方面，所述条件包括基本上厌氧的培养条件。
检测正丙醇，异丙醇，1,4-BDO，1,3-BDO和/或MAA的产生的合适的纯化和/或方法可以使用众所周知的方法进行。合适的副本数例如一式三份培养可以用于被检测的每种工程菌生长。例如，可以检测在工程产生宿主中形成的产品和副产品。终产物和中间体及其它有机化合物通过如下方法使用本领域中众所周知的程序分析，例如HPLC（高效液相色谱法），GC-MS（气相色谱-质谱法）和LC-MS（液相色谱-质谱法）或者在其它合适的分析方法。发酵液内中产品的释放也可用培养上清液检测。副产品和残余糖可以通过HPLC或者使用本领域公知的其它合适的分析法和检测方法来定量，所述的HPLC使用例如示差折光检测器用于葡萄糖和乙醇，以及紫外检测器用于有机酸（Lin等，Biotechnol.Bioeng.90:775-779(2005)）。来自外源性DNA序列的个别酶或者蛋白质的活性也可使用本领域公知的方法分析。各种醇可以通过气相色谱法使用如离子焰检测器来定量，所述的离子焰检测器描述于Atsumi等，Metab Eng(2007)和Hanai等人Appl Environ Microbiol 73:7814-7818(2007)中。
正丙醇，异丙醇，1,4-BDO，1,3-BDO和/或MAA可以使用本领域公知的各种方法从培养中的其它成分中分离出来。这种分离方法包括，例如，提取方法以及包括连续液-液萃取，渗透蒸发，膜过滤，膜分离，反渗透，电渗析，蒸馏，结晶，离心，抽滤，离子交换色谱法，体积排阻色谱法，吸附色谱法和超滤的方法。所有上述的方法都是本领域公知的。
可培养本发明所述的任何非天然存在的微生物有机体以产生和/或分泌本发明的生物合成产物。例如，可培养正丙醇，异丙醇，1,4-BDO，1,3-BDO和/或MAA产生菌以生物合成产生正丙醇，异丙醇，1,4-BDO，1,3-BDO和/或MAA。
为了产生正丙醇，异丙醇，1,4-BDO，1,3-BDO和/或MAA，在含有碳源和其它必需营养物的培养基中培养重组菌株。有必要保持发酵罐中的缺氧条件以降低整个方法的费用。这种条件可以例如，通过首先用氮气给培养基鼓泡，然后用密封螺旋盖密封烧瓶。对于厌氧下没有观察到生长的菌株来说，可以通过在隔板上打一小孔有限通风来应用微需氧的条件。示例性的厌氧条件前面已经描述并且在本技术领域是众所周知的。示例性的需氧和厌氧条件描述在，例如，2007年8月10日提交的美国公开号2009/0047719中。发酵可以分批培养，补料分批培养或者连续的方式进行，如本发明所公开的。
如果需要，培养基的pH可以保持在期望的pH，尤其是中性pH，例如根据需要通过添加碱（例如NaOH或其它碱）或者酸保持在大约7的pH值，保持培养基在期望的pH值。生长率可以通过使用分光光度计（600nm）测量光密度来测定，以及葡萄糖摄入率通过监测随时间碳源的消耗来测定。
生长培养基可包括，例如，可向非天然存在的微生物提供碳源的任何碳水化合物源。这种来源包括例如糖类，例如葡萄糖，木糖，阿拉伯糖，半乳糖，甘露糖，果糖，蔗糖和淀粉。碳水化合物的其它来源包括例如可再生原料和生物质。可在本发明的方法中用作原料的生物质的示例性种类包括纤维生物质，半纤维生物质和木质素原料或者原料的一部分。这种生物质原料包括，例如，作为有用的碳源的糖类物质（例如葡萄糖，木糖，阿拉伯糖，半乳糖，甘露糖，果糖和淀粉）。鉴于本发明提供的教导和指导，本领域熟练的技术人员将理解除了以上列举的以外其它的可再生原料和生物质也可以用于培养本发明的产生正丙醇，异丙醇，1,4-BDO，1,3-BDO和/或MAA的微生物有机体。
除了例如以上所列举的可再生原料之外，本发明的正丙醇和异丙醇，1,4-BDO和异丙醇，1,3-BDO和异丙醇，或者MAA和异丙醇微生物有机体也可以经修饰作为其碳源用于在合成气上生长。在这种具体的实施方式中，一种或多种蛋白质或者酶在正丙醇，异丙醇，1,4-BDO，1,3-BDO和/或MAA产生生物中表达，以提供利用合成气或者其它气态碳源的代谢途径。
合成气体（Synthesis gas）也称为合成气（syngas）或者发生炉煤气（producer gas），是煤和含碳物质例如生物质材料气化的主要产物，包括农作物和残渣。，合成气是主要为H2和CO的混合物，并且可以从任何有机原料的气化中获得，包括但不限于煤，煤油，天然气，生物质和废弃有机物。气化一般在高的燃料氧气比下进行。虽然大部分是H2和CO，合成气还可包括少量的CO2和其它气体。因此，合成气体提供一个经济有效的气态碳源，例如CO和CO2。
Wood-Ljungdahl途径催化CO和H2转化为乙酰-CoA和其它产物（例如乙酸）。能利用CO和合成气的生物一般也具有通过相同的一组基本的酶利用CO2和CO2/H2混合物和通过Wood-Ljungdahl途径转化的能力。通过微生物H2依赖性的CO2向乙酸的转化很早就被认识了，远早于揭示CO也可被相同的生物使用以及所涉及的相同途径。很多产乙酸菌已经显示在CO2存在下生长并产生化合物，例如乙酸，只要存在H2以提供必要的还原当量（参见例如Drake，Acetogenesis，pp.3-60 Chapman and Hall，New York，(1994)）。这可以归纳为以下列方程式:
2CO2+4H2+nADP+nPi→CH3COOH+2H2O+nATP
因此，拥有Wood-Ljungdahl途径的非天然存在的微生物可利用CO2和H2混合物以及用于产生乙酰-CoA和其它期望的产物。
Wood-Ljungdahl途径是本领域公知的，并且由12个反应组成，其可以分成两个分支：（1）甲基分支和（2）羰基分支。甲基分支把合成气转化成甲基四氢叶酸（甲基THF），而羰基分支把甲基THF转化成乙酰-CoA。在甲基分支中的反应依次被下列酶或者蛋白质催化:铁氧还蛋白氧化还原酶，甲酸脱氢酶，甲酰四氢叶酸合成酶，次甲基四氢叶酸环化脱水酶，次甲基四氢叶酸脱氢酶和次甲基四氢叶酸还原酶。在羰基分支中的反应依次被下列酶或者蛋白质催化:甲基四氢叶酸:类咕啉蛋白甲基转移酶（例如，AcsE），类咕啉铁硫蛋白，镍蛋白组装蛋白（例如，AcsF），铁氧还蛋白，乙酰-CoA合成酶，一氧化碳脱氢酶和镍蛋白组装蛋白（例如，CooC）。在本发明提供了导入足量的编码核酸以产生正丙醇，异丙醇，1,4-BDO，1,3-BDO和/或MAA途径的教导和指导之后，本领域熟练的技术人员将理解，相同的工程设计也能执行关于导入至少一种编码在宿主有机体中缺乏的Wood-Ljungdahl酶或者蛋白质的核酸。因此，向本发明的微生物有机体导入一种或多种编码核酸，以便被修饰的生物包括完整的Wood-Ljungdahl途径，将赋予合成气的利用能力。
另外，还原性（逆向）三羧酸循环和/或氢化酶活性也可用于转化CO，CO2和/或H2为乙酰-CoA和其它产物（例如乙酸）。能通过还原性TCA途径固定碳的生物可利用一种或多种下列酶：ATP柠檬酸裂解酶，柠檬酸裂解酶，乌头酸酶，异柠檬酸脱氢酶，α-酮戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原酶，琥珀酰-CoA合成酶，琥珀酰-CoA转移酶，延胡索酸还原酶，延胡索酸酶，苹果酸脱氢酶，NAD(P)H:铁氧还蛋白氧化还原酶，一氧化碳脱氢酶和氢化酶。具体地，被一氧化碳脱氢酶和氢化酶从CO和/或H2中提取的还原当量通过还原性TCA循环用于固定CO2转化成乙酰-CoA或者乙酸。乙酸可以被酶（例如乙酰-CoA转移酶，乙酸激酶/磷酸乙酰基转移酶和乙酰-CoA合成酶）转化成乙酰-CoA。乙酰-CoA可以通过丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶和葡糖异生的酶转化为正丙醇，异丙醇，1,4-BDO，1,3-BDO和/或MAA的前体，甘油醛3-磷酸，磷酸烯醇式丙酮酸和丙酮酸。在本发明提供了导入足量的编码核酸以产生正丙醇，异丙醇，1,4-BDO，1,3-BDO和/或MAA途径的教导和指导之后，本领域熟练的技术人员将理解，相同的工程设计也可以执行涉及的导入至少一种编码还原性TCA途径酶或者宿主有机体内缺乏的蛋白质的核酸。因此，将一种或多种编码核酸导入本发明的微生物有机体，从而被修饰的生物包括完整的还原性TCA途径，将赋予利用合成气的能力。
因此，考虑到本发明提供的教导和指导，本领域熟练的技术人员将理解，可以产生一种非天然存在的微生物有机体，当在碳源例如碳水化合物上生长时其分泌本发明的生物合成化合物。这种化合物包括例如正丙醇，异丙醇，1,4-BDO，1,3-BDO和/或MAA，以及在正丙醇，异丙醇，1,4-BDO，1,3-BDO和/或MAA途径中的任何一种中间代谢物。所有需要的就是改造一种或多种期望的酶或者蛋白质活性以实现期望的化合物或者中间体的生物合成，所述中间体包括，例如包括在正丙醇，异丙醇，1,4-BDO，1,3-BDO和/或MAA生物合成途径中的部分或全部。因此，本发明提供一种非天然存在的微生物有机体，当在碳水化合物或其它碳源上生长时其产生和/或分泌正丙醇，异丙醇，1,4-BDO，1,3-BDO和/或MAA，和当在碳水化合物或其它碳源上生长时其产生和/或分泌显示在正丙醇，异丙醇，1,4-BDO，1,3-BDO和/或MAA途径中的任何中间代谢物。本发明的产生正丙醇和异丙醇，1,4-BDO和异丙醇，1,3-BDO和异丙醇或者MAA和异丙醇的微生物有机体可由一种中间体引发合成，例如，琥珀酰-CoA，丙酰-CoA和/或乙酰-CoA。
本发明的非天然存在的微生物有机体按照本发明所述使用本领域公知的方法构建，以足够的量外源性表达至少一种编码正丙醇，异丙醇，1,4-BDO，1,3-BDO和/或MAA途径酶或者蛋白质的核酸，以产生正丙醇，异丙醇，1,4-BDO，1,3-BDO和/或MAA。将理解，本发明的微生物有机体在足以产生正丙醇，异丙醇，1,4-BDO，1,3-BDO和/或MAA的条件下培养。在本发明提供教导和指导之后，本发明的非天然存在的微生物有机体能实现正丙醇，异丙醇，1,4-BDO，1,3-BDO和/或MAA的生物合成，产生大约0.1-200mM之间或更高的胞内浓度。通常，正丙醇，异丙醇，1,4-BDO，1,3-BDO和/或MAA的胞内浓度在大约3-150mM之间，具体地在大约5-125mM之间，和更具体地在大约8-100mM之间，包括大约10mM，20mM，50mM，80mM，或更高。由本发明的非天然存在的微生物有机体也可获得介于每个这些示例性的范围之间和高于每个这些示例性的范围的胞内浓度。
在某些内实施方式中例，培养条件包括厌氧或者基本上厌氧的生长或者维持条件。示例性的厌氧条件在先前已有描述并且为本领域所公知。本发明描述了发酵工艺的示例性厌氧条件，且其也例如描述于2007年8月10日提交的美国公开2009/0047719中。任何这些条件以及本领域公知的其它厌氧条件都可被非天然存在的微生物有机体利用。在这种厌氧条件下，正丙醇，异丙醇，1,4-BDO，1,3-BDO和/或MAA产生菌能合成正丙醇，异丙醇，1,4-BDO，1,3-BDO和/或MAA在细胞内的浓度可达到5-10mM或以上，以及本发明示例性的所有其它浓度。可以理解，虽然如上所述的是指胞内浓度，产生正丙醇，异丙醇，1,4-BDO，1,3-BDO和/或MAA的微生物有机体也可在细胞内产生正丙醇，异丙醇，1,4-BDO，1,3-BDO和/或MAA，和/或将产物分泌进培养基中。
培养条件可包括例如液体培养程序以及发酵和其它大规模培养程序。如本发明所述，本发明的生物合成产物的特别有用的产量可以在厌氧或者基本上厌氧的培养条件下获得。
如本发明所述，用于获得正丙醇和异丙醇，1,4-BDO和异丙醇，1,3-BDO和异丙醇或者MAA和异丙醇的生物合成的一种示例性的生长条件包括厌氧培养或者发酵条件。在某些实施方式中，本发明的非天然存在的微生物有机体可在厌氧或者基本上厌氧条件下维持，培养或者被发酵。简言之，厌氧条件指一种缺氧环境。基本上厌氧条件包括例如在培养基中溶解氧的浓度保持在0和10%饱和度的条件下培养，分批发酵或连续发酵。基本上厌氧条件还包括在维持于小于1％氧的气氛的密封室内，在液体培养基中或固体琼脂上生长或放置细胞。氧的百分比可通过例如用N2/CO2混合物或其它合适的非氧气体喷射培养物来维持。
本发明所述的培养条件可以按比例扩大和连续扩大以供生产正丙醇和异丙醇，1,4-BDO和异丙醇，1,3-BDO和异丙醇或者MAA和异丙醇。示例性生长程序包括例如补料分批发酵和分批分离；补料分批发酵和连续分离；或连续发酵和连续分离。所有这些过程都是本领域所公知的。发酵程序尤其适用于生物合成的产生商业量的正丙醇，异丙醇，1,4-BDO，1,3-BDO和/或MAA。通常情况下且如非连续培养程序，正丙醇，异丙醇，1,4-BDO，1,3-BDO和/或MAA的连续和/或接近连续产生将包括在充足的营养物和培养基中培养本发明的非天然存在的产生正丙醇和异丙醇，1,4-BDO和异丙醇，1,3-BDO和异丙醇或者MAA和异丙醇的有机体，以保持和/或接近保持指数生长期的生长。在这种条件下的连续培养可包括例如生长1天，2天，3天，4天，5天，6天或7天或者以上。此外，连续培养可包括1周，2周，3周，4周或5周以上和至多数月的更长一段时间。或者，本发明的有机体可适应具体应用的需要培养数小时。应理解，连续和/或接近连续的培养条件还可包括这些示例性时间段之间的所有时间间隔。还应理解，培养本发明的微生物有机体的时间是足以产生足量产物用于期望目的的时间段。
发酵程序为本领域所公知。简言之，用于以生物合成方法产生正丙醇和异丙醇，1,4-BDO和异丙醇，1,3-BDO和异丙醇或者MAA和异丙醇的发酵可例如以下列方式利用:补料分批发酵和分批分离；补料分批发酵和连续分离；或连续发酵和连续分离。分批和连续发酵程序的例子为本领域所公知。
除了使用本发明的正丙醇，异丙醇，1,4-BDO，1,3-BDO和/或MAA产生菌连续产生大量正丙醇和异丙醇，1,4-BDO和异丙醇，1,3-BDO和异丙醇或者MAA和异丙醇的上述发酵程序外，正丙醇，异丙醇，1,4-BDO，1,3-BDO和/或MAA产生菌也可例如根据需要同时经历化学合成程序以将产物转化为其它化合物，或产物可从发酵培养物分离，和后续经历化学转化以将产物转化为其它化合物。
除了本发明所述的培养和发酵条件之外，为了获得生物合成正丙醇和异丙醇，1,4-BDO和异丙醇，1,3-BDO和异丙醇或者MAA和异丙醇的生长条件可包括向培养条件中添加渗透保护剂。在某些实施方式中，本发明的非天然存在的微生物有机体可以在渗透保护剂存在的情况下按照本发明所述被维持，培养或者发酵。简言之，渗透保护剂表示一种化合物，其作为一种渗透压调节剂，并且帮助如本发明所述的微生物有机体在渗透压胁迫下成活。渗透保护剂包括但不限于甜菜碱，氨基酸和海藻糖。其非限制实例是甘氨酸甜菜碱，脯氨酸甜菜碱，二甲基噻亭，二甲基硫丙酸（dimethylslfonioproprionate），3-二甲基巯基-2-甲基丙酸，哌啶酸，二甲基巯基乙酸，胆碱，L-肉碱和四氢嘧啶。在一个方面，渗透保护剂是甘氨酸甜菜碱。本领域的普通技术人员可以理解，适于从渗透胁迫保护本发明所述的微生物有机体的渗透保护剂的数量和种类将取决于所使用的微生物有机体。在培养条件下的渗透保护剂的数量可以是例如不超过大约0.1mM，不超过大约0.5mM，不超过大约1.0mM，不超过大约1.5mM，不超过大约2.0mM，不超过大约2.5mM，不超过大约3.0mM，不超过大约5.0mM，不超过大约7.0mM，不超过关于l0mM，不超过大约50mM，不超过关于l00mM，或者不超过大约500mM。
为了产生更好的产生菌，可利用代谢建模来优化生长条件。也可用建模来设计基因敲除，其还优化途径的利用(参见例如美国专利公开US2002/0012939，US 2003/0224363，US 2004/0029149，US 2004/0072723，US 2003/0059792，US2002/0168654和US 2004/0009466，和美国专利No.7，127，379)。建模分析允许可靠地预测使代谢朝着更有效产生正丙醇，异丙醇，1,4-BDO，1,3-BDO和/或MAA的方向移动对细胞生长的影响。
一种鉴别和设计有利于目标产物的生物合成的代谢改变的计算方法是OptKnock计算框架（Burgard等，Biotechnol.Bioeng.84:647-657(2003)）。OptKnock是一种代谢建模和模拟程序，其表明可形成过量产生目标产物的遗传稳定的微生物的基因缺失或破坏策略。具体地，所述框架检查微生物的完整代谢和/或生物化学网络，以便表明促使期望生物化学产物变成细胞生长的专性副产物的基因操作。通过用具有战略意义的基因缺失或其它功能基因破坏使生物化学生产与细胞生长联系，在生物反应器中历经长时间后施加于经工程改造的菌株的生长选择压力可导致性能提高，因为生长与生物化学生产被强制联系。最后，当构建基因缺失时，经设计的菌株还原成其野生型状态的可能性可以忽略，因为OptKnock所选择的基因会从基因组完全移除。因此，所述计算方法可用于鉴别可实现目标产物的生物合成的替代途径，或与非天然存在的微生物有机体结合使用以便进一步优化目标产物的生物合成。
简言之，OptKnock是本发明中用于指代建模细胞代谢的计算方法和系统的术语。OptKnock程序涉及将具体约束纳入通量平衡分析(FBA)模型中的模型和方法的框架。这些约束包括例如定性动态信息，定性调控信息和/或DNA微阵列实验数据。OptKnock还例如通过缩窄通过通量平衡模型产生的通量边界，随后探测在基因添加或缺失存在下代谢网络的性能极限来计算各种代谢问题的解决方案。OptKnock计算框架允许构建可有效地询问代谢网络的性能极限的模型公式，并提供对所得混合整数线性规划问题求解的方法。本发明中称为OptKnock的代谢建模和模拟方法描述于例如2002年1月10日提交的美国公开2002/0168654，2002年1月10日提交的国际专利号PCT/US02/00660和2007年8月10日提交的美国公开2009/0047719中。
另一种鉴别和设计有利于产物的生物合成产生的代谢变化的计算方法是称为的代谢建模和模拟系统。这种计算方法和系统描述于例如2002年6月14日提交的美国公开2003/0233218和2003年6月13日提交的国际专利申请No.PCT/US03/18838号中。
Figure BDA00001613425500812
是一种计算系统，可用于产生硅中(insilico)网络模型并模拟质量，能量或电荷通过生物系统的化学反应的通量，以便界定含有化学反应在系统中任何和所有可能的功能性的解空间，从而确定生物系统的允许活性的范围。这种方法被称作基于约束的建模，因为解空间是由例如所包括反应的已知化学计量以及反应热力学和与通过反应的最大通量能力约束等约束界定。可询问这些约束所界定的空间以确定生物系统或其生物化学组分的表型能力和行为。
这些计算方法与生物现实一致，因为生物系统适用性强且可以许多不同方式获得相同结果。通过进化机制设计生物系统，所述进化机制已经受所有活系统必须面对的基本约束限制。因此，基于约束的建模策略涵盖这些一般现实。此外，通过缩窄约束而对网络模型连续施加进一步约束的能力导致解空间的尺寸变小，从而提高生理性能或表型的预测精确性。
根据本发明所提供的教导和指导，本领域技术人员将能够应用代谢建模和模拟的各种计算框架，以便设计和实施期望化合物在宿主微生物有机体中的生物合成。所述代谢建模和模拟方法包括例如上文以
Figure BDA00001613425500813
和OptKnock示例的计算系统。为了说明本发明，本发明关于建模和模拟的OptKnock计算框架描述了一些方法。本领域技术人员将知悉如何使用OptKnock对本领域中公知的任何其它代谢建模和模拟计算框架和方法应用代谢变化的鉴别，设计和实施。
上文所述的方法将提供一组用于破坏的代谢反应。所述组内每个反应的消除或代谢修饰可导致目标产物在有机体的生长期中作为专性产物产生。因为这些反应是已知的，所以二层OptKnock问题的解决方案也将提供催化这一组反应内每个反应的一种或多种酶的相关编码基因。对于一组反应和其参与每个反应的酶的对应编码基因的鉴别一般是自动化方法，这可通过将所述反应与在酶和编码基因之间具有关系的反应数据库相关联来实现。
一旦得到鉴别，就通过至少一种编码这一组反应内每个代谢反应的基因的功能破坏在目标细胞或有机体中实施打算破坏以产生目标产物的这一组反应。一种尤其有用的实现反应组的功能破坏的方法是缺失每种编码基因。然而，在一些情况下，通过其它基因畸变破坏反应可能是有利的，包括例如突变，调控区（例如启动子或调控因子的顺式结合位点）缺失或在许多位置中的任一个位置截断编码序列。例如，当希望快速评定产物偶联时，或当遗传逆转不太可能发生时，产生少于基因集合的总体缺失的缺失的这些畸变可能是有利的。
为了针对上述二层OptKnock问题确定其它生产解决方案，从而产生用于破坏的其它各组反应或可实现生物合成(包括目标产物的生长偶联型生物合成)的代谢修饰，可实施被称作整数分割的优化方法。所述方法是通过对上文示例的OptKnock问题迭代求解来进行，其中在每次迭代时纳入被称作整数分割的另一种约束。整数分割约束有效地防止求解过程选择在任何先前迭代中鉴别的完全相同的一组反应，所述迭代强制产物生物合成与生长联系。例如，如果先前鉴别的生长偶联型代谢修饰规定反应1，2和3用于破坏，那么以下约束防止在随后求解中同时考虑相同的反应。整数分割方法在本领域中是公知的且可描述于例如Burgard等，Biotechnol.Prog.17:791-797(2001)中。与本发明关于与代谢建模和模拟的OptKnock计算框架组合使用而描述的所有方法一样，减少迭代计算分析中的冗余度的整数分割方法也可与本领域中公知的其它计算框架（包括例如）一起应用。
本发明中示例的方法允许构建以生物合成方式产生目标产物的细胞和有机体，包括强制目标生物化学产物的产生与经工程改造以具有所鉴别基因变异的细胞或有机体的生长偶联。因此，本发明所述的计算方法允许鉴别和实施通过选自OptKnock或
Figure BDA00001613425500822
的硅中方法鉴别的代谢修饰。这组代谢修饰可包括例如一种或多种生物合成途径酶的添加和/或一种或多种代谢反应的功能破坏，包括例如通过基因缺失来破坏。
如上文所讨论的，OptKnock方法的开发是基于突变型微生物网络当经历长期生长选择时可朝向其以计算机预测的最大生长表型进化这一前提。换句话说，所述方法调节有机体在选择性压力下自我优化的能力。OptKnock框架允许对基于网络化学计量迫使生物化学生产与细胞生长偶联的基因缺失组合进行穷举。对于最佳基因/反应敲除的鉴别需要对二层优化问题求解，所述问题选择活性反应组，使得所得网络的最佳生长答案过量产生目的生物化学品（Burgard等，Biotechnol.Bioeng.84:647-657(2003)）。
大肠杆菌代谢的计算机化学计量模型可用于鉴别先前示例的代谢途径的必需基因，且描述于例如美国专利公开US 2002/0012939，US2003/0224363，US2004/0029149，US 2004/0072723，US 2003/0059792，US 2002/0168654和US2004/0009466，以及美国专利No.7，127，379中。如本发明所公开的，OptKnock数学框架可用于定位导致目标产物的生长偶联型生产的基因缺失。此外，二层OptKnock问题的解决方案仅提供一组缺失。为了列举所有有意义的解决方案，即导致生长偶联型生产形成的所有敲除集合，可实施被称作整数分割的优化技术。这要求对OptKnock问题迭代求解，其中在每次迭代时纳入被称作整数分割的另一种约束，如上文所讨论的。
应理解不会对本发明的各种实施方式的活性造成实质影响的修改也提供在本发明提供的发明定义中。因此，以下实施例打算说明但不限制本发明。
实施例I
从葡萄糖协同产生正醇和异丙醇的途径
本实施例描述协同产生正丙醇和异丙醇的示例性途径。
用于协同产生正丙醇和异丙醇和相关产物的新途径描述于本发明中。本发明提供协同产生正丙醇和异丙醇的四种替代方法。大肠杆菌中异丙醇的产生先前已有描述（Hanai等，Appl Environ Microbiol 73:7814-7818(2007)）。简言之，乙酰-CoA转化成乙酰乙酰-CoA，转变成乙酰乙酸，脱去羧基形成丙酮，然后还原形成异丙醇（图1-4）。本发明所述的微生物有机体和方法将这条已知的路线与合成正丙醇的四种新途径结合起来。这种协同产生将提供完全氧化还原平衡的生产C3醇（即正丙醇和异丙醇）的路线，允许厌氧生产，与如Hanai等，supra.所述如果异丙醇单独地通过丙酮生产需要氧气相反。使用本发明所述的任何途径协同产生正丙醇和异丙醇的一个优点是提供C3醇的最高理论产量:
1葡萄糖→1.33C3H8O+2CO2+0.67H2O
而且，所有这些途径都具有净的ATP正产量。
利用乙酰-CoA异丙醇的产生
异丙醇的产生通过乙酰乙酰-CoA硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶和异丙醇脱氢酶转化乙酰-CoA实现，如附图1-4所述。异丙醇的产生已经被描述为重组体大肠杆菌在表达两种来自丙酮丁醇梭菌的异源基因（thl和adc分别编码乙酰乙酰-CoA硫解酶和乙酰乙酸脱羧酶）和一种来自C.beijerinckii（adh编码仲醇脱氢酶）的基因后，一起增加天然atoA和atoD基因（其编码乙酰乙酰-CoA:乙酸:CoA转移酶活性）的表达（Hanai等，Appl Environ Microbiol 73:7814-7818(2007)）。乙酰乙酰-CoA向乙酰乙酸的转化可被具有乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶活性的酶催化。
乙酰乙酰-CoA硫解酶
乙酰乙酰-CoA硫解酶（也称为乙酰-CoA乙酰基转移酶）将两分子乙酰-CoA转化成乙酰乙酰-CoA和CoA各一分子。示例性的乙酰乙酰-CoA硫解酶包括来自大肠杆菌的atoB（Martin等，Nat.Biotechnol 21:796-802(2003)），来自丙酮丁醇梭菌的thlA和thlB（Hanai等，Appl Environ Microbiol 73:7814-7818(2007)；Winzer等，J.Mol.Microbiol Biotechnol 2:531-541(2000)），以及来自S.cerevisiae 的ERG10（Hiser等，J.Biol.Chem.269:31383-31389(1994))）的基因产物。这些基因/蛋白质在下表1中鉴定。
表1
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  AtoB   NP_416728   16130161   大肠杆菌
  ThlA   NP_349476.1   15896127   丙酮丁醇梭菌
  ThlB   NP_149242.1   15004782   丙酮丁醇梭菌
  ERG10   NP_015297   6325229   啤酒酵母
乙酰乙酰-CoA转移酶
乙酰乙酰-CoA转移酶催化乙酰乙酰-CoA向乙酰乙酸的转化，同时将CoA部分转移到CoA受体分子。很多转移酶具有广泛的特异性，并且因此可以利用各种CoA受体，如乙酸，琥珀酸，丙酸，丁酸，2-甲基乙酰乙酸，3-酮己酸，3-酮戊酸，戊酸，巴豆酸，3-巯基丙酸，丙酸，乙烯基乙酸，丁酸，其它CoA受体。
乙酰乙酰-CoA:乙酸:CoA转移酶将乙酰乙酰-CoA和乙酸转化成乙酰乙酸和乙酰-CoA。示例性的酶包括来自大肠杆菌的atoAD（Hanai等，Appl EnvironMicrobiol 73:7814-7818(2007)），来自丙酮丁酸梭菌的ctfAB（Jojima等，Appl.Microbiol.Biotechnol.77:1219-1224(2008)）和来自糖乙酸多丁醇梭菌的ctfAB（Kosaka等，Biosci.Biotechnol Biochem.71:58-68(2007)）的基因产物，显示在下表2中。琥珀酰-CoA:3-酮酸CoA转移酶（SCOT）也可催化3-酮酰基-CoA，乙酰乙酰-CoA向3-酮酸，乙酰乙酸的转化。与乙酰乙酰-CoA:乙酸:CoA转移酶相反，SCOT使用琥珀酸作为CoA受体而不是乙酸。示例性琥珀酰-CoA:3:酮酰-CoA转移酶存在于幽门螺杆菌（Corthesy-Theulaz等，J Biol Chem272:25659-25667(1997)），枯草杆菌（Stols等，Protein Expr Purif 53:396-403(2007)），以及智人（Fukao等，Genomics 68:144-151(2000)；Tanaka等，MolHum Reprod 8:16-23(2002)）中。而另一种具有这种转化能力的转移酶是丁酰-CoA:乙酰乙酸CoA-转移酶。示例性的酶可在具核梭杆菌（Barker等人，JBacteriol_152(1):201-7(1982)），梭菌SB4（Barker等人，J Biol Chem253(4):1219-25(1978)）以及丙酮丁酸梭菌（Wiesenborn等，Appl EnvironMicrobiol 55(2):323-9(1989)）中找到。虽然在这些文献中没有提供丁酰-CoA:乙酰乙酸CoA转移酶的具体的基因序列，基因FN0272和FN0273已经被作为丁酸-乙酰乙酸CoA转移酶（Kapatral等，J Bact 184(7)2005-2018(2002)）。具核梭杆菌中的同源物例如FN1857和FN1856也可能具有期望的乙酰乙酰-CoA转移酶活性。FN1857和FN1856定位于与赖氨酸发酵中的很多其它基因相邻，并且因此很可能编码乙酰乙酸:丁酸CoA转移酶（Kreimeyer等，J Biol Chem 282(10)7191-7197(2007)）。来自牙龈卟啉单胞菌和腾冲嗜热厌氧菌的其它候选者可以相似的方式鉴定（Kreimeyer等，J Biol Chem 282(10)7191-7197(2007)）。这些基因/蛋白质鉴定于下表2中。
表2
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  基因   GenBank ID   GI编号  有机体
  AtoA   NP_416726.1   2492994  大肠杆菌
  AtoD   NP_416725.1   2492990  大肠杆菌
  CtfA   NP_149326.1   15004866  丙酮丁酸梭菌
  CtfB   NP_149327.1   15004867  丙酮丁酸梭菌
  CtfA   AAP42564.1   31075384  糖乙酸多丁醇梭菌
  CtfB   AAP42565.1   31075385  糖乙酸多丁醇梭菌
  HPAG1_0676   YP_627417   108563101  幽门螺杆菌
  HPAG1_0677   YP_627418   108563102  幽门螺杆菌
  ScoA   NP_391778   16080950  枯草芽孢杆菌
  ScoB   NP_391777   16080949  枯草芽孢杆菌
  OXCT1   NP_000427   4557817  智人
  OXCT2   NP_071403   11545841  智人
  FN0272   NP_603179.1   19703617  具核梭杆菌
  FN0273   NP_603180.1   19703618  具核梭杆菌
  FN1857   NP_602657.1   19705162  具核梭杆菌
  FN1856   NP_602656.1   19705161  具核梭杆菌
  PG1066   NP_905281.1   34540802  牙龈卟啉单胞菌W83
  PG1075   NP_905290.1   34540811  牙龈卟啉单胞菌W83
  TTE0720   NP_622378.1   20807207  腾冲嗜热厌氧菌MB4
  TTE0721   NP_622379.1   20807208  腾冲嗜热厌氧菌MB4
乙酰乙酰-CoA合成酶
CoA合成酶也可催化从乙酰乙酰-CoA除去CoA部分。一种候选酶，形成ADP的乙酰-CoA合成酶（ACD，EC 6.2.1.13），与酰基-CoA酯向其相应酸的转化同时合成ATP相偶联。具有广泛的底物特异性的几种酶已经描述在文献中。来自闪烁古生球菌的ACDI（由AF1211编码）显示在多种直链和支链底物上操作，包括乙酰-CoA，丙酰-CoA，丁酰-CoA，乙酸，丙酸，丁酸，异丁酸，异戊酸，琥珀酸，延胡索酸，苯乙酸，吲哚乙酸（Musfeldt等，J Bacteriol 184:636-644(2002)）。来自死海盐盒菌的酶（记为琥珀酰-CoA合成酶）接受丙酸，丁酸，和支链酸（异戊酸和异丁酸）作为底物，并且显示对正向和反向都发挥作用（Brasen等，Arch Microbiol 182:277-287(2004)）。来自极端嗜热泉古菌需氧热棒菌由PAE3250编码的ACD显示所有已鉴定ACDs的最广泛的底物范围，与乙酰-CoA反应，异丁酰-CoA（优选的底物）和苯乙酰-CoA（Brasen等，同上）。来自闪烁古生球菌，死海盐盒菌和需氧热棒菌菌株的这种酶已经全部被克隆，功能表达，和在大肠杆菌中表征（Musfeldt等，同上；Brasen等，同上）。这些基因/蛋白质在表下3中鉴定。
表3
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  AF1211   NP_070039.1   11498810   闪烁古生球菌DSM 4304
  scs   YP_135572.1   55377722   死海盐盒菌ATCC 43049
  PAE3250   NP_560604.1   18313937   需氧热棒菌菌株IM2
另一种候选CoA合成酶是琥珀酰-CoA合成酶。大肠杆菌的sucCD基因形成琥珀酰-CoA合成酶复合物，其自然催化由琥珀酸形成琥珀酰-CoA，同时消耗一分子ATP，一种在体内可逆的反应（Buck等，Biochem.24:6245-6252(1985)）。这些基因/蛋白质在下表4中鉴定。
表4
  蛋白质   GenBank ID   GI编号   有机体
  sucC   NP_415256.1   16128703   大肠杆菌
  sucD   AAC73823.1   1786949   大肠杆菌
其它示例性CoA连接酶包括序列还未表征的大鼠二羧酰-CoA连接酶（Vamecq等，Biochemical Journal 230:683-693(1985)），两个已鉴定的来自产黄青霉的苯乙酰-CoA连接酶（Lamas-Maceiras等，Biochem.J.395:147-155(2005)；Wang等，Biochem Biophy Res Commun 360(2):453-458(2007)）和来自恶臭假单胞菌的苯乙酰-CoA连接酶（Martinez-Blanco等，J.Biol.Chem.265:7084-7090(1990)）中的任何一个，以及来自枯草芽孢杆菌的6-羧基己酰-CoA连接酶（Bower等，J.Bacteriol.178(14):4122-4130(1996)）。另外的候选酶是来自家鼠（Hasegawa等，Biochim Biophys Acta 1779:414-419(2008)）和智人（Ohgami等，Biochem Pharmacol 65:989-994(2003)）的乙酰乙酰-CoA合成酶，其自然催化ATP依赖的将乙酰乙酸转化为乙酰乙酰-CoA。这些基因/蛋白质在下表5中鉴定。
表5
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  phl   CAJ15517.1   77019264   产黄青霉
  phlB   ABS19624.1   152002983   产黄青霉
  paaF   AAC24333.2   22711873   恶臭假单胞菌
  bioW   NP_390902.2   50812281   枯草芽孢杆菌
  AACS   NP_084486.1   21313520   小家鼠
  AACS   NP_076417.2   31982927   智人
乙酰乙酰-CoA水解酶
乙酰乙酰-CoA也可被CoA水解酶转化成乙酰乙酸。乙酰乙酰-CoA水解酶候选者包括酰基-CoA水解酶，3-羟基异丁酰-CoA水解酶，乙酰-CoA水解酶和二羧酸硫酯酶。短链脂肪酰基-CoA水解酶在大鼠肝线粒体中被发现接受乙酰乙酰-CoA作为底物；然而，与此酶相关的基因到目前为止还没鉴定（Svensson等，Eur.J.Biochem.，239:526-531(1996)）。
3-羟基异丁酰-CoA水解酶有效地催化3-羟基异丁酰基-CoA在缬氨酸降解期间转化为3-羟基异丁酸（Shimomura等，J Biol Chem.269:14248-14253(1994)）。编码该酶的基因包括褐鼠（Shimomura等，同上；Shimomura等，MethodsEnzymol.324:229-240(2000)）和智人（Shimomura等，同上）的hibch。智人的该酶也接受3-羟基丁酰-CoA和3-羟基丙酰-CoA作为底物（Shimomura等，同上）。序列同源的侯选基因包括啤酒酵母的hibch和蜡样芽胞杆菌的BC_2292。这些基因/蛋白质在下表6中鉴定。
表6
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  hibch   Q5XIE6.2   146324906   褐鼠
  hibch   Q6NVY1.2   146324905   智人
  hibch   P28817.2   2506374   啤酒酵母
  BC_2292   AP09256   29895975   蜡样芽胞杆菌
几种真核的乙酰-CoA水解酶（EC 3.1.2.1）有广泛的底物特异性，和因此代表合适的候选酶。例如，来自褐鼠大脑的酶（Robinson等，Res.Commun.71:959-965(1976)）能与丁酰-CoA，己酰-CoA和丙二酰-CoA反应。虽然它的序列还没有被报道，来自豌豆叶线粒体的酶也具有广泛的底物特异性，对乙酰-CoA，丙酰上-CoA，丁酰-CoA，棕榈酰-CoA，油酰-CoA，琥珀酰-CoA和巴豆酰-CoA具有证实的活性（Zeiher等，Plant.Physiol.94:20-27(1990)）。来自啤酒酵母的乙酰-CoA水解酶(ACH1）代表另一种候选水解酶（Buu等，(Buu等人，J.Biol.Chem.278:17203-17209(2003)）。这些基因/蛋白质在下表7中鉴定。
表7
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  acot12   NP_570103.1   18543355   褐鼠
  ACH1   NP_009538   6319456   啤酒酵母
另一种候选水解酶是人二羧酸硫酯酶acot8，其对戊二酰-CoA，己二酰-CoA，环庚基-CoA，癸二酰-CoA和十二烷二酰-CoA显示活性（Westin等，J Biol.Chem.280:38125-38132(2005)），和最近的大肠杆菌同源物（tesB），其也能水解广泛的CoA硫酯（Naggert等，J Biol.Chem.266:11044-11050(1991))）。一种相似的酶也已经在大鼠肝脏中表征（Deana等，Biochem.Int.26:767-773(1992)）。其它潜在的大肠杆菌硫酯水解酶包括tesA（Bonner等，Chem.247:3123-3133(1972)），ybgC（Kuznetsova等，FEMS Microbiol Rev 29:263-279(2005)；和Zhuang等，FEBS Lett.516:161-163(2002)），paaI（Song等，J Biol.Chem.281:11028-11038(2006)），以及ybdB（Leduc等，J Bacteriol.189:7112-7126(2007)）的基因产物。这些基因/蛋白质在下表8中鉴定。
表8
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  tesB   NP_414986   16128437   大肠杆菌
  acot8   CAA15502   3191970   智人
  acot8   NP_570112   51036669   褐鼠
  tesA   NP_415027   16128478   大肠杆菌
  ybgC   NP_415264   16128711   大肠杆菌
  paaI   NP_415914   16129357   大肠杆菌
  ybdB   NP_415129   16128580   大肠杆菌
而另一种候选水解酶是来自发酵氨基酸球菌的戊烯二酸CoA-转移酶。这种酶通过定点突变转化成对戊二酰-CoA，乙酰-CoA和3-丁烯酰-CoA具有活性的酰基-CoA水解酶（Mack等，FEBS.Lett.405:209-212(1997)）。这表明编码琥珀酰-CoA:3-酮酰-CoA转移酶和乙酰乙酰-CoA:乙酰-CoA转移酶的这种酶也可能作为该反应步骤的候选酶，但是将需要某些突变以改变它们的功能。这些基因/蛋白质在下表9中鉴定。
表9
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  gctA   CAA57199   559392   发酵氨基酸球菌
  gctB   CAA57200   559393   发酵氨基酸球菌
乙酰乙酸脱羧酶
乙酰乙酸脱羧酶将乙酰乙酸转化成二氧化碳和丙酮。示例性的乙酰乙酸脱羧酶酶由来自丙酮丁酸梭菌的adc（Petersen和Bennett，Appl Environ.Microbiol 56:3491-3498(1990)）和来自糖乙酸多丁醇梭菌的adc（Kosaka等，Biosci.Biotechnol Biochem.71:58-68(2007)）的基因产物编码。来自拜氏梭菌的酶可以由序列相似性推测。这些基因/蛋白质在下表10中鉴定。
表10
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  Adc   NP_149328.1   15004868   丙酮丁酸梭菌
  Adc   AAP42566.1   31075386   糖乙酸多丁醇梭菌
  Adc   YP_001310906.1   150018652   拜氏梭菌
异丙醇脱氢酶
异丙醇合成途径中的最后步骤涉及异丙醇向丙酮的还原。能进行这种转化的示例性醇脱氢酶包括来自拜氏梭菌的adh（Hanai等，Appl Environ Microbiol73:7814-7818(2007)；Jojima等，Appl.Microbiol.Biotechnol.77:1219-1224(2008)）和来自布氏嗜热厌氧杆菌（Thermoanaerobobacter brockii）的adh（Hanai等，Appl Environ Microbiol 73:7814-7818(2007)；Peretz等，Anaerobe3:259-270(1997)）。其它已鉴定的酶包括来自真氧产碱杆菌（曾命名为Alcaligenes eutrophus）（Steinbuchel和Schlegel等，Eur.J.Biochem.141:555-564(1984)）和植物单胞菌属（Uttaro和Opperdoes等，Mol.Biochem.Parasitol.85:213-219(1997)）的醇脱氢酶。这些基因/蛋白质在下表11中鉴定。
表11
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  sadh   CAD36475   21615553   红色红球菌
  adhA   AAC25556   3288810   激烈热球菌
  Adh   P14941.1   113443   布氏嗜热厌氧杆菌
  Adh   AAA23199.2   60592974   拜氏梭菌
利用丙酰-CoA产生正丙醇
本发明所述的产生正丙醇的途径利用CoA依赖的醛脱氢酶还原丙酰-CoA为丙醛，然后进一步还原形成正丙醇（图1-4）。这种转化由两种不同的酶完成:醛和醇脱氢酶，或者在一个步骤中通过双官能醛/醇脱氢酶完成。可替代地，丙酰-CoA可以转化为丙酰磷酸，然后由酰基磷酸还原酶转化为丙醛。
丙醛脱氢酶和丙醇脱氢酶
丙酰-CoA向丙醇的转化由具有CoA依赖的醛脱氢酶和醇脱氢酶活性的双功能酶或者由具有醛和醇脱氢酶活性的两种不同酶催化。
示例性的能将酰基-CoA转化为醇的两步氧化还原酶包括能转化底物的酶，例如将乙酰-CoA转化为乙醇（例如，来自大肠杆菌的adhE）（Kessler，FEBS.Lett.281:59-63(1991)）和丁酰-CoA转化为丁醇（例如来自丙酮丁酸梭菌的adhE2）（Fontaine等，J.Bacteriol.184:821-830(2002)）。除了将乙酰-CoA还原为乙醇之外，由肠膜明串珠菌中的adhE编码的酶已经显示将支链化合物异丁醛氧化为异丁酰-CoA（Kazahaya，Microbiol.18:43-55(1972)；和Koo等，Biotechnol Lett.27:505-510(2005)）。这些基因/蛋白质在下表12中鉴定。
表12
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  adhE   NP_415757.1   16129202   大肠杆菌
  adhE2   AAK09379.1   12958626   丙酮丁酸梭菌
  adhE   AAV66076.1   55818563   肠膜明串珠菌
其它示例性的酶能转化丙二酰-CoA为3-HP。具有这种活性的NADPH依赖性酶已经在橙色绿屈挠菌中鉴定，其中所述的酶参与到3-羟基丙酸循环中（Hugler，J.Bacteriol.184:2404-2410(2002)；和Strauss，Eur.J.Biochem.215:633-643(1993)）。这种酶具有300kDa的分子量，具有高度的底物特异性，并且显示与其它已知的氧化还原酶有很少的序列相似性（Hugler，J.Bacteriol.184:2404-2410(2002)）。在其它有机体中还没有酶显示出催化这种特异性反应；但是有生物信息学证据表明其它有机体可能具有相似的途径（Klatt，Environ.Microbiol.9:2067-2078(2007)）。在其它生物包括Roseiflexus castenholzii，赤杆菌NAP1种和海洋γ蛋白菌HTCC2080中的候选酶可以由序列相似性推测。这些基因/蛋白质在下表13中鉴定。
表13
Figure BDA00001613425500921
更长链脂肪酰-CoA分子可以被酶例如荷荷巴（希蒙德木）FAR还原，其中所述的FAR编码形成醇的脂酰-CoA还原酶。其在大肠杆菌中过表达导致FAR活性和脂肪族醇的积累（Metz，Plant Physiology 122:635-644(2000)）。这些基因/蛋白质在下表14中鉴定。
表14
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  FAR   AAD38039.1   5020215   希蒙德木
几种酰基-CoA脱氢酶能还原酰基-CoA为其相应的醛。编码这种酶的示例性基因包括醋酸钙不动杆菌acrl编码的脂肪酰-CoA还原酶（Reiser，Journal ofBacteriology 179:2969-2975(1997)），不动杆菌菌株M-1脂肪酰-CoA还原酶（Ishige等，Appl.Environ.Microbiol.68:1192-1195(2002)）和由克氏梭状芽孢杆菌中的sucD基因编码的CoA和NADP依赖的琥珀酸半脱氢酶（Sohling，J.Bacteriol.178:871-880(1996)）。牙龈卟啉单胞菌的sucD是另一种琥珀酸半醛脱氢酶（Takahashi，J.Bacteriol 182:4704-4710(2000)）。在假单胞菌中酰化乙醛脱氢酶的酶由bphG编码，是又一候选酶，因为其已经被证明氧化和酰化乙醛，丙醛，丁醛，异丁醛和甲醛（Powlowski，J.Bacteriol.175:377-385(1993)）。除了将乙酰-CoA还原为乙醇之外，由肠膜明串珠菌中的adhE编码的酶已经显示出氧化支链化合物异丁醛为异丁酰-CoA（Kazahaya，J.Gen.Appl.Microbiol.18:43-55（1972）；和Koo等，Biotechnol.Lett.27:505-510(2005)）。这些基因/蛋白质在下表15中鉴定。
表15
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  acr1   YP_047869.1   50086359   醋酸钙不动杆菌
  acr1   AAC45217   1684886   贝氏不动杆菌
  acr1   BAB85476.1   18857901   不动杆菌菌株M-1
  sucD   P38947.1   172046062   克氏梭状芽孢杆菌
  sucD   NP_904963.1   34540484   牙龈卟啉单胞菌
  bphG   BAA03892.1   425213   假单胞菌属
  adhE   AAV66076.1   55818563   肠膜明串珠菌
转化酰基-CoA为它的相应醛的另一种酶类型是丙二酰-CoA还原酶，其转化丙二酰-CoA为丙二酸半醛。丙二酰-CoA还原酶是通过嗜热嗜酸古细菌中的3-羟基丙酸循环的自养碳固定中的一个关键酶（Berg，Science 318:1782-1786(2007)；和Thauer，Science 318:1732-1733(2007)）。这种酶利用NADPH作为辅因子并且已经在金属球菌和硫化叶菌属中鉴定（Alber等，J.Bacteriol.188:8551-8559(2006)；和Hugler，J.Bacteriol.184:2404-2410(2002)）。该酶由勤奋金属球菌中的Msed_0709编码（Alber等，J.Bacteriol.188:8551-8559(2006)；和Berg，Science 318:1782-1786(2007)）。一种编码来自Sulfolobus tokodaii的丙二酰基-CoA还原酶的基因在大肠杆菌中被克隆和异源表达（Alber等，J.Bacteriol.188:8551-8559(2006)）。这种酶也已经显示催化甲基丙二酰-CoA向其相应醛的转化（WO2007141208(2007)）。虽然这些酶的醛脱氢酶功能类似于来自橙色绿屈挠菌的双功能脱氢酶，但几乎没有序列相似性。两种丙二酰-CoA还原酶的候选酶与天冬氨酸半醛脱氢酶具有高度的序列相似性，后者是一种催化天冬氨酰-4-磷酸向天冬氨酸半醛的还原和正向脱磷酸化的酶。其它的候选基因可通过在其它有机体包括硫磺矿硫化叶菌和嗜酸热硫化叶菌以及下文所列举的有机体中蛋白质的序列同源性发现。酰化CoA的醛脱氢酶的又一候选酶是来自拜氏梭菌的ald基因（Toth，Appl.Environ.Microbiol.65:4973-4980(1999)）。已经报道此酶还原乙酰-CoA和丁酰-CoA为其相应的醛。此基因与编码鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌的乙醛脱氢酶的eutE非常类似（Toth，Appl.Environ.Microbiol.65:4973-4980(1999)）。这些基因/蛋白质在下表16中鉴定。
表16
 基因   GenBank ID   GI编号  有机体
 Msed_0709   YP_001190808.1   146303492  勤奋金属球菌
 mcr   NP_378167.1   15922498  Sulfolobus tokodaii
 asd-2   NP_343563.1   15898958  硫磺矿硫化叶菌
 Saci_2370   YP_256941.1   70608071  嗜酸热硫化叶菌
 Ald   AAT66436   49473535  拜氏梭菌
 eutE   AAA80209   687645  鼠伤寒沙门菌
 eutE   P77445   2498347  大肠杆菌
编码催化醛转化为醇的酶（即，醇脱氢酶或者等效地醛还原酶）的示例性基因包括编码C2-C14中链醇脱氢酶的alrA，（Tani，Appl.Environ.Microbio66:5231-5235(2000)）来自啤酒酵母的ADH2，（Atsumi，Nature 451:86-89(2008)）来自大肠杆菌的yqhD，其偏爱分子长于C3，（Sulzenbacher等，Journal ofMolecular Biology 342:489-502(2004)）和来自丙酮丁酸梭菌的bdh I和bdh II，其将丁醛转化为丁醇（Walter，Journal of Bacteriology174:7149-7158(1992)）。yqhD的基因产物使用NADPH作为辅因子催化还原乙醛，丙二醛，丙醛，丁醛和丙烯醛（Perez，J.Biol.Chem.283:7346-7353(2008)）。来自运动发酵单胞菌的ADH1已经被证明对许多醛类具有活性，包括甲醛，乙醛，丙醛，丁醛和丙烯醛（Kinoshita，Appl.Microbiol.Biotechnol.22:249-254(1985)）。这些基因/蛋白质在下表17中鉴定。
表17
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  alrA   BAB12273.1   9967138   不动杆菌M-1菌株
  ADH2   NP_014032.1   6323961   啤酒酵母
  yqhD   NP_417484.1   16130909   大肠杆菌
  bdhI   NP_349892.1   15896543   丙酮丁酸梭菌
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  bdh II   NP_349891.1   15896542   丙酮丁酸梭菌
  adhA   YP_162971.1   56552132   运动发酵单胞菌
显示3-羟基丁醛还原酶活性的酶（EC 1.1.1.61）也分为这种类型。这种酶已经在真氧产碱杆菌（Bravo J.Forensic Sci.49:379-387(2004)），克氏梭状芽孢杆菌（Wolff，Protein Expr.Purif.6:206-212(1995)）和拟南芥（Breitkreuz等，J.Biol.Chem.278:41552-41556(2003)）中鉴定。而其它候选基因是来自热糖苷酶地芽孢杆菌的醇脱氢酶adhI（Jeon等，J.Biotechnal 135:127-133(2008)）。这些基因/蛋白质在下表18中鉴定。
表18
其它示例性的酶是催化可逆氧化3-羟基异丁酸为甲基丙二酸半醛的3-羟基异丁酸脱氢酶。此酶参与缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸的降解，并且已经在细菌，真核生物和哺乳动物中鉴定。由来自嗜热栖热菌HB8的P84067编码的酶已经在结构上进行了描述（Lokanath等，J Mol Biol 352:905-917(2005)）。人3-羟基异丁酸脱氢酶的可逆性使用同位素标记底物已被证实（Manning，Biochem J231:481-484(1985)）。编码该酶的其它包括智人（Hawes等，Methods Enzymol.324:218-228(2000)）和欧洲兔（Hawes等，Methods Enzymol.324:218-228(2000)；和Chowdhury，Biosci.Biotechnol Biochem.60:2043-2047(1996)）中的3hidh，绿脓杆菌中的mmsb，以及恶臭假单胞菌中的dhat（Aberhart，J Chem.Soc.6:1404-1406（1979）；Chowdhury，Biosci.Biotechnol Biochem.60:2043-2047(1996)和Chowdhury，Biosci.Biotechnol Biochem.67:438-441(2003)）。这些基因/蛋白质在下表19中鉴定。
表19
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  P84067   P84067   75345323   嗜热栖热菌
  mmsb   P28811.1   127211   绿脓杆菌
  dhat   Q59477.1   2842618   恶臭假单胞菌
  3hidh   P31937.2   12643395   智人
  3hidh   P32185.1   416872   欧洲兔
丙酰CoA:磷酸丙酰基转移酶
丙酰-CoA向丙酰磷酸的转化可由磷酸转移酶催化。在磷酸乙酰基转移酶（EC 2.3.1.8）中，包括来自枯草杆菌（Rado，Biochem.Biophys.Acta321:114-125(1973)），克氏梭状芽孢杆菌（Stadtman，Methods Enzymol1:596-599(1955)）和海栖热袍菌（Bock，J Bacteriol.181:1861-1867(1999)）的几种酶已经显示出对丙酰-CoA具有活性。因此，编码这些磷酸乙酰基转移酶的基因以及大肠杆菌pta基因将利用来催化此步骤。这些基因/蛋白质在下表20中鉴定。
表20
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  pta   P39646   730415   枯草芽孢杆菌
  pta   A5N801   146346896   克氏梭状芽孢杆菌
  pta   Q9X0L4   6685776   海栖热袍菌
  pta   P0A9M8   71152910   大肠杆菌K12
丙酰磷酸还原酶
丙酰磷酸向丙醛的转化由丙酰磷酸还原酶催化。即使这种直接转化还没有被证实，但相似的转化已经被充分证明了，包括甘油醛3-磷酸脱氢酶和天冬氨酸半醛脱氢酶。编码甘油醛3-磷酸脱氢酶和天冬氨酸半醛脱氢酶的下列基因将考虑催化此步骤。这些基因/蛋白质在下表21中鉴定。
表21
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  asd   NP_417891   16131307   大肠杆菌K12
  gapA   NP_785996   28379104   植物乳杆菌WCFS1
  gapA   NP_416293   71159358   大肠杆菌K12
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  gapA   NP_347346   15893997   丙酮丁酸梭菌ATCC 824
  gapN   NP_350239   15896890   丙酮丁酸梭菌ATCC 824
丙酰-CoA水解酶
丙酰-CoA可以被CoA水解酶，合成酶或者转移酶转化为丙酸。丙酰-CoA水解为丙酸发生在有机酸降解途径中，其中通过中间体2-氧代丁酸进行。此反应由酰基-CoA水解酶（EC 3.1.2.18）催化。丙酰-CoA是在大鼠肝线粒体中发现的优选的短链脂肪酰-CoA底物（Alexson等，Biochim Biophys.Acta.，1105(1):13-9(1989)）。此酶已经鉴定但是编码该基因的序列还没有鉴定（Garras等，Biochim.Biophys.Acta.，1255:154-160(1995)）。对丙酰CoA显示出CoA水解酶活性的其它酶在豌豆叶的线粒体中被发现。虽然其序列还没有报道，但此酶具有广泛的底物特异性，对乙酰-CoA，丙酰-CoA，丁酰-CoA，棕榈酰-CoA，油酰-CoA，琥珀酰-CoA，以及巴豆酰-CoA具有经证实的活性（Zeiher等，Plant.Physiol.94:20-27(1990)）。其它丙酰-CoA水解酶候选者包括3-羟基异丁酰-CoA水解酶，乙酰-CoA水解酶和二羧酸硫酯酶。
在缬氨酸降解期间3-羟基异丁酰-CoA水解酶有效地催化3-羟基异丁酰-CoA向3-羟基异丁酸的转化（Shimomura等，J Biol Chem.269:14248-14253(1994)）。编码这种酶的基因包括褐鼠（Shimomura等，Methods Enzymol.324:229-240(2000)）和智人（Shimomura等，同上）的hibch。智人的酶也接受3-羟基丁酰-CoA和3-羟基丙酰-CoA作为底物（Shimomura等，同上）。通过序列同源性的侯选基因包括啤酒酵母和蜡样芽胞杆菌BC_2292的hibch。这些基因/蛋白质在下表22中鉴定。
表22
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  hibch   Q5XIE6.2   146324906   褐鼠
  hibch   Q6NVY1.2   146324905   智人
  hibch   P28817.2   2506374   啤酒酵母
  BC_2292   AP09256   29895975   蜡样芽胞杆菌
几种真核乙酰-CoA水解酶（EC 3.1.2。1）具有广泛的底物特异性，因此代表合适的候选酶。例如，来自褐鼠大脑的酶（Robinson等，Res.Commun.71:959-965（1976））能与丁酰-CoA，己酰-CoA和丙二酰-CoA反应。来自啤酒酵母的乙酰-CoA水解酶ACH1代表另一种候选水解酶（Buu等，J.Biol.Chem.278:17203-17209(2003)）。这些基因/蛋白质在下表23中鉴定。
表23
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  acot12   NP_570103.1   18543355   褐鼠
  ACH1   NP_009538   6319456   啤酒酵母
另一种候选水解酶是人二羧酸硫酯酶acot8，其对戊二酰-CoA，己二酰-CoA，环庚基-CoA，癸二酰-CoA和十二烷二酰-CoA显示活性（Westin等，J Biol.Chem.280:38125-38132(2005)），以及最近的大肠杆菌同源物tesB，其也能水解广泛的CoA硫酯（Naggert等，J Biol.Chem.266:11044-11050(1991)）。一种相似的酶也已经在大鼠肝中鉴定（Deana等，Biochem.Int.26:767-773(1992)）。其它潜在的大肠杆菌硫酯水解酶包括tesA（Bonner等，Chem.247:3123-3133（1972）），ybgC（Kuznetsova等，FEMS Microbiol Rev 29:263-279(2005)；和Zhuang等，FEBS Lett.516:161-163(2002)），paal（Song等，J Biol.Chem.281:11028-11038(2006)），md ybdB（Leduc等，J Bacteriol.189:7112-7126(2007)）的基因产物。这些基因/蛋白质在下表24中鉴定。
表24
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  tesB   NP_414986   16128437   大肠杆菌
  acot8   CAA15502   3191970   智人
  acot8   NP_570112   51036669   褐鼠
  tesA   NP_415027   16128478   大肠杆菌
  ybgC   NP_415264   16128711   大肠杆菌
  paaI   NP_415914   16129357   大肠杆菌
  ybdB   NP_415129   16128580   大肠杆菌
而其它候选水解酶是来自发酵氨基酸球菌的戊烯二酰-CoA转移酶。此酶通过定点突变转化成对戊二酰-CoA，乙酰-CoA和3-丁烯酰-CoA具有活性的酰基-CoA水解酶（Mack等，FEBS.Lett.405:209-212(1997)）。这表明编码琥珀酰-CoA:3-酮酰-CoA转移酶和乙酰乙酰-CoA:乙酰-CoA转移酶的酶也可作为这步反应的候选者，但是需要某种突变改变它们的功能。这些基因/蛋白质在下表25中鉴定。
表25
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  gctA   CAA57199   559392   发酵氨基酸球菌
  gctB   CAA57200   559393   发酵氨基酸球菌
丙酰-CoA合成酶
CoA合成酶也可催化从丙酰-CoA除去CoA部分。一种候选酶，ADP-形成的乙酰-CoA合成酶（ACD，EC 6.2.1.13），将酰基-CoA酯向相应酸的转化与同时合成ATP相偶联。具有广泛的底物特异性的几种酶已经描述在文献中。来自闪烁古生球菌的ACDI由AF1211编码，显示对多种直链和支链底物发挥作用，包括乙酰-CoA，丙酰-CoA，丁酰-CoA，乙酸，丙酸，丁酸，异丁酸，异戊酸，琥珀酸，延胡索酸，苯乙酸，吲哚乙酸（Musfeldt等，J Bacteriol184:636-644(2002)）。来自死海盐盒菌的酶（记为琥珀酰-CoA合成酶）接受丙酸，丁酸，和支链酸（异戊酸和异丁酸）作为底物，并且显示对正向和反向都发挥作用（Brasen等，Arch Microbiol 182:277-287(2004)）。来自极端嗜热泉古菌需氧热棒菌由PAE3250编码的ACD显示出所有已鉴定ACDs的最广泛的底物范围，与乙酰-CoA，异丁酰-CoA（优选的底物）和苯乙酰-CoA反应（Brasen等，同上）。来自闪烁古生球菌和需氧热棒菌的酶全部已经在大肠杆菌中被克隆，功能表达和鉴定（Musfeldt等，同上杆菌；Brasen等，同上）。这些基因/蛋白质在下表26中鉴定。
表26
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  AF1211   NP_070039.1   11498810   闪烁古生球菌DSM 4304
  scs   YP_135572.1   55377722   死海盐盒菌ATCC 43049
  PAE3250   NP_560604.1   18313937   需氧热棒菌菌株IM2
另一种候选的CoA合成酶是琥珀酰-CoA合成酶。大肠杆菌的sucCD基因形成琥珀酰-CoA合成酶复合物，其自然催化由琥珀酸形成琥珀酰-CoA，同时消耗一分子ATP，该反应在体内可逆（Buck等，Biochem.24:6245-6252(1985)）。这些基因/蛋白质在下表27中鉴定。
表27
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  sucC   NP_415256.1   16128703   大肠杆菌
  sucD   AAC73823.1   1786949   大肠杆菌
其它示例性CoA连接酶包括大鼠二羧酰-CoA连接酶，其序列还未鉴定（Vamecq等，Biochemical Journal 230:683-693(1985)），两个已鉴定的来自产黄青霉的苯乙酰-CoA的连接酶（Lamas-Maceiras等，Biochem.J.395:147-155(2005)；Wang等，Biochem Biophy Res Commun 360（2）:453-458(2007)），来自恶臭假单胞菌的乙酰-CoA连接酶（马丁内斯Bianco等的，J.Biol.Chem.265:7084-7090(1990)），以及来自枯草芽孢杆菌的6-羧基己酰-CoA连接酶（Boweret al，J.Bacteriol.178（14）:4122-4130(1996)）。其它候选酶是来自家鼠（Hasegawa等，Biochim Biophys Acta 1779:414-419(2008)）和智人（Ohgami等，Biochem Pharmacol 65:989-994(2003)）的乙酰乙酰-CoA合成酶，其自然催化ATP依赖的乙酰乙酸向乙酰乙酰-CoA的转化。这些基因/蛋白质在下表28中鉴定。
表28
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  phl   CAJ15517.1   77019264   产黄青霉
  phlB   ABS19624.1   152002983   产黄青霉
  paaF   AAC24333.2   22711873   恶臭假单胞菌
  bioW   NP_390902.2   50812281   枯草芽孢杆菌
  AACS   NP_084486.1   21313520   小家鼠
  AACS   NP_076417.2   31982927   智人
丙酰-CoA转移酶
丙酰-CoA转移酶催化丙酰-CoA向丙酸的转化，同时将CoA部分转移给CoA受体分子。很多转移酶具有广泛的特异性，因此可以利用如乙酸，琥珀酸，丙酸，丁酸，2-甲基乙酰乙酸，3-酮己酸，3-酮戊酸，戊酸，巴豆酸，3-巯基丙酸，丙酸，乙酸乙烯酯，丁酸，除此之外等不同的CoA受体。
几种基因已经鉴定具有丙酰-CoA转移酶活性。来自罗斯氏菌属A2-183的酶显示具有丁酰-CoA:乙酸:CoA转移酶和丙酰-CoA:乙酸:CoA转移酶活性（Charrier等，Microbiology 152，179-185(2006)）。相近的同源物可在例如肠罗斯氏菌L1-82，Roseburia inulinivorans DSM 16841，直肠真细菌ATCC33656中发现。具有丙酰-CoA转移酶活性的其它酶可在丙酸梭菌（Selmer等，Eur J Biochem 269，372-380(2002)）中发现。此酶可使用乙酸，(R)-乳酸，(S)-乳酸，丙烯酸和丁酸作为CoA受体（Selmer等，Eur J Biochem 269，372-380(2002)；Schweiger和Buckel，FEBS Letters，171（1）79-84(1984)）。相近的同源物可在例如诺氏梭菌NT，拜氏梭菌NCIMB 8052，以及C型肉毒杆菌埃克隆德菌株中发现。Ygfli编码大肠杆菌中的丙酰-CoA:琥珀酸CoA转移酶（Haller等，Biochemistry，39（16）4622-4629）。相近的同源物可在例如杨氏柠檬酸杆菌ATCC29220，肠道沙门氏菌亚种亚利桑那沙门和中间耶尔森菌ATCC 29909中发现。这些基因/蛋白质在下表29中鉴定。
表29
Figure BDA00001613425501011
Figure BDA00001613425501021
一种其它的候选酶是由假单胞菌中的pcaI和pcaJ编码的双亚基酶，其已经显示具有3-氧代己二酸CoA/琥珀酸转移酶活性（Kaschabek等，同上）。基于同源的近似酶存在于不动细菌属ADPl（Kowalchuk等，gene 146:23-30(1994)）和链霉菌属coelicolor中。其它示例性琥珀酰-CoA:3:酮酰-CoA转移酶存在于幽门螺杆菌（Corthesy-Theulaz等，J.Biol.Chem.272:25659-25667(1997)）和枯草杆菌（Stols等，Protein.Expr.Purif.53:396-403(2007)）中。这些基因/蛋白质在下表30中鉴定。
表30
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  pcaI   AAN69545.1   24985644   恶臭假单胞菌
  pcaJ   NP_746082.1   26990657   恶臭假单胞菌
  pcaI   YP_046368.1   50084858   不动杆菌属ADP1
  pcaJ   AAC37147.1   141776   不动杆菌属ADP1
  pcaI   NP_630776.1   21224997   链霉菌
  pcaJ   NP_630775.1   21224996   链霉菌
  HPAG1_0676   YP_627417   108563101   幽门螺杆菌
  HPAG1_0677   YP_627418   108563102   幽门螺杆菌
  ScoA   NP_391778   16080950   枯草芽孢杆菌
  ScoB   NP_391777   16080949   枯草芽孢杆菌
能利用乙酸作为CoA受体的CoA转移酶是乙酰乙酰-CoA转移酶，由大肠杆菌atoA（α亚单位）和atoD（β亚基)基因编码（Vanderwinkel等，Biochem.Biophys.Res.Commun.33:902-908(1968)；Korolev等，Acta Crystallogr.D BiolCrystallogr.58:2116-2121(2002)）。此酶也已经显示出从各种支链和直链酰基-CoA底物向乙酰转移CoA部分，包括异丁酸（Matthies等，Appl Environ Microbiol58:1435-1439(1992)），戊酸（Vanderwinkel等，同上）和丁酸（Vanderwinkel等，同上）。相似的酶存在于谷氨酸棒杆菌ATCC 13032（Duncan等，Appl EnvironMicrobiol 68:5186-5190(2002)），丙酮丁酸梭菌（Cary等，Appl Environ Microbiol56:1576-1583(1990)），以及糖乙酸多丁醇梭菌（Kosaka等，Biosci.BiotechnolBiochemistry 71:58-68(2007)）中。这些基因/蛋白质在下表31中鉴定。
表31
Figure BDA00001613425501031
上述酶也可能对丙酰-CoA显示出期望的活性。其它示例性的候选转移酶由克氏梭状芽孢杆菌的catl，cat2和cat3的基因产物催化，其已经分别显示出琥珀酰-CoA，4-羟基丁酰-CoA和丁酰-CoA转移酶活性（Seedorf等，同上；Sohling等，Eur.J.Biochem.212:121-127(1993)；Sohling等，J Bacteriol.178:871-880(1996)）。相似的CoA转移酶活性也存在于阴道毛滴虫（van Grinsven等，J.Biol.Chem.283:1411-1418(2008)）和布氏锥虫（Riviere等，J.Biol.Chem.279:45337-45346(2004)）。这些基因/蛋白质在下表32中鉴定。
表32
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  cat1   P38946.1   729048   克氏梭状芽孢杆菌
  cat2   P38942.2   172046066   克氏梭状芽孢杆菌
  cat3   EDK35586.1   146349050   克氏梭状芽孢杆菌
  TVAG_395550   XP_001330176   123975034   阴道毛滴虫G3
  Tb11.02.0290   XP_828352   71754875   布氏锥虫
来自厌氧细菌发酵氨基酸球菌中的戊烯二酰-CoA转移酶（EC 2.8.3.12）与二酸戊烯二酰-CoA和3-丁烯酰-CoA反应（Mack等，FEBS Lett.405:209-212(1997)）。编码该酶的基因是gctA和gctB。此酶对其它CoA衍生物具有降低的但可检测的活性，包括戊二酰-CoA，2-羟基戊二酰-CoA，己二酰-CoA和丙烯酰-CoA（Buckel等，Eur.J.Biochem.118:315-321（1981））。酶已经在E被克隆并且表达大肠杆菌的（Mack等，Eur.J.Biochem.226:41-51(1994)）。这些基因/蛋白质在下表33中鉴定。
表33
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  gctA   CAA57199.1   559392   发酵氨基酸球菌
  gctB   CAA57200.1   559393   发酵氨基酸球菌
丙酸激酶
丙酸被具有丙酸激酶活性的酶活化为丙酰磷酸。丁酸激酶（EC 2.7.2.7）在丙酮丁酸梭菌产酸过程中进行可逆的转化丁酰磷酸为丁酸（Cary等，Appl.Environ.Microbiol.56:1576-1583(1990)）。此酶由两个buk基因产物中的任一个编码（黄等，J.Mol.Microbiol Biotechnol 2:33-38(2000)）。此酶显示接受丙酸，异丁酸和戊酸作为替代的底物（Hartmanis，J.Biol.Chem.，262（2）:617-21(1987)）。其它丁酸激酶在丁酸梭菌和破伤风形梭菌中发现（Twarog等，J Bacteriol.86:112-117（1963））。这些酶也接受丙酸，异丁酸和戊酸作为第二底物。来自海栖热袍菌的有关酶异丁酸激酶也已经在大肠杆菌中表达和结晶（Diao等，E.Biol.Crystallogr.59:1100-1102(2003)；和Diao等，J Bacteriol.191:2521-2529(2009)）。天冬氨酸激酶催化ATP依赖的天冬氨酸磷酸化，并且参与几种氨基酸的合成。大肠杆菌中的天冬氨酸激酶III由lysC编码，具有广泛的底物范围和涉及底物特异性的催化残基已经被阐明（Keng等，Arch.Biochem.Biophys.335:73-81(1996)）。大肠杆菌中的两种其它激酶也是良好的候选酶：乙酸激酶和γ-谷氨酸激酶。大肠杆菌乙酸激酶由ackA编码（Skarstedt等，J.Biol.Chem.251:6775-6783（1976）），除乙酸外还磷酸化丙酸（Hesslinger等，Mol.Microbiol.27:477-492(1998)）。大肠杆菌γ-谷氨酸激酶由proB编码（史密斯等，J.Bacteriol.157:545-551(1984)），磷酸化谷氨酸的γ-羧酸基。这些基因/蛋白质在下表34中鉴定。
表34
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  buk1   NP_349675   15896326   丙酮丁酸梭菌
  buk2   Q97II1   20137415   丙酮丁酸梭菌
  buk2   Q9X278.1   6685256   海栖热袍菌
  lysC   NP_418448.1   16131850   大肠杆菌
  ackA   NP_416799.1   16130231   大肠杆菌
  proB   NP_414777.1   16128228   大肠杆菌
丙酸还原酶
丙酸还原为丙酸半醛由羧酸还原酶催化。如下所述，琥珀酸还原酶和4-羟基丁酸还原酶的示例性候选酶也适用于此。
实施例II
由葡萄糖产生乙酰-CoA的途径
继续实施例I，由葡萄糖产生乙酰CoA的途径通过磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）进行（图1-4）。葡萄糖由微生物有机体的天然糖酵解途径转化为PEP。PEP由丙酮酸激酶转化为丙酮酸，然后由丙酮酸脱氢酶或丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶转化为乙酰CoA。或者，丙酮酸由丙酮酸甲酸裂解酶转化为乙酰CoA和甲酸。然后甲酸由甲酸脱氢酶转化为二氧化碳，其也产生NADH。由这些途径产生的乙酰-CoA然后用于异丙醇的产生，如实施例I所述，或者用于正丙醇和异丙醇的产生，如下面的实施例V所述（图3）。
丙酮酸脱氢酶
丙酮酸脱氢酶复合物已被广泛研究，其催化丙酮酸转化为乙酰CoA。啤酒酵母复合物由结合E1(PDA1，PDB1），E3(LPD1）和蛋白质X（含PDX1）组分的E2(LAT1）核心组成（Pronk，Yeast 12:1607-1633(1996)）。在大肠杆菌酶中，E1组分的特异性残基负责底物的特异性（Bisswanger，J.Biol Chem.256:815-822（1981）；Bremer，Eur.J Biochem.8:535-540（1969）和Gong等，J.Biol Chem.275:13645-13653(2000)）。工程方面的工作已经增加了在厌氧条件下大肠杆菌PDH酶活性（Kim，J.Bacteriol.190:3851-3858(2008)；Kim，Appl.Environ.Microbiol.73:1766-1771(2007)，和Zhou，Biotechnol.Lett.30:335-342(2008)）。与大肠杆菌PDH相反，枯草杆菌复合物具有活性并且在厌氧条件下生长（Nakano，J.Bacteriol.179:6749-6755(1997)）所需。肺炎克雷伯氏菌PDH在甘油上生长期间鉴定，在厌氧条件下也具有活性（Menzel，J.Biotechnol.，56:135-142(1997)）。可以获得来自牛肾的酶复合物的晶体结构（Zhou，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98:14802-14807(2001)）和来自固氮菌的E2的催化结构域（Mattevi等，Science.255:1544-1550(1992)）。一些哺乳动物的PDH酶复合物可在替代底物上反应，例如2-氧代丁酸（Paxton，J.Bacteriol.179:5684-5692(1997)）。这些基因/蛋白质在下表35中鉴定。
表35.
Figure BDA00001613425501061
丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶
丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶（PFOR）催化丙酮酸的氧化形成乙酰-CoA。来自非洲脱硫弧菌的PFOR已经在大肠杆菌中克隆和表达，产生一种具有活性的重组酶，其在有氧气存在下的稳定数天（Pieulle，J.Bacteriol.179:5684-5692(1997)）。氧稳定性在PFORs中比较少见，并且被认为是非洲脱硫弧菌酶的多肽链中的60个残基延伸所赋予的。热乙酸菌PFOR也被充分表征了（Menon，Biochemistry 36:8484-8494(1997)），并且甚至在自养生长期间显示出丙酮酸合成方向的高活性（Furdui，J Biol Chem.275:28494-28499(2000)）。此外，大肠杆菌拥有一个未知的开放读码框ydbK，其编码一种与热乙酸菌PFOR51％同源的蛋白质。关于大肠杆菌中丙酮酸氧化还原酶活性的证据已经被描述了（Blaschkowski，Eur.J Biochem.123:563-569（1982））。几个其它PFOR酶描述在以下的综述中（Ragsdale，Chem.Rev.103:2333-2346(2003)）。最后，黄素氧还蛋白还原酶（例如来自幽门螺杆菌或空肠弯曲菌的fqrB）（St Maurice等，J.Bacteriol.189:4764-4773(2007)）或Rnf-型蛋白质（Seedorf等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.105:2128-2133（2008年）；和Herrmann，J.Bacteriol.190:784-791(2008)）提供一种由PFOR产生的还原性铁氧还蛋白产生NADH或NADPH的方式。这些基因/蛋白质在如下表36鉴定。
表36.
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  por   CAA70873.1   1770208   非洲脱硫弧菌
  por   YP_428946.1   83588937   热乙酸菌
  ydbK   NP_415896.1   16129339   大肠杆菌
  fqrB   NP_207955.1   15645778   幽门螺杆菌
  fqrB   YP_001482096.1   157414840   空肠弯曲菌
  RnfC   EDK33306.1   146346770   克氏梭状芽孢杆菌
  RnfD   EDK33307.1   146346771   克氏梭状芽孢杆菌
  RnfG   EDK33308.1   146346772   克氏梭状芽孢杆菌
  RnfE   EDK33309.1   146346773   克氏梭状芽孢杆菌
  RnfA   EDK33310.1   146346774   克氏梭状芽孢杆菌
  RnfB   EDK33311.1   146346775   克氏梭状芽孢杆菌
丙酮酸甲酸裂解酶
丙酮酸甲酸裂解酶是一种催化丙酮酸和CoA转化成乙酰-CoA和甲酸的酶。丙酮酸甲酸裂解酶是一种原核生物中常见的酶，其用来帮助调节厌氧的氧化还原平衡。示例性的酶可在大肠杆菌（Knappe，FEMS.Microbiol Rev.6:383-398(1990)），乳酸乳球菌（Melchiorsen，Appl Microbiol Biotechnol58:338-344(2002)）和变形链球菌（Takahashi-Abbe，Oral.Microbiol Immunol.18:293-297(2003)）中发现。线粒体丙酮酸甲酸裂解酶也已在真核生物莱茵衣藻（Hemschemeier，Eukaryot.Cell 7:518-526(2008)；和Atteia，J.Biol Chem.281:9909-9918(2008)）中鉴定。这些基因/蛋白质在如下表37中鉴定。
表37
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  pflB   NP_415423   16128870   大肠杆菌
  pfl   CAA03993   2407931   乳酸链球菌
  pfl   BAA09085   1129082   变形链球菌
  PFL1   EDP09457   158283707   莱茵衣藻
甲酸氢裂解酶
甲酸氢裂解酶可以用于将甲酸转化为二氧化碳和氢气。一种示例性甲酸氢裂解酶可在大肠杆菌中发现。大肠杆菌甲酸氢裂解酶由氢化酶3和甲酸脱氢酶-H组成（Maeda，Appl.Microbiol.Biotechnol.77:879-890(2007)）。其被fhlA的基因产物激活（Maeda，Appl.Microbiol.Biotechnol.77:879-890(2007)）。向发酵液中加入微量元素硒，镍和钼，已经显示出提高甲酸氢裂解酶的活性（Soini，Microb.Cell Fact.7:26(2008)）。这些基因/蛋白质在下表38中鉴定。
表38
Figure BDA00001613425501081
甲酸氢裂解酶也存在于极端嗜热古菌嗜热球菌中（Takacs等，BMC.Microbiol.8:88(2008)）。这些基因/蛋白质在下表39中鉴定。
表39.
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  mhyC   ABW05543   157954626   嗜热球菌
  mhyD   ABW05544   157954627   嗜热球菌
  mhyE   ABW05545   157954628   嗜热球菌
  myhF   ABW05546   157954629   嗜热球菌
  myhG   ABW05547   157954630   嗜热球菌
  myhH   ABW05548   157954631   嗜热球菌
  fdhA   AAB94932   2746736   嗜热球菌
  fdhB   AAB94931   157954625   嗜热球菌
其它甲酸氢裂解酶系统已经在鼠伤寒沙门氏菌，肺炎克雷伯氏菌，深红红螺菌，甲酸甲烷杆菌中发现（Vardar-Schara，Microbial Biotechnology1:107-125(2008)）。
甲酸脱氢酶
在其它生物中，甲酸脱氢酶活性在大肠杆菌和啤酒酵母中都存在。啤酒酵母包括两种甲酸脱氢酶FDH1和FDH2，催化甲酸氧化为CO2（Overkamp等，Yeast 19:509-520(2002)）。在热乙酸菌中，基因位点Moth_2312和Moth_2313实际上是一个，其负责编码甲酸脱氢酶的α亚单位，而β亚基由Moth_2314编码（Pierce等，Environ.Microbiol(2008)；Andreesen，J.Bacteriol.116:867-873（1973）；Li，J.Bacteriol.92:405-412（1966）和Yamamoto，J.Biol.Chem.258:1826-1832（1983））在Syntrophobacter fumaroxidans中编码甲酸脱氢酶活性的另一组基因由Sfum 2703到Sfum 2706编码（Reda，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.105:10654-10658(2008)；以及de Bok等，Eur.J.Biochem.270:2476-2485(2003)）。类似于它们的热乙酸菌对应物，Sfum_2705和Sfum_2706实际上是一个基因。大肠杆菌包括多种甲酸脱氢酶。这些基因/蛋白质在下表40中鉴定。
表40
Figure BDA00001613425501101
实施例III
利用还原性TCA循环由葡萄糖产生丙酰-CoA的途径
继续实施例I和II，产生丙酰-CoA的途径通过草酰乙酸进行（图1）。PEP通过PEP羧激酶或者PEP羧化酶转化为草酰乙酸。或者，PEP首先由丙酮酸激酶转化为丙酮酸，然后由甲基丙二酰-CoA羧基转移酶或者丙酮酸羧化酶转化为草酰乙酸。
PEP羧激酶
虽然磷酸烯醇式丙酮酸向草酰乙酸的净转化是氧化还原平衡的，这种转化的机理对这种协同产生途径的总的能量学很重要。PEP转化为草酰乙酸的最理想的酶是PEP羧激酶，其在羧化PEP的同时形成ATP。然而在大多数生物中，PEP羧激酶发挥糖异生功能，并且消耗一分子ATP将草酰乙酸转化为PEP。啤酒酵母是这种生物中的一种，其天然PEP羧激酶PCK1发挥糖异生作用（Valdes-Hevia，FEBS.Lett.258:313-316(1989)）。大肠杆菌是这种生物的另一种，由于当与PEP羧化酶相比时，PEP羧激酶在产生草酰乙酸中的作用被认为是较小的，其并不形成ATP，可能是因为碳酸氢盐更高的PEP羧激酶Km值（Kim，Appl Environ Microbiol 70:1238-1241(2004)）。虽然如此，天然的大肠杆菌PEP羧激酶转化PEP为草酰乙酸的活性最近已经在大肠杆菌K-12的ppc突变体中被证实（Kwon，Journal of Microbiology and Biotechnology16:1448-1452(2006)）。这些菌株显示没有生长缺陷，并且已经在高的NaHCO3浓度下增加琥珀酸的产生。在某些生物中，尤其是瘤胃细菌，PEP羧激酶在从PEP产生草酰乙酸和产生ATP中十分有效。已经被克隆到大肠杆菌中的PEP羧激酶基因的实例包括来自琥珀酸曼海姆菌（Lee，Biotechnol.Bioprocess Eng.7:95-99(2002)），琥珀酸厌氧螺菌（Laivenieks，Appl Environ Microbiol63:2273-2280(1997)）以及琥珀酸放线杆菌（Kim，Appl Environ Microbiol70:1238-1241(2004)）的基因。内部实验也已发现，流感嗜血杆菌编码的PEP羧激酶对从PEP形成草酰乙酸非常有效。这些基因/蛋白质在下表41中鉴定。
表41
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  PCK1   NP_013023   6322950   啤酒酵母
  pck   NP_417862.1   16131280   大肠杆菌
  pckA   YP_089485.1   52426348   琥珀酸曼海姆菌
  pckA   O09460.1   3122621   琥珀酸厌氧螺菌
  pckA   Q6W6X5   75440571   琥珀酸放线杆菌
  pckA   P43923.1   1172573   流感嗜血杆菌
这些序列以及列入此报告中的后续酶的序列可用于在GenBank或者其它数据库中通过序列相似性搜寻鉴定同源蛋白质（例如BLASTp）。所得同源蛋白质及其相应的基因序列提供附加的DNA序列用于转化所选的宿主有机体。
PEP羧化酶
PEP羧化酶代表由PEP形成草酰乙酸的一种可替代酶。因为酶在草酰乙酸脱羧基上不产生ATP，其应用将减少生产途径的ATP最大产量，并且代表草酰乙酸向PEP转化的较差选择。虽然如此，如果利用PEP羧化酶将PEP转化为草酰乙酸，1.33mol/mol的最大C3醇理论产量将保持不变。啤酒酵母并不天然编码PEP羧化酶，但是具有编码PEP羧化酶基因的示例性的生物包括大肠杆菌（Kai，Arch.Biochem.Biophys.414:170-179(2003)），扭曲甲基杆菌（Arps，J.Bacteriol.175:3776-3783(1993)）和谷氨酸棒杆菌（Eiknanns，Mol.Gen.Genet.218:330-339(1989)）。这些基因/蛋白质在下表42中鉴定。
表42
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  ppc   NP_418391   16131794   大肠杆菌
  ppcA   AAB58883   28572162   扭曲甲基杆菌
  ppc   ABB53270   80973080   谷氨酸棒杆菌
丙酮酸激酶和甲基丙二酰-CoA羧基转移酶
从PEP形成草酰乙酸的其它能量有效的路线需要两种酶活性：丙酮酸激酶和甲基丙二酰-CoA羧基转移酶。丙酮酸激酶催化ATP-产生的PEP向丙酮酸的转化，并且由啤酒酵母中PYK1（Burke，J.Biol.Chem.258:2193-2201（1983））和PYK2（Boles等，J.Bacteriol.179:2987-2993(1997)）基因编码。在大肠杆菌中，此活性由pykF和pykA的基因产物催化。甲基丙二酰-CoA羧基转移酶催化转化丙酮酸为草酰乙酸。重要的是，此反应同时也催化转化(S)-甲基丙二酰-CoA为丙酰-CoA（参见图1和2）。示例性的甲基丙二酰-CoA羧基转移酶包括1.3S，5S和12S亚基，可在费氏丙酸杆菌中发现（Thornton等，J.Bacteriol175:5301-5308(1993)）。这些基因/蛋白质在下表43中鉴定。
表43
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  PYK1   NP_009362   6319279   啤酒酵母
  PYK2   NP_014992   6324923   啤酒酵母
  pykF   NP_416191.1   16129632   大肠杆菌
  pykA   NP_416368.1   16129807   大肠杆菌
  1.3S亚基   P02904   114847   费氏丙酸杆菌
  5S亚基   Q70AC7   62901478   费氏丙酸杆菌
  12S亚基   Q8GBW6   62901481   费氏丙酸杆菌
丙酮酸激酶和丙酮酸羧化酶
酶的组合可用于与PEP羧化酶相同的化学计量学转化PEP为草酰乙酸。这些酶由丙酮酸激酶，PYK1（Burke，J.Biol.Chem.258:2193-2201（1983））或者PYK2（Boles等，J.Bacteriol.，179:2987-2993(1997)）和丙酮酸羧化酶，PYC1（Walker，Biochem.Biophys.Res.Commun.176:1210-1217(1991)）或者PYC2（Walker，Biochem.Biophys.Res.Commun.176:1210-1217(1991)）编码。后文的基因/蛋白质在下表44中鉴定。
表44
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  PYC1   NP_011453   6321376   啤酒酵母
  PYC2   NP_009777   6319695   啤酒酵母
  Pyc   YP_890857.1   118470447   耻垢分枝杆菌
苹果酸脱氢酶，延胡索酸酶，延胡索酸还原酶
当TCA循环在还原性循环中进行时，草酰乙酸可以被苹果酸脱氢酶，延胡索酸酶和延胡索酸还原酶转化为琥珀酸。啤酒酵母拥有三拷贝苹果酸脱氢酶，MDH1（McAister-Henn，J.Bacteriol.169:5157-5166(1987)），MDH2（Minard，Mol.Cell.Biol.11:370-380(1991)；和Gibson，J.Biol.Chem.278:25628-25636(2003)）和MDH3（Steffan，J.Biol.Chem.267:24708-24715(1992)），其分别位于线粒体，胞浆和过氧化物酶体中。啤酒酵母包括一拷贝的延胡索酸酶编码基因FUM1，其产物位于胞浆和线粒体中（Sass，J.Biol.Chem.278:45109-45116(2003)）。延胡索酸还原酶由两种可溶性酶FRDS1（Enomoto，DNA.Res.3:263-267(1996)）和FRDS2（Muratsubaki，Arch.Biochem.Biophys.352:175-181(1998)）编码，其分别位于胞浆和前线粒体。并且要求在葡萄糖上厌氧生长（Arikawa，Microbiol Lett.165:111-116(1998)）。已知大肠杆菌具有活性的苹果酸脱氢酶。其具有由fumA，B和C编码的三种延胡索酸酶，其中每个在不同的供氧条件下有活性。大肠杆菌中的延胡索酸还原酶由四个亚基组成。这些基因/蛋白质在下表45中鉴定。
表45
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  MDH1   NP_012838   6322765   啤酒酵母
  MDH2   NP_014515   116006499   啤酒酵母
  MDH3   NP_010205   6320125   啤酒酵母
  FUM1   NP_015061   6324993   啤酒酵母
  FRDS1   P32614   418423   啤酒酵母
  FRDS2   NP_012585   6322511   啤酒酵母
  frdA   NP_418578.1   16131979   大肠杆菌
  frdB   NP_418577.1   16131978   大肠杆菌
  frdC   NP_418576.1   16131977   大肠杆菌
  frdD   NP_418475.1   16131877   大肠杆菌
  Mdh   NP_417703.1   16131126   大肠杆菌
  FumA   NP_416129.1   16129570   大肠杆菌
  FumB   NP_418546.1   16131948   大肠杆菌
  FumC   NP_416128.1   16129569   大肠杆菌
琥珀酰-CoA转移酶
琥珀酰-CoA转移酶催化琥珀酰-CoA转化为琥珀酸，同时转移CoA部分给一个CoA受体分子。很多转移酶具有广泛的特异性，并且因此可以利用广泛的CoA受体如乙酸，琥珀酸，丙酸，丁酸，2-甲基乙酰乙酸，3-酮己酸，3-酮戊酸，戊酸，巴豆酸，3-巯基丙酸，丙酸，乙酸乙烯酯，丁酸，及其它。
琥珀酸向琥珀酰-CoA的转化由一种不需要直接消耗ATP或者GTP的转移酶理想地进行。这类反应在许多生物中很普遍。或许此反应步骤的最高候选酶是琥珀酰-CoA:3-酮酰-CoA转移酶。此酶将3-酮酰-CoA转化为3-酮酸的同时将琥珀酸转化为琥珀酰-CoA。示例性的琥珀酰-CoA:3:酮酰-CoA转移酶存在于幽门螺杆菌（Corthesy-Theulaz等，J.Biol.Chem.272:25659-25667(1997)），枯草杆菌（Stols等，Protein.Expr.Purif.53:396-403(2007)）和智人（Fukao等，Genomics，68:144-151(2000)；和Tanaka，Mol.Hum.Reprod.8:16-23(2002)）中。这些基因/蛋白质在下表46中鉴定。
表46
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  HPAG1_0676   YP_627417   108563101   幽门螺杆菌
  HPAG1_0677   YP_627418   108563102   幽门螺杆菌
  ScoA   NP_391778   16080950   枯草芽孢杆菌
  ScoB   NP_391777   16080949   枯草芽孢杆菌
  OXCT1   NP_000427   4557817   智人
  OXCT2   NP_071403   11545841   智人
琥珀酸向琥珀酰-CoA的转化也可由琥珀酰-CoA:乙酰-CoA转移酶催化。克氏梭状芽孢杆菌cat1的基因产物已经显示出琥珀酰-CoA:乙酰-CoA转移酶活性（Sohling，J Bacteriol.178:871-880(1996)）。另外，此活性也存在于阴道毛滴虫（van Grinsven等，J.Biol.Chem.283:1411-1418(2008)）和布氏锥虫（Riviere等，J.Biol.Chem.279:45337-45346(2004)）中。这些基因/蛋白质在下表47中鉴定。
表47
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  cat1   P38946.1   729048   克氏梭状芽孢杆菌
  TVAG_395550   XP_001330176   123975034   阴道毛滴虫G3
  Tb11.02.0290   XP_828352   71754875   布氏锥虫
又一可能的CoA受体是苄基琥珀酸。琥珀酰-CoA:(R)-苄基琥珀酰-CoA转移酶在有机体芳香索氏菌中对甲苯的厌氧降解途径起部分作用（Leutwein和Heider，J.Bact.183（14）4288-4295(2001)）。同源物可在固氮弧菌T，Aromatoleumaromaticum EbN1和金属还原泥土杆菌GS-15中发现。这些基因/蛋白质在下表48中鉴定。
表48
Figure BDA00001613425501151
Figure BDA00001613425501161
最后，ygfH编码大肠杆菌中的丙酰-CoA:琥珀酰-CoA转移酶（Haller等，Biochemistry，39(16)4622-4629）。相近的同源物可在例如杨氏柠檬酸杆菌ATCC29220，肠道沙门氏菌亚种亚利桑那沙门，中间耶尔森菌ATCC 29909中发现。这些基因/蛋白质在下表49中鉴定。
表49
琥珀酰-CoA合成酶
啤酒酵母的LSC1和LSC2基因和大肠杆菌的sucC和sucD基因的产物自然形成琥珀酰-CoA合成酶复合物，其催化从琥珀酸同时消耗一分子ATP的琥珀酰-CoA的形成，其是一种在体内可逆的反应（Przybyla-Zawilask等，Eur.J.Biochem.258(2):736-743(1998)和Buck等，J.Gen.Microbiol.132（6）:1753-1762(1986)）。这些基因/蛋白质在下表50中鉴定。
表50
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  LSC1   NP_014785   6324716   啤酒酵母
  LSC2   NP_011760   6321683   啤酒酵母
  sucC   NP_415256.1   16128703   大肠杆菌
  sucD   AAC73823.1   1786949   大肠杆菌
甲基丙二酰-CoA变位酶
琥珀酰-CoA可以被甲基丙二酰-CoA变位酶（MCM）转化为(R)-甲基丙二酰-CoA。在大肠杆菌中，可逆的腺苷钴胺依赖的变位酶参与到三步骤途径中，导致琥珀酸转化为丙酸（Haler，Biochemistry 39:4622-9(2000)）。MCM由大肠杆菌中的基因scpA（Haller，Biochemistry 39:4622-4629(2000)；以及Bobik，Anal.Bioanal.Chem.375:344-349(2003)）和智人中的mutA（Padovani，Biochemistry45:9300-9306(2006)）编码。在几种其它有机体中MCM包括α和β亚基并且由两种基因编码。编码两个亚基的蛋白质的示例性候选基因是费氏丙酸杆菌谢氏亚种的mutA和mutB（Korotkova，J Biol Chem.279:13652-13658(2004)）和扭曲甲基杆菌的mcmA和mcmB（Korotkova，J Biol Chem.279:13652-13658(2004)）。这些基因/蛋白质在下表51中鉴定。
表51
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  scpA   NP_417392.1   16130818   大肠杆菌K12
  mutA   P22033.3   67469281   智人
  mutA   P11652.3   127549   费氏丙酸杆菌谢氏亚种
  mutB   P11653.3   127550   费氏丙酸杆菌谢氏亚种
  mcmA   Q84FZ1   75486201   扭曲甲基杆菌
  mcmB   Q6TMA2   75493131   扭曲甲基杆菌
基于与大肠杆菌的spcA基因产物高度同源的已鉴定的其它候选酶在下表52中鉴定。
表52
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  sbm   NP_838397.1   30064226   弗氏志贺菌
  SARI_04585   ABX24358.1   160867735   肠道沙门氏菌
  YfreA_01000861   ZP_00830776.1   77975240   弗氏耶尔森氏菌
存在更进一步的证据，与甲基丙二酰-CoA变位酶催化基因相邻的基因也需要最大的活性。例如已经证明，来自扭曲甲基杆菌的meaB基因与甲基丙二酰-CoA变位酶形成复合物，刺激体外变位酶活性，并且可能保护其免受不可逆失活（Korotkova，J Biol Chem.279:13652-13658(2004)）。扭曲甲基杆菌的meaB基因产物非常类似于大肠杆菌argK的基因产物（BLASTP：45%同源性，e值：4e-67），其在染色体上与scpA相邻。没有费氏丙酸杆菌中meaB的同源物的序列录入GenBank中。不过，疮疱丙酸杆菌KPA171202的基因产物YP055310.1与扭曲甲基杆菌meaB蛋白质51%同源，并且其基因在染色体上也与甲基丙二酰-CoA变位酶基因相邻。这些基因/蛋白质在下表53中鉴定。
表53
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  argK   AAC75955.1   1789285   大肠杆菌K12
  KPA171202   YP_055310.1   50842083   疮疱丙酸杆菌
  meaB   2QM8_B   158430328   扭曲甲基杆菌
甲基丙二酰-CoA差向异构酶
甲基丙二酰-CoA差向异构酶（MMCE）是一种使(R)-甲基丙二酰-CoA和(S)-甲基丙二酰-CoA互相转化的酶。MMCE是奇数脂肪酸和氨基酸缬氨酸，异亮氨酸和蛋氨酸的分解中的必需酶。甲基丙二酰-CoA差向异构酶存在于有机体例如枯草杆菌（YqjC）（Haller，Biochemistry 39:4622-4629(2000)），智人（YqjC）（Fuller，Biochemistry J.213:643-650（1983）），褐鼠（Mcee）（Bobik，J Biol Chem.276:37194-37198(2001)），谢氏丙酸杆菌（AF454511）（Haller，Biochemistry 39:4622-9(2000)；McCarthy，Structure 9:637-46(2001)和（Fuller，Biochemistry7213:643-650(1983)）和秀丽隐杆线虫（mMce）（Kuhnl等，FEBS J 7272:1465-1477(2005)）中。其它的候选基因，蜡样芽胞杆菌中的AE016877，与其它已鉴定酶具有高的序列同源性。如果所使用的甲基丙二酰-CoA脱羧酶或者甲基丙二酰-CoA羧基转移酶需要甲基丙二酰-CoA的(S)-立体异构体，则MMCE活性是需要的。这些基因/蛋白质在下表54中鉴定。
表54
Figure BDA00001613425501181
Figure BDA00001613425501191
甲基丙二酰-CoA脱羧酶
甲基丙二酰-CoA脱羧酶是一个生物素依赖的酶，其在大肠杆菌中催化甲基丙二酰-CoA转化为丙酰-CoA（Benning，Biochemistry.39:4630-4639（2000）；和Haller，Biochemistry.39:4622-4629（2000））。没有报道大肠杆菌酶的立体特异性，但在中度产丙酸菌（Bott等人，Eur.J.Biochem.250:590-599(1997)）和极小韦永氏球菌（Huder，J.Biol.Chem.268:24564-24571(1993)）中催化甲基丙二酰-CoA的S-异构体脱羧反应（Hoffmann，FEBS.Lett.220:121-125(1987)）。来自中度产丙酸菌和极小韦永氏球菌的酶由多个亚基组成，其不但使(S)-甲基丙二酰-CoA脱羧化，而且产生跨细胞膜运送钠离子的泵作为产生能量的一种方式。这些基因/蛋白质在下表55中鉴定。
表55.
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  YgfG   NP_417394   90111512   大肠杆菌
  mmdA   CAA05137   2706398   中度产丙酸菌
  mmdD   CAA05138   2706399   中度产丙酸菌
  mmdC   CAA05139   2706400   中度产丙酸菌
  mmdB   CAA05140   2706401   中度产丙酸菌
  mmdA   CAA80872   415915   极小韦永氏球菌
  mmdC   CAA80873   415916   极小韦永氏球菌
  mmdE   CAA80874   415917   极小韦永氏球菌
  mmdD   CAA80875   415918   极小韦永氏球菌
  mmdB   CAA80876   415919   极小韦永氏球菌
实施例IV
由葡萄糖经过苏氨酸产生丙酰-CoA的途径
继续实施例I和II，由葡萄糖通过苏氨酸产生丙酰-CoA的途径在图2中举例说明。如实施例III所述，PEP通过PEP羧激酶或者PEP羧化酶转化成草酰乙酸。可替代地，如实施例III所述，PEP首先被丙酮酸激酶转化为丙酮酸，然后被甲基丙二酰-CoA羧基转移酶或丙酮酸羧化酶转化为草酰乙酸。草酰乙酸被工程改造为高产量的天然苏氨酸途径转化成苏氨酸。其然后脱氨基以形成2-氧代丁酸，和随后转化成丙酰-CoA。在一个替代方案中，2-氧代丁酸被脱羧酶转化为丙醛，其然后由丙醇脱氢酶还原为正丙醇。
苏氨酸脱氨酶
苏氨酸向2-氧代丁酸（或2-酮丁酸）的转化可以由苏氨酸脱氨酶完成。它由选自ilvA（Calhoun等，J.Biol.Chem.248(10):3511-6，(1973)）和tdcB（Umbarger等，J.Bacteriol.73(1):105-12，(1957)；Datta等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84(2):393-7(1987)）的一个或多个基因编码。深红红螺菌代表其它含有苏氨酸脱氨酶的示例性有机体（Feldberg等，Eur.J.Biochem.21(3):438-46(1971)；美国专利5，958，745）。用于进行这种转化的示例性酶的详情如下所示。这些基因/蛋白质在下表56中鉴定。
表56.
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  ilvA   AAC77492   1790207   大肠杆菌
  tdcB   AAC76152   1789505   大肠杆菌
  Rru_A2877   YP_427961.1   83594209   深红红螺菌
  Rru_A0647   YP_425738.1   83591986   深红红螺菌
2-氧代丁酸脱氢酶
2-氧代丁酸（2-酮丁酸）可由丙酮酸甲酸裂解酶和丙酮酸甲酸裂解酶激活酶转化成丙酰-CoA。丙酮酸甲酸裂解酶由选自pflB和tdcE的基因编码，而丙酮酸甲酸裂解酶激活酶由pflA基因编码。用于进行这种转化的这些示例性基因的详情已经列出。
另外，2-氧代丁酸可通过丙酮酸脱氢酶，丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶（PFOR），或任何其它2-酮酸脱氢酶功能的方式转化成丙酰-CoA。这种酶也能将丙酮酸转化为乙酰-CoA。示例性丙酮酸脱氢酶存在于例如大肠杆菌（Bisswanger，H.，J.Biol.Chem.256:815-822(1981)；Bremer，J.，Eur.J.Biochem.8:535-540(1969)；Gong等，J.Biol.Chem.275:13645-13653(2000)），枯草芽孢杆菌（Nakano等，J.Bacteriol.179:6749-6755(1997)），肺炎克雷伯菌（Menzel等，J.Biotechnol.56:135-142(1997)），褐鼠（Paxton等，Biochem.J.234:295-303(1986)）中。示例性的基因信息在下文提供。这些基因/蛋白质在下表57中鉴定。
表57
示例性的PFOR酶包括例如来自非洲脱硫弧菌的酶，其已经在大肠杆菌中克隆和表达，产生一种在氧存在下稳定数天的活性重组酶（Pieulle等，J.Bacteriol.179:5684-5692(1997)）。氧稳定性在PFORs中比较少见，并且据报道是由非洲脱硫弧菌酶的多肽链中的60个残基延伸所赋予的。热乙酸菌PFOR也被充分表征了（Menon，Biochemistry 36:8484-8494(1997)），并且在自养生长期间显示出丙酮酸合成方向的高活性（Furdui，J Biol Chem.275:28494-28499(2000)）。此外，大肠杆菌拥有一个未知的开放读码框ydbK，其编码一种与热乙酸菌PFOR 51％同源的蛋白质。关于大肠杆菌中丙酮酸氧化还原酶活性的证据已经被描述了（Blaschkowski，Eur.J Biochem.123:563-569(1982)）。这些示例性的PFOR酶的蛋白质序列可以根据GenBank登录号和/或如下所示的GI编号来鉴定。几个其它的PFOR酶描述在以下的综述中（Ragsdale，Chem.Rev.103:2333-2346(2003)）。这些基因/蛋白质在如下表58鉴定。
表58
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  Por   CAA70873.1   1770208   非洲脱硫弧菌
  Por   YP_428946.1   83588937   热乙酸菌
  YdbK   NP_415896.1   16129339   大肠杆菌
用于产生丙酰-CoA的其它路线公开在美国专利5、958，745中，其全文并入本发明作为参考。一个这种路线包括由丙酮酸氧化酶将2-酮丁酸转化为丙酸，和通过酰基-CoA合成酶将丙酸转化为丙酰-CoA。
2-氧代丁酸脱羧酶
酮酸脱羧酶可催化2-氧代丁酸转化为丙醛。已经鉴定了数种2-酮酸脱羧酶。此步骤的候选酶是丙酮酸脱羧酶（EC 4.1.1.1），苯甲酸脱羧酶（4.1.1.7），α-酮戊二酸脱羧酶（EC 4.1.1.71），支链α-酮酸脱羧酶（4.1.1.72），以及吲哚丙酮酸脱羧酶（EC4.1.1.74）。这些类型的脱羧酶是NADH-依赖的，它们利用二磷酸硫胺素作为辅因子，并且底物与酶结合辅因子的相互作用成为该酶激活的限速步骤（Hubner，Eur.J.Biochemistry 92:175-181(1978)）。丙酮酸脱羧酶和苯甲酰甲酸脱羧酶具有各种酮酸的广泛的底物范围，并且已经确认了其结构细节。很少有α-酮戊二酸和支链α-酮酸脱羧酶已经过实验确认；但是这些酶也似乎使各种酮酸底物脱羧。
丙酮酸脱羧酶（PDC）也称为酮酸脱羧酶，是醇发酵中的关键酶，催化丙酮酸脱羧为乙醛。来自啤酒酵母的酶具有脂肪2-酮酸的广泛的底物范围，包括2-酮丁酸，2-酮戊酸，3-羟基丙酮酸和2-苯基丙酮酸（22）。来自运动发酵单胞菌的PDC由pdc编码，已经过直接的工程研究改变对不同底物的亲和力（Siegert等，Protein Eng Des Sel 18:345-357(2005)）。来自啤酒酵母的PDC也已经过广泛地研究，在大肠杆菌中工程改造以改变活性和功能表达（Li，Biochemistry.38:10004-10012(1999)；ter Schure，Appl.Environ.Microbiol.64:1303-1307(1998)和Killenberg-Jabs，Eur.J.Biochem.268:1698-1704(2001)）。提供了此酶的晶体结构（Killenberg-Jabs，Eur.J.Biochem.268:1698-1704(2001)）。其它很好地鉴定的PDC候选酶包括来自巴氏醋酸杆菌（Chandra，Arch.Microbiol.176:443-451(2001)）和乳酸克鲁维酵母（Krieger，Eur.J.Biochem.269:3256-3263(2002)）的酶。这些基因/蛋白质在下表59中鉴定。
表59
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  pdc   P06672.1   118391   运动发酵单胞菌
  pdc1   P06169   30923172   啤酒酵母
  pdc   Q8L388   20385191   巴氏醋酸杆菌
  pdc1   Q12629   52788279   乳酸克鲁维酵母
如PDC一样，苯甲酰甲酸脱羧酶具有广泛的底物范围，并且已成为酶工程研究的目标。来自恶臭假单胞菌的酶已经被广泛研究，并且提供了此酶的晶体结构（Polovnikova等，Biochemistry 42:1820-1830(2003)；和Hasson等，Biochemistry37:9918-9930(1998)）。在恶臭假单胞菌酶的活性部位中的两残基的定点突变改变了自然亲和力（Km）和非天然存在的底物（Siegert等，Protein Eng Des Sel18:345-357(2005)）。此酶的性质已经通过直接工程改造进一步修饰（Lingen等，Chembiochem.4:721-726(2003)；和Lingen，Protein Eng 15:585-593(2002)）。来自绿脓杆菌的酶由mdlC编码，也已经过实验鉴定了（Barrowman，FEMSMicrobiology Letters 34:57-60(1986)）。来自司徒茨假单胞菌，荧光假单胞菌和其它有机体的其它候选基因可以使用在恶臭假单胞菌中开发的生长选择系统通过序列同源性推断或者鉴定（Henning等，Appl.Environ.Microbiol.72:7510-7517(2006)）。这些基因/蛋白质在下表60中鉴定。
表60
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  mdlC   P20906.2   3915757   恶臭假单胞菌
  mdlC   Q9HUR2.1   81539678   绿脓杆菌
  dpgB   ABN80423.1   126202187   司徒茨假单胞菌
  ilvB-1   YP_260581.1   70730840   荧光假单胞菌
能使2-酮酸脱羧的第三种酶是α-酮戊二酸脱羧酶（KGD）。此类酶的底物范围到目前为止还没有研究。来自结核分支杆菌的KDC（Tian，Proc Natl Acad SciUS.A 102:10670-10675(2005)）已经在Genomatica的其它内部项目中被克隆并功能表达。不过，它并不是菌株工程理想的候选酶，因为其太大（~130kD）和富含GC。KDC酶活性已经在包括慢生型大豆根瘤菌和百脉根根瘤菌的几种根瘤菌中检测到（Green，J Bacteriol.182:2838-2844(2000)）。虽然KDC-编码基因还没有在这些有机体中分离，但可获得基因组序列，并且每个基因组中的数种基因注解为理想的丙酮酸KDCs。来自纤细裸藻的KDC也已经被表征了，但是与此活性相关的基因道目前为止还没鉴定（Shgeoka，Arch.Biochem.Biophys.288:22-28(1991)）。N末端的前20个氨基酸序列为MTYKAPVKDVKFLLDKVFKV（Shigeoka，Arch.Biochem.Biophys.288:22-28(1991)）。可能通过检测包括具有KDC活性的这种N末端序列的侯选基因来鉴定基因。这些基因/蛋白质在下表61中鉴定。
表61
Figure BDA00001613425501241
用于催化此步骤的第四种候选酶是支链α-酮酸脱羧酶（BCKA）。这类酶已经显示出对具有链长从3到6个碳原子的各种化合物起作用（Oku，J BiolChem.263:18386-18396(1988)；和Smit等，Appl Environ Microbiol71:303-311(2005)）。乳酸乳球菌中的酶已经在各种支链和直链底物上确认，包括2-氧代丁酸，2-氧代己酸，2-氧代戊酸，3-甲基2-氧代丁酸，4-甲基2-氧代丁酸和异已酸（Smit等，Appl Environ Microbiol 71:303-311(2005)）。该酶已经从结构上表征（Berthold等，Acta Crystallogr.D Biol.Crystallogr.63:1217-1224(2007)）。乳酸乳球菌酶和运动发酵单胞菌的丙酮酸脱羧酶之间的序列排列表明，催化和底物识别残基几乎相同（Siegert等，Protein Eng Des Sel 18:345-357(2005)），因此该酶将是一个有期望的定向工程候选酶。在枯草杆菌中检测到了BCKA催化的α-酮戊二酸脱羧反应；但是，这种活性相对于对其它支链底物的活性很低（5%）（Oku，J Biol Chem.263:18386-18396(1988)），并且编码该酶的基因目前为止还没有鉴定。其它BCKA候选基因可通过与乳酸乳球菌蛋白质序列的同源性鉴定。对该酶很多高分BLASTp命中的都记为吲哚丙酮酸脱羧酶（EC 4.1.1.74）。在植物和植物细菌中吲哚丙酮酸脱羧酶（IPDA）是一种催化吲哚丙酮酸脱羧为吲哚乙醛的酶。这种基因/蛋白质在下表62中鉴定。
表62.
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  kdcA   AAS49166.1   44921617   乳酸链球菌
重组支链α-酮酸脱羧酶来源于智人和牛的线粒体支链酮酸脱氢酶复合物的E1亚基，已在大肠杆菌中克隆和功能表达（Wynn，J.Biol.Chem.267:12400-12403(1992)；Davie，J.Biol.Chem.267:16601-16606(1992)和Wynn等，J.Biol.Chem.267:1881-1887(1992)）。在这些研究中，作者发现，分子伴侣GroEL和GroES的共表达提高了脱羧酶的特异性活性500倍（Wynn，J.Biol.Chem.267:12400-12403(1992)）。这些酶由两个α和两个β亚基组成。这些基因/蛋白质在如下表6中鉴定。
表63.
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  BCKDHB   NP_898871.1   34101272   智人
  BCKDHA   NP_000700.1   11386135   智人
  BCKDHB   P21839   115502434   牛
  BCKDHA   P11178   129030   牛
实施例V
从葡萄糖经过丙二酰-CoA产生丙酰-CoA的途径
继续实施例I和II，通过丙二酰-CoA产生丙酰-CoA的途径在图3中举例说明。乙酰-CoA被羧化形成丙二酰-CoA。其然后还原为丙二酸半醛，随后转化成3-羟基丙酸（3HP）。3HP通过丙酰-CoA合成酶转化成丙酰-CoA。
乙酰-CoA羧化酶
多亚基乙酰-CoA羧化酶复合物（ACC）在细菌中大致保守，催化由乙酰-CoA和碳酸氢盐ATP依赖地形成丙二酰-CoA。此反应作为脂肪酸生物合成中的第一个关键步骤，并且该酶已经成为大肠杆菌（Freiberg等，J.Biol.Chem.279:26066-26073(2004)），酵母（Zhang，Proc.Natl.Acad.Sci.US.A.101:5910-5915(2004)），枯草芽孢杆菌（Freiberg等人，J.Biol.Chem.279:26066-26073(2004))）和其它有机体（Barber，Biochim.Biophys.Acta1733:1-28(2005)）中致力开发抗菌药物和抑制剂的靶标酶。在大肠杆菌和许多其它细菌中，ACC由accA，accB，accC和accD编码的四个亚基组成（Choi-Rhee，J.Biol.Chem.278:30806-30812(2003)）。accB和accC两个亚基的表达由accB基因产物自动调节（James，J.Biol.Chem.279:2520-2527(2004)）。在酵母中，该酶由两个基因hfa1和acc1编码。基因bpl1编码生物素:载脂蛋白连接酶，是酶功能所需要的。
古菌（archael）分类组硫化叶菌目的自养成员在3-羟基丙酸循环的背景中表现出高水平的乙酰-CoA羧化酶活性（Chuakrut，J.Bacteriol.185:938-947(2003)，和Hugler，Eur.J.Biochem.270:736-744(2003)）。在勤奋金属球菌中，酰基CoA羧化酶全酶是由3个基因编码的亚基组成的多聚体：Msed_0148（生物素/硫辛酸连接物），Msed_0147（生物素羧化酶）和Msed_1375（羧基转移酶）。该酶已被纯化和表征，并且发现是双功能的，与乙酰-CoA和丙酰-CoA反应（Hugler，Eur.J.Biochem.270:736-744(2003)）。一种来自布氏酸菌的双功能古菌乙酰-CoA羧化酶由3个基因编码，已克隆到大肠杆菌中并被表征（Chuakrut，J.Bacteriol.185:938-947(2003)）。布氏酸菌酰基-CoA羧化酶基因的序列和侧翼区以登录号AB088419提交给了日本DNA数据库（DDBJ）。虽然这些古菌酶表现出高活性，但应当指出，最适温度为65℃（Chuakrut，J.Bacteriol.185:938-947(2003)）。这些基因/蛋白质在下表64中鉴定。
表64.
Figure BDA00001613425501261
Figure BDA00001613425501271
丙二酰-CoA还原酶和丙二酸半醛还原酶
丙二酰-CoA还原为3-HP可由具有醛脱氢酶和醇脱氢酶功能的双功能丙二酰-CoA还原酶完成。具有这种活性的NADPH依赖性酶已经在橙色绿屈挠菌中表征，其中所述酶参与3-羟基丙酸循环（Hugler，J.Bacteriol.184:2404-410(2002)；和Strauss，Eur.J.Biochem.215:633-643(1993)）。此酶具有300kDa的分子质量，具有高度的底物特异性，并且显示出与其它已知氧化还原酶几乎没有序列同源性（Hugler，J.Bacteriol.184:2404-2410(2002)）。在其它有机体中还没有酶显示出催化此特异反应；但是有生物信息学证据表明，其它有机体可能具有类似途径（Klatt，Environ.Microbiol.9:2067-2078(2007)）。在包括Roseiflexuscastenholzii，赤杆菌NAP1种和海洋γ蛋白菌HTCC2080的其它有机体中的候选酶可以由序列相似性推测。这些基因/蛋白质在下表65中鉴定。
表65
Figure BDA00001613425501281
可替代地，丙二酰-CoA还原为3-HP可由两种独立的酶催化：CoA酰化的醛脱氢酶和伯醇脱氢酶。通过这条路线，丙二酰-CoA首先由丙二酸半醛脱氢酶或者丙二酰-CoA还原酶还原为丙二酸半醛（MSA）。MSA随后被3-HP脱氢酶转化为3-HP。
在嗜热嗜酸古细菌中丙二酰-CoA还原酶在通过3-羟基丙酸循环的自养碳固定中是一种关键酶（Berg，Science.318:1782-1786(2007)；和Thauer，Science.318:1732-1733(2007)）。该酶利用NADPH作为辅因子，并且已经在金属球菌和硫化叶菌中鉴定了（Alber，J.Bacteriol.188:8551-8559(2006)；和Hugler，J.Bacteriol.184:2404-2410(2002)）。在勤奋金属球菌中由Msed_0709编码的酶已知将丙二酰-CoA转化为丙二酸半醛，并且以感兴趣的方向进行（Alber等，J.Bacteriol.188:8551-8559(2006)；和Berg，Science.318:1782-1786(2007)）。来自Sulfofobus tokodaii编码丙二酰基-CoA还原酶的基因在大肠杆菌克隆和异源表达（Alber等，J.Bacteriol.188:8551-8559(2006)。虽然这些酶的醛脱氢酶功能类似于来自橙色绿屈挠菌的双功能脱氢酶，但几乎没有序列相似性。两种丙二酰-CoA还原酶候选酶都与天冬氨酸半醛脱氢酶具有高度的序列相似性，所述的天冬氨酸半醛脱氢酶是一种催化还原并同时脱磷酸化天冬氨酰-4-磷酸为天冬氨酸半醛的酶。其它的候选基因可通过与包括硫磺矿硫化叶菌和嗜酸热硫化叶菌的其它有机体的蛋白质的序列同源性发现。这些基因/蛋白质在下表66中鉴定。
表66
 基因   GenBank ID   GI编号   有机体
 Msed_0709   YP_001190808.1   146303492   勤奋金属球菌
 mcr   NP_378167.1   15922498   Sulfolobus tokodaii
 asd-2   NP_343563.1   15898958   硫磺矿硫化叶菌
 Saci_2370   YP_256941.1   70608071   嗜酸热硫化叶菌
随后的丙二酸半醛向3-HP的转化可由具有3-HP脱氢酶活性的酶完成。已知三种酶催化这种转化：NADH-依赖的3-羟基丙酸脱氢酶，NADPH-依赖的丙二酸半醛还原酶和NADH-依赖的3-羟基异丁酸脱氢酶。NADH-依赖的3-羟基丙酸脱氢酶被认为参与细菌和植物中从丙酸的β-丙胺酸生物合成途径（Rathinasabapathi，Journal of Plant Pathology 159:671-674(2002)；和Stadtman，A.J.Am.Chem.Soc.77:5765-5766(1955)）。目前此酶还没有与任何有机体的基因相关。NADPH-依赖的丙二酸半醛还原酶催化自养CO2固定细菌中的可逆反应。虽然酶活性已经在勤奋金属球菌中发现，基因的身份还不清楚（Alber等，J.Bacteriol.188:8551-8559(2006)）。
几种3-羟基异丁酸脱氢酶也已经显示将丙二酸半醛转化为3-HP。显示这种活性的三种候选基因是来自绿脓杆菌PAOl的mmsB（Gokam等，美国专利7，393，676(2008)），来自恶臭假单胞菌KT2440的mmsB（Liao，美国专利公开2005-0221466(2005)）和来自恶臭假单胞菌E23的mmsB（Chowdhury，Biosci.Biotechnol.Biochemistry 60:2043-2047(1996)）。来自恶臭假单胞菌E23的蛋白质已经在大肠杆菌中表征并功能表达；然而，其对3-HP的活性是相对较低（Chowdhury，Biosci.Biotechnol.Biochemistry 60:2043-2047(1996)）。粪产碱菌M3A中一种具有3-羟基丁酸脱氢酶活性的酶也已经被鉴定（Liao，美国专利公开2005-0221466(2005)；和Liao，美国专利公开2005-0221466(2005)）。来自包括球形红杆菌的其它有机体的其它候选基因可由序列相似性推测。这些基因/蛋白质在下表67中鉴定。
表67
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  mmsB   AAA25892.1   151363   绿脓杆菌
  mmsB   NP_252259.1   15598765   绿脓杆菌PAO1
  mmsB   NP_746775.1   26991350   恶臭假单胞菌KT2440
  mmsB   JC7926   60729613   恶臭假单胞菌E23
  orfB1   AAL26884   16588720   球形红杆菌
显示4-羟基丁酸活性的酶（EC 1.1.1.61）可能也能将丙二酸半醛转化为3-HP，因为该化学转化非常相似。此酶已经在真氧产碱杆菌（Bravo，J.ForensicSci.49:379-387(2004)），克氏梭状芽孢杆菌（Wolff，Protein Expr.Purif.6:206-212(1995)）和拟南芥（Breitkreuz等，J.Biol.Chem.278:41552-41556(2003)）中鉴定。这些酶对丙二酸半醛的活性到目前为止还没有经实验证实。但是，由于这些酶已经在Genomatica的其它内部项目中研究，它们可容易地检测3-HP脱氢酶活性。这些基因/蛋白质在下表68中鉴定。
表68
  基因   GenBank ID   GI编号  有机体
  4hbd   YP_726053.1   113867564  真氧产碱杆菌H16
  4hbd   L21902.1   146348486  克氏梭状芽孢杆菌DSM 555
  4hbd   Q94B07   75249805  拟南芥
丙酰-CoA合成酶
3-羟基丙酸（3HP）转化为丙酰-CoA由丙酰-CoA合成酶完成。此步骤已知由橙色绿屈挠菌中201KDa的单一融合蛋白催化（Alber，J Biol.Chem.277:12137-12143(2002)）。该蛋白质由CoA连接酶，烯酰-CoA水合酶和烯酰-CoA还原酶组成。此酶已经被纯化30倍达到几乎均匀性，并且具有在500和800kDa之间的非常大的天然分子质量。在嗜热嗜酸的勤奋金属球菌中（并且是硫化叶菌科家族的成员），这种功能由三种不同的酶催化，将3HP活化为其CoA酯的3-羟基丙酰-CoA合成酶，将3-HP-CoA转化为丙烯酰-CoA之后将后者还原形成丙酰-CoA的3-羟基丙酰-CoA脱水酶。3-HP-CoA合成酶已有报道（Alber，J.Bacteriol.190:1383-1389(2008)）。编码该蛋白质的基因已经测序，并且编码同一蛋白质的基因在Sulfolobus tokodaii的基因组中鉴定；相似的基因被在硫磺矿硫化叶菌和嗜酸热硫化叶菌中发现。该基因在大肠杆菌中异源表达。这些基因/蛋白质在下表69中鉴定。
表69
 基因   GenBank ID   GI编号   有机体
 Msed_1456   YP_001191537   146304221   勤奋金属球菌
 ST0783   NP_376686   15921017   S.tokodaii
 acsA-10   NP_344510   15899905   硫磺矿硫化叶菌
 Saci_1184   YP_255824   70606954   嗜酸热硫化叶菌
 pcs   AAL47820   29126583   橙色绿屈挠菌
最近，3-羟基丙酰-CoA脱水酶和丙烯酰-CoA还原酶从勤奋金属球菌中纯化（Teufel，J Bacteriol.191:4572-4581(2009)），编码基因从勤奋金属球菌和硫化叶菌目的其它成员的基因组中鉴定，并且重组酶作为功能的证明产生。可以断定，编码3-羟基丙酰-CoA脱水酶和丙烯酰-CoA还原酶的基因在金属球菌或者硫化叶菌基因组中没有聚簇。对比这两种有机体中丙酰-CoA合成酶各自的结构域已经显示出，催化3HP转化为丙酰-CoA的酶已经在这两个类群中独立地进化。来自勤奋金属球菌的3-HP-CoA脱水酶的GenBank登录号和/或GI编号在下表70中鉴定。
表70
 基因   GenBank ID   GI编号   有机体
 Msed_2001   YP_001192065.1   146304749   勤奋金属球菌
丙烯先-CoA还原酶的GenBank IDs在下表71中鉴定。
表71.
 基因   GenBank ID   GI编号   有机体
 Msed_1426   YP_001191508.1   146304192   勤奋金属球菌
 ST0480   NP_376364   15920695   S.tokodaii
编码这两种酶的其它基因候选物可通过序列同源性检索获得。
实施例VI
由葡萄糖经过乳酸产生丙酰-CoA的途径
继续实施例I和II，经乳酸产生丙酰-CoA的途径在附图4中举例说明。此途径还存在另一形成丙酰-CoA的氧化还原平衡的路线。还原丙酮酸形成乳酸，其然后被活化形成乳酰-CoA。乳酰-CoA被脱水以形成丙烯酰-CoA和然后还原产生丙酰-CoA。
乳酸脱氢酶
丙酮酸向乳酸的转化由乳酸脱氢酶（EC 1.1.1.27）催化。很多乳酸脱氢酶已经有详细描述（Garvie，Microbiol Rev 44:106-139(1980)）。大肠杆菌的发酵的乳酸脱氢酶将成为过表达的第一个候选酶，用于将丙酮酸转化为乳酸（Bunch，Microbiology 143(Pt1)，187-195(1997)）。其它乳酸脱氢酶候选酶将用于此步骤，包括对丙酮酸具有低的Km的酶，其优先形成乳酸，例如来自干酪乳杆菌（Gordon，Eur.J Biochem.67:543-555(1976)），卵形疟原虫（Brown等，Biochemistry 43:6219-6229(2004)）和海栖热袍菌（Auerbach等，Structure.6:769-781(1998)）的乳酸脱氢酶。这些基因/蛋白质在下表72中鉴定。
表72
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  ldh   P52643   1730102   大肠杆菌
  ldh   P00343   126063   干酪乳杆菌
  ldh   Q6JH32   74911026   卵形疟原虫
  ldh   P16115   547837   海栖热袍菌
乳酰-CoA转移酶
乳酸向乳酰-CoA的活化可以由乳酰-CoA转移酶活性相关的丙酸CoA转移酶（EC 2.8.3.1）催化。丙酸梭菌通过非随机化途径用丙烯酰-CoA作为特异中间体发酵丙氨酸。在此途径中，用丙酰-CoA或者乙酰-CoA作为辅酶A供体，乳酸被丙酸:乙酰-CoACoA转移酶（EC 2.8.3.1或者丙酸CoA转移酶）活化为乳酰-CoA（Schweigr，FEBS Lett.171:79-84(1984)）。此酶对单羧酸包括丙烯酸，丙酸和丁酸显示相当广泛的底物特异性，而不利用二羧酸。编码此酶的基因已被克隆（Selmer，Eur.J.Biochemistry 269:372-380(2002)）。其它丙酸CoA-转移酶可作为此步骤的候选酶，包括丙酸梭菌的丙酸CoA转移酶同源物。这些基因/蛋白质在下表73中鉴定。
表73
Figure BDA00001613425501321
乳酰-CoA脱水酶
乳酰-CoA脱水成乳酸由乳酰-CoA脱水酶（EC 4.2.1.54）催化。丙酸梭菌通过非随机化途径用丙烯酰-CoA作为特异中间体发酵丙氨酸（Schweiger，FEBSLett.171:79-84(1984)）。在此途径中，乳酰-CoA被乳酰-CoA脱水酶脱水为丙烯酰-CoA（Hofmeister，Eur.J.Biochemistry 206:547-552(1992)）。克隆丙酸CoA转移酶也确定一个第二ORF（lcdB），其可能编码在此途径中需要的乳酰-CoA脱水酶的一个亚基。lcdB类似于2-羟基戊二酰-CoA脱水酶β亚基。lcdB的同源物将在此步骤中测试其活性。这些基因/蛋白质在下表74中鉴定。
表74
 基因   GenBank ID   GI编号   有机体
 CBC_A0885   ZP_02621214   168186579   C型肉毒杆菌埃克隆德菌株
 CBC_A0886   ZP_02621215   168186580   C型肉毒杆菌埃克隆德菌株
 hgdB   YP_878441   118444181   诺非氏梭菌-NT
 hgdA   YP_878442   118444701   诺非氏梭菌-NT
丙烯酰-CoA还原酶
丙烯酰-CoA向丙酰-CoA的转化由丙烯酰-CoA还原酶催化。在发酵丙氨酸的丙酸梭菌中，丙烯酰-CoA还原酶催化从丙烯酰-CoA不可逆的NADH依赖的形成丙酰-CoA。该酶已经纯化，并且该酶亚基的N-末端已经确定（Hetzel等，Eur.J Biochem.270:902-910(2003)）。二聚丙酰-CoA脱氢酶亚基的N-末端类似于来自几个梭状芽孢杆菌和相关厌氧菌的丁酰-CoA脱氢酶（高达55%的序列同源性）。β和γ亚基的N-末端分别与来自埃氏巨型球菌的电子转移黄素蛋白（ETF）的A和B亚基的N-末端共享40%和35%的序列同源性，并且与来自其它厌氧菌的丙酮酸ETFs的N-末端共享高达60%的序列同源性。由于没有提供丙酸梭菌的整个基因组序列，丙酰-CoA脱氢酶亚基的N-末端“MDFKLTKTQVLQQWLFAEFAGIGIKPIAE”（SEQ ID NO.）用于相似性搜索，并且为其在此步骤中的活性产生丙酰-CoA脱氢酶的下列同源物。这些基因/蛋白质在下表75中鉴定。
表75
Figure BDA00001613425501331
Figure BDA00001613425501341
另外，三功能的丙酰-CoA合成酶(pcs）基因从光合绿色非硫真杆菌橙色绿屈挠菌中鉴定（Alber，J Biol.Chem.277:12137-12143(2002)）。丙酰-CoA合成酶是一种由CoA连接酶，烯酰-CoA水合酶和烯酰-CoA还原酶组成的201kDa的天然融合蛋白质。该酶催化3-羟基丙酸依次转化为3-羟基丙酰-CoA和丙烯酰-CoA，然后转化为丙酰-CoA。此酶可以整体或部分利用其烯酰-CoA还原酶活性。基因/蛋白质在下表76中鉴定。
表76
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  pcs   AAL47820   29126583   橙色绿屈挠菌
实施例VII
由葡萄糖协同产生1,4-丁二醇（1,4-BDO）和异丙醇的途径
本实施例描述用于1,4-丁二醇（1,4-BDO）和异丙醇的协同产生的示例性途径。
本发明描述了用于协同产生1,4-丁二醇（1,4-BDO）和异丙醇以及相关产物的新途径。在图5所示的1,4-丁二醇（1,4BDO）和异丙醇的协同产生途径中，主要的代谢中间体首先引导至琥珀酰-CoA。为了形成琥珀酰-CoA，磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）通过PEP羧激酶或者PEP羧化酶转化为草酰乙酸。可替代地，PEP首先被丙酮酸激酶转化为丙酮酸，然后被甲基丙二酰-CoA羧基转移酶或者丙酮酸羧化酶转化为草酰乙酸。草酰乙酸然后通过还原性TCA循环的方式转化为琥珀酰-CoA。琥珀酰-CoA然后被CoA-依赖的醛脱氢酶转化为琥珀酸半醛。可替代地，琥珀酸可以被琥珀酸还原酶转化为琥珀酸半醛。下一步，琥珀酸半醛被4-羟基丁酸脱氢酶还原为4-羟基丁酸。4-HB转化为其酰基-CoA的活化由一种CoA转移酶或合成酶催化。可替代地，4-HB可转化为4-羟基丁酰磷酸，和随后通过磷酸转-4-羟基丁酸化酶转化4-HB-CoA。4-HB-CoA然后被双功能CoA依赖的醛/醇脱氢酶或者具有醛和醇脱氢酶活性的两种独立的酶转化为1,4-BDO。绕开4-HB-CoA中间体的又一可替代方案是通过羧酸还原酶直接还原4-HB为4-羟基丁醛，4-羟基丁醛随后被醇脱氢酶还原为1,4-BDO。绕开CoA中间体的又一路线是通过磷酸还原酶直接还原4-羟基丁酰磷酸为4-羟基丁醛。用于产生异丙醇的途径按照如上的实施例I和II中所述进行。
产生1,4-BDO和异丙醇的有机体按每个下列方程式消耗每摩尔葡萄糖的最高理论产量为0.77摩尔异丙醇和0.46摩尔1,4-BDO（0.26g/gIPA和0.23g/g1,4-BDO）：
13葡萄糖→10IPA+61,4-BDO+24CO2+8H2O
实施例VIII
由葡萄糖协同产生1,3-丁二醇（1,3-BDO）和异丙醇的途径
本实施例描述用于协同产生1,3-丁二醇（1,3-BDO）和异丙醇的示例性途径。
本发明描述了用于协同产生1,3-丁二醇（1,3-BDO）和异丙醇和相关产物的新途径。1,3-丁二醇（1,3-BDO）和异丙醇的协同产生路线如附图6所示，也通过如实施例VI所述的形成4-羟基丁酰-CoA进行。在此路线中，4-羟基丁酰-CoA被脱水和异构化以形成巴豆酰-CoA。该脱水和乙烯基异构化反应由双功能酶4-羟基丁酰-CoA脱水酶催化。然后巴豆酰-CoA水合成3-羟基丁酰-CoA。移除CoA部分并同时还原产生3-羟基丁醛。最后，由3-羟基丁醛还原酶还原该醛产生1,3-BDO。可替代地，3-羟基丁酰-CoA可以被1,3-BDO-CoA还原酶（形成醇）直接转化为1,3-BDO。几条其它可替代路线可能属于这条途径。琥珀酸可以被羧酸还原酶转化为琥珀酸半醛，绕过形成琥珀酰-CoA。4-HB可以被激酶磷酸化成4-HB-磷酸，然后接着转化为4-HB-CoA。最后3-羟基丁酰-CoA可能被CoA水解酶，转移酶或者合成酶脱酰基化，然后接着通被羧酸还原酶还原为3-羟基丁醛。
产生异丙醇的途径按照如上的实施例I和II中所述进行。
通过此途径按每个下列方程式消耗每摩尔葡萄糖的1,3-BDO和异丙醇的最高理论产量为0.77摩尔异丙醇和0.46摩尔1,3-BDO（0.26g/g IPA和0.23g/g1,3-BDO）：
13葡萄糖→10IPA+61,3-BDO+24CO2+8H2O
实施例IX
由葡萄糖协同产生甲基丙烯酸（MAA）和异丙醇的途径
本实施例描述协同产生甲基丙烯酸（MAA）和异丙醇的示例性途径。
本发明描述了用于协同产生甲基丙烯酸（MAA）和异丙醇和相关产物的新途径。两条协同产生甲基丙烯酸（MAA）的路线如附图7和8所示。如附图7所示的路线通过如前所述形成4-羟基丁酰-CoA进行。4-羟基丁酰-CoA由甲基变位酶转化为3-羟基异丁酰基-CoA。3-羟基异丁酰-CoA的CoA部分然后被CoA转移酶，水解酶或者合成酶清除。最后，3-羟基基团的脱水产生MAA。此路线中的几个关键步骤可以通过可替代路线绕过。例如，琥珀酸可以直接被琥珀酸还原酶转化为琥珀酸半醛，绕过琥珀酰-CoA的形成。4-HB向4-HB-CoA的转化可通过中间体4-羟基丁酰磷酸经4-羟基丁酸激酶和磷酸转-4-羟基丁酸化酶进行。3-HIBCOA可以经中间体甲基丙烯酰-CoA转化为MAA。异丙醇的产生途径如上文实施例I和II中所述进行。
在如附图8所示的可替代的MAA协同产生路线中，琥珀酰-CoA通过还原性TCA循环形成，然后通过甲基丙二酰-CoA变位酶转化为甲基丙二酰-CoA。将甲基丙二酰-CoA的(R)立体异构体转化为(S)构型可能需要差向异构酶。然后CoA-依赖的醛脱氢酶将甲基丙二酰-CoA转化为甲基丙二酸半醛。该醛还原为3-羟基异丁酸后脱水，产生MAA。可替代地，甲基丙二酰-CoA被醇-形成CoA还原酶转化为3-羟基异丁酸。在又一条可替代路线中，甲基丙二酰-CoA被CoA水解酶，转移酶或者合成酶转化为甲基丙二酸。甲基丙二酸随后被羧酸还原酶转化为甲基丙二酸半醛。甲基丙二酸半醛如前所述被转化为MAA。产生异丙醇的途径按照如上的实施例I和II中所述进行。
按每个方程式利用每摩尔葡萄糖，两种MAA协同产生途径都获得异丙醇和MAA各0.67摩尔的产量（0.22g/g异丙醇和0.32g/g MAA）：
3葡萄糖→2IPA+2MAA+4CO2+4H2O
实施例X
产生异丙醇和1,4-丁二醇（1,4-BDO），1,3-丁二醇（1,3-BDO）或甲基丙烯酸（MAA）的酶分类系统
本实施例描述了用于产生1,4-丁二醇（1,4-BDO），1,3-丁二醇（1,3-BDO）或甲基丙烯酸（MAA）的实施例VII和IX所述的示例性途径的酶分类系统。从乙酰辅酶A的异丙醇生产示例性酶描述范例，我和示例性酶生产葡萄糖的乙酰辅酶A的第二例。
PEP羧激酶
虽然磷酸烯醇式丙酮酸向草酰乙酸的净转化是氧化还原平衡的，这种转化的机理对这种协同产生途径的总的能量学很重要。PEP转化为草酰乙酸的最理想的酶是PEP羧激酶，其在羧化PEP的同时形成ATP。然而在大多数生物中，PEP羧激酶发挥糖异生功能，并且消耗一分子AP将草酰乙酸转化为PEP。啤酒酵母是这种生物中的一种，其天然PEP羧激酶PCK1发挥糖异生作用（Valdes-Hevia，FEBS.Lett.258:313-316(1989)）。大肠杆菌是这种生物的另一种，由于当与PEP羧化酶相比时，PEP羧激酶在产生草酰乙酸中的作用被认为是较小的，其并不形成ATP，可能是因为碳酸氢盐更高的PEP羧激酶Km值（Kim，Appl Environ Microbiol 70:1238-1241(2004)）。虽然如此，天然的大肠杆菌PEP羧激酶转化PEP为草酰乙酸的活性最近已经在大肠杆菌K-12的ppc突变体中被证实（Kwon，Journal of Microbiology and Biotechnology16:1448-1452(2006)）。这些菌株显示没有生长缺陷，并且已经在高的NaHCO3浓度下增加琥珀酸的产生。在某些生物中，尤其是瘤胃细菌，PEP羧激酶在从PEP产生草酰乙酸和产生AP中十分有效。已经被克隆到大肠杆菌中的PEP羧激酶基因的实例包括来自琥珀酸曼海姆菌（Lee，Biotechnol.Bioprocess Eng.7:95-99(2002)），琥珀酸厌氧螺菌（Laivenieks，Appl Environ Microbiol63:2273-2280(1997)）以及琥珀酸放线杆菌（Kim，Appl Environ Microbiol70:1238-1241(2004)）的基因。内部实验也已发现，流感嗜血杆菌编码的PEP羧激酶对从PEP形成草酰乙酸非常有效。这些基因/蛋白质在下表77中鉴定。
表77
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  PCK1   NP_013023   6322950   啤酒酵母
  pck   NP_417862.1   16131280   大肠杆菌
  pckA   YP_089485.1   52426348   琥珀酸曼海姆菌
  pckA   O09460.1   3122621   琥珀酸厌氧螺菌
  pckA   Q6W6X5   75440571   琥珀酸放线杆菌
  pckA   P43923.1   1172573   流感嗜血杆菌
这些序列以及列入此报告中的后续酶的序列可用于在GenBank或者其它数据库中通过序列相似性搜寻鉴定同源蛋白质（例如BLASTp）。所得同源蛋白质及其相应的基因序列提供附加的DNA序列用于转化所选的宿主有机体。
PEP羧化酶
PEP羧化酶代表由PEP形成草酰乙酸的一种可替代酶。啤酒酵母并不天然编码PEP羧化酶，但是具有编码PEP羧化酶基因的示例性的生物包括大肠杆菌（Kai，Arch.Biochem.Biophys.414:170-179(2003)），扭曲甲基杆菌（Arps，J.Bacteriol.175:3776-3783(1993)）和谷氨酸棒杆菌（Eikmanns，Mol.Gen.Genet.218:330-339(1989)）。这些基因/蛋白质在下表78中鉴定。
表78
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  ppc   NP_418391   16131794   大肠杆菌
  ppcA   AAB58883   28572162   扭曲甲基杆菌
  ppc   ABB53270   80973080   谷氨酸棒杆菌
丙酮酸激酶和甲基丙二酰-CoA羧基转移酶
从PEP形成草酰乙酸的其它能量有效的路线需要两种酶活性：丙酮酸激酶和甲基丙二酰-CoA羧基转移酶。丙酮酸激酶催化ATP-产生的PEP向丙酮酸的转化，并且由啤酒酵母中PYK1（Burke，J.Biol.Chem.258:2193-2201（1983））和PYK2（Boles等，J.Bacteriol.179:2987-2993(1997)）基因编码。在大肠杆菌中，此活性由pykF和pykA的基因产物催化。甲基丙二酰-CoA羧基转移酶催化转化丙酮酸为草酰乙酸。重要的是，此反应同时也催化转化(S)-甲基丙二酰-CoA为丙酰-CoA（参见图1和2）。示例性的甲基丙二酰-CoA羧基转移酶包括1.3S，5S和12S亚基，可在费氏丙酸杆菌中发现（Thornton等，J.Bacteriol175:5301-5308(1993)）。这些基因/蛋白质在下表79中鉴定。
表79
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  PYK1   NP_009362   6319279   啤酒酵母
  PYK2   NP_014992   6324923   啤酒酵母
  pykF   NP_416191.1   16129632   大肠杆菌
  pykA   NP_416368.1   16129807   大肠杆菌
  1.3S亚基   P02904   114847   费氏丙酸杆菌
  5S亚基   Q70AC7   62901478   费氏丙酸杆菌
  12S亚基   Q8GBW6   62901481   费氏丙酸杆菌
丙酮酸激酶和丙酮酸羧化酶
酶的组合可用于与PEP羧化酶相同的化学计量学转化PEP为草酰乙酸。这些酶由丙酮酸激酶，PYK1（Burke，J.Biol.Chem.258:2193-2201（1983））或者PYK2（Boles等，J.Bacteriol.，179:2987-2993(1997)）和丙酮酸羧化酶，PYC1（Walker，Biochem.Biophys.Res.Commun.176:1210-1217(1991)）或者PYC2（224）编码。丙酮酸羧化酶功能的某些候选基因在下表80中鉴定。
表80
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  PYC1   NP_011453   6321376   啤酒酵母
  PYC2   NP_009777   6319695   啤酒酵母
  Pyc   YP_890857.1   118470447   耻垢分枝杆菌
苹果酸脱氢酶，延胡索酸酶，延胡索酸还原酶
当TCA循环在还原性循环中进行时，草酰乙酸可以被苹果酸脱氢酶，延胡索酸酶和延胡索酸还原酶转化为琥珀酸。啤酒酵母拥有三拷贝苹果酸脱氢酶，MDH1（McAlister-Henn，J.Bacteriol.169:5157-5166(1987)），MDH2（Gibson，J.Biol.Chem.278:25628-25636(2003)；和Minard，Mol.Cell.Biol.11:370-380(1991)）和MDH3（Steffan，J.Biol.Chem.267:24708-24715(1992)），其分别位于线粒体，胞浆和过氧化物酶体中。啤酒酵母包括一拷贝的延胡索酸酶编码基因FUM1，其产物位于胞浆和线粒体中（Sass，J.Biol.Chem.278:45109-45116(2003)）。延胡索酸还原酶由两种可溶性酶FRDS1（Enomoto，DNA.Res.3:263-267(1996)）和FRDS2（Muratsubaki，Arch.Biochem.Biophys.352:175-181(1998)）编码，其分别位于胞浆和前线粒体。并且要求在葡萄糖上厌氧生长（Arikawa，Microbiol Lett.165:111-116(1998)）。已知大肠杆菌具有活性的苹果酸脱氢酶。其具有由fumA，B和C编码的三种延胡索酸酶，其中每个在不同的供氧条件下有活性。大肠杆菌中的延胡索酸还原酶由四个亚基组成。这些基因/蛋白质在下表81中鉴定。
表81
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  MDH1   NP_012838   6322765   啤酒酵母
  MDH2   NP_014515   116006499   啤酒酵母
  MDH3   NP_010205   6320125   啤酒酵母
  FUM1   NP_015061   6324993   啤酒酵母
  FRDS1   P32614   418423   啤酒酵母
  FRDS2   NP_012585   6322511   啤酒酵母
  frdA   NP_418578.1   16131979   大肠杆菌
  frdB   NP_418577.1   16131978   大肠杆菌
  frdC   NP_418576.1   16131977   大肠杆菌
  frdD   NP_418475.1   16131877   大肠杆菌
  Mdh   NP_417703.1   16131126   大肠杆菌
  FumA   NP_416129.1   16129570   大肠杆菌
  FumB   NP_418546.1   16131948   大肠杆菌
  FumC   NP_416128.1   16129569   大肠杆菌
琥珀酰-CoA转移酶
琥珀酰-CoA转移酶催化琥珀酰-CoA转化为琥珀酸，同时转移CoA部分给一个CoA受体分子。很多转移酶具有广泛的特异性，并且因此可以利用广泛的CoA受体如乙酸，琥珀酸，丙酸，丁酸，2-甲基乙酰乙酸，3-酮己酸，3-酮戊酸，戊酸，巴豆酸，3-巯基丙酸，丙酸，乙酸乙烯酯，丁酸，及其它。
琥珀酸向琥珀酰-CoA的转化由一种不需要直接消耗ATP或者GTP的转移酶理想地进行。这类反应在许多生物中很普遍。或许此反应步骤的最高候选酶是琥珀酰-CoA:3-酮酰-CoA转移酶。此酶将3-酮酰-CoA转化为3-酮酸的同时将琥珀酸转化为琥珀酰-CoA。示例性的琥珀酰-CoA:3:酮酰-CoA转移酶存在于幽门螺杆菌（Corthesy-Theulaz等，J.Biol.Chem.272:25659-25667(1997)），枯草杆菌（Stols等，Protein.Expr.Purif.53:396-403(2007)）和智人（Fukao等，Genomics，68:144-151(2000)；和Tanaka，Mol.Hum.Reprod.8:16-23(2002)）中。这些基因/蛋白质在下表82中鉴定。
表82
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  HPAG1_0676   YP_627417   108563101   幽门螺杆菌
  HPAG1_0677   YP_627418   108563102   幽门螺杆菌
  ScoA   NP_391778   16080950   枯草芽孢杆菌
  ScoB   NP_391777   16080949   枯草芽孢杆菌
  OXCT1   NP_000427   4557817   智人
  OXCT2   NP_071403   11545841   智人
琥珀酸向琥珀酰-CoA的转化也可由琥珀酰-CoA:乙酰-CoA转移酶催化。克氏梭状芽孢杆菌cat1的基因产物已经显示出琥珀酰-CoA:乙酰-CoA转移酶活性（Sohling，J Bacteriol.178:871-880(1996)）。另外，此活性也存在于阴道毛滴虫（van Grinsven等，J.Biol.Chem.283:1411-1418(2008)）和布氏锥虫（Riviere等，J.Biol.Chem.279:45337-45346(2004)）中。这些基因/蛋白质在下表83中鉴定。
表83
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  cat1   P38946.1   729048   克氏梭状芽孢杆菌
  TVAG_395550   XP_001330176   123975034   阴道毛滴虫G3
  Tb11.02.0290   XP_828352   71754875   布氏锥虫
又一可能的CoA受体是苄基琥珀酸。琥珀酰-CoA:(R)-苄基琥珀酰-CoA转移酶在有机体芳香索氏菌中对甲苯的厌氧降解途径起部分作用（Leutwein和Heider，J.Bact.183（14）4288-4295(2001)）。同源物可在固氮弧菌T，Aromatoleumaromaticum EbN1和金属还原泥土杆菌GS-15中发现。这些基因/蛋白质在下表84中鉴定。
表84
Figure BDA00001613425501411
Figure BDA00001613425501421
最后，ygfH编码大肠杆菌中的丙酰-CoA:琥珀酰-CoA转移酶（Haller等，Biochemistry，39(16)4622-4629）。相近的同源物可在例如杨氏柠檬酸杆菌ATCC29220，肠道沙门氏菌亚种亚利桑那沙门，中间耶尔森菌ATCC 29909中发现。这些基因/蛋白质在下表85中鉴定。
表85
Figure BDA00001613425501422
琥珀酰-CoA合成酶
啤酒酵母的LSC1和LSC2基因和大肠杆菌的sucC和sucD基因的产物自然形成琥珀酰-CoA合成酶复合物，其催化从琥珀酸同时消耗一分子ATP的琥珀酰-CoA的形成，其是一种在体内可逆的反应（Bravo等，J.Forensic Sci.49:379-387(2004)）。这些基因/蛋白质在下表86中鉴定。
表86
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  LSC1   NP_014785   6324716   啤酒酵母
  LSC2   NP_011760   6321683   啤酒酵母
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  sucC   NP_415256.1   16128703   大肠杆菌
  sucD   AAC73823.1   1786949   大肠杆菌
丙酮酸甲酸裂解酶
丙酮酸甲酸裂解酶是一种催化丙酮酸和CoA转化成乙酰-CoA和甲酸的酶。丙酮酸甲酸裂解酶是一种原核生物中常见的酶，其用来帮助调节厌氧的氧化还原平衡。示例性的酶可在大肠杆菌（Knappe，FEMS.Microbiol Rev.6:383-398(1990)），乳酸乳球菌（Melchiorsen，Appl Microbiol Biotechnol58:338-344(2002)）和变形链球菌（Takahashi-Abbe，Oral.Microbiol Immunol.18:293-297(2003)）中发现。线粒体丙酮酸甲酸裂解酶也已在真核生物莱茵衣藻（Atteia，J.Biol Chem.281:9909-9918(2008)；和Hemschemeier，Eukaryot.Cell7:518-526(2008)）中鉴定。这些基因/蛋白质在如下表87中鉴定。
表87
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  pflB   NP_415423   16128870   大肠杆菌
  pfl   CAA03993   2407931   乳酸链球菌
  pfl   BAA09085   1129082   变形链球菌
  PFL1   EDP09457   158283707   莱茵衣藻
甲酸氢裂解酶
甲酸氢裂解酶可以用于将甲酸转化为二氧化碳和氢气。一种示例性甲酸氢裂解酶可在大肠杆菌中发现。大肠杆菌甲酸氢裂解酶由氢化酶3和甲酸脱氢酶-H组成（Maeda，Appl.Microbiol.Biotechnol.77:879-890(2007)）。其被fhlA的基因产物激活（Maeda，Appl.Microbiol.Biotechnol.77:879-890(2007)）。向发酵液中加入微量元素硒，镍和钼，已经显示出提高甲酸氢裂解酶的活性（Soini，Microb.Cell Fact.7:26(2008)）。这些基因/蛋白质在下表88中鉴定。
表88
Figure BDA00001613425501441
甲酸氢裂解酶也存在于极端嗜热古菌嗜热球菌中（Takacs等，BMC.Microbiol.8:88(2008)）。这些基因/蛋白质在下表89中鉴定。
表89.
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  mhyC   ABW05543   157954626   嗜热球菌
  mhyD   ABW05544   157954627   嗜热球菌
  mhyE   ABW05545   157954628   嗜热球菌
  myhF   ABW05546   157954629   嗜热球菌
  myhG   ABW05547   157954630   嗜热球菌
  myhH   ABW05548   157954631   嗜热球菌
  fdhA   AAB94932   2746736   嗜热球菌
  fdhB   AAB94931   157954625   嗜热球菌
其它甲酸氢裂解酶系统已经在鼠伤寒沙门氏菌，肺炎克雷伯氏菌，深红红螺菌，甲酸甲烷杆菌中发现（Vardar-Schara，Microbial Biotechnology 1:107-125）。
甲酸脱氢酶
在其它生物中，甲酸脱氢酶活性在大肠杆菌和啤酒酵母中都存在。啤酒酵母包括两种甲酸脱氢酶FDHl和FDH2，催化甲酸氧化为CO2（Overkamp等，Yeast 19:509-520(2002)）。在热乙酸菌中，基因位点Moth_2312和Moth_2313实际上是一个，其负责编码甲酸脱氢酶的α亚单位，而β亚基由Moth_2314编码（Andreesen，J.Bacteriol.116:867-873（1973）；Li，J.Bacteriol.92:405-412（1966）；Pierce等，Environ.Microbiol(2008)和Yamamoto，J.Biol.Chem.258:1826-1832（1983））在Syntrophobacter fumaroxidans中编码甲酸脱氢酶活性的另一组基因由Sfum 2703到Sfum 2706编码（de Bok等，Eur.J.Biochem.270:2476-2485(2003)；和Reda，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.105:10654-10658(2008)）。类似于它们的热乙酸菌对应物，Sfum_2705和Sfum_2706实际上是一个基因。大肠杆菌包括多种甲酸脱氢酶。这些基因/蛋白质在下表90中鉴定。
表90
Figure BDA00001613425501451
丙酮酸脱氢酶
丙酮酸脱氢酶复合物已被广泛研究，其催化丙酮酸转化为乙酰CoA。啤酒酵母复合物由结合E1(PDA1，PDB1），E3(LPD1）和蛋白质X（含PDX1）组分的E2(LAT1）核心组成（Pronk，Yeast 12:1607-1633(1996)）。在大肠杆菌酶中，E1组分的特异性残基负责底物的特异性（Bisswanger，J.Biol Chem.256:815-822（1981）；Bremer，Eur.J Biochem.8:535-540（1969）和Gong等，J.Biol Chem.275:13645-13653(2000)）。工程方面的工作已经增加了在厌氧条件下大肠杆菌PDH酶活性（Kim，Appl.Environ.Microbiol.73:1766-1771(2007)；Kim，J.Bacteriol.190:3851-3858(2008)和Zhou，Biotechnol.Lett.30:335-342(2008)）。与大肠杆菌PDH相反，枯草杆菌复合物具有活性并且在厌氧条件下生长（Nakano，J.Bacteriol.179:6749-6755(1997)）所需。肺炎克雷伯氏菌PDH在甘油上生长期间鉴定，在厌氧条件下也具有活性（Menzel，J.Biotechnol.，56:135-142(1997)）。可以获得来自牛肾的酶复合物的晶体结构（Zhou，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98:14802-14807(2001)）和来自固氮菌的E2的催化结构域（Mattevi等，Science.255:1544-1550(1992)）。一些哺乳动物的PDH酶复合物可在替代底物上反应，例如2-氧代丁酸（Paxton等，BioChem.J.234:295-303(1986))）。这些基因/蛋白质在下表91中鉴定。
表91
Figure BDA00001613425501461
Figure BDA00001613425501471
丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶
丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶（PFOR）催化丙酮酸的氧化形成乙酰-CoA。来自非洲脱硫弧菌的PFOR已经在大肠杆菌中克隆和表达，产生一种具有活性的重组酶，其在有氧气存在下的稳定数天（Pieulle，J.Bacteriol.179:5684-5692(1997)）。氧稳定性在PFORs中比较少见，并且被认为是非洲脱硫弧菌酶的多肽链中的60个残基延伸所赋予的。热乙酸菌PFOR也被充分表征了（Menon，Biochemistry 36:8484-8494(1997)），并且甚至在自养生长期间显示出丙酮酸合成方向的高活性（Furdui，J Biol Chem.275:28494-28499(2000)）。此外，大肠杆菌拥有一个未知的开放读码框ydbK，其编码一种与热乙酸菌PFOR51％同源的蛋白质。关于大肠杆菌中丙酮酸氧化还原酶活性的证据已经被描述了（Blaschkowski，Eur.J Biochem.123:563-569（1982））。几个其它PFOR酶描述在以下的综述中（Ragsdale，Chem.Rev.103:2333-2346(2003)）。最后，黄素氧还蛋白还原酶（例如来自幽门螺杆菌或空肠弯曲菌的fqrB）（St Maurice等，J.Bacteriol.189:4764-4773(2007)）或Rnf-型蛋白质（Herrmann，J.Bacteriol.190:784-791(2008)；和Seedof等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.105:2128-2133（2008年））提供一种由PFOR产生的还原性铁氧还蛋白产生NADH或NADPH的方式。这些基因/蛋白质在下表92鉴定。
表92
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  por   CAA70873.1   1770208   非洲脱硫弧菌
  por   YP_428946.1   83588937   热乙酸菌
  ydbK   NP_415896.1   16129339   大肠杆菌
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  fqrB   NP_207955.1   15645778   幽门螺杆菌
  fqrB   YP_001482096.1   157414840   空肠弯曲菌
  RnfC   EDK33306.1   146346770   克氏梭状芽孢杆菌
  RnfD   EDK33307.1   146346771   克氏梭状芽孢杆菌
  RnfG   EDK33308.1   146346772   克氏梭状芽孢杆菌
  RnfE   EDK33309.1   146346773   克氏梭状芽孢杆菌
  RnfA   EDK33310.1   146346774   克氏梭状芽孢杆菌
  RnfB   EDK33311.1   146346775   克氏梭状芽孢杆菌
琥珀酸半醛脱氢酶（CoA-依赖的）
琥珀酸半醛脱氢酶（CoA-依赖的）也称为琥珀酰-CoA还原酶，是一种CoA-和NAD(P)H-依赖的氧化还原酶，其还原琥珀酰-CoA为其相应的醛。示例性的酶由来自克氏梭状芽孢杆菌的sucD基因（Sohling等，J Bacteriol 178:871-80(1996)；和Sohling等，J Bacteriol.178:871-880(1996)）和来自牙龈卟啉单胞菌的suc基因（Takahashi等，J.Bacteriol.182:4704-4710(2000)）编码。催化相似反应的其它酶有醋酸钙不动杆菌（Reiser等，Journal ofBacteriology179:2969-2975(2007)）和不动杆菌M-1菌株（Ishige等，Appl.Environ.Microbiol.68:1192-1195(2002)）的脂肪酰-CoA还原酶，以及假单胞菌属的酰化乙醛脱氢酶，已经证明其氧化和酰化乙醛，丙醛，丁醛，异丁醛和甲醛（Powlowski和，J Bacteriol.175:377-385(1993)）。除了将乙酰-CoA还原为乙醇之外，由肠膜明串珠菌中的adhE编码的酶已经显示出将支链化合物异丁醛氧化成异丁酰-CoA（Koo等，Biotechnol.Lett.27:505-510(2005)）。这些基因/蛋白质在下表93中鉴定。
表93
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  sucD   P38947.1   172046062   克氏梭状芽孢杆菌
  sucD   NP_904963.1   34540484   牙龈卟啉单胞菌
  acr1   YP_047869.1   50086359   醋酸钙不动杆菌
  acr1   AAC45217   1684886   贝氏不动杆菌
  acr1   BAB85476.1   18857901   不动杆菌M-1菌株
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  bphG   BAA03892.1   425213   假单胞菌属
  adhE   AAV66076.1   55818563   肠膜明串珠菌
4-羟基丁酸脱氢酶
4-羟基丁酸脱氢酶催化NAD(P)H-依赖的琥珀酸半醛还原为4-HB。显示此活性的酶在真氧产碱杆菌（Bravo等，J.Forensic Sci.49:379-387(2004)），克氏梭状芽孢杆菌（Wolff等，Protein Expr.Purif.6:206-212(1995)）和拟南芥（Breitkreuz等，J.Biol.Chem.278:41552-41556(2003)）中发现。而其它基因是来自热糖苷酶地芽孢杆菌的醇脱氢酶adh1（Jeon等，J Biotechnol 135:127-133(2008)）。这些基因/蛋白质在下表94中鉴定。
表94
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  4hbd   YP_726053.1   113867564   真氧产碱杆菌H16
  4hbd   EDK35022.1   146348486   克氏梭状芽孢杆菌
  4hbd   Q94B07   75249805   拟南芥
  adhI   AAR91477.1   40795502   糖苷酶地芽孢杆菌
4-羟基丁酰-CoA转移酶
4-HB转化为4-羟基丁酰基-CoA由具有4-羟基丁酰-CoA转移活性的酶催化。候选酶包括克氏梭状芽孢杆菌的catl，catl和cat3的基因产物，已经表明其分别显示琥珀酰-CoA，4-羟基丁酰-CoA和丁酰-CoA转移酶活性（Gerhardt等，Arch.Microbiol 174:189-199(2000)；Arikawa等，Microbiol Lett.165:111-116(1998)和Sohling等，J.Bacteriol.178:871-880(1996)）。相似的CoA转移酶活性也存在于阴道毛滴虫（van Grinsven等，J.Biol.Chem.283:1411-1418(2008)）和布氏锥虫（Riviere等，J.Biol.Chem.279:45337-45346(2004)）中。大肠杆菌的atoA和atoD基因编码具有广泛的底物范围的乙酰乙酰-CoA转移酶（Sramek等，Arch.BioChem.Biophys.171:14-26（1975））。已经表明此酶将CoA部分从乙酰-CoA转移到各种支链和直链底物，包括异丁酸（Matthies等，Appl Environ.Microbiol58:1435-1439(1992)），戊酸（Vanderwinkel等，BioChem.Biophys.Res.Commun.33:902-908(1968)）和丁酸（Vanderwinkel等，BioChem.Biophys.Res.Commun.33:902-908(1968)）。这些基因/蛋白质在下表95中鉴定。
表95
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  cat1   P38946.1   729048   克氏梭状芽孢杆菌
  cat2   P38942.2   172046066   克氏梭状芽孢杆菌
  cat3   EDK35586.1   146349050   克氏梭状芽孢杆菌
  TVAG_395550   XP_001330176   123975034   阴道毛滴虫G3
  Tb11.02.0290   XP_828352   71754875   布氏锥虫
  atoA   P76459.1   2492994   大肠杆菌
  atoD   P76458.1   2492990   大肠杆菌
4-羟基丁酰-CoA合成酶
4-HB转化为4-羟基丁酰-CoA也可由CoA酸硫醇连接酶催化，其也称为CoA合成酶。催化这种精确转化的酶到目前为止还没有表征；不过，具有广泛的底物特异性的几种酶已经描述在文献中了。一个示例性的候选酶是大肠杆菌中的sucCD编码的酶，其自然催化由琥珀酸形成琥珀酰-CoA伴随着消耗一分子ATP，是一种体内可逆的反应（Buck等，Biochemistry 24:6245-6252(1985)）的CoA。其它CoA连接酶的候选酶包括来自产黄青霉的ADP-形成的苯乙酸-CoA连接酶（Lamas-Maceiras等，BioChem.J 395:147-155(2006)；和Wang等，BioChem.Biophys.Res.Commun.360:453-458(2007)）和来自门多萨假单胞菌的庚二酰-CoA连接酶。来自门多萨假单胞菌的AMP-形成的酶已克隆到大肠杆菌中，表明其接受可替代底物己二酸和壬二酸（Binieda等，BioChem.J 340（Pt3）:793-801(1999)）。这些基因/蛋白质在下表96中鉴定。已鉴定用于乙酰乙酰-CoA合成酶，琥珀酰-CoA合成酶，丙酰-CoA合成酶，3-羟基丁酰-CoA合成酶，3-羟基异丁酰-CoA合成酶，甲基丙二酰-CoA合成酶和甲基丙烯酰-CoA合成酶的CoA合成酶的候选酶也在这里应用。
表96
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  sucC   NP_415256.1   16128703   大肠杆菌
  sucD   AAC73823.1   1786949   大肠杆菌
  phl   CAJ15517.1   77019264   产黄青霉
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  pauA   NP_249708.1   15596214   门多萨假单胞菌
4-羟基丁酰-CoA还原酶（形成醛)
4-羟基丁酰-CoA还原酶催化NAD(P)H-依赖的4-羟基丁酰-CoA还原为4-羟基丁醛。显示此活性的酶包括由克氏梭状芽孢杆菌中的sucD基因（Sohling等，J.Bacteriol 178:871-80(1996)；和Sohling等，J Bacteriol.178:871-880(1996)）和牙龈卟啉单胞菌的sucD基因（Takahashi等，J.Bacteriol.182:4704-4710(2000)）编码的琥珀酸半醛脱氢酶。丁醛脱氢酶发现于生溶剂性有机体例如糖乙酸多丁醇梭菌中（Kosaka等，Biosci.Biotechnol.BioChem.71:58-68(2007)），催化一个相似的反应：将丁酰-CoA转化为丁醛。在假单胞菌属中酰化乙醛脱氢酶的酶由bphG编码，也是一个候选酶，因为其已经证明氧化和酰化乙醛，丙醛，丁醛，异丁醛和甲醛（Powlowski等，J Bacteriol.175:377-385(1993)）。来自醋酸钙不动杆菌（Reiser等，Journal of Bacteriology 179:2969-2975(1997)）和不动杆菌M-1菌株（Ishige等，Appl.Environ.Microbiol.68:1192-1195(2002)）的脂肪酰-CoA还原酶催化相似的反应。除了将乙酰-CoA还原为乙醇之外，由肠膜明串珠菌中的adhE编码的酶已经表明将支链化合物异丁醛氧化成异丁酰-CoA（Koo等，Biotechnol.Lett.27:505-510(2005)）。这些基因/蛋白质在下表97中鉴定。
表97
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  sucD   P38947.1   172046062   克氏梭状芽孢杆菌
  sucD   NP_904963.1   34540484   牙龈卟啉单胞菌
  bld   AAP42563.1   31075383   糖乙酸多丁醇梭菌
  bphG   BAA03892.1   425213   假单胞菌属
  acr1   YP_047869.1   50086359   醋酸钙不动杆菌
  acr1   AAC45217   1684886   贝氏不动杆菌
  acr1   BAB85476.1   18857901   不动杆菌M-1菌株
  adhE   AAV66076.1   55818563   肠膜明串珠菌
4-羟基丁醛还原酶
4-羟基丁醛转化为1,4-BDO由一种醇脱氢酶催化。大肠杆菌中的几种天然脱氢酶例如yqhD（Sulzenbacher等，Journal of Molecular Biology 342:489-502(2004)）显示广泛的底物特异性并且能催化此反应。yqhD的基因产物用NADPH作为辅因子催化乙醛，丙二醛，丙醛，丁醛和丙烯醛的还原（Perez和，J Biol.Chem.283:7346-7353(2008)；和Perez等，J Biol.Chem.283:7346-7353(2008)）。催化将醛转化为醇的其它候选酶包括alrA编码的C2-C14中链醇脱氢酶（Tani等，Appl.Environ.Microbiol.66:5231-5235(2000)），来自啤酒酵母的ADH2（Atsumi等，Nature 451:86-89(2008)）和来自丙酮丁酸梭菌将丁醛转化为丁醇的bdh I和bdhII（Walter等，Journal of Bacteriology 174:7149-7158(1992)）。来自运动发酵单胞菌的adhk基因产物已经证明对许多醛类具有活性，包括甲醛，乙醛，丙醛，丁醛和丙烯醛（Kinoshita等，Appl.Microbiol.Biotechnol.22:249-254(1985)）。这些基因/蛋白质在下表98中鉴定。
表98
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  yqhD   NP_417484.1   16130909   大肠杆菌
  alrA   BAB12273.1   9967138   不动杆菌M-1菌株
  ADH2   NP_014032.1   6323961   啤酒酵母
  bdh I   NP_349892.1   15896543   丙酮丁酸梭菌
  bdh II   NP_349891.1   15896542   丙酮丁酸梭菌
  adhA   YP_162971.1   56552132   运动发酵单胞菌
4-羟基丁酰-CoA还原酶（形成醇）
4-羟基丁酰-CoA转化为1,4-BDO也可由具有醛脱氢酶和醇脱氢酶能力的双功能氧化还原酶催化。例如，来自丙酮丁酸梭菌的adheE2基因产物将丁酰-CoA转化为丁醇（Fontaine等，J.Bacteriol.184:821-830(2002)）。此酶也接受4-羟基丁酰-CoA作为底物。其它双功能醇-形成的还原酶包括肠膜明串珠菌adhE（Kazahaya等，J.Gen.Appl.Microbiol.18:43-55（1972）；和Koo等，Biotechnol.Lett.27:505-510(2005)）和来自希蒙德木的FAR（Metz等，Plant Physiology122:635-644(2000)）的基因产物。其它示例性的酶是来自橙色绿屈挠菌由mcr编码的NADPH-依赖的丙二酰基-CoA还原酶（Hugler等，J.Bacteriol.184:2404-2410(2002)；和Strauss等，Eur.J.BioChem.215:633-643(1993)）。这些基因/蛋白质在下表99中鉴定。
表99
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  adhE2   AAK09379.1   12958626   丙酮丁酸梭菌
  adhE   AAV66076.1   55818563   肠膜明串珠菌
  FAR   AAD38039.1   5020215   希蒙德木
  mcr   AAS20429.1   42561982   橙色绿屈挠菌
4-羟基丁酸磷酸转移酶（又名激酶）
4-羟基丁酸磷酸转移酶也称为4-羟基丁酸激酶，将4-HB转化为4-羟基丁酰磷酸伴随着水解一分子ATP。用于催化这些转化的候选酶包括丁酸激酶，天冬氨酸激酶，乙酸激酶和γ-谷氨酸激酶。丁酸激酶（EC 2.7.2.7）在丙酮丁酸梭菌产酸过程中进行可逆的转化丁酰磷酸为丁酸（Cary等，Appl.Environ.Microbio56:1576-1583(1990)）。此酶由两个buk基因产物中的任一个编码（黄等，J.Mol.Microbiol Biotechnol 2:33-38(2000)）。其它丁酸激酶在丁酸梭菌和破伤风形梭菌中发现（Twarog等，J Bacteriol.86:112-117（1963））。来自海栖热袍菌的有关酶异丁酸激酶也已经在大肠杆菌中表达和结晶（Diao等，D.Biol.Crystallogr.59:1100-1102(2003)；和Diao等，J Bacteriol.191:2521-2529(2009)）。天冬氨酸激酶催化ATP依赖的天冬氨酸磷酸化，并且参与几种氨基酸的合成。大肠杆菌中的天冬氨酸激酶III由lysC编码，具有广泛的底物范围和涉及底物特异性的催化残基已经被阐明（Keng等，Arch.Biochem.Biophys.335:73-81(1996)）。大肠杆菌中的两种其它激酶也是良好的候选酶：乙酸激酶和γ-谷氨酸激酶。大肠杆菌乙酸激酶由ackA编码（Skarstedt等，J.Biol.Chem.251:6775-6783（1976）），除乙酸外还磷酸化丙酸（Hesslinger等，Mol.Microbiol.27:477-492(1998)）。大肠杆菌γ-谷氨酸激酶由proB编码（史密斯等，J.Bacteriol.157:545-551(1984)），磷酸化谷氨酸的γ-羧酸基。这些基因/蛋白质在下表100中鉴定。
表100
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  buk1   NP_349675   15896326   丙酮丁酸梭菌
  buk2   Q97II1   20137415   丙酮丁酸梭菌
  buk2   Q9X278.1   6685256   海栖热袍菌
  lysC   NP_418448.1   16131850   大肠杆菌
  ackA   NP_416799.1   16130231   大肠杆菌
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  proB   NP_414777.1   16128228   大肠杆菌
磷酸转-4-羟基丁酸酶
磷酸转-4-羟基丁酸酶将4-羟基丁酰磷酸的磷酸部分与CoA部分交换，形成4-羟基丁酰-CoA。一种用于这种转化的候选酶是磷酸转丁酸酶（EC 2.3.1.19），是一种可逆转化丁酰-CoA为丁酰磷酸的酶。此酶由发现于丙酮丁酸梭菌（Walter等，Gene 134:107-111(1993)；和Wiesenborn等，Appl Environ.Microbiol55:317-322(1989)），丁酸产生菌L2-50（Louis等，J.Bacteriol.186:2099-2106(2004)）和巨大芽孢杆菌（Vazquez等，Curr.Microbiol 42:345-349(2001)）中的ptb基因编码。这些基因/蛋白质在下表101中鉴定。
表101
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  ptb   NP_349676   34540484   丙酮丁酸梭菌
  ptb   AAR19757.1   38425288   丁酸产生菌L2-50
  ptb   CAC07932.1   10046659   巨大芽孢杆菌
4-羟基丁酰磷酸还原酶
4-羟基丁酰磷酸还原为其相应的醛由磷酸还原酶催化。此反应催化不被已知的酶催化，但是一个类似的反应由天冬氨酸半醛脱氢酶催化（ASD，EC1.2.1.11）：NADPH依赖的还原4-天冬氨酰磷酸为4-天冬氨酸半醛。ASD参与氨基酸的生物合成，并且最近已经作为一个抗菌靶标研究（Hadfield等，Biochemistry 40:14475-14483(2001)）。大肠杆菌ASD结构已经被解析（Hadfield等，J Mol.Biol.289:991-1002(1999)）并且该酶已经显示接受可替代的底物β-3-甲基天冬氨酰基磷酸（Shames等，J Biol.Chem.259:15331-15339(1984)）。流感嗜血杆菌酶已经成为酶工程研究的课题以改变活性部位的底物结合亲和力（Blanco等，Acta Crystallogr.D.Biol.Crystallogr.60:1388-1395(2004)；和Blanco等，Acta Crystallogr.D.Biol.Crystallogr.60:1808-1815(2004)）。其它ASD候选酶在结核分支杆菌（Shafiani等，J Appl Microbiol 98:832-838(2005)），詹氏甲烷球菌（Faehnle等，J Mol.Biol.353:1055-1068(2005)），以及传染性微生物霍乱弧菌和幽门螺杆菌幽门（Moore等，Protein Expr.Purif.25:189-194(2002)）中发现。一个有关的候选酶是乙酰谷氨酰磷酸还原酶（EC 1.2.1.38），一种将乙酰谷氨酰磷酸自然还原为乙酰谷氨酸-5-半醛的酶，在啤酒酵母（Pauwels等，Eur.JBiocgem.270:1014-1024(2003)），枯草芽孢杆菌（O′Reilly和Devine，Microbiology 140(Pt 5):1023-1025(1994)）和其它生物中发现。这些基因/蛋白质在下表102中鉴定。
表102
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  asd   NP_417891.1   16131307   大肠杆菌
  asd   YP_248335.1   68249223   流感嗜血杆菌
  asd   AAB49996   1899206   结核分枝杆菌
  VC2036   NP_231670   15642038   霍乱弧菌
  asd   YP_002301787.1   210135348   幽门螺杆菌
  ARG5，6   NP_010992.1   6320913   啤酒酵母
  argC   NP_389001.1   16078184   枯草芽孢杆菌
其它示例性磷酸还原酶酶包括将甘油醛3-磷酸转化为D-甘油酸-1,3-二磷酸的甘油醛3-磷酸脱氢酶（例如，大肠杆菌gapA（Branlant等，Eur.J.Biochem.150:61-66(1985)）），将N-乙酰基-L-谷氨酸-5半醛转化为N-乙酰基-L-谷氨酰基-5磷酸的N-乙酰基-γ-谷氨酰磷酸还原酶（例如，大肠杆菌argC（Parsot等，Gene，68:275-283(1988)）），以及将L-谷氨酸-5-半醛转化为L-谷氨酰基-5-磷酸的谷氨酸-5-半脱氢酶（例如，大肠杆菌proA（Smith等，J.Bacteriol.，157:545-551(1984)））。来自鼠伤寒沙门氏菌（Mahan等，J.Bacteriol.，156:1249-1262（1983））和空肠弯曲菌（Louie等，Mol.Gen.Genet.，240:29-35(1993)）编码谷氨酸-5-半醛脱氢酶的基因在大肠杆菌中被克隆并表达。这些基因/蛋白质在下表103中鉴定。
表103
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  gapA   P0A9B2.2   71159358   大肠杆菌
  argC   NP_418393.1   16131796   大肠杆菌
  proA   NP_414778.1   16128229   大肠杆菌
  proA   NP_459319.1   16763704   鼠伤寒沙门菌
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  proA   P53000.2   9087222   空肠弯曲菌
琥珀酸还原酶和4-羟基丁酸还原酶
将琥珀酸直接还原为琥珀酸半醛或者4-HB直接还原为4-羟基丁醛可由羧酸还原酶催化。Nocardia iowensis的羧酸还原酶已知等同于芳基醛脱氢酶，催化镁，ATP和NADPH-依赖的还原羧酸为其相应的醛（Venkitasubramanian等，J Biol.Chem.282:478-485(2007)），并且能催化4-羟基丁酸转化为4-羟基丁醛。此酶由car编码，在表达大肠杆菌中被克隆并且功能表达（Venkitasubramanian等，J Biol.Chem.282:478-485(2007)）。npt基因产物的表达通过转录后修饰提高此酶的活性。npt基因编码特异性磷酸泛酰巯基乙胺转移酶（PPTase），该酶将非活性的apo-酶转化为活性的holo-酶。此酶的天然底物是香草酸，并且此酶显示出广泛接受芳香族和脂肪族底物（Venkitasubramanian等，“Biocatalytic Reduction ofCarboxylic Acids:Mechanism and Applications”Chapter 15 in Biocatalysisin the Pharmaceutical and Biotechnology Industires，ed.R.N.Patel，CRCPress LLC，Boca Raton，FL.(2006)）。这些基因/蛋白质在下表104中鉴定。
表104
Figure BDA00001613425501561
其它car和npt基因可以基于序列同源性鉴定。由这些基因编码的蛋白质的非限制性实施例如表105所示。
表105
Figure BDA00001613425501562
Figure BDA00001613425501571
在灰色链霉菌中发现的其它候选酶由griC和griD基因编码。当griC或者griD之一缺失导致细胞外3-乙酰氨基-4-羟基苯甲酸（3-氨基-4-羟基苯甲酸代谢的一种旁路产物）累积时，此酶被认为将3-氨基-4-羟基苯甲酸转化为3-氨基-4-羟基苯甲醛（Suzuki等，J.Antibiot.60(6):380-387(2007)）。griC和griD与SGR 665（一种与Nocardia iowensis的npt在序列上类似的酶）的协同表达可能是有益的。这些基因/蛋白质在下表106中鉴定。
表106
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  griC   YP_001825755.1   182438036   灰色链霉菌NBRC 13350
  griD   YP_001825756.1   182438037   灰色链霉菌NBRC 13350
α-氨基己二酸还原酶（AAR，EC 1.2.1.31）是一种具有类似特性的酶，在某些真菌中参与赖氨酸生物合成途径。此酶将α-氨基己二酸还自然原为α-氨基己二酸半醛。羧基首先通过ATP-依赖的形成腺苷酸而激活，然后被NAD(P)H还原产生醛和AMP。如CAR一样，此酶利用镁并且需要通过PPTase活化。AAR的候选酶及其相应的PPTase在啤酒酵母（Morris等，Gene 98:141-145(1991)），白色念珠菌（Guo等，Mol.Genet.Genomics 269:271-279(2003)）和粟酒裂殖酵母（Ford等，Curr.Genet.28:131-137(1995)）中发现。当大肠杆菌中表达时来自粟酒裂殖酵母的AAR显示显著的活性（Guo等，Yeast 21:1279-1288(2004)）。来自产黄青霉的AAR接受S-羧甲基-L-半胱氨酸作为可替代的底物，但是不与己二酸，L-谷氨酸或者二氨基庚二酸反应（Hijarrubia等，J Biol.Chem 278:8250-8256(2003)）。编码产黄青霉PPTase的基因到目前为止还没有鉴定，并且提高序列比较同源搜索没有鉴定到高可信的结果。这些基因/蛋白质在下表107中鉴定。
表107
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  LYS2   AAA34747.1   171867   啤酒酵母
  LYS5   P50113.1   1708896   啤酒酵母
  LYS2   AAC02241.1   2853226   白色念珠菌
  LYS5   AAO26020.1   28136195   白色念珠菌
  Lys1p   P40976.3   13124791   裂殖酵母
  Lys7p   Q10474.1   1723561   裂殖酵母
  Lys2   CAA74300.1   3282044   产黄青霉
4-羟基丁酰-CoA脱水酶
4-羟基丁酰-CoA脱水酶催化可逆的转化4-羟基丁酰-CoA为巴豆酰-CoA。此酶具有固有的乙烯基乙酰-CoAΔ-异构酶活性，将双键从3，4位移动到2，3位（Scherf等，Eur.J BioChem.215:421-429(1993)；和Scherf等，Arch.Microbiol161:239-245(1994)）。来自氨基丁酸梭菌和克氏梭状芽孢杆菌的4-羟基丁酰-CoA脱水酶被纯化，表征，和在N末端测序（Scherf等，Eur.J BioChem.215:421-429(1993)；和Schert等，Arch.Microbiol 161:239-245(1994)）。克氏梭状芽孢杆菌酶由abfD编码，在大肠杆菌中被克隆，测序和表达（Gerhardt等，Arch.Microbiol 174:189-199(2000)）。来自牙龈卟啉菌ATCC 33277的abfD基因产物与梭菌的基因产物在序列同源性上亲缘关系很近。这些基因/蛋白质在下表108中鉴定。
表108
Figure BDA00001613425501591
巴豆酸酶
3-羟基丁酰-CoA脱水酶（EC 4.2.1.55）也叫巴豆酸酶，是一种烯酰-CoA水合酶，使3-羟基异丁酰-CoA可逆脱水形成巴豆酰-CoA。巴豆酸酶在某些生物中需要形成正丁醇，特别是梭菌属，并且在硫化叶菌属，酸菌属和金属球菌属的嗜热嗜酸古细菌中也包括3-羟基丙酸/4-羟基丁酸循环的一个步骤。编码巴豆酸酶的示例性基因可在丙酮丁酸梭菌（Atsumi等，Metab Eng 10:305-311(2008)；以及Boynton，J Bacteriol.178:3015-3024(1996)），克氏梭状芽孢杆菌（Hillmer等，FEBS Lett.21:351-354（1972）），以及勤奋金属球菌（Berg等，Science.318:1782-1786(2007)）中发现，尽管后一基因的序列还不知道。恶臭假单胞菌的烯酰-CoA水合酶由ech编码，催化巴豆酰-CoA转化为3-羟基丁酰-CoA（Roberts等，Arch.Microbiol 117:99-108（1978））。其它烯酰-CoA水合酶的候选酶是来自恶臭假单胞菌的phaA和phaB，和来自荧光假单胞菌paaA和paaB（Olivera等，Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A95:6419-6424(1998)）。最后，大量的大肠杆菌基因已经显示证实了烯酰-CoA水合酶功能，包括maoC（Park等，J Bacteriol.185:5391-5397(2003)），paaF（Ismail等，Eur.J BioChem.270:3047-3054(2003)；Park等，Appl.BioChem.Biotechnol 113-116:335-346(2004)和Park等，Biotechnol Bioeng 86:681-686(2004)）和paaG（Ismail等，Eur.J BioChem.270:3047-3054(2003)；Park等，Appl.BioChem.Biotechnol 113-116:335-346(2004)和Park等，Biotechnol Bioeng 86:681-686(2004)）。这些基因/蛋白质在下表109中鉴定。
表109
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  crt   NP_349318.1   15895969   丙酮丁酸梭菌
  crt1   YP_001393856.1   153953091   克氏梭状芽孢杆菌
  ech   NP_745498.1   26990073   恶臭假单胞菌
  paaA   NP_745427.1   26990002   恶臭假单胞菌
  paaB   NP_745426.1   26990001   恶臭假单胞菌
  phaA   ABF82233.1   106636093   荧光假单胞菌
  phaB   ABF82234.1   106636094   荧光假单胞菌
  maoC   NP_415905.1   16129348   大肠杆菌
  paaF   NP_415911.1   16129354   大肠杆菌
  paaG   NP_415912.1   16129355   大肠杆菌
3-羟基丁酰-CoA还原酶（形成醛)
3-羟基丁酰基CoA脱氢酶催化NAD(P)H依赖的还原3-羟基丁酰-CoA为3-羟基丁醛。到目前为止还没有鉴定催化这种转化的酶。一种示例性CoA-酰化的醛脱氢酶是来自拜氏梭菌的ald基因（Toth等，Appl Environ.Microbiol65:4973-4980(1999)）。已经报道此酶还原乙酰-CoA和丁酰-CoA为它们的相应醛。将酰基-CoA转化为相应醛的另一种酶是丙二酰基-CoA还原酶，其转化丙二酰-CoA为丙二酸半醛。丙二酰-CoA还原酶在嗜热嗜酸古细菌中是通过3-羟基丙酸循环的自养碳固定中的一个关键酶（Berg等，Science.318:1782-1786(2007)；和Thauer，Science.318:1732-1733(2007)）。该酶利用NADPH作为辅因子并且已经在金属球菌属和硫化叶菌属中表征（Alber等，J.Bacteriol.188:8551-8559(2006)；和Hugler等，J.Bacteriol.184:2404-2410(2002)）。此酶在勤奋金属球菌中由Msed_0709编码（Alber等，J.Bacteriol.188:8551-8559(2006)；Berg等，Science.18:1782-1786(2007)）。来自Sulfolobus tokodaii编码丙二酰-CoA还原酶的基因在大肠杆菌中被克隆和异源表达（Alber等，J.Bacteriol.188:8551-8559(2006)）。此酶也已经显示催化甲基丙二酰-CoA转化为其相应的醛（WO/2007/141208）。如上所述，将4-羟基丁酰-CoA转化为4-羟基丁醛的醛脱氢酶候选酶也适用于此。这些基因/蛋白质在下表110中鉴定。
表110
 基因   GenBank ID   GI编号  有机体
 Ald   AAT66436   49473535  拜氏梭菌
 Msed_0709   YP_001190808.1   146303492  勤奋金属球菌
 mcr   NP_378167.1   15922498  Sulfolobus tokodaii
3-羟基丁醛还原酶
具有3-羟基丁醛还原酶活性的酶需要将3-羟基丁醛转化为1,3-丁二醇。编码催化醛转化为醇的酶（即，醇脱氢酶或者等效地醛还原酶）的示例性基因包括编码C2-C14中链醇脱氢酶的alrA，（Tani，Appl.Environ.Microbiol.66:5231-5235(2000)）来自啤酒酵母的ADH2，（Atsumi，Nature 451:86-89(2008)）来自大肠杆菌的yqhD，其偏爱分子长于C3，（Sulzenbacher等，Journal ofMolecular Biology 342:489-502(2004)）和来自丙酮丁酸梭菌的bdh I和bdh II，其将丁醛转化为丁醇（Walter，Journal of Bacteriology174:7149-7158(1992)）。yqhD的基因产物使用NADPH作为辅因子催化还原乙醛，丙二醛，丙醛，丁醛和丙烯醛（Perez，J.Biol.Chem.283:7346-7353(2008)）。来自运动发酵单胞菌的adhA基因已经被证明对许多醛类具有活性，包括甲醛，乙醛，丙醛，丁醛和丙烯醛（Kinoshita，Appl.Microbiol.Biotechnol.22:249-254(1985)）。这些基因/蛋白质在下表111中鉴定。
表111
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  alrA   BAB12273.1   9967138   不动杆菌M-1菌株
  ADH2   NP_014032.1   6323961   啤酒酵母
  yqhD   NP_417484.1   16130909   大肠杆菌
  bdh I   NP_349892.1   15896543   丙酮丁酸梭菌
  bdh II   NP_349891.1   15896542   丙酮丁酸梭菌
  adhA   YP_162971.1   56552132   运动发酵单胞菌
其它候选酶包括4-羟基丁酸脱氢酶和3-羟基异丁酸脱氢酶。4-羟基丁酸脱氢酶自然转化4-羟基丁醛为4-HB，并且已经在真氧产碱杆菌（Bravo等，J.Forensic Sci.49:379-387(2004)），克氏梭状芽孢杆菌（Wolff等，Protein Expr.Purif.6:206-212(1995)）和拟南芥（Breitkreuz等，J.Biol.Chem.278:41552-41556(2003)）中表征。3-羟基异丁酸脱氢酶的候选酶包括来自绿脓杆菌PAO1的mmsB（Gokam等，美国专利7393676(2008)），来自恶臭假单胞菌KT2440（118）的mmsB和来自恶臭假单胞菌E23的mmsB（Chowdhury等，Biosci.Biotechnol.BioChem.60:2043-2047(1996)）。这些基因/蛋白质在下表112中鉴定。
表112
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  4hbd   YP_726053.1   113867564   真氧产碱杆菌H16
  4hbd   EDK35022.1   146348486   克氏梭状芽孢杆菌
  4hbd   Q94B07   75249805   拟南芥
  mmsB   NP_252259.1   15598765   绿脓杆菌PAO1
  mmsB   NP_746775.1   26991350   恶臭假单胞菌KT2440
  mmsB   JC7926   60729613   恶臭假单胞菌E23
3-羟基丁酰-CoA还原酶（形成醇）
将3-羟基丁酰-CoA直接转化为1,3-丁二醇需要一种双功能氧化还原酶。将酰基-CoA转化为醇的示例性酶包括转化如下底物的酶：将乙酰-CoA转化为乙醇（例如，来自大肠杆菌的adhE（凯斯勒等，FEBS.Lett.281:59-63(1991)）），将丁酰-CoA转化为丁醇（例如来自丙酮丁酸梭菌的adhE2（Fontaine等，J.Bacteriol.184:821-830(2002)））和将4-羟基丁酰基-CoA转化为1,4-丁二醇（参见前述部分中的候选酶）。荷荷巴（希蒙德木）FAR编码形成醇的脂肪酰-CoA还原酶。该基因在大肠杆菌中被克隆和过表达，导致FAR激活和脂肪族醇的积累（Metz等，Plant Physiology 122:635-644(2000)）。另一种示例性酶将丙二酰-CoA转化为3-羟基丙酸。具有此活性的NADPH依赖性酶已经在橙色绿屈挠菌中鉴定，其参与3-羟基丙酸循环（Hugler等，J.Bacteriol.184:2404-2410(2002)；和Strauss等，Eur.J.BioChem.215:633-643(1993)）。此酶具有300kDa的分子质量，具有高度的底物特异性，并且显示与其它已知的氧化还原酶几乎没有序列相似性（Hugler等，J.Bacteriol.184:2404-2410(2002)）。这些基因/蛋白质在下表113中鉴定。
表113
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  adhE   NP_415757.1   16129202   大肠杆菌
  adhE2   AAK09379.1   12958626   丙酮丁酸梭菌
  adhE   AAV66076.1   55818563   肠膜明串珠菌
  FAR   AAD38039.1   5020215   希蒙德木
  mcr   AAS20429.1   42561982   橙色绿屈挠菌
3-羟基丁酰-CoA转移酶
将3-羟基丁酰-CoA转化为3-羟基丁酸（3-HB）由CoA转移酶，水解酶或合成酶催化。催化这种特异性转化的CoA转移酶到目前为止还没有被鉴定。大肠杆菌酶酰基-CoA:乙酰-CoA转移酶也称为乙酰-CoA转移酶（EC 2.8.3.8），已经显示从各种支链和直链酰基-CoA底物转移CoA部分给乙酸，所述底物包括异丁酸（Matthies等，Appl Environ Microbiol 58:1435-1439(1992)），戊酸（Vanderwinkel等，BioChem.Biophys.Res Commun.33:902-908(1968)）和丁酸（Vanderwinkel等，BioChem.Biophys.Res Commun.33:902-908(1968)）。此酶由大肠杆菌K12中的atoA（α亚单位）和atoD（β亚基)（Korolev等，D Biol.Crystallogr.58:2116-2121(2002)；和Vanderwinkel等，BioChem.Biophys.ResCommun.33:902-908(1968)），以及谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的actA和cg0592编码（Duncan等，Appl Environ Microbiol 68:5186-5190(2002)）。类似的酶存在于谷氨酸棒杆菌ATCC 13032（Eikmanns等，Mol.Gen.Genet.218:330-339(1989)），丙酮丁酸梭菌（Cary等，Appl.Environ.Microbiol.56:1576-1583(1990)；和Wiesenborn等，Appl.Environ.Microbiol.55:323-329(1989)），以及糖乙酸多丁醇梭菌（Kosaka等，Biosci.Biotechnol BioChem.71:58-68(2007)）中。这些基因/蛋白质在下表114中鉴定。
表114
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  atoA   P76459.1   2492994   大肠杆菌
  atoD   P76458.1   2492990   大肠杆菌
  actA   YP_226809.1   62391407   谷氨酸棒杆菌
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  cg0592   YP_224801.1   62389399   谷氨酸棒杆菌
  ctfA   NP_149326.1   15004866   丙酮丁酸梭菌
  ctfB   NP_149327   15004867   丙酮丁酸梭菌
  ctfA   AAP42564.1   31075384   糖乙酸多丁醇梭菌
  ctfB   AAP42565.1   31075385   糖乙酸多丁醇梭菌
描述丙酰-CoA转移酶，甲基丙二酰-CoA转移酶，乙酰乙酰-CoA转移酶，甲基丙烯酰-CoA转移酶，3-羟基异丁酰-CoA转移酶，4-羟基丁酰-CoA转移酶和琥珀酰-CoA转移酶的CoA转移酶候选基因也适用于此。
3-羟基丁酰-CoA合成酶
3-羟基丁酰-CoA也可由CoA合成酶（也称为连接酶或者合成酶）转化为3-HB。一种候选的ATP合成酶是ADP-形成的乙酰-CoA合成酶（ACD，EC6.2.1.13），所述的乙酰-CoA合成酶将酰基-CoA向其相应酸的转化与同时合成ATP相偶联。虽然此酶还没有显示与作为底物的3-羟基丁酰-CoA反应，几种具有广泛的底物特异性的酶已经描述在文献中。来自闪烁古生球菌的ACD I由AF1211编码，显示对多种直链和支链底物包括异丁酸，异戊酸和延胡索酸发挥作用（Musfeldt等，J Bacteriol.184:636-644(2002)）。闪烁古生球菌中的第二种可逆的ACD由AF1983编码，也显示具有广泛的底物范围，对环状化合物苯乙酸和吲哚乙酸具有高活性（Musfeldt等，J Bacteriol.184:636-644(2002)）。来自死海盐盒菌的酶（记为琥珀酰-CoA合成酶）接受丙酸，丁酸，和支链酸（异戊酸和异丁酸）作为底物，并且显示对正向和反向都发挥作用（Brasen等，Arch.Microbiol182:277-287(2004)）。来自极端嗜热泉古菌需氧热棒菌由PAE3250编码的ACD显示在所有已鉴定ACDs中最广泛的底物范围，与乙酰-CoA，异丁酰-CoA（优选的底物）和苯乙酰-CoA反应（Brasen等，Arch.Microbiol 182:277-287(2004)）。不过，定向进化或者工程对于此酶在宿主有机体的生理温度发挥作用可能是必要的。来自闪烁古生球菌，死海盐盒菌和需氧热棒菌的酶已经全部在大肠杆菌中克隆，功能表达和表征（Brasen等，Arch.Microbiol 182:277-287(2004)；和Musfeldt等，J.Bacteriol.184:636-644(2002)）。其它候选酶是由大肠杆菌中的sucCD编码的酶，其自然催化琥珀酸形成琥珀酰-CoA，同时来消耗一分子ATP，是一种在体内可逆的反应（Buck等，Biochemistry 24:6245-6252(1984)）。这些基因/蛋白质在下表115中鉴定。
表115
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  AF1211   NP_070039.1   11498810   闪烁古生球菌DSM 4304
  AF1983   NP_070807.1   11499565   闪烁古生球菌DSM 4304
  scs   YP_135572.1   55377722   死海盐盒菌
  PAE3250   NP_560604.1   18313937   需氧热棒菌菌株IM2
  sucC   NP_415256.1   16128703   大肠杆菌
  sucD   AAC73823.1   1786949   大肠杆菌
描述丙酰-CoA合成酶，甲基丙二酰-CoA合成酶，甲基丙烯酰-CoA合成酶，乙酰乙酰-CoA合成酶，3-羟基异丁酰-CoA合成酶，4-羟基丁酰-CoA合成酶和琥珀酰-CoA合成酶的CoA合成酶的候选基因也适用于此。
3-羟基丁酰-CoA水解酶
将3-羟基丁酰-CoA转化为3-HB需要3-羟基丁酰-CoA水解酶。3-羟基异丁酰-CoA水解酶（EC 3.1.2.4）催化相关的转化：3-羟基异丁酰-CoA的水解。来自智人的3-羟基异丁酰基-CoA水解酶也接受3-羟基丁酰-CoA作为底物（Shimomura等，Methods Enzymol.324:229-240(2000)）。此酶也已经在褐鼠中鉴定了（Shimomura等，J Biol Chem.269:14248-14253(1994)；和Shimomura等，Methods Enzymol.324:229-240(2000)）。序列同源性的侯选基因包括啤酒酵母的hibch和蜡样芽胞杆菌的BC_2292。这些蛋白质在下表116中鉴定。鉴定丙酰-CoA水解酶，甲基丙二酰-CoA水解酶，甲基丙烯酰-CoA水解酶，乙酰乙酰-CoA水解酶和3-羟基异丁酰-CoA的其它CoA水解酶的候选酶也适用于此。这些基因/蛋白质在下表116中鉴定。
表116
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  hibch   Q5XIE6.2   146324906   褐鼠
  hibch   Q6NVY1.2   146324905   智人
  hibch   P28817.2   2506374   啤酒酵母
  BC_2292   AP09256   29895975   蜡样芽胞杆菌
3-羟基丁酸还原酶
将3-羟基丁酸还原为3-羟基丁醛由羧酸还原酶催化。琥珀酸还原酶和4-羟基丁酸还原酶的示例性候选酶也适用于此。
4-羟基丁酰-CoA变位酶
4-HB转化为3-羟基异丁酰-CoA由甲基变位酶催化。这种转化尚未经实验证实。不过，考虑到其相应底物的结构相似性，催化类似反应的两种甲基变位酶（即，异丁酰-CoA变位酶和甲基丙二酰-CoA变位酶）是有希望的候选酶。
甲基丙二酰-CoA变位酶（MCM）是一种自然转化琥珀酰-CoA转化为甲基丙二酰-CoA的钴胺素依赖性酶。在大肠杆菌中，可逆的腺苷钴胺素依赖的变位酶参与三步骤途径，导致琥珀酸转化为丙酸（Haller等，Biochemistry 39:4622-9(2000)））。MCM由大肠杆菌编中的基因scpA（Bobik等，Anal.Bioanal.Chem.375:344-349(2003)；和Haller等，Biochemistry 39:4622-4629(2000)）和智人中的mutA（Padovani等，BioChemistry 45:9300-9306(2006)）编码。在几种其它有机体中MCM包括α和β亚基并且由两种基因编码。编码二亚基的蛋白质的示例性候选基因是费氏丙酸杆菌谢氏亚种的mutA和mutB（Korotkova等，J Biol Chem.279:13652-13658(2004)）和扭曲甲基杆菌的mcmA和mcmB（Korotkova等，J BiolChem.279:13652-13658(2004)）。这些基因/蛋白质在下表117中鉴定。
表117
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  scpA   NP_417392.1   16130818   大肠杆菌K12
  mutA   P22033.3   67469281   智人
  mutA   P11652.3   127549   费氏丙酸杆菌谢氏亚种
  mutB   P11653.3   127550   费氏丙酸杆菌谢氏亚种
  mcmA   Q84FZ1   75486201   扭曲甲基杆菌
  mcmB   Q6TMA2   75493131   扭曲甲基杆菌
基于与大肠杆菌spcA基因产物的高度同源性鉴定的其它酶的候选酶包括在下表118中鉴定的酶。
表118
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  sbm   NP_838397.1   30064226   弗氏志贺菌
  SARI_04585   ABX24358.1   160867735   肠道沙门氏菌
  YfreA_01000861   ZP_00830776.1   77975240   弗氏耶尔森氏菌
存在更进一步的证据，与甲基丙二酰-CoA变位酶催化基因邻近的基因也是最大活性所必需的。例如已经证明，来自扭曲甲基杆菌的meaB基因与甲基丙二酰-CoA变位酶形成复合物，刺激体外变位酶活性，并且可能保护其不可逆失活（Korotkova等，J.Bio chem.279:13652-13658(2004)）。扭曲甲基杆菌meaB基因产物非常类似于大肠杆菌argK基因产物（BLASTP：45%同源性，e值：4e-67），其在染色体上与scpA邻近。GenBank没有收录费氏丙酸杆菌的meaB同源物的序列。不过，位于PPA0597的疮疱丙酸杆菌KPA171202基因产物与扭曲甲基杆菌meaB蛋白质51%同源，并且它的基因也与甲基丙二酰-CoA变位酶基因在染色体上相邻。这些基因/蛋白质在下表119中鉴定。
表119
 基因   GenBank ID   GI编号   有机体
 argK   AAC75955.1   1789285   大肠杆菌K12
 PPA0597   YP_055310.1   50842083   疮疱丙酸杆菌
 KPA171202   2QM8_B   158430328   扭曲甲基杆菌
可替代地，异丁酰-CoA变位酶（ICM）能催化推荐的转化。ICM是MCM家族中钴胺素依赖的甲基变位酶，其可逆地重排丁酰-CoA的碳骨架成为异丁酰-CoA（Ratnatillek的附图7B，J Bio chem.274:31679-31685(1999)）。Methylibiumpetroleiphilum中新的ICM的最近研究与以前的工作一起，提供改变活性部位附近的单一氨基酸改变此酶的底物特异性的证据（Ratnatilleke等，J Bio chem.274:31679-31685(1999)；和Rohwerder等，Appl Environ Microbiol 72:4128-4135(2006)）。这暗示如果天然酶不能催化4HB-CoA转化为3HIB-CoA，该酶可经合理的改造。编码同源二聚酶的示例性ICM基因包括链霉菌A3(2)的icmA和Methylibium petroleiphilum PM1的Mpe_B0541（Ratnatilleke等，J Biol Chem.274:31679-31685(1999)；和Rohwerder等，Appl Environ Microbiol 72:4128-4135(2006)）。编码异源二聚酶的基因包括肉桂地链霉菌的icm和icmB（Ratnatilleke等，J Biol Chem.274:31679-31685(1999)；Vrijbloed等，J Bacteriol.181:5600-5605(1999)和Zerbe-Burkhardt等，J Biol Chem.273:6508-6517(1998)）。由阿维链霉菌MA-4680中的icmA和icmB基因编码的酶显示与已知的ICMs高度的序列相似性。这些基因/蛋白质在下表120中鉴定。
表120
Figure BDA00001613425501681
3羟基异丁酰基CoA转移酶
在此途径的下一步需要由CoA转移酶将3-羟基异丁酰-CoA转化为3-羟基异丁酸（3-HIB）。催化此特异性转化的酶到目前为止还没有被鉴定。大肠杆菌酶脂肪酰-CoA:乙酸-CoA转移酶也称为乙酸-CoA转移酶（EC 2.8.3.8），已经显示从各种支链和直链酰基-CoA底物转移CoA部分到乙酸，所述底物包括异丁酸（Matthies等，Appl Environ Microbiol 58:1435-1439(1992)），戊酸（Vanderwinkel等，BioChem.Biophys.Res.Commun.33:902-908(1968)）和丁酸（Vanderwinkel等，BioChem.Biophys.Res.Commun.33:902-908(1968)）。此酶由大肠杆菌K12的atoA（α亚单位）和atoD（β亚基）（Korolev等，D Biol.Crystallogr.58:2116-2121(2002)；和Vanderwinkel等，BioChem.Biophys.Res.Commun.33:902-908(1968)）和谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的actA和cg0592（Duncan等，Appl Environ Microbiol 68:5186-5190(2002)）编码。类似的酶存在于谷氨酸棒杆菌ATCC 13032（Eikmanns等，Mol.Gen.Genet.218:330-339(1989)），丙酮丁酸梭菌（Cary等，Appl.Environ.Microbiol.56:1576-1583(1990)；和Wiesenborn等，Appl.Environ.Microbiol.55:323-329(1989)），以及糖乙酸多丁醇梭菌（Kosaka等，Biosci.Biotechnol BioChem.71:58-68(2007)）中。如前所述，4-羟基丁酰-CoA转移酶的候选酶也适用于此。这些基因/蛋白质在下表121中鉴定。
表121
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  atoA   P76459.1   2492994   大肠杆菌
  atoD   P76458.1   2492990   大肠杆菌
  actA   YP_226809.1   62391407   谷氨酸棒杆菌
  cg0592   YP_224801.1   62389399   谷氨酸棒杆菌
  ctfA   NP_149326.1   15004866   丙酮丁酸梭菌
  ctfB   NP_149327   15004867   丙酮丁酸梭菌
  ctfA   AAP42564.1   31075384   糖乙酸多丁醇梭菌
  ctfB   AAP42565.1   31075385   糖乙酸多丁醇梭菌
3-羟基异丁酰-CoA合成酶
3-羟基异丁酰-CoA也可由CoA合成酶（也称为连接酶或者合成酶）转化为3-HIB。一种候选的ATP合成酶是ADP-形成的乙酰-CoA合成酶（ACD，EC6.2.1.13），所述的乙酰-CoA合成酶将酰基-CoA向其相应酸的转化与同时合成ATP相偶联。虽然此酶还没有显示与作为底物的3-羟基异丁酰-CoA反应，几种具有广泛的底物特异性的酶已经描述在文献中。来自闪烁古生球菌的ACD I由AF1211编码，显示对多种直链和支链底物包括异丁酸，异戊酸和延胡索酸发挥作用（Musfeldt等，J Bacteriol.184:636-644(2002)）。闪烁古生球菌中的第二种可逆的ACD由AF1983编码，也显示具有广泛的底物范围，对环状化合物苯乙酸和吲哚乙酸具有高活性（Musfeldt等，J Bacteriol.184:636-644(2002)）。来自死海盐盒菌的酶（记为琥珀酰-CoA合成酶）接受丙酸，丁酸，和支链酸（异戊酸和异丁酸）作为底物，并且显示对正向和反向都发挥作用（Brasen等，Arch.Microbiol182:277-287(2004)）。来自极端嗜热泉古菌需氧热棒菌由PAE3250编码的ACD显示在所有已鉴定ACDs中最广泛的底物范围，与乙酰-CoA，异丁酰-CoA（优选的底物）和苯乙酰-CoA反应（Brasen等，Arch.Microbiol 182:277-287(2004)）。不过，定向进化或者工程对于此酶在宿主有机体的生理温度发挥作用可能是必要的。来自闪烁古生球菌，死海盐盒菌和需氧热棒菌的酶已经全部在大肠杆菌中克隆，功能表达和表征（Brasen等，Arch.Microbiol 182:277-287(2004)；和Musfeldt等，J.Bacteriol.184:636-644(2002)）。其它候选酶是由大肠杆菌中的sucCD编码的酶，其自然催化琥珀酸形成琥珀酰-CoA，同时来消耗一分子ATP，是一种在体内可逆的反应（Buck等，Biochemistry 24:6245-6252(1984)）。这些基因/蛋白质在下表122中鉴定。
表122
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  AF1211   NP_070039.1   11498810   闪烁古生球菌DSM 4304
  AF1983   NP_070807.1   11499565   闪烁古生球菌DSM 4304
  scs   YP_135572.1   55377722   死海盐盒菌
  PAE3250   NP_560604.1   18313937   需氧热棒菌菌株IM2
  sucC   NP_415256.1   16128703   大肠杆菌
  sucD   AAC73823.1   1786949   大肠杆菌
3羟基异丁酰基CoA水解酶
在缬氨酸降解期间3-羟基异丁酰-CoA水解酶选择性转化3-羟基异丁酰基-CoA为3-HIB（Shimomura等，J Biol Chem 269:14248-53(1994)）。编码该酶的基因前面已描述了。如前所述的3-羟基丁酰-CoA水解酶和丙酰-CoA基因的候选基因也适用于此。
3-羟基异丁酸脱水酶
3-羟基异丁酸脱水为甲基丙烯酸由具有3-羟基异丁酸脱水酶活性的酶催化。没有直接证据表明这种特异性的酶促转化已经鉴定。但是，大多数脱水酶催化α，β脱水，其包括有吸电子的羰基，羧基或者CoA硫醇酯基活化α氢，以及从β位消除羟基（Buckel等，J Bacteriol.117:1248-1260（1974）；和Martins等，Proc Natl Acad Sci USA 101:15645-9(2004)）。这是甲基丙烯酸路径中为最后步骤提出的精确类型的转化。提出的转化非常类似于巴克氏真杆菌的2-(羟甲基)戊二酸脱水酶（图3A）。此酶已经在烟酸还原代谢中进行了研究，并且由hmd编码（Alhapel等，Proc Natl Acad Sci USA 103:12341-6(2006)）。巴克氏真杆菌中具有类似功能的酶是二甲基苹果酸水合酶，它是乌头酸酶家族中的一种可逆的铁2+-依赖和氧敏感的酶，其中二甲基苹果酸水合形成(2R，3S)-2，3-二甲基苹果酸。此酶由dmdAB编码（Alhapel等，Proc Natl Acad Sci USA103:12341-6(2006)；和Kollmann-Koch等，Hoppe Seylers.Z.Physiol Chem.365:847-857(1984)）。这些基因/蛋白质在下表123中鉴定。
表123
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  hmd   ABC88407.1   86278275   巴克氏真杆菌
  dmdA   ABC88408   86278276   巴克氏真杆菌
  dmdB   ABC88409.1   86278277   巴克氏真杆菌
其它的候选酶是2-甲基苹果酸脱水酶，也叫二甲基苹果酸水解酶，是一种催化从二甲基苹果酸α，β脱水形成中康酸的可逆的水解酶。此酶已经在詹氏甲烷球菌中在丙酮酸途径到2-氧代丁酸的过程中进行了研究，其中已显示具有广泛的底物特异性（Drevl和等，J.Bacteriol.189:4391-4400(2007)）。此酶活性也在破伤风形梭菌，摩氏摩根菌，无丙二酸柠檬酸杆菌中检测到，其中认为参与谷氨酸降解（Kato等，Arch.Microbiol 168:457-463(1997)）。詹氏甲烷球菌蛋白质序列与这些有机体中的基因没有明显的同源性。这基因/蛋白质在下表124中鉴定。
表124.
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  leuD   Q58673.1   3122345   詹氏甲烷球菌
延胡索酸水合酶自然催化苹果酸脱水成延胡索酸，代表另一组候选酶。虽然延胡索酸水合酶对3-羟基异丁酸作为底物的反应能力还没有描述，为此酶提供了丰富的结构信息，并且其他研究人员已经成功地改造该酶以改变活性，抑制性和定位（Weaver，D Biol Crystallogr.61:1395-1401(2005)）。大肠杆菌具有三种延胡索酶：FumA，FumB和FumC，其由生长条件调控。FumB对氧气敏感并且只在厌氧条件下有活性。FumA在微厌氧条件下具有活性，以及FumC是在有氧生长中唯一具有活性的酶（Guest等，J Gen Microbiol131:2971-2984（1985），Tseng等，J Bacteriol 183:461-467（2001）。和Woods等，Biochim Biophys Acta 954:14-26(1988)）。其它候选酶在空肠弯曲菌（Smith等，Iht.J BioChem.Cell Biol 31:961-975（1999）），嗜热栖热菌（Mizobata等，Arch.BioChem.Biophys.355:49-55（1998））和褐鼠（Kobayashi等，J BioChem.89:1923-1931(1981)）中发现。来自Pelotomaculumthermopropionicum的MmcBC延胡索酸酶是另一类具有两个亚基的延胡索酸酶（Shimoyama等，FEMS Microbiol Lett 270:207-213(2007)）。这些基因/蛋白质在如下表125中鉴定。
表125.
Figure BDA00001613425501721
3-羟基异丁酰-CoA脱氢酶
由CoA脱水酶将3-羟基异丁酰-CoA脱水产生甲基丙烯酰-CoA。烯酰CoA水合酶（EC4.2.1.17）催化3-羟基酰基-CoA底物的脱水（Agnihotri和Liu.，J.Bacteriol.188:8551-8559(2003)；Conrad等，J.Bacteriol.118:103-111(1974)；和Roberts等，Arch.Microbiol 117:99-108(1978)）。烯酰-CoA水合酶（ECH）在牛肝中发现接受各种底物，包括甲基丙烯酰-CoA，2-和3-甲基巴豆酰-CoA，丙烯酰-CoA和1-羧基环己烯酰基-CoA（Agnihotri等，Bioorg MedChem.，11(1):9-20(2003)）。重组牛肝ECH酶已在大肠杆菌中过表达，并发现具有类似的催化性能（Dakoji等，J Am Chem Soc.，123:9749(2001)）。恶臭假单胞菌的烯酰-CoA水合酶由ech编码，催化3-羟基丁酰-CoA转化为巴豆酰-CoA（Roberts等，Arch.Microbiol 117:99-108（1978））。其它烯酰-CoA水合酶的候选酶是恶臭假单胞菌的phaA和phaB，以及荧光假单胞菌的phaA和phaB（Olivera等，Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A95:6419-6424(1998)）。预计沼泽红假单胞菌的pimF基因产物编码参与庚二酰-CoA降解的烯酰-CoA水合酶（Harrison和Harwood，Microbiology 151:727-736(2005)）。最后，大量的大肠杆菌基因已经证明烯酰-CoA水合酶的功能，包括maoC（Park和Lee，J.Bacteriol.185:5391-5397(2003)），paaF（Ismail等，J Biochem.270:3047-3054(2003)；Park和Lee，Appl.Biochem.Biotechnol 113-116:335-346(2004)；以及Park和Yup，Biotechnol Bioeng 86:681-686(2004)）和paaG（Ismail等，J Biochem.270:3047-3054(2003)；Park和Lee，Appl.Biochem.Biotechnol 113-116:335-346(2004)；以及Park和Yup，Biotechnol Bioeng86:681-686(2004)）。这些基因/蛋白质在如下表126中鉴定。
表126.
催化此反应的另一示例性的候选酶是巴豆酸酶。此酶的候选基因如上所述。另外，大肠杆菌fadA和fadB的基因产物编码参与脂肪酸氧化的多酶复合体，其表现出烯酰-CoA水合酶活性（Nakahigashi和Inokuchi，Nucleic Acids Res.18:4937(1990)；Yang，J.Bacteriol.173:7405-7406(1991)；和Yang等，Biochemistry 30:6788-6795(1991)）。敲除由fadR编码的负调控因子可以用来激活fadB基因产物（Sato等，J Biosci.Bioeng 103:38-44(2007)）。fadI和fadJ基因编码类似的功能并且在厌氧条件下自然表达（Campbell等，Mol.Microbiol47:793-805(2003)）。这些基因/蛋白质在如下表127中鉴定。
表127
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  fadA   YP_026272.1   49176430   大肠杆菌
  fadB   NP_418288.1   16131692   大肠杆菌
  fadI   NP_416844.1   16130275   大肠杆菌
  fadJ   NP_416843.1   16130274   大肠杆菌
  基因   GenBank ID   GI编号   有机体
  fadR   NP_415705.1   16129150   大肠杆菌
甲基丙烯酰-CoA水解酶
甲基丙烯酰-CoA转化为MAA由CoA转移酶，合成酶或者水解酶催化。描述为丙酰-CoA水解酶，甲基丙二酰-CoA水解酶，乙酰乙酰-CoA水解酶，3-羟基丁酰-CoA水解酶和3-羟基异丁酰-CoA水解酶的CoA水解酶候选基因也适用于此。
甲基丙烯酰-CoA转移酶
甲基丙烯酰-CoA转化为MAA由CoA转移酶，合成酶或者水解酶催化。描述为丙酰-CoA转移酶，甲基丙二酰-CoA转移酶，乙酰乙酰-CoA转移酶，3-羟基丁酰-CoA转移酶，3-羟基异丁酰-CoA转移酶，4-羟基丁酰-CoA转移酶和琥珀酰-CoA转移酶的CoA转移酶候选基因在这里是适用的。
甲基丙烯酰-CoA合成酶
甲基丙烯酰-CoA转化为MAA由CoA转移酶，合成酶或者水解酶催化。描述为丙酰-CoA合成酶，甲基丙二酰-CoA合成酶，乙酰乙酰-CoA合成酶，3-羟基丁酰-CoA合成酶，3-羟基异丁酰-CoA合成酶，4-羟基丁酰-CoA合成酶和琥珀酰-CoA合成酶的CoA合成酶候选基因适用于此。
甲基丙二酰-CoA水解酶
甲基丙二酰-CoA由甲基丙二酰-CoA水解酶（EC 3.1.2.17）转化为甲基丙二酸。此酶分离自褐鼠肝脏，对作为替代底物的丙二酰-CoA和丙酰-CoA也有效（Kovachy等，J.Biol.Chem.，258:11415-11421(1983)）。与此酶相关的基因还不清楚。如前面部分所述的丙酰-CoA水解酶，甲基丙烯酰-CoA水解酶，乙酰乙酰-CoA水解酶，3-羟基丁酰-CoA水解酶和3-羟基异丁酰-CoA水解酶的其它CoA水解酶候选酶适用于此。
甲基丙二酰-CoA转移酶
可替代地，甲基丙二酰-CoA由CoA转移酶转化为甲基丙二酸。描述为丙酰-CoA转移酶，甲基丙烯酰-CoA转移酶，乙酰乙酰-CoA转移酶，3-羟基丁酰-CoA转移酶，3-羟基异丁酰-CoA转移酶，4-羟基丁酰-CoA转移酶和琥珀酰-CoA转移酶的CoA转移酶的候选基因也适用于此。
甲基丙二酰-CoA合成酶
从甲基丙二酰-CoA形成甲基丙二酸的另一种酶是甲基丙二酰-CoA合成酶。描述为丙酰-CoA合成酶，甲基丙烯酰-CoA合成酶，乙酰乙酰-CoA合成酶，3-羟基丁酰-CoA合成酶，3-羟基异丁酰-CoA合成酶，4-羟基丁酰-CoA合成酶和琥珀酰-CoA合成酶的CoA合成酶的候选基因适用于此。
甲基丙二酸还原酶
将甲基丙二酸还原为甲基丙二酸半醛由羧酸还原酶催化。琥珀酸还原酶和4-羟基丁酸还原酶的示例性候选酶也适用于此。
本申请通篇已引用了各种公开文献。这些公开文献的公开内容（包括GenBank和GI登录号公开的内容)整体并入到本申请中作为参考，以便更充分地描述本发明所属技术领域的状态。虽然已经参考上面提供的实施例描述了本发明，但应理解在不背离本发明精神的情况下可进行各种修改。

Claims (91)

1.一种非天然存在的微生物有机体，包括具有正丙醇途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的正丙醇途径包括至少一种编码正丙醇途径酶并以足以产生正丙醇的量表达的外源性核酸，所述的正丙醇途径包括：
丙醇脱氢酶，丙醛脱氢酶，丙酰-CoA:磷酸丙酰基转移酶，丙酰-CoA水解酶，丙酰-CoA转移酶，丙酰-CoA合成酶，丙酸激酶，丙酸还原酶或丙酰磷酸还原酶，
所述的异丙醇途径，包括至少一种编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的外源性核酸，所述的异丙醇途径包括：
异丙醇脱氢酶，乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰-CoA转移酶，乙酰-CoA水解酶，乙酰-CoA合成酶，或者乙酰乙酸脱羧酶。
2.权利要求1的非天然存在的微生物有机体，其进一步包括乙酰-CoA途径，乙酰-CoA途径包括至少一种编码乙酰-CoA途径酶并以足以产生乙酰-CoA的量表达的外源性核酸，所述的乙酰-CoA途径包括：
丙酮酸激酶，丙酮酸脱氢酶，丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶，丙酮酸甲酸裂解酶，丙酮酸甲酸裂解酶激活酶，或甲酸脱氢酶。
3.权利要求1的非天然存在的微生物有机体，还包括丙酰-CoA途径，其包括至少一种编码丙酰-CoA途径酶并以足以产生丙酰-CoA的量表达的外源性核酸，所述的丙酰-CoA途径包括：
PEP羧激酶，PEP羧化酶，苹果酸脱氢酶，延胡索酸酶，延胡索酸还原酶，琥珀酰-CoA转移酶，琥珀酰-CoA合成酶，甲基丙二酰-CoA变位酶，甲基丙二酰-CoA差向异构酶或者甲基丙二酰-CoA脱羧酶。
4.权利要求3的非天然存在的微生物有机体，其中所述的丙酰-CoA途径还包括丙酮酸羧化酶或者甲基丙二酰-CoA羧基转移酶。
5.权利要求1的非天然存在的微生物有机体，还包括丙酰-CoA途径，其包括至少一种编码丙酰-CoA途径酶并以足以产生丙酰-CoA的量表达的外源性核酸，所述的丙酰-CoA途径包括：
PEP羧激酶，PEP羧化酶，苏氨酸脱氨酶或者2-氧代丁酸脱氢酶。
6.权利要求5的非天然存在的微生物有机体，其中所述的正丙醇途径还包括2-氧代丁酸脱羧酶。
7.权利要求1的非天然存在的微生物有机体，还包括丙酰-CoA途径，其包括至少一种编码丙酰-CoA途径酶并以足以产生丙酰-CoA的量表达的外源性核酸，所述的丙酰-CoA途径包括：
乙酰-CoA羧化酶，丙二酰-CoA还原酶，丙二酸半醛还原酶或者丙酰-CoA合成酶。
8.权利要求1的非天然存在的微生物有机体，还包括丙酰-CoA途径，其包括至少一种编码丙酰-CoA途径酶并以足以产生丙酰-CoA的量表达的外源性核酸，所述的丙酰-CoA途径包括：
乳酸脱氢酶，乳酰-CoA转移酶，乳酰-CoA脱水酶或者丙烯酰-CoA还原酶。
9.一种非天然存在的微生物有机体，包括具有正丙醇途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的正丙醇途径包括编码正丙醇途径酶并以足以产生正丙醇的量表达的第一组外源性核酸，所述的第一组外源性核酸编码：
丙醛脱氢酶和丙醇脱氢酶；或者
丙酰-CoA:磷酸丙酰基转移酶，丙酰磷酸还原酶和丙醇脱氢酶；或者
丙酰-CoA水解酶或者丙酰-CoA转移酶或者丙酰-CoA合成酶，丙酸激酶，丙酰磷酸还原酶和丙醇脱氢酶；或者
丙酰-CoA水解酶或者丙酰-CoA转移酶或者丙酰-CoA合成酶，丙酸还原酶和丙醇脱氢酶，
所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，所述的第二组外源性核酸编码：
乙酰-CoA乙酰基硫解酶；乙酰乙酰-CoA转移酶，乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶；乙酰乙酸脱羧酶；和异丙醇脱氢酶。
10.权利要求9的非天然存在的微生物有机体，还包括乙酰-CoA途径，其包括编码乙酰-CoA途径酶并以足以产生乙酰-CoA的量表达的第三组外源性核酸，所述的第三组外源性核酸编码：
丙酮酸激酶，以及丙酮酸脱氢酶或者丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶；或者丙酮酸甲酸裂解酶，丙酮酸甲酸裂解酶激活酶和甲酸脱氢酶。
11.权利要求9的非天然存在的微生物有机体，还包括丙酰-CoA途径，其包括编码丙酰-CoA途径酶并以足以产生丙酰-CoA的量表达的第三组外源性核酸，所述的第三组外源性核酸编码：
PEP羧激酶或者PEP羧化酶，苹果酸脱氢酶，延胡索酸酶，延胡索酸还原酶，琥珀酰-CoA转移酶或者琥珀酰-CoA合成酶，甲基丙二酰-CoA变位酶，以及甲基丙二酰-CoA脱羧酶。
12.权利要求11的非天然存在的微生物有机体，其中所述的第三组外源性核酸还编码甲基丙二酰-CoA差向异构酶，丙酮酸羧化酶或者甲基丙二酰-CoA羧基转移酶。
13.权利要求9的非天然存在的微生物有机体，还包括丙酰-CoA途径，其包括编码丙酰-CoA途径酶并以足以产生丙酰-CoA的量表达的第三组外源性核酸，所述的第三组外源性核酸编码：
PEP羧激酶或者PEP羧化酶，苏氨酸脱氨酶，以及2-氧代丁酸脱氢酶。
14.权利要求13的非天然存在的微生物有机体，其中所述的第三组外源性核酸还编码甲基丙二酰-CoA羧基转移酶或者丙酮酸羧化酶。
15.权利要求13的非天然存在的微生物有机体，其中所述的第二组外源性核酸还编码2-氧代丁酸脱羧酶。
16.权利要求9的非天然存在的微生物有机体，还包括丙酰-CoA途径，其包括编码丙酰-CoA途径酶并以足以产生丙酰-CoA的量表达的第三组外源性核酸，所述的第三组外源性核酸编码：
乙酰-CoA羧化酶，丙二酰-CoA还原酶，丙二酸半醛还原酶，以及丙酰-CoA合成酶。
17.权利要求9的非天然存在的微生物有机体，还包括丙酰-CoA途径，其包括编码丙酰-CoA途径酶并以足以产生丙酰-CoA的量表达的第三组外源性核酸，所述的第三组外源性核酸编码：
乳酸脱氢酶，乳酰-CoA转移酶，乳酰-CoA脱水酶，以及丙烯酰-CoA还原酶。
18.一种非天然存在的微生物有机体，包括具有正丙醇途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的正丙醇途径包括编码正丙醇途径酶并以足以产生正丙醇的量表达的第一组外源性核酸，所述的第一组外源性核酸编码：
PEP羧激酶或者PEP羧化酶；苹果酸脱氢酶；延胡索酸酶；延胡索酸还原酶；琥珀酰-CoA转移酶或者琥珀酰-CoA合成酶；甲基丙二酰-CoA变位酶；甲基丙二酰-CoA脱羧酶；以及丙醛脱氢酶和丙醇脱氢酶；或者丙酰-CoA:磷酸丙酰基转移酶和丙酰磷酸还原酶；或者丙酰-CoA水解酶或者丙酰-CoA转移酶或者丙酰-CoA合成酶，丙酸激酶，丙酰磷酸还原酶和丙醇脱氢酶；或者丙酰-CoA水解酶或者丙酰-CoA转移酶或者丙酰-CoA合成酶，丙酸还原酶和丙醇脱氢酶，
所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，所述的第二组外源性核酸编码：
丙酮酸激酶；丙酮酸脱氢酶或者丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶；或者丙酮酸甲酸裂解酶，丙酮酸甲酸裂解酶激活酶和甲酸脱氢酶，乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶，乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶；和异丙醇脱氢酶。
19.权利要求18的非天然存在的微生物有机体，其中所述的第一组外源性核酸还编码甲基丙二酰-CoA差向异构酶，丙酮酸羧化酶或者甲基丙二酰-CoA羧基转移酶。
20.一种非天然存在的微生物有机体，包括具有正丙醇途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的正丙醇途径包括编码正丙醇途径酶并以足以产生正丙醇的量表达的第一组外源性核酸，所述的第一组外源性核酸编码：
PEP羧激酶或者PEP羧化酶；苏氨酸脱氨酶；以及2-氧代丁酸脱羧酶和丙醇脱氢酶；或者2-氧代丁酸脱氢酶，丙醛脱氢酶和丙醇脱氢酶；或者2-氧代丁酸脱氢酶，丙酰-CoA:磷酸丙酰基转移酶，丙酰磷酸还原酶和丙醇脱氢酶；或者2-氧代丁酸脱氢酶，丙酰-CoA水解酶或者丙酰-CoA转移酶或者丙酰-CoA合成酶，丙酸激酶，丙酰磷酸还原酶和丙醇脱氢酶；或者2-氧代丁酸脱氢酶，丙酰-CoA水解酶或者丙酰-CoA转移酶或者丙酰-CoA合成酶，丙酸还原酶和丙醇脱氢酶，
所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，所述的第二组外源性核酸编码：
丙酮酸激酶；丙酮酸脱氢酶或者丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶；或者丙酮酸甲酸裂解酶，丙酮酸甲酸裂解酶激活酶和甲酸脱氢酶；乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶，乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶；乙酰乙酸脱羧酶；和异丙醇脱氢酶。
21.权利要求20的非天然存在的微生物有机体，其中所述的第二组外源性核酸还编码甲基丙二酰-CoA脱羧酶或者丙酮酸羧化酶。
22.一种非天然存在的微生物有机体，包括具有正丙醇途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的正丙醇途径包括编码正丙醇途径酶并以足以产生正丙醇的量表达的第一组外源性核酸，所述的第一组外源性核酸编码：
丙酮酸激酶；丙酮酸脱氢酶或者丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶；或者丙酮酸甲酸裂解酶，丙酮酸甲酸裂解酶激活酶和甲酸脱氢酶；乙酰-CoA羧化酶；丙二酰-CoA还原酶；丙二酸半醛还原酶；丙酰-CoA合成酶；以及丙醛脱氢酶和丙醇脱氢酶；或者丙酰-CoA:磷酸丙酰基转移酶，丙酰磷酸还原酶和丙醇脱氢酶；或者丙酰-CoA水解酶或者丙酰-CoA转移酶或者丙酰-CoA合成酶，丙酸激酶，丙酰磷酸还原酶和丙醇脱氢酶；或者丙酰-CoA水解酶或者丙酰-CoA转移酶或者丙酰-CoA合成酶，丙酸还原酶和丙醇脱氢酶，
所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，所述的第二组外源性核酸编码：
乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶，乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
23.一种非天然存在的微生物有机体，包括具有正丙醇途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的正丙醇途径包括编码正丙醇途径酶并以足以产生正丙醇的量表达的第一组外源性核酸，所述的第一组外源性核酸编码：
乳酸脱氢酶；乳酰-CoA转移酶；乳酰-CoA脱水酶；丙烯酰-CoA还原酶；以及丙醛脱氢酶和丙醇脱氢酶；或者丙酰-CoA:磷酸丙酰基转移酶，丙酰磷酸还原酶和丙醇脱氢酶；或者丙酰-CoA水解酶或者丙酰-CoA转移酶或者丙酰-CoA合成酶，丙酸激酶，丙酰磷酸还原酶和丙醇脱氢酶；或者丙酰-CoA水解酶或者丙酰-CoA转移酶或者丙酰-CoA合成酶，丙酸还原酶和丙醇脱氢酶，
所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，所述的第二组外源性核酸编码：
丙酮酸脱氢酶或者丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶；或者丙酮酸甲酸裂解酶，丙酮酸甲酸裂解酶激活酶和甲酸脱氢酶；乙酰-CoA乙酰基硫解酶；乙酰乙酰-CoA转移酶，乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶；乙酰乙酸脱羧酶；和异丙醇脱氢酶。
24.权利要求1-23中任一项的非天然存在的微生物有机体，其中所述的外源性核酸是异源核酸。
25.权利要求1-23中任一项的非天然存在的微生物有机体，其中所述的非天然存在的微生物有机体在基本上厌氧的培养基中。
26.一种生产正丙醇和异丙醇的方法，包括在一定条件下培养权利要求1-23中任一项的非天然存在的微生物有机体足够的时间，以生产正丙醇和异丙醇。
27.权利要求26所述的方法，其中所述的条件包括基本上厌氧的培养条件。
28.权利要求26所述的方法，其中所述的外源性核酸是异源核酸。
29.一种非天然存在的微生物有机体，包括具有正丙醇途径的微生物有机体，所述的正丙醇途径包括至少一种编码正丙醇途径酶并以足以产生正丙醇的量表达的外源性核酸，所述的正丙醇途径包括：
丙醇脱氢酶，丙醛脱氢酶，丙酰-CoA:磷酸丙酰基转移酶，丙酰-CoA水解酶，丙酰-CoA转移酶，丙酰-CoA合成酶，丙酸激酶，丙酸还原酶或者丙酰磷酸还原酶。
30.一种非天然存在的微生物有机体，包括具有正丙醇途径的微生物有机体，所述的正丙醇途径包括一组编码正丙醇途径酶并以足以产生正丙醇的量表达的外源性核酸，所述的一组外源性核酸编码：
丙醛脱氢酶和丙醇脱氢酶；或者丙酰-CoA:磷酸丙酰基转移酶，丙酰磷酸还原酶和丙醇脱氢酶；或者丙酰-CoA水解酶或者丙酰-CoA转移酶或者丙酰-CoA合成酶，丙酸激酶，丙酰磷酸还原酶和丙醇脱氢酶；或者丙酰-CoA水解酶或者丙酰-CoA转移酶或者丙酰-CoA合成酶，丙酸还原酶和丙醇脱氢酶。
31.权利要求29或30的非天然存在的微生物有机体，其中所述的外源性核酸是异源核酸。
32.权利要求29或30的非天然存在的微生物有机体，其中所述的非天然存在的微生物有机体在基本上厌氧的培养基中。
33.一种生产正丙醇的方法，包括在一定条件下培养权利要求29或30的非天然存在的微生物有机体足够的时间，以生产正丙醇。
34.权利要求33所述的方法，其中所述的条件包括基本上厌氧的培养条件。
35.权利要求33所述的方法，其中所述的外源性核酸是异源核酸。
36.一种非天然存在的微生物有机体，包括具有1,4-丁二醇途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的1,4-丁二醇途径包括至少一种编码1,4-丁二醇途径酶并以足以产生1,4-丁二醇的量表达的外源性核酸，所述的1,4-丁二醇途径包括：
4-羟基丁醛还原酶，琥珀酰-CoA还原酶，琥珀酸还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酰-CoA转移酶，4-羟基丁酰-CoA合成酶，4-羟基丁酰-CoA还原酶（形成醛），4-羟基丁酰磷酸还原酶，4-羟基丁酸还原酶；4-羟基丁酸激酶，磷酸转-4-羟基丁酸化酶，或者4-羟基丁酰-CoA还原酶（形成醇）；
所述的异丙醇途径包括至少一种编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的外源性核酸，所述的异丙醇途径包括：
异丙醇脱氢酶，乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶，乙酰乙酰-CoA水解酶，乙酰乙酰-CoA合成酶或者乙酰乙酸脱羧酶。
37.一种非天然存在的微生物有机体，包括具有1,3-丁二醇途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的1,3-丁二醇途径包括至少一种编码1,3-丁二醇途径酶并以足以产生1,3-丁二醇的量表达的外源性核酸，所述的1,3-丁二醇途径包括：
3-羟基丁醛还原酶，琥珀酰-CoA还原酶，琥珀酸还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酰-CoA转移酶，4-羟基丁酰-CoA合成酶，4-羟基丁酸激酶，磷酸转-4-羟基丁酸化酶，4-羟基丁酰-CoA脱水酶，巴豆酸酶，3-羟基丁酰-CoA转移酶，3-羟基丁酰-CoA合成酶，3-羟基丁酰-CoA水解酶，3-羟基丁酸还原酶，3-羟基丁酰-CoA还原酶（形成醛)，或者3-羟基丁酰-CoA还原酶（形成醇）；
所述的异丙醇途径包括至少一种编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的外源性核酸，所述的异丙醇途径包括：
异丙醇脱氢酶，乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶，乙酰乙酰-CoA水解酶，乙酰乙酰-CoA合成酶或者乙酰乙酸脱羧酶。
38.一种非天然存在的微生物有机体，包括具有甲基丙烯酸途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的甲基丙烯酸途径包括至少一种编码甲基丙烯酸途径酶并以足以产生甲基丙烯酸的量表达的外源性核酸，所述的甲基丙烯酸途径包括：
4-羟基丁酰-CoA变位酶，琥珀酰-CoA还原酶，琥珀酸还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酰-CoA转移酶，4-羟基丁酰-CoA合成酶，4-羟基丁酸激酶，磷酸转-4-羟基丁酸化酶，3-羟基异丁酰-CoA脱水酶，甲基丙烯酰-CoA转移酶，甲基丙烯酰-CoA合成酶，甲基丙烯酰-CoA水解酶，3-羟基异丁酰-CoA转移酶，3-羟基异丁酰-CoA合成酶，3-羟基异丁酰-CoA水解酶，3-羟基异丁酸脱水酶，甲基丙二酰-CoA变位酶，甲基丙二酰-CoA差向异构酶，甲基丙二酰-CoA转移酶，甲基丙二酰-CoA合成酶，甲基丙二酰-CoA水解酶，甲基丙二酸还原酶，甲基丙二酰-CoA还原酶（形成醛)，3-羟基异丁酸脱氢酶，甲基丙二酰-CoA还原酶（形成醇）或者3-羟基异丁酸脱水酶；
所述的异丙醇途径包括至少一种编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的外源性核酸，所述的异丙醇途径包括：
异丙醇脱氢酶，乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶，乙酰乙酰-CoA水解酶，乙酰乙酰-CoA合成酶或者乙酰乙酸脱羧酶。
39.权利要求36-38中任一项的非天然存在的微生物有机体，还包括乙酰-CoA途径，其包括至少一种编码乙酰-CoA途径酶并以足以产生乙酰-CoA的量表达的外源性核酸，所述的乙酰-CoA途径包括：
丙酮酸激酶，丙酮酸脱氢酶，丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶，丙酮酸甲酸裂解酶，丙酮酸甲酸裂解酶激活酶或者甲酸脱氢酶。
40.权利要求36-38中任一项的非天然存在的微生物有机体，还包括琥珀酰-CoA途径，其包括至少一种编码琥珀酰-CoA途径酶并以足以产生琥珀酰-CoA的量表达的外源性核酸，所述的琥珀酰-CoA途径包括：
PEP羧激酶，PEP羧化酶，苹果酸脱氢酶，延胡索酸酶，延胡索酸还原酶，琥珀酰-CoA转移酶或者琥珀酰-CoA合成酶。
41.权利要求40的非天然存在的微生物有机体，其中所述的琥珀酰-CoA途径还包括丙酮酸羧化酶或者甲基丙二酰-CoA羧基转移酶。
42.一种非天然存在的微生物有机体，包括具有1,4-丁二醇途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的1,4-丁二醇途径包括编码1,4-丁二醇途径酶并以足以产生1,4-丁二醇的量表达的第一组外源性核酸，所述的第一组外源性核酸编码：
琥珀酰-CoA还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酰-CoA转移酶或者4-羟基丁酰-CoA合成酶，4-羟基丁酰-CoA还原酶（形成醛)，以及4-羟基丁醛还原酶，
所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，所述的第二组外源性核酸编码：
乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
43.一种非天然存在的微生物有机体，包括具有1,4-丁二醇途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的1,4-丁二醇途径包括编码1,4-丁二醇途径酶并以足以产生1,4-丁二醇的量表达的第一组外源性核酸，所述的第一组外源性核酸编码：
琥珀酰-CoA还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酸还原酶，以及4-羟基丁醛还原酶，
所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，所述的第二组外源性核酸编码：
乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
44.一种非天然存在的微生物有机体，包括具有1,4-丁二醇途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的1,4-丁二醇途径包括编码1,4-丁二醇途径酶并以足以产生1,4-丁二醇的量表达的第一组外源性核酸，所述的第一组外源性核酸编码：
琥珀酰-CoA还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酸激酶，磷酸转-4-羟基丁酸化酶，4-羟基丁酰-CoA还原酶（形成醛)，以及4-羟基丁醛还原酶，
所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，所述的第二组外源性核酸编码：
乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
45.一种非天然存在的微生物有机体，包括具有1,4-丁二醇途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的1,4-丁二醇途径包括编码1,4-丁二醇途径酶并以足以产生1,4-丁二醇的量表达的第一组外源性核酸，所述的第一组外源性核酸编码：
琥珀酰-CoA还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酸激酶，4-羟基丁酰磷酸还原酶，以及4-羟基丁醛还原酶，
所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，所述的第二组外源性核酸编码：
乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
46.一种非天然存在的微生物有机体，包括具有1,4-丁二醇途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的1,4-丁二醇途径包括编码1,4-丁二醇途径酶并以足以产生1,4-丁二醇的量表达的第一组外源性核酸，所述的第一组外源性核酸编码：
琥珀酰-CoA还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酸激酶，磷酸转-4-羟基丁酸化酶，以及4-羟基丁酰-CoA还原酶（形成醇），
所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，所述的第二组外源性核酸编码：
乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
47.一种非天然存在的微生物有机体，包括具有1,4-丁二醇途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的1,4-丁二醇途径包括编码1,4-丁二醇途径酶并以足以产生1,4-丁二醇的量表达的第一组外源性核酸，所述的第一组外源性核酸编码：
琥珀酰-CoA还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酰-CoA转移酶或者4-羟基丁酰-CoA合成酶，以及4-羟基丁酰-CoA还原酶（形成醇），
所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，所述的第二组外源性核酸编码：
乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
48.一种非天然存在的微生物有机体，包括具有1,4-丁二醇途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的1,4-丁二醇途径包括编码1,4-丁二醇途径酶并以足以产生1,4-丁二醇的量表达的第一组外源性核酸，所述的第一组外源性核酸编码：
琥珀酸还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酰-CoA转移酶或者4-羟基丁酰-CoA合成酶，4-羟基丁酰-CoA还原酶（形成醛)，以及4-羟基丁醛还原酶，
所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，所述的第二组外源性核酸编码：
乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
49.一种非天然存在的微生物有机体，包括具有1,4-丁二醇途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的1,4-丁二醇途径包括编码1,4-丁二醇途径酶并以足以产生1,4-丁二醇的量表达的第一组外源性核酸，所述的第一组外源性核酸编码：
琥珀酸还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酸还原酶，以及4-羟基丁醛还原酶，
所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，所述的第二组外源性核酸编码：
乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
50.一种非天然存在的微生物有机体，包括具有1,4-丁二醇途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的1,4-丁二醇途径包括编码1,4-丁二醇途径酶并以足以产生1,4-丁二醇的量表达的第一组外源性核酸，所述的第一组外源性核酸编码：
琥珀酸还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酸激酶，磷酸转-4-羟基丁酸化酶，4-羟基丁酰-CoA还原酶（形成醛)，以及4-羟基丁醛还原酶，
所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，所述的第二组外源性核酸编码：
乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
51.一种非天然存在的微生物有机体，包括具有1,4-丁二醇途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的1,4-丁二醇途径包括编码1,4-丁二醇途径酶并以足以产生1,4-丁二醇的量表达的第一组外源性核酸，所述的第一组外源性核酸编码：
琥珀酸还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酸激酶，4-羟基丁酰磷酸还原酶，以及4-羟基丁醛还原酶，
所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，所述的第二组外源性核酸编码：
乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
52.一种非天然存在的微生物有机体，包括具有1,4-丁二醇途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的1,4-丁二醇途径包括编码1,4-丁二醇途径酶并以足以产生1,4-丁二醇的量表达的第一组外源性核酸，所述的第一组外源性核酸编码：
琥珀酸还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酸激酶，磷酸转-4-羟基丁酸化酶，以及4-羟基丁酰-CoA还原酶（形成醇），
所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，所述的第二组外源性核酸编码：
乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
53.一种非天然存在的微生物有机体，包括具有1,4-丁二醇途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的1,4-丁二醇途径包括编码1,4-丁二醇途径酶并以足以产生1,4-丁二醇的量表达的第一组外源性核酸，所述的第一组外源性核酸编码：
琥珀酸还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酰-CoA转移酶或者4-羟基丁酰-CoA合成酶，以及4-羟基丁酰-CoA还原酶（形成醇），
所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，所述的第二组外源性核酸编码：
乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
54.一种非天然存在的微生物有机体，包括具有1,3-丁二醇途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的1,3-丁二醇途径包括编码1,3-丁二醇途径酶并以足以产生1,3-丁二醇的量表达的第一组外源性核酸，所述的第一组外源性核酸编码：
琥珀酰-CoA还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酰-CoA转移酶或者4-羟基丁酰-CoA合成酶，4-羟基丁酰-CoA脱水酶，巴豆酸酶，3-羟基丁酰-CoA还原酶（形成醛)，和3-羟基丁醛还原酶，
所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，所述的第二组外源性核酸编码：
乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
55.一种非天然存在的微生物有机体，包括具有1,3-丁二醇途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的1,3-丁二醇途径包括编码1,3-丁二醇途径酶并以足以产生1,3-丁二醇的量表达的第一组外源性核酸，所述的第一组外源性核酸编码：
琥珀酰-CoA还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酰-CoA转移酶或者4-羟基丁酰-CoA合成酶，4-羟基丁酰-CoA脱水酶，巴豆酸酶，3-羟基丁酰-CoA转移酶或者3-羟基丁酰-CoA合成酶或者3-羟基丁酰-CoA水解酶，3-羟基丁酸还原酶，和3-羟基丁醛还原酶，
所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，所述的第二组外源性核酸编码：
乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
56.一种非天然存在的微生物有机体，包括具有1,3-丁二醇途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的1,3-丁二醇途径包括编码1,3-丁二醇途径酶并以足以产生1,3-丁二醇的量表达的第一组外源性核酸，所述的第一组外源性核酸编码：
琥珀酰-CoA还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酸激酶，磷酸转-4-羟基丁酸化酶，4-羟基丁酰-CoA脱水酶，巴豆酸酶，3-羟基丁酰-CoA还原酶（形成醛)，和3-羟基丁醛还原酶，
所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，所述的第二组外源性核酸编码：
乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
57.一种非天然存在的微生物有机体，包括具有1,3-丁二醇途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的1,3-丁二醇途径包括编码1,3-丁二醇途径酶并以足以产生1,3-丁二醇的量表达的第一组外源性核酸，所述的第一组外源性核酸编码：
琥珀酰-CoA还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酸激酶，磷酸转-4-羟基丁酸化酶，4-羟基丁酰-CoA脱水酶，巴豆酸酶，3-羟基丁酰-CoA转移酶或者3-羟基丁酰-CoA合成酶或者3-羟基丁酰-CoA水解酶，3-羟基丁酸还原酶，和3-羟基丁醛还原酶，
所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，所述的第二组外源性核酸编码：
乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
58.一种非天然存在的微生物有机体，包括具有1,3-丁二醇途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的1,3-丁二醇途径包括编码1,3-丁二醇途径酶并以足以产生1,3-丁二醇的量表达的第一组外源性核酸，所述的第一组外源性核酸编码：
琥珀酰-CoA还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酸激酶，磷酸转-4-羟基丁酸化酶，4-羟基丁酰-CoA脱水酶，巴豆酸酶，和3-羟基丁酰-CoA还原酶（形成醇），
所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，所述的第二组外源性核酸编码：
乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
59.一种非天然存在的微生物有机体，包括具有1,3-丁二醇途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的1,3-丁二醇途径包括编码1,3-丁二醇途径酶并以足以产生1,3-丁二醇的量表达的第一组外源性核酸，所述的第一组外源性核酸编码：
琥珀酰-CoA还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酰-CoA转移酶或者4-羟基丁酰-CoA合成酶，4-羟基丁酰-CoA脱水酶，巴豆酸酶，和3-羟基丁酰-CoA还原酶（形成醇），
所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，所述的第二组外源性核酸编码：
乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
60.一种非天然存在的微生物有机体，包括具有1,3-丁二醇途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的1,3-丁二醇途径包括编码1,3-丁二醇途径酶并以足以产生1,3-丁二醇的量表达的第一组外源性核酸，所述的第一组外源性核酸编码：
琥珀酸还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酰-CoA转移酶或者4-羟基丁酰-CoA合成酶，4-羟基丁酰-CoA脱水酶，巴豆酸酶，3-羟基丁酰-CoA还原酶（形成醛)，和3-羟基丁醛还原酶，
所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，所述的第二组外源性核酸编码：
乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
61.一种非天然存在的微生物有机体，包括具有1,3-丁二醇途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的1,3-丁二醇途径包括编码1,3-丁二醇途径酶并以足以产生1,3-丁二醇的量表达的第一组外源性核酸，所述的第一组外源性核酸编码：
琥珀酸还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酰-CoA转移酶或者4-羟基丁酰-CoA合成酶，4-羟基丁酰-CoA脱水酶，巴豆酸酶，3-羟基丁酰-CoA转移酶或者3-羟基丁酰-CoA合成酶或者3-羟基丁酰-CoA水解酶，3-羟基丁酸还原酶，和3-羟基丁醛还原酶，
所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，所述的第二组外源性核酸编码：
乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
62.一种非天然存在的微生物有机体，包括具有1,3-丁二醇途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的1,3-丁二醇途径包括编码1,3-丁二醇途径酶并以足以产生1,3-丁二醇的量表达的第一组外源性核酸，所述的第一组外源性核酸编码：
琥珀酸还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酸激酶，磷酸转-4-羟基丁酸化酶，4-羟基丁酰-CoA脱水酶，巴豆酸酶，3-羟基丁酰-CoA还原酶（形成醛)，和3-羟基丁醛还原酶，
所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，所述的第二组外源性核酸编码：
乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
63.一种非天然存在的微生物有机体，包括具有1,3-丁二醇途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的1,3-丁二醇途径包括编码1,3-丁二醇途径酶并以足以产生1,3-丁二醇的量表达的第一组外源性核酸，所述的第一组外源性核酸编码：
琥珀酸还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酸激酶，磷酸转-4-羟基丁酸化酶，4-羟基丁酰-CoA脱水酶，巴豆酸酶，3-羟基丁酰-CoA转移酶或者3-羟基丁酰-CoA合成酶或者3-羟基丁酰-CoA水解酶，3-羟基丁酸还原酶，和3-羟基丁醛还原酶，
所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，所述的第二组外源性核酸编码：
乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
64.一种非天然存在的微生物有机体，包括具有1,3-丁二醇途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的1,3-丁二醇途径包括编码1,3-丁二醇途径酶并以足以产生1,3-丁二醇的量表达的第一组外源性核酸，所述的第一组外源性核酸编码：
琥珀酸还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酸激酶，磷酸转-4-羟基丁酸化酶，巴豆酸酶，和3-羟基丁酰-CoA还原酶（形成醇），
所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，所述的第二组外源性核酸编码：
乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
65.一种非天然存在的微生物有机体，包括具有1,3-丁二醇途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的1,3-丁二醇途径包括编码1,3-丁二醇途径酶并以足以产生1,3-丁二醇的量表达的第一组外源性核酸，所述的第一组外源性核酸编码：
琥珀酸还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，4-羟基丁酰-CoA转移酶或者4-羟基丁酰-CoA合成酶，4-羟基丁酰-CoA脱水酶，巴豆酸酶，和3-羟基丁酰-CoA还原酶（形成醇），
所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，所述的第二组外源性核酸编码：
乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
66.一种非天然存在的微生物有机体，包括具有甲基丙烯酸途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的甲基丙烯酸途径包括编码甲基丙烯酸途径酶并以足以产生甲基丙烯酸的量表达的第一组外源性核酸，所述的第一组外源性核酸编码：
琥珀酰-CoA还原酶；4-羟基丁酸脱氢酶；4-羟基丁酰-CoA转移酶或者4-羟基丁酰-CoA合成酶；4-羟基丁酰-CoA变位酶；3-羟基异丁酰-CoA转移酶，3-羟基异丁酰-CoA合成酶或者3-羟基异丁酰-CoA水解酶；和3-羟基异丁酸脱水酶，
所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，所述的第二组外源性核酸编码：乙酰-CoA乙酰基硫解酶；
乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
67.一种非天然存在的微生物有机体，包括具有甲基丙烯酸途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的甲基丙烯酸途径包括编码甲基丙烯酸途径酶并以足以产生甲基丙烯酸的量表达的第一组外源性核酸，所述的第一组外源性核酸编码：
琥珀酰-CoA还原酶；4-羟基丁酸脱氢酶；4-羟基丁酰-CoA转移酶或者4-羟基丁酰-CoA合成酶；4-羟基丁酰-CoA变位酶；3-羟基异丁酰-CoA脱水酶；以及甲基丙烯酰-CoA转移酶，甲基丙烯酰-CoA合成酶或者甲基丙烯酰-CoA水解酶，
所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，所述的第二组外源性核酸编码：
乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
68.一种非天然存在的微生物有机体，包括具有甲基丙烯酸途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的甲基丙烯酸途径包括编码甲基丙烯酸途径酶并以足以产生甲基丙烯酸的量表达的第一组外源性核酸，所述的第一组外源性核酸编码：
琥珀酰-CoA还原酶；4-羟基丁酸脱氢酶；4-羟基丁酸激酶；磷酸转-4-羟基丁酸化酶；4-羟基丁酰-CoA变位酶；3-羟基异丁酰-CoA转移酶，3-羟基异丁酰-CoA合成酶或者3-羟基异丁酰-CoA水解酶；和3-羟基异丁酸脱水酶，
所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，所述的第二组外源性核酸编码：
乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
69.一种非天然存在的微生物有机体，包括具有甲基丙烯酸途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的甲基丙烯酸途径包括编码甲基丙烯酸途径酶并以足以产生甲基丙烯酸的量表达的第一组外源性核酸，所述的第一组外源性核酸编码：
琥珀酰-CoA还原酶；4-羟基丁酸脱氢酶；4-羟基丁酸激酶；磷酸转-4-羟基丁酸化酶；4-羟基丁酰-CoA变位酶；3-羟基异丁酰-CoA脱水酶；以及甲基丙烯酰-CoA转移酶，甲基丙烯酰-CoA合成酶或者甲基丙烯酰-CoA水解酶，
所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，所述的第二组外源性核酸编码：
乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
70.一种非天然存在的微生物有机体，包括具有甲基丙烯酸途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的甲基丙烯酸途径包括编码甲基丙烯酸途径酶并以足以产生甲基丙烯酸的量表达的第一组外源性核酸，所述的第一组外源性核酸编码：
琥珀酸还原酶；4-羟基丁酸脱氢酶；4-羟基丁酰-CoA转移酶或者4-羟基丁酰-CoA合成酶；4-羟基丁酰-CoA变位酶；3-羟基异丁酰-CoA转移酶，3-羟基异丁酰-CoA合成酶或者3-羟基异丁酰-CoA水解酶；和3-羟基异丁酸脱水酶，
所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，所述的第二组外源性核酸编码：
乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
71.一种非天然存在的微生物有机体，包括具有甲基丙烯酸途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的甲基丙烯酸途径包括编码甲基丙烯酸途径酶并以足以产生甲基丙烯酸的量表达的第一组外源性核酸，所述的第一组外源性核酸编码：
琥珀酸还原酶；4-羟基丁酸脱氢酶；4-羟基丁酰-CoA转移酶或者4-羟基丁酰-CoA合成酶；4-羟基丁酰-CoA变位酶；3-羟基异丁酰-CoA脱水酶；以及甲基丙烯酰-CoA转移酶，甲基丙烯酰-CoA合成酶或者甲基丙烯酰-CoA水解酶，
所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，所述的第二组外源性核酸编码：
乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
72.一种非天然存在的微生物有机体，包括具有甲基丙烯酸途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的甲基丙烯酸途径包括编码甲基丙烯酸途径酶并以足以产生甲基丙烯酸的量表达的第一组外源性核酸，所述的第一组外源性核酸编码：
琥珀酸还原酶；4-羟基丁酸脱氢酶；4-羟基丁酸激酶；磷酸转-4-羟基丁酸化酶；4-羟基丁酰-CoA变位酶；3-羟基异丁酰-CoA转移酶，3-羟基异丁酰-CoA合成酶或者3-羟基异丁酰-CoA水解酶；和3-羟基异丁酸脱水酶，
所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，所述的第二组外源性核酸编码：
乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
73.一种非天然存在的微生物有机体，包括具有甲基丙烯酸途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的甲基丙烯酸途径包括编码甲基丙烯酸途径酶并以足以产生甲基丙烯酸的量表达的第一组外源性核酸，所述的第一组外源性核酸编码：
琥珀酸还原酶；4-羟基丁酸脱氢酶；4-羟基丁酸激酶；磷酸转-4-羟基丁酸化酶；4-羟基丁酰-CoA变位酶；3-羟基异丁酰-CoA脱水酶；以及甲基丙烯酰-CoA转移酶，甲基丙烯酰-CoA合成酶或者甲基丙烯酰-CoA水解酶，
所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，所述的第二组外源性核酸编码：
乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
74.一种非天然存在的微生物有机体，包括具有甲基丙烯酸途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的甲基丙烯酸途径包括编码甲基丙烯酸途径酶并以足以产生甲基丙烯酸的量表达的第一组外源性核酸，所述的第一组外源性核酸编码：
甲基丙二酰-CoA变位酶，甲基丙二酰-CoA还原酶（形成醛)，3-羟基异丁酸脱氢酶，和3-羟基异丁酸脱水酶，
所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，所述的第二组外源性核酸编码：
乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
75.一种非天然存在的微生物有机体，包括具有甲基丙烯酸途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的甲基丙烯酸途径包括编码甲基丙烯酸途径酶并以足以产生甲基丙烯酸的量表达的第一组外源性核酸，所述的第一组外源性核酸编码：
甲基丙二酰-CoA变位酶；甲基丙二酰-CoA差向异构酶；甲基丙二酰-CoA转移酶，甲基丙二酰-CoA合成酶或者甲基丙二酰-CoA水解酶；甲基丙二酸还原酶；3-羟基异丁酸脱氢酶；和3-羟基异丁酸脱水酶，
所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，所述的第二组外源性核酸编码：
乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
76.一种非天然存在的微生物有机体，包括具有甲基丙烯酸途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的甲基丙烯酸途径包括编码甲基丙烯酸途径酶并以足以产生甲基丙烯酸的量表达的第一组外源性核酸，所述的第一组外源性核酸编码：
甲基丙二酰-CoA变位酶；甲基丙二酰-CoA转移酶，甲基丙二酰-CoA合成酶或者甲基丙二酰-CoA水解酶；甲基丙二酸还原酶；3-羟基异丁酸脱氢酶；和3-羟基异丁酸脱水酶，
所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，所述的第二组外源性核酸编码：
乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
77.一种非天然存在的微生物有机体，包括具有甲基丙烯酸途径和异丙醇途径的微生物有机体，所述的甲基丙烯酸途径包括编码甲基丙烯酸途径酶并以足以产生甲基丙烯酸的量表达的第一组外源性核酸，所述的第一组外源性核酸编码：
甲基丙二酰-CoA变位酶，甲基丙二酰-CoA还原酶（形成醇），和3-羟基异丁酸脱水酶，
所述的异丙醇途径包括编码异丙醇途径酶并以足以产生异丙醇的量表达的第二组外源性核酸，所述的第二组外源性核酸编码：
乙酰-CoA乙酰基硫解酶，乙酰乙酰-CoA转移酶或者乙酰乙酰-CoA水解酶或者乙酰乙酰-CoA合成酶，乙酰乙酸脱羧酶，和异丙醇脱氢酶。
78.权利要求42-77中任一项的非天然存在的微生物有机体，还包括乙酰-CoA途径，其包括编码乙酰-CoA途径酶并以足以产生乙酰-CoA的量表达的第三组外源性核酸，所述的第三组外源性核酸编码：
丙酮酸激酶；以及丙酮酸脱氢酶或者丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶；或者丙酮酸甲酸裂解酶，丙酮酸甲酸裂解酶激活酶和甲酸脱氢酶。
79.权利要求42-77中任一项的非天然存在的微生物有机体，还包括琥珀酰-CoA途径，其包括包括编码琥珀酰-CoA途径酶并以足以产生琥珀酰-CoA的量表达的第三组外源性核酸，所述的第三组外源性核酸编码：
PEP羧激酶，PEP羧化酶，苹果酸脱氢酶，延胡索酸酶，延胡索酸还原酶，琥珀酰-CoA转移酶和琥珀酰-CoA合成酶。
80.权利要求79的非天然存在的微生物有机体，其中所述的第三组外源性核酸还编码丙酮酸羧化酶或甲基丙酰-CoA羧基转移酶。
81.权利要求36-38或者42-77中任一项的非天然存在的微生物有机体，其中所述的外源性核酸是异源核酸。
82.权利要求36-38或42-77中任一项的非天然存在的微生物有机体，其中所述的非天然存在的微生物有机体在基本上厌氧的培养基中。
83.一种生产1,4-丁二醇和异丙醇的方法，包括在一定条件下培养权利要求36或42-53中任一项的非天然存在的微生物有机体足够的时间，以生产1,4-丁二醇和异丙醇。
84.权利要求83的方法，其中所述的条件包括基本上厌氧的培养条件。
85.权利要求83方法，其中所述的外源性核酸是异源核酸。
86.一种生产1,3-丁二醇和异丙醇的方法，包括在一定条件下和培养权利要求37或54-65中任一项的非天然存在的微生物有机体足够的时间，以生产1,3-丁二醇和异丙醇。
87.权利要求86的方法，其中所述的条件包括基本上厌氧的培养条件。
88.权利要求86所述的方法，其中所述的外源性核酸是异源核酸。
89.一种生产甲基丙烯酸和异丙醇的方法，包括在一定条件下培养权利要求38或67-77中任一项的非天然存在的微生物有机体足够的时间，以生产甲基丙烯酸和异丙醇。
90.权利要求89所述的方法，其中所述的条件包括基本上厌氧的培养条件。
91.权利要求89所述的方法，其中所述的外源性核酸是异源核酸。
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