[go: up one dir, main page]

CN102625713A - 用于制备金黄色葡萄球菌血清型5和8荚膜多糖缀合物免疫原性组合物的组合物和方法 - Google Patents

用于制备金黄色葡萄球菌血清型5和8荚膜多糖缀合物免疫原性组合物的组合物和方法 Download PDF

Info

Publication number
CN102625713A
CN102625713A CN2010800372767A CN201080037276A CN102625713A CN 102625713 A CN102625713 A CN 102625713A CN 2010800372767 A CN2010800372767 A CN 2010800372767A CN 201080037276 A CN201080037276 A CN 201080037276A CN 102625713 A CN102625713 A CN 102625713A
Authority
CN
China
Prior art keywords
polysaccharide
serotype
carrier protein
conjugate
activatory
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN2010800372767A
Other languages
English (en)
Inventor
S·J·弗雷泽
A·安德森
V·帕夫利阿克
K·U·扬森
I·L·道奇
T·D·斯科特
J·S·南拉
A·K·普瑞萨德
B·A·格林
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wyeth LLC
Original Assignee
Wyeth LLC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wyeth LLC filed Critical Wyeth LLC
Publication of CN102625713A publication Critical patent/CN102625713A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/085—Staphylococcus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/6415—Toxins or lectins, e.g. clostridial toxins or Pseudomonas exotoxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/646—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the entire peptide or protein drug conjugate elicits an immune response, e.g. conjugate vaccines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/62—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier
    • A61K2039/627—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier characterised by the linker
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/64—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the architecture of the carrier-antigen complex, e.g. repetition of carrier-antigen units

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明涉及包含缀合至载体蛋白的金黄色葡萄球菌血清型5和8荚膜多糖的免疫原性缀合物以及它们的制备和使用方法。制备本发明的免疫原性缀合物的方法包括利用缀合化学将所述荚膜多糖与所述载体蛋白共价缀合，所述缀合化学包括1，1-羰基-二-1，2，4-三唑(CDT)或3-(2-吡啶二硫代)-丙酰肼(PDPH)。

Description

用于制备金黄色葡萄球菌血清型5和8荚膜多糖缀合物免疫原性组合物的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2009年6月22日提交的美国临时专利申请第61/219,143号和第61/219,151号的优先权，其整个公开各自整体援引加入本文。
发明领域
本发明通常涉及金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)血清型5和8荚膜多糖缀合物免疫原性组合物以及它们的制备和使用方法。
发明背景
人是革兰氏阳性金黄色葡萄球菌的天然储存宿主。例如，金黄色葡萄球菌(S.aureus)可以永久或短暂定殖皮肤、鼻孔和咽喉而不引起疾病。金黄色葡萄球菌感染范围从轻微的皮肤感染至心内膜炎、骨髓炎、菌血症和败血症。金黄色葡萄球菌还引起大多数医院感染，并且其在社区发病感染中的流行程度增加。此外，在2005年，抗甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)感染估计为31.8/100,000个体，包括2005年在美国的16,650例死亡(Klevenset al.(2007)J.Am.Med.Assoc.298：1763-1771)。当个体由于免疫屏障的破坏(例如手术期间、放置留置导管或其他装置、创伤或伤口)变为免疫受损时，随后发生疾病。
金黄色葡萄球菌产生大量细胞外和细胞内抗原，包括许多毒素和酶。本文特别关注金黄色葡萄球菌的荚膜多糖血清型(参见，Karakawa & Vann，″Capsular polysaccharides of Staphylococcus aureus，″In：Weinstein & Fields，eds.Seminars in Infectious Disease.IV.Bacterial Vaccines.(New York，NY；Thieme Stratton；1982.pp.285293)，特别是血清型5和8荚膜多糖。对分离自个体的大量金黄色葡萄球菌菌株的流行病学研究显示70％-80％是血清型5或8荚膜多糖(Arbeit et al.(1984)Diagn.Microbiol.Infect.Dis.2：85-91)。不幸的是，荚膜多糖本身是不良免疫原。
在过去20年，由于使用血管内装置和侵入性操作，葡萄球菌感染和疾病急剧增加。由于抗生素抗性的平行上升，疾病发生率的这种上升更令人不安；因此，对免疫原性组合物有迫切需要以预防葡萄球菌感染和疾病。
发明概述
本发明涉及免疫原性缀合物，其包含缀合至载体蛋白的金黄色葡萄球菌血清型5或8荚膜多糖，以及制备这类缀合物的方法。金黄色葡萄球菌血清型5或8荚膜多糖可以利用本领域技术人员已知的分离方法直接分离自细菌，可以利用合成方案制备，或者可以利用本领域技术人员还已知的基因工程方法重组产生。此外，本发明提供诱导针对葡萄球菌(Staphylococcus)细菌的免疫应答的方法，预防葡萄球菌细菌所引起的疾病的方法，以及降低葡萄球菌细菌感染所引起的疾病的至少一种症状的严重程度的方法。
在一实施方案中，本发明包含免疫原性多糖-蛋白缀合物，其包含分离的缀合至载体蛋白的金黄色葡萄球菌血清型5或8荚膜多糖，其中所述多糖具有20kDa-1000kDa的分子量。在一些实施方案中，所述免疫原性缀合物具有200kDa-5000kDa的分子量。在一实施方案中，所述免疫原性缀合物的多糖部分具有70kDa-300kDa的分子量范围。在一实施方案中，所述免疫原性缀合物具有500kDa-2500kDa的分子量范围。
在一实施方案中，所述血清型5或8荚膜多糖具有10-100％的O-乙酰化程度。在一实施方案中，所述O-乙酰化程度为50-100％。在一实施方案中，所述O-乙酰化程度为75-100％。在一实施方案中，所述免疫原性缀合物产生抗体，如通过在动物效力模型中杀死细菌或通过调理吞噬杀死测定所测量的，所述抗体是有功能的。
在一实施方案中，所述免疫原性缀合物载体蛋白包含CRM197。在一实施方案中，所述CRM197通过氨基甲酸酯键、酰胺键或这两者共价连接至所述多糖。在一实施方案中，缀合的赖氨酸比CRM197的摩尔比可以是约10∶1-约25∶1。在一实施方案中，所述缀合物在所述多糖的至少每5-10个糖重复单元包含一个CRM197和多糖之间的共价键。在一实施方案中，载体蛋白和多糖之间的键在所述多糖的每5个重复单元中存在一个。
在一实施方案中，所述包含CRM197的免疫原性缀合物包含共价连接至所述多糖的5-22个赖氨酸或8-15个赖氨酸。在一实施方案中，所述包含CRM197的免疫原性缀合物包含共价连接至所述多糖的5-23个赖氨酸或8-12个赖氨酸。
在一实施方案中，所述免疫原性缀合物包含10-100％O-乙酰化的5型或8型多糖。在一实施方案中，所述免疫原性缀合物包含50-100％O-乙酰化的5型或8型多糖。在一实施方案中，所述免疫原性缀合物包含75-100％O-乙酰化的5型或8型多糖。在一些实施方案中，所述免疫原性组合物可以用来产生在动物效力模型或调理吞噬杀死测定中有功能的抗体。
在一实施方案中，与5型或8型多糖的总量相比，所述免疫原性缀合物包含少于约30％游离5型或8型多糖。
在一实施方案中，与5型或8型多糖的总量相比，所述免疫原性缀合物包含少于约20％游离5型或8型多糖。
在一实施方案中，本发明包含免疫原性组合物，其包含如本文所述的免疫原性缀合物，以及包含佐剂、稀释剂或载体中的至少一种。
所述佐剂可以是基于铝的佐剂，例如磷酸铝、硫酸铝和氢氧化铝中的一种或多种。在一实施方案中，所述佐剂包含磷酸铝。
在一实施方案中，与5型或8型多糖的总量相比，所述免疫原性组合物包含少于约30％游离5型或8型多糖。
在一实施方案中，与5型或8型多糖的总量相比，所述免疫原性组合物包含少于约20％游离5型或8型多糖。
在一实施方案中，本发明包括在对象中诱导对金黄色葡萄球菌血清型5或8荚膜多糖缀合物的免疫应答的方法，所述方法包括给所述对象施用免疫学有效量的如本文所述的免疫原性组合物。
在一实施方案中，本发明包括产生包含分离的缀合至载体蛋白的金黄色葡萄球菌血清型5或8荚膜多糖的免疫原性多糖-蛋白缀合物的方法，所述方法包括以下步骤：使分离的金黄色葡萄球菌血清型5或8荚膜多糖与1，1-羰基-二-(1，2，4-三唑)(CDT)在有机溶剂中反应来产生活化的血清型5或8多糖；以及使活化的血清型5或8多糖与载体蛋白在有机溶剂中反应来产生血清型5或8多糖∶载体蛋白缀合物。
在一实施方案中，活化金黄色葡萄球菌血清型5或8荚膜多糖的方法进一步包括冻干所述分离的血清型5或8多糖，并且将所述冻干的多糖重悬在有机溶剂。在一实施方案中，将所述重悬的多糖活化，然后使其与所述载体蛋白直接反应。在一实施方案中，在与所述载体蛋白反应之前分离所述活化的分离的血清型5或8多糖。在一实施方案中，将所述活化的分离的血清型5或8多糖冻干，以便在使所述多糖与载体蛋白反应之前产生冻干的活化的分离的血清型5或8多糖。在一实施方案中，产生分离的多糖-载体蛋白缀合物的方法包括将所述载体蛋白冻干的步骤，以便在使所述载体蛋白与所述多糖反应之前产生冻干的载体蛋白。在一实施方案中，产生分离的多糖-载体蛋白缀合物的方法包括将冻干的活化的分离的血清型5或8多糖以及冻干的载体蛋白重悬在有机溶剂中的步骤，作为所述活化的分离的血清型5或8多糖与载体蛋白的反应的部分。
在一实施方案中，产生分离的金黄色葡萄球菌5型或8型荚膜多糖-载体蛋白缀合物的方法包括稀释活化的多糖与载体蛋白的反应混合物并在约20℃-约26℃下维持约8.8-约9.2的pH至少4小时的步骤。
在一实施方案中，将所述活化的金黄色葡萄球菌5型或8型荚膜多糖与载体蛋白的反应混合物在约23℃下维持约9.0的pH至少4小时。
在一实施方案中，产生分离的金黄色葡萄球菌5型或8型荚膜多糖-载体蛋白的方法包括在产生之后分离所述分离的血清型5或8多糖-蛋白缀合物的步骤。
在一实施方案中，用于产生分离的金黄色葡萄球菌5型或8型荚膜多糖-载体蛋白缀合物的方法的有机溶剂是极性非质子溶剂。在一实施方案中，所述极性非质子溶剂选自二甲基亚砜(DMSO)。在一实施方案中，产生分离的多糖-载体蛋白缀合物的方法，所述有机溶剂为DMSO。
在一实施方案中，产生分离的金黄色葡萄球菌5型荚膜多糖-载体蛋白缀合物的方法包括将有机溶剂中的包含5型荚膜多糖与CDT的反应混合物的水浓度调整至约0.1-0.3％。在一实施方案中，将有机溶剂中的包含5型荚膜多糖与CDT的反应混合物的水浓度调整至约0.2％。
在一实施方案中，活化分离的金黄色葡萄球菌5型荚膜多糖的步骤包括使所述多糖与CDT反应，所述CDT的量约超过存在于有机溶剂中的包含5型荚膜多糖和CDT的反应混合物中的多糖的量20摩尔。
在一实施方案中，产生分离的金黄色葡萄球菌8型荚膜多糖∶载体蛋白缀合物的方法包括测定包含8型荚膜多糖的反应混合物的水浓度的步骤。在一实施方案中，加入所述反应混合物以活化所述多糖的CDT的量以约与存在于有机溶剂中的包含8型荚膜多糖和CDT的反应混合物中的水的量等摩尔的CDT的量提供。
在一实施方案中，加入所述反应混合物以活化所述多糖的CDT的量以约与存在于有机溶剂中的包含8型荚膜多糖和CDT的反应混合物中的水的量相比约0.5∶1的摩尔比的CDT的量提供。在一实施方案中，加入所述反应混合物以活化所述多糖的CDT的量以约与存在于有机溶剂中的包含8型荚膜多糖和CDT的反应混合物中的水的量相比0.75∶1的摩尔比的CDT的量提供。
在一实施方案中，包括分离所述活化的多糖的步骤的方法包括渗滤的步骤。
在一实施方案中，包括冻干所述载体蛋白的方法，在冻干之前，将所述载体蛋白对NaCl渗滤，并且将NaCl/蛋白载体蛋白的w/w比例调整至约0.5-约1.5。在一实施方案中，NaCl比载体蛋白的比例约为1。
在一实施方案中，用于产生分离的金黄色葡萄球菌5型或8型荚膜多糖-载体蛋白缀合物的方法的载体蛋白包含CRM197。
在一实施方案中，使用于产生分离的金黄色葡萄球菌5型或8型荚膜多糖-载体蛋白缀合物的方法的CRM197与所述活化的血清型5或8多糖以约1∶1的重量比例反应。
在一实施方案中，产生分离的金黄色葡萄球菌5型或8型荚膜多糖-载体蛋白缀合物的方法包括在与CDT在有机溶剂中混合之前将所述5型或8型荚膜多糖与咪唑或三唑混合的步骤。
在一实施方案中，产生分离的金黄色葡萄球菌5型或8型荚膜多糖∶载体蛋白缀合物的方法包括水解所述血清型5或8多糖-载体蛋白缀合物以去除未反应的活化基团的步骤。
在一实施方案中，本发明提供产生包含分离的缀合至载体蛋白的金黄色葡萄球菌血清型5或8荚膜多糖的免疫原性缀合物的方法，所述方法包括以下步骤：使金黄色葡萄球菌血清型5或8荚膜多糖与3-(2-吡啶二硫代)-丙酰肼(PDPH)和碳二亚胺在有机溶剂中反应以产生PDPH连接的多糖；使所述PDPH连接的多糖与还原剂反应以产生活化的多糖；分离所述活化的血清型5或8多糖以产生分离的活化的血清型5或8多糖；提供活化的载体蛋白；使所述分离的活化的血清型5或8多糖与所述活化的载体蛋白反应以产生血清型5或8多糖-载体蛋白缀合物；由此产生包含分离的缀合至载体蛋白的金黄色葡萄球菌血清型5或8荚膜多糖的免疫原性缀合物。在一实施方案中，在使所述活化的载体蛋白与所述活化的多糖反应之前分离所述活化的载体蛋白。
在一实施方案中，分离所述活化的载体蛋白的步骤进一步包括冻干所述分离的活化的血清型5或8多糖以产生冻干的活化的血清型5或8多糖。
在一实施方案中，所述溴乙酸为溴乙酸的N-羟基琥珀酰亚胺酯(BAANS)。
在一实施方案中，利用PDPH产生血清型8荚膜多糖-载体蛋白缀合物的方法包括使用有机溶剂，所述有机溶剂为极性非质子溶剂。在一实施方案中，所述极性非质子溶剂选自二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基乙酰胺、N-甲基-2-吡咯烷酮和六甲基磷酰胺(HMPA)。在一实施方案中，所述有机溶剂为二甲基亚砜(DMSO)。
在一实施方案中，用于利用PDPH产生血清型5或8荚膜多糖-载体蛋白缀合物的方法的碳二亚胺是1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDAC)。
在一实施方案中，利用PDPH产生血清型5或8荚膜多糖-载体蛋白缀合物的方法包括使所述血清型5或8荚膜多糖与PDPH和EDAC在有机中以约1∶5∶3的多糖∶PDPH∶EDAC重量比例反应的步骤。
在一实施方案中，用于利用PDPH和EDAC产生血清型5或8荚膜多糖-载体蛋白缀合物的方法的还原剂为二硫苏糖醇(DTT)。
在一实施方案中，在利用PDPH和EDAC产生血清型5或8荚膜多糖-载体蛋白缀合物的方法中活化所述载体蛋白包括使所述载体蛋白与溴乙酸反应。
在一实施方案中，利用PDPH和EDAC产生血清型5或8荚膜多糖-载体蛋白缀合物的方法中的分离所述活化的血清型5或8多糖的步骤包括渗滤。
在一实施方案中，利用PDPH和EDAC产生血清型5或8荚膜多糖-载体蛋白缀合物的方法包括水解所述血清型5或8多糖-载体蛋白缀合物以去除未反应的活化基团的步骤。在一实施方案中，水解所述血清型5或8多糖-载体蛋白缀合物的步骤包括添加半胱胺盐酸盐。
在一实施方案中，利用PDPH和EDAC产生血清型5或8荚膜多糖-载体蛋白缀合物的方法进一步包括分离免疫原性缀合物，所述免疫原性缀合物包含分离的缀合至载体蛋白的金黄色葡萄球菌血清型5或8荚膜多糖。
在一实施方案中，所述血清型5或8多糖-载体蛋白缀合物的分离包括渗滤。
在一实施方案中，用于利用PDPH和EDAC产生血清型5或8荚膜多糖-载体蛋白缀合物的方法的载体蛋白包括CRM197。
在一实施方案中，利用PDPH和EDAC产生血清型5或8荚膜多糖-CRM197缀合物的方法中的CRM197以约1∶1CRM197∶荚膜多糖分子的重量比例添加。
在一实施方案中，用于利用PDPH和EDAC产生血清型5或8荚膜多糖-载体蛋白缀合物的方法的活化的5型或8型荚膜多糖具有约50kd-约500kd的大小。
在一实施方案中，在利用PDPH和EDAC产生血清型5或8荚膜多糖-载体蛋白缀合物的方法中制备的免疫原性缀合物具有约400kd-约5000kd的大小。
在一实施方案中，本发明提供免疫原性组合物，其包含通过本文所述的任何方法产生的5型或8型荚膜多糖-载体蛋白缀合物。
在一实施方案中，本发明提供免疫原性组合物，其包含通过本文所述的任何方法产生的5型或8型荚膜多糖-载体蛋白缀合物以及包含佐剂、稀释剂或载体中的至少一种。在一实施方案中，所述免疫原性组合物包含基于铝的佐剂，其可以选自磷酸铝、硫酸铝和氢氧化铝。在一实施方案中，本文所述的免疫原性组合物包含佐剂磷酸铝。
本文所述的免疫原性组合物与5型或8型多糖的总量相比可以包含少于30％以及少于20％的游离5型或8型多糖。可以将本文所述的免疫原性组合物储存在水或低离子强度的中性pH缓冲液中。
在一实施方案中，本发明提供减少或预防对象中的葡萄球菌感染、与葡萄球菌细菌相关的疾病或疾病状况的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗或预防量的如本文所述的免疫原性组合物的步骤。在一实施方案中，所述感染、疾病或疾病状况选自侵袭性金黄色葡萄球菌、败血症和携带。
在一实施方案中，本发明提供减少或预防接受外科手术的对象中的葡萄球菌感染的方法，所述方法包括在所述外科手术之前向所述对象施用预防有效量的如本文所述的免疫原性组合物的步骤。
在一实施方案中，本发明的方法包括用CDT取代CDI。
在一实施方案中，本发明提供具有50kDa-800kDa的分子量的金黄色葡萄球菌5型或8型荚膜多糖，其共价结合至载体蛋白；其中共价结合至所述载体蛋白的多糖的组合分子量为约400kDa-5000kDa。
在一实施方案中，共价结合至载体蛋白的多糖包含具有70kDa-300kDa的分子量范围的多糖部分。在一实施方案中，共价结合至载体蛋白的多糖具有500kDa-2500kDa的分子量范围。
在一实施方案中，共价结合至载体蛋白的多糖的载体蛋白部分包含CRM197。在一实施方案中，将所述CRM197通过氨基甲酸酯键、酰胺键或这两者共价连接至所述多糖。在一些实施方案中，缀合的赖氨酸比CRM197的摩尔比为约10∶1-约25∶1。在一些实施方案中，共价结合至载体蛋白的多糖至少在所述多糖的每5-10个糖重复单元包含至少一个与CRM197之间的共价键。在一些实施方案中，共价结合至载体蛋白的多糖包含存在于所述多糖的每5个糖重复单元的至少一个CRM197和多糖之间的键。在一些实施方案中，共价结合至所述CRM197的多糖的CRM197部分包含5-22个共价连接至所述多糖的赖氨酸。在一些实施方案中，共价结合至所述CRM197的多糖的CRM197部分包含5-23个共价连接至所述多糖的赖氨酸。在一些实施方案中，共价结合至载体蛋白的多糖的CRM197部分包含8-15个共价连接至所述多糖的赖氨酸。在一些实施方案中，共价结合至载体蛋白的多糖的CRM197部分包含8-12个共价连接至所述多糖的赖氨酸。
在一实施方案中，本发明提供免疫原性组合物，其包含如本文所述共价结合至载体蛋白的金黄色葡萄球菌5型或8型多糖以及包含佐剂、稀释剂或载体中的至少一种。
在一实施方案中，本发明提供向对象施用包含如本文所述共价连接至载体蛋白的金黄色葡萄球菌5型或8型多糖的免疫原性组合物以产生如本文所述的免疫应答的方法。
在一实施方案中，本发明提供分离具有20kDa-1000kDa的分子量的多糖的方法。
在一实施方案中，本发明提供通过本发明的荚膜多糖、免疫原性缀合物或免疫原性组合物产生的抗体。
附图说明
基于以下发明详述，会更好地理解本发明除了上文所列之外的特征、方面和优势。这样的发明详述参考以下附图，其中：
图1示出金黄色葡萄球菌血清型8荚膜多糖的重复多糖结构(N-乙酰氨基甘露醇醛酸为ManNAca，N-乙酰L-岩藻糖胺为L-FucNAc，并且N-乙酰D-岩藻糖胺为D-FucNAc)。
图2A示出来自金黄色葡萄球菌血清型8荚膜多糖(O-乙酰基测定)和磷壁酸(磷酸盐测定)的离子交换层析(Q-琼脂糖)级分的分析；图2B示出通过双向免疫扩散测定的来自金黄色葡萄球菌血清型8荚膜多糖的离子交换层析(Q-琼脂糖)级分的分析。
图3A示出在加热处理中，pH(3.5、4或5)在95℃下对于降低金黄色葡萄球菌血清型8荚膜多糖分子量的效果；图3B示出在加热处理中，温度(55℃、75℃或95℃)在pH 3.5下对于降低金黄色葡萄球菌血清型8荚膜多糖分子量的效果。
图4示出分别在pH 3.5和4.5下于95℃下加热处理期间，随着时间的推移与血清型5荚膜多糖相比的纯化的金黄色葡萄球菌血清型8荚膜多糖的分子量。
图5示出与AlPO4处理的对照(圆形)相比，在接受血清型8荚膜多糖-CRM197缀合物的小鼠(菱形)中存活率提高。
图6示出金黄色葡萄球菌血清型5多糖的重复多糖结构(N-乙酰氨基甘露醇醛酸为ManNAcA，N-乙酰L-岩藻糖胺为L-FucNAc，并且N-乙酰D-岩藻糖胺为D-FucNAcA)。
图7A示出来自金黄色葡萄球菌血清型5多糖(O-乙酰基测定)和磷壁酸(磷酸盐测定)的离子交换层析(Q-琼脂糖)级分的分析；图7B示出通过双向免疫扩散测定的来自金黄色葡萄球菌血清型5多糖的离子交换层析(Q-琼脂糖)级分的分析。
图8A示出在加入处理中，pH(3.5、4或5)在95℃下对于降低金黄色葡萄球菌血清型5荚膜多糖分子量的效果；图8B示出在加热处理中，温度(55℃、75℃或95℃)在pH 3.5下对于降低金黄色葡萄球菌血清型5荚膜多糖分子量的效果。
图9示出与PBS处理的对照(阴影区为处理的小鼠)相比，在接受血清型5多糖-CRM197缀合物的小鼠中肾盂肾炎减少。
图10示出在用高分子量(HMW)CP5-CRM、低分子量(LMW)CP5-CRM或PP5-CRM对照免疫接种的小鼠中用金黄色葡萄球菌PFESA0266攻击之后，肾中回收的菌落形成单位(CFU)。
图11示出来自血清的OPA效价(几何平均数)的比较，所述血清获得自用多糖缀合物的不同制剂(高分子量(HMW)CP5-CRM、低分子量(LMW)CP5-CRM)免疫接种的小鼠。组由5-9只小鼠组成。
发明详述
综述
本发明涉及包含缀合至载体蛋白的金黄色葡萄球菌血清型5或8荚膜多糖的免疫原性缀合物以及它们的制备和使用方法。本发明的免疫原性缀合物的新特征包括所述多糖和所得的缀合物的分子量谱，每个CRM197载体蛋白缀合的赖氨酸的比例和共价连接至所述多糖的赖氨酸的数目，作为所述多糖的重复单元的函数的所述载体蛋白与所述多糖之间的共价键的数目，以及与总多糖相比的游离多糖的相对量。在本文中使用时，术语“游离多糖”表示未缀合至所述载体蛋白但是仍然存在于所述缀合物组合物中的多糖。
制备本发明的免疫原性缀合物的方法包括利用包括CDI(1，1-羰基二咪唑)、CDT(1，1-羰基-二-1，2，4-三唑)或PDPH(3-(2-吡啶二硫代)-丙酰肼)的缀合化学使所述荚膜多糖与所述载体蛋白共价缀合。CDI仅对CP8缀合具有特异性。使用CDI/CDT导致荚膜多糖和载体蛋白之间的1-碳或0-碳接头，而使用PDPH导致荚膜多糖和载体蛋白之间的共价硫醚键。
用于-SH(硫醇化CP)至-NH2键的其他交联剂包括但不限于：磺基-LC-SMPT；磺基-LC-SMPT(4-磺基琥珀酰亚胺基-6-甲基-a-(2-吡啶二硫代)甲苯甲酰氨基]己酸酯))；磺基-KMUS(N-[k-马来酰亚胺基十一酰基氧基]磺基琥珀酰亚胺酯)；切割巯基的磺基-LC-SPDP(磺基琥珀酰亚胺基6-(3′-[2-吡啶二硫代]-丙酰胺基)己酸酯)；磺基-SMPB(磺基琥珀酰亚胺基4-[对-马来酰亚胺基苯基]丁酸酯)；磺基-SIAB(N-磺基琥珀酰亚胺基[4-碘乙酰基]氨基苯甲酸酯)；磺基-EMCS([N-e-马来酰亚胺基己酰基氧基]磺基琥珀酰亚胺酯)；EMCA(N-e-马来酰亚胺基己酸)；磺基-SMCC(磺基琥珀酰亚胺基4-[N-马来酰亚胺基甲基]环己烷-1-羧酸酯)；磺基-MBS(间-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯)；磺基-GMBS(N-[g-马来酰亚胺基丁酰氧基]磺基琥珀酰亚胺酯)；BMPA(N-β-马来酰亚胺基丙酸)；2-亚氨基硫烷盐酸盐(2-immunothiolane hydrochloride)；3-(2-吡啶二硫代)丙酸N-琥珀酰亚胺基酯；3-马来酰亚胺基(malemido)丙酸N-琥珀酰亚胺基酯；4-马来酰亚胺基丁酸N-琥珀酰亚胺基酯；SMPT(4-琥珀酰亚胺基氧基羰基-甲基-a-[2-吡啶二硫代]甲苯)；LC-SMCC(琥珀酰亚胺基-4-[N-马来酰亚胺基甲基]环己烷-1-羧基-[6-酰氨基己酸酯])；KMUA(N-k-马来酰亚胺基十一酸)；LC-SPDP(琥珀酰亚胺基6-(3-[2-吡啶二硫代]-丙酰胺基)己酸酯)；SMPH(琥珀酰亚胺基-6-[β-马来酰亚胺基丙酰胺基]己酸酯)；SMPB(琥珀酰亚胺基4-[对-马来酰亚胺基苯基]丁酸酯)；SIAB(N-琥珀酰亚胺基[4-碘乙酰基]氨基苯甲酸酯)；EMCS([N-e-马来酰亚胺基己酰基氧基]琥珀酰亚胺酯)；SMCC(琥珀酰亚胺基4-[N-马来酰亚胺基甲基]环己烷-1-羧酸酯)；MBS(间-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)；SBAP(琥珀酰亚胺基3-[溴乙酰氨基]丙酸酯)；BMPS (N-[β-马来酰亚胺基丙基氧基]琥珀酰亚胺酯)；AMAS N-(a-马来酰亚胺基乙酰氧基)琥珀酰亚胺酯)；SIA(N-琥珀酰亚胺基碘乙酸酯)；以及N-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)-氨基苯甲酸酯。
还可以利用-SH至-OH基团的交联剂将所述物质交联。这类交联剂包括但不限于PMPI(N-[对-马来酰亚胺基苯基]异氰酸酯)。
本文所述的组合物和方法在各种应用中有用。例如，所述缀合物可以用于产生缀合物免疫原性组合物以保护受体免受金黄色葡萄球菌感染。或者，所述各种缀合物可以用于产生针对细菌荚膜多糖的抗体，随后所述抗体可以用于研究和临床实验室测定，例如细菌检测和血清分型。这类抗体还可以用来赋予对象被动免疫。在一些实施方案中，所制备的针对细菌多糖的抗体在动物效力模型或调理吞噬杀死测定中有功能。
除非另有说明，本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所涉及的领域的技术人员通常理解的相同的含义。虽然与本文所述的方法和材料相似或相当的任何方法和材料可以用于本发明的实施或测试，但是本文描述优选方法和材料。在描述实施方案和要求本发明中，某些术语会按照下文所示的定义使用。
在本文中使用时，除非上下文明确另有规定，单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“这个”包括复数参考物。因此，例如，提及“这个方法”包括本文所述类型的一种或多种方法和/或步骤，和/或在阅读本公开等时对本领域技术人员会变得清楚的一种或多种方法和/或步骤。
在本文中使用时，“约”表示在值(例如所述浓度范围、时限、分子量、温度或pH)的统计上有意义的范围内。这样的范围可以在一个数量级内，典型地在给定值或范围的20％内，更典型地仍在10％内，并且甚至更典型地在5％内。术语“约”所涵盖的允许偏差取决于研究下的特定系统，并且可以由本领域技术人员很容易判断。在本申请内无论何时提到范围，所述范围内的每个整数也预期为本发明的实施方案。
注意到在这个公开中，诸如“包含(comprises)”、“包含(comprised)”、“包含(comprising)”、“含有(contains)”、“含有(containing)”等的术语可以具有符合美国专利法的含义；例如，它们可以表示“包括(includes)”、“包括(included)”、“包括(including)”等。这类术语指包括特定成分或成分的组而不排除任何其他成分。诸如“基本上由...组成(consisting essentially of)”和“基本上由...组成(consists essentially of)”的术语具有符合美国专利法的含义，例如，它们允许包括不偏离本发明的新特征或基本特征的额外的成分或步骤，即，它们排除偏离本发明的新特征或基本特征的额外的未列举的成分或步骤，并且它们排除现有技术(例如本文所引用或援引加入本文的文件，特别是该文件的目的是限定实施方案可授权，如对于现有技术如本文所引用的文件或援引加入本文的文件是新的、非显而易见的、具有创造性的)的成分或步骤。并且，术语“由...组成(consists of)”和“由...组成(consisting of)”具有符合美国专利法的含义；即这些术语是封闭的。因此，这些术语指包括特定成分或成分的组，并且排除所有其他成分。
免疫原性缀合物
如上文所述，本发明涉及包含缀合至载体蛋白的金黄色葡萄球菌血清型5或8荚膜多糖的免疫原性缀合物。本发明的一实施方案提供包含缀合至载体分子或蛋白的金黄色葡萄球菌血清型5或8荚膜多糖的免疫原性缀合物，其具有一种或多种以下特征：所述多糖具有50kDa-700kDa的分子量；所述免疫原性缀合物具有500kDa-2500KDa的分子量；并且相对于总多糖，所述缀合物包含少于约30％游离多糖。在一些实施方案中，所述多糖具有20kDa-1000kDa的分子量。在一些实施方案中，所述免疫原性缀合物具有200kDa-5000kDa的分子量。在其他实施方案中，相对于总多糖，所述缀合物包含少于约25％、约20％、约15％、约10％或约5％游离多糖。
在本文中使用时，“缀合物”包含通常具有期望范围的分子量的荚膜多糖和载体蛋白，其中所述荚膜多糖缀合至所述载体蛋白。缀合物可以含有或可以不含一定量的游离荚膜多糖。在本文中使用时，“游离荚膜多糖”指与缀合的荚膜多糖-载体蛋白非共价关联(即，非共价结合、吸附或包埋)的荚膜多糖。术语“游离荚膜多糖”、“游离多糖”和“游离糖”可以交换使用，并且旨在表达相同含义。
无论所述载体分子的性质如何，其可以直接或通过接头缀合至所述荚膜多糖。在本文中使用时，“待缀合”、“已缀合”和“正在缀合”指将细菌荚膜多糖共价连接至所述载体分子的过程。缀合增强所述细菌荚膜多糖的免疫原性。缀合可以根据下文所述的方法或通过本领域已知的其他方法进行。
所述金黄色葡萄球菌荚膜多糖的分子量是用于免疫原性组合物的考虑因素。由于在抗原表面存在较高价的表位，高分子量荚膜多糖能够诱导某些抗体免疫应答。“高分子量荚膜多糖”的分离考虑用于本发明的组合物和方法。在本发明的一实施方案中，可以分离和纯化分子量范围为20kDa-1000kDa的高分子量血清型5或8荚膜多糖。在本发明的一实施方案中，可以分离和纯化分子量范围为50kDa-700kDa的高分子量血清型5或8荚膜多糖。在本发明的一实施方案中，可以分离和纯化分子量范围为50kDa-300kDa的高分子量血清型5或8荚膜多糖。在一实施方案中，可以分离和纯化分子量范围为70kDa-300kDa的高分子量血清型5或8荚膜多糖。在一实施方案中，可以分离和纯化分子量范围为90kDa-250kDa的高分子量血清型5或8荚膜多糖。在一实施方案中，可以分离和纯化分子量范围为90kDa-150kDa的高分子量血清型5或8荚膜多糖。在一实施方案中，可以分离和纯化分子量范围为90kDa-120kDa的高分子量血清型5或8荚膜多糖。在一实施方案中，可以分离和纯化分子量范围为80kDa-120kDa的高分子量血清型5或8荚膜多糖。可以通过本发明的方法分离和纯化的其他范围的高分子量血清型5或8荚膜多糖包括分子量70kDa-100kDa；分子量70kDa-110kDa；分子量70kDa-120kDa；分子量70kDa-130kDa；分子量70kDa-140kDa；分子量70kDa-150kDa；分子量70kDa-160kDa；分子量80kDa-110kDa；分子量80kDa-120kDa；分子量80kDa-130kDa；分子量80kDa-140kDa；分子量80kDa-150kDa；分子量80kDa-160kDa；分子量90kDa-110kDa；分子量90kDa-120kDa；分子量90kDa-130kDa；分子量90kDa-140kDa；分子量90kDa-150kDa；分子量90kDa-160kDa；分子量100kDa-120kDa；分子量100kDa-130kDa；分子量100kDa-140kDa；分子量100kDa-150kDa；分子量100kDa-160kDa；以及相似的期望的分子量范围。在任何上述范围内的任何整数考虑为本发明的实施方案。
在一实施方案中，所述缀合物具有约50kDa-约5000kDa的分子量。在一实施方案中，所述缀合物具有约200kDa-约5000kDa的分子量。在一实施方案中，所述免疫原性缀合物具有约500kDa-约2500kDa的分子量。在一实施方案中，所述免疫原性缀合物具有约500kDa-约2500kDa的分子量。在一实施方案中，所述免疫原性缀合物具有约600kDa-约2800kDa的分子量。在一实施方案中，所述免疫原性缀合物具有约700kDa-约2700kDa的分子量。在一实施方案中，所述免疫原性缀合物具有约1000kDa-约2000kDa；约1800kDa-约2500kDa；约1100kDa-约2200kDa；约1900kDa-约2700kDa；约1200kDa-约2400kDa；约1700kDa-约2600kDa；约1300kDa-约2600kDa；约1600kDa-约3000kDa的分子量。在任何上述范围内的任何整数考虑为本发明的实施方案。
在本文中使用时，“免疫原性”表示抗原(或者所述抗原的表位)，如细菌荚膜多糖或包含所述抗原的缀合物免疫原性组合物引发诸如哺乳动物的宿主中的免疫应答(体液或细胞介导的，或者两者)的能力。相应地，在本文中使用时，“免疫原性缀合物”或“缀合物”表示含有缀合至载体分子的细菌荚膜多糖的抗原或抗原决定簇(即，表位)的任何免疫原性缀合物，其可以用来引发免疫应答。所述免疫原性缀合物可以有助于通过与细胞表面的MHC分子相关的抗原呈递来敏化宿主。此外，可以产生抗原特异性T-细胞或抗体以允许未来保护已免疫的宿主。因此免疫原性缀合物可以保护宿主避免与细菌感染相关的一种或多种症状，或者可以保护宿主避免由于感染与所述荚膜多糖相关的细菌的死亡。免疫原性缀合物还可以用来产生多克隆或单克隆抗体，其可以用来赋予对象被动免疫。免疫原性缀合物还可以用来产生抗体，如通过在动物效力模型中杀死细菌或通过调理吞噬杀死测定所测量的，所述抗体是有功能的。
“抗体”是能够通过位于免疫球蛋白分子的可变区中的至少一个抗原识别位点特异性结合至靶(诸如糖类、多核苷酸、脂质、多肽等)的免疫球蛋白分子。在本文中使用时，除非上下文另有说明，该术语不仅包括完整多克隆或单克隆抗体，还包括工程抗体(例如，嵌合、人源化和/或衍生以改变效应子功能、稳定性和其他生物学活性)及其片段(如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv)、单链(ScFv)和结构域抗体，包括鲨鱼和骆驼抗体)，以及包含抗体部分的融合蛋白、多价抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体，只要它们表现出期望的生物学活性)和如本文所述的抗体片段，以及包含抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其他修饰的构型。抗体包括任何类别的抗体，如IgG、IgA或IgM(或其亚类)，并且所述抗体不需要是任何特定类别的。根据其重链恒定结构域的抗体氨基酸序列，免疫球蛋白可以分配至不同类别。有五大类的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些类别中的几类可以进一步分为亚类(同种型)，例如，人中的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是公知的。
“抗体片段”仅包含完整抗体的部分，其中所述部分优选保留至少一种，优选大部分或全部的通常与存在于完整抗体中时的该片段相关的功能。
术语“抗原”一般指生物分子，通常为免疫原性组合物中的蛋白、肽、多糖或缀合物，或者可以在动物中刺激产生抗体或T-细胞应答或者两者的免疫原性物质，包括注射或吸收入动物的组合物。可以对整个分子，或者对该分子的不同部分(例如，表位或半抗原)产生免疫应答。该术语可以用来指单个分子，或者指抗原分子的同质或异质群体。抗原被抗体、T-细胞受体或者特异性体液和/或细胞免疫的其他元件识别。“抗原”还包括所有相关的抗原表位。给定抗原的表位可以利用本领域公知的任何数量的表位作图技术来鉴定。参见，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods inMolecular Biology，Vol.66(Glenn E.Morris，Ed.，1996)Humana Press，Totowa，N.J.。例如，线性表位可以这样测定，例如，在固体支持物上同时合成大量肽，所述肽对应于蛋白分子的部分，并且在所述肽仍然连接至所述支持体的同时使所述肽与抗体反应。这类技术是本领域已知的，并且如美国专利第4,708,871号；Geysen et al.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA81：3998-4002；Geysen et al.(1986)Molec.Immunol.23：709-715所述；每个整体援引加入本文。相似地，构象表位可以通过例如x射线晶体分析法和二维核磁共振测定氨基酸的空间构象来鉴定。参见，例如，上文的EpitopeMapping Protocols。此外，为了本发明的目的，“抗原”还可以用来指包括对天然序列的修饰的蛋白，如缺失、添加和取代(一般在自然中保守，但是它们可以不保守)，只要所述蛋白保持引起免疫应答的能力。这些修饰可以是故意的，如通过位点定向诱变，或者通过特定合成方法，或者通过基因工程方法，或者可以是偶然的，如通过宿主的突变，其产生抗原。此外，抗原可以来源于、获得自或分离自微生物，例如细菌，或者可以是整个有机体。相似地，如在核酸免疫应用中表达抗原的寡核苷酸或多核苷酸也包括在所述定义中。还包括合成抗原，例如，多表位、侧翼表位以及其他重组或合成来源的抗原(Bergmann et al.(1993)Eur.J.Immunol.23：2777 2781；Bergmann et al.(1996)J.Immunol.157：3242-3249；Suhrbier(1997)Immunol.Cell Biol.75：402 408；Gardner et al.(1998)12th World AIDS Conference，Geneva，Switzerland，Jun.28to Jul.3，1998)。
“保护性”免疫应答指免疫原性组合物引起体液或细胞或者两者介导的免疫应答的能力，所述免疫应答有助于保护对象免受感染。所提供的保护不需要是绝对的，即，如果与对象的对照群体(例如未施用所述疫苗或免疫原性组合物的感染的动物)相比有统计上显著的改善，所述感染不需要被完全阻止或根除。保护可以限于缓解所述感染症状发生的严重程度或速度。一般来说，“保护性免疫应答”包括在至少50％的对象中诱导特定抗原的特异性抗体水平的提高，包括对每种抗原应答的可测量的功能抗体的一些水平。在特定情况下，“保护性免疫应答”可以包括在至少50％的对象中诱导特定抗原的特异性抗体水平的2倍增加或4倍增加，包括对每种抗原应答的可测量的功能抗体的一些水平。在某些实施方案中，调理抗体与保护性免疫应答相关。因此，保护性免疫应答可以通过测量调理吞噬测定中细菌计数减少的百分比来测定，例如下文所述。优选地，细菌计数有至少10％、25％、50％、65％、75％、80％、85％、90％、95％或更多的减少。组合物中特定缀合物的“免疫原性量”一般基于总多糖(对于该缀合物缀合或未缀合的)剂量施用。例如，含有20％游离多糖的血清型5或8荚膜多糖在100mcg剂量中会含有约80mcg缀合的多糖和约20mcg未缀合的多糖。在计算缀合物的剂量时，通常不考虑蛋白对所述缀合物的贡献。缀合物的量可以根据葡萄球菌血清型变化。通常，每个剂量会包含0.1-100mcg多糖，特别是0.1-10mcg，并且更特别是1-10mcg。
术语“对象”指哺乳动物、鸟、鱼、爬行动物或任何其他动物。术语“对象”还包括人。术语“对象”还包括家庭宠物。家庭宠物的非限制性实例包括：犬、猫、猪、兔、大鼠、小鼠、沙鼠、仓鼠、豚鼠、雪貂、鸟、蛇、蜥蜴、鱼、海龟和蛙。术语“对象”还包括家畜。家畜的非限制性实例包括：羊驼、野牛、骆驼、牛、鹿、猪、马、美洲驼、骡、驴、绵羊、山羊、兔、驯鹿、牦牛、鸡、鹅和火鸡。
如图1所示，金黄色葡萄球菌血清型5和8荚膜多糖具有以下结构：血清型5[→4)-β-D-ManNAcA-(1→4)-3-O-Ac-α-L-FucNAc-(1→3)-β-DFucNAc-(1→]n.和血清型8[→3)-4-O-Ac-β-D-ManNAcA-(1→3)-α-L-FucNAc-(1→3)-β-DFucNAc-(1→]n.。参见，Jones(2005)Carbohydr.Res.340：1097-1106。血清型8荚膜多糖具有与血清型5荚膜多糖相似的三糖重复单元；但是，它们在糖键和O-乙酰化位点不同，这产生血清学上不同的免疫反应性模式(Fournier et al.(1984)Infect.Immun.45：87-93；and Moreau et al.(1990)Carbohydr.Res.201：285-297)。因此血清型8和5荚膜多糖是水溶性的相对复杂的糖类，通常为酸性，并且以前认为其具有约25kDa的分子量(Fattom(1990)Infect.Immun.58，2367-2374)。
在一些实施方案中，本发明的血清型5和/或8荚膜多糖是O-乙酰化的。在一些实施方案中，5型荚膜多糖或寡糖的O-乙酰化程度为10-100％、20-100％、30-100％、40-100％、50-100％、60-100％、70-100％、80-100％、90-100％、50-90％、60-90％、70-90％或者80-90％。在一些实施方案中，8型荚膜多糖或寡糖的O-乙酰化程度为10-100％、20-100％、30-100％、40-100％、50-100％、60-100％、70-100％、80-100％、90-100％、50-90％、60-90％、70-90％或者80-90％。在一些实施方案中，5型和8型荚膜多糖或寡糖的O-乙酰化程度为10-100％、20-100％、30-100％、40-100％、50-100％、60-100％、70-100％、80-100％、90-100％、50-90％、60-90％、70-90％或者80-90％。
所述多糖或寡糖的O-乙酰化程度可以通过本领域已知的任何方法测定，例如，通过质子NMR(Lemercinier and Jones 1996，Carbohydrate Research296；83-96，Jones and Lemercinier 2002，J Pharmaceutical and Biomedicalanalysis 30；1233-1247，WO 05/033148或WO 00/56357)。另一常用的方法如Hestrin(1949)J.Biol.Chem.180；249-261所述。
在一些实施方案中，本发明的血清型5和/或8荚膜多糖用来产生抗体，如通过在动物效力模型中杀死细菌或通过证实所述抗体杀死细菌的调理吞噬杀死测定所测量的，所述抗体是有功能的。利用单独监测抗体的产生的测定可能未证实这样的杀死功能性，其未显示O-乙酰化在效力中的重要性。
利用本领域技术人员已知的分离方法，诸如血清型5或8的荚膜多糖可以直接获得自细菌。参见，例如，上文的Fournier et al.(1984)；Fournieret al.(1987)Ann.Inst.Pasteur/Microbiol.138：561-567；美国专利申请公开第2007/0141077号；以及国际专利申请公开第WO 00/56357；每个整体援引加入本文。此外，它们可以利用合成方案来制备。而且，血清型5或8荚膜多糖可以利用本领域技术人员还已知的基因工程方法重组产生(参见，Sau et al.(1997)Microbiology 143：2395-2405；以及美国专利第6,027,925号，每个整体援引加入本文)。
可以用来获得分离的血清型8荚膜多糖的一种金黄色葡萄球菌菌株是金黄色葡萄球菌R2 PFESA0286。将金黄色葡萄球菌PFESA0286(美国典型培养物保藏中心；Manassas，VA；ATCC登录号49525；)在改良的Frantz肉汤中培养之后，用兔抗血清型8多糖抗体通过流式细胞术选择这种菌株。流式细胞术期间观察到两个群体R1和R2。将R1和R2纯化和重新培养。R2产生血清型8荚膜多糖。流式细胞术分析显示同质荧光强度。因此，选择R2用于血清型8荚膜多糖制备。
可以用来获得分离的血清型5荚膜多糖的一种金黄色葡萄球菌是金黄色葡萄球菌PFESA0266。这种菌株在生长期间产生血清型5荚膜多糖，并且在细胞处于稳定期时生产达到高峰。其他金黄色葡萄球菌5型或8型菌株可以用来制备获得自建立的培养物收藏或临床标本的各自的多糖。
本发明的免疫原性缀合物的另一组分是缀合所述细菌荚膜多糖的载体分子或蛋白。术语“蛋白载体”或“载体蛋白”指可以缀合至抗原(如所述荚膜多糖)的任何蛋白分子，针对所述抗原的免疫应答是期望的。缀合至载体可以增强所述抗原的免疫原性。可以通过标准方法进行缀合。所述抗原的优选的蛋白载体为毒素，类毒素或者来自破伤风、白喉、百日咳、假单胞菌(Pseudomonas)、大肠杆菌(E.coli)、葡萄球菌和链球菌(Streptococcus)的毒素的任何突变交叉反应性物质(CRM)。在一实施方案中，特别优选的载体为白喉类毒素CRM197，其来源于产生CRM197蛋白的白喉棒杆菌(C.diphtheriae)菌株C7(β197)。这种菌株具有ATCC登录号53281。用于制备CRM197的方法如美国专利第5,614,382号所述，其整体援引加入本文。或者，可以使用所述蛋白载体或其他免疫原性蛋白的片段或表位。例如，可以将半抗原偶联至细菌毒素、类毒素或CRM的T-细胞表位。参见，1988年2月1日提交的题目为″Synthetic Peptides Representing a T-Cell Epitope asa Carrier Molecule For Conjugate Vaccines″的美国专利申请第150,688号；其整体援引加入本文。其他合适的载体蛋白包括灭活的细菌毒素，如霍乱类毒素(例如，如国际专利申请第WO2004/083251号所述)、大肠杆菌LT、大肠杆菌ST以及来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的外毒素A。还可以使用细菌外膜蛋白，如外膜蛋白复合物c(OMPC)、孔蛋白、转铁蛋白结合蛋白、肺炎球菌溶血素、肺炎球菌表面蛋白A(PspA)、肺炎球菌粘附蛋白(PsaA)或流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)蛋白D。其他蛋白也可以用作载体蛋白，如卵白蛋白、匙孔血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)或结核菌素纯蛋白衍生物(PPD)。
因此，在一实施方案中，本发明的免疫原性缀合物内的载体蛋白为CRM197，并且所述CRM197通过氨基甲酸酯键、酰胺键或两者共价连接至所述荚膜多糖。在一些实施方案中，本发明的免疫原性缀合物内的载体蛋白为CRM197，并且所述CRM197通过硫醚键共价连接至所述荚膜多糖。所述载体蛋白中缀合至荚膜多糖的赖氨酸残基的数目可以表征为缀合的赖氨酸的范围。例如，在给定的免疫原性组合物中，所述CRM197在39个赖氨酸中可以包含5-15个赖氨酸共价连接至所述荚膜多糖。表达这个参数另一方式是12％-40％的CRM197赖氨酸共价连接至所述荚膜多糖。例如，在给定的免疫原性组合物中，所述CRM197在39个赖氨酸中可以包含18-22个赖氨酸共价连接至所述荚膜多糖。表达这个参数的另一方式是40％-60％的CRM197赖氨酸共价连接至所述荚膜多糖。在一些实施方案中，所述CRM197在39个赖氨酸中包含5-15个赖氨酸共价连接至CP8。表达这个参数的另一方式是12％-40％的CRM197赖氨酸共价连接至CP8。在一些实施方案中，所述CRM197在39个赖氨酸中包含18-22个赖氨酸共价连接至CP5。表达这个参数的另一方式是40％-60％的CRM197赖氨酸共价连接至CP5。
如上文所讨论，所述载体蛋白中缀合至所述荚膜多糖的赖氨酸残基的数目可以表征为缀合的赖氨酸的范围，其可以表达为摩尔比。例如，所述CP8免疫原性缀合物中缀合的赖氨酸比CRM197的摩尔比可以为约18∶1-约22∶1。在一实施方案中，所述CP8免疫原性缀合物中缀合的赖氨酸比CRM197的摩尔比的范围可以为约15∶1-约25∶1。在一些实施方案中，所述CP8免疫原性缀合物中缀合的赖氨酸比CRM197的摩尔比的范围可以为约14∶1-约20∶1；约12∶1-约18∶1；约10∶1-约16∶1；约8∶1-约14∶1；约6∶1-约12∶1；约4∶1-约10∶1；约20∶1-约26∶1；约22∶1-约28∶1；约24∶1-约30∶1；约26∶1-约32∶1；约28∶1-约34∶1；约30∶1-约36∶1；约5∶1-约10∶1；约5∶1-约20∶1；约10∶1-约20∶1；或者约10∶1-约30∶1。而且，所述CP5免疫原性缀合物中缀合的赖氨酸比CRM197的摩尔比可以为约3∶1-25∶1。一实施方案中，所述CP5免疫原性缀合物中缀合的赖氨酸比CRM197的摩尔比的范围可以为约5∶1-约20∶1。在一实施方案中，所述CP5免疫原性缀合物中缀合的赖氨酸比CRM197的摩尔比的范围可以为约4∶1-约20∶1；约6∶1-约20∶1；约7∶1-约20∶1；约8∶1-约20∶1；约10∶1-约20∶1；约11∶1-约20∶1；约12∶1-约20∶1；约13∶1-约20∶1；约14∶1-约20∶1；约15∶1-约20∶1；约16∶1-约20∶1；约17∶1-约20∶1；约18∶1-约20∶1；约5∶1-约18∶1；约7∶1-约16∶1；或者约9∶1-约14∶1。
表达所述载体蛋白中缀合至所述荚膜多糖的赖氨酸残基的数目的另一方式可以为缀合的赖氨酸的范围。例如，在给定的CP8免疫原性缀合物中，所述CRM197在39个赖氨酸中可以包含5-15个赖氨酸共价连接至所述荚膜多糖。或者，这个参数可以表达为百分比。例如，在给定的CP8免疫原性缀合物中，缀合的赖氨酸的百分比可以为10％-50％。在一些实施方案中，20％-50％的赖氨酸可以共价连接至CP8。或者，30％-50％的CRM197赖氨酸可以共价连接至CP8；10％-40％的CRM197赖氨酸、10％-30％的CRM197赖氨酸、20％-40％的CRM197赖氨酸、25％-40％的CRM197赖氨酸、30％-40％的CRM197赖氨酸、10％-30％的CRM197赖氨酸、15％-30％的CRM197赖氨酸、20％-30％的CRM197赖氨酸、25％-30％的CRM197赖氨酸、10％-15％的CRM197赖氨酸、或者10％-12％的CRM197赖氨酸共价连接至CP8。而且，在给定的CP5免疫原性缀合物中，所述CRM197在39个赖氨酸中可以包含18-22个赖氨酸共价连接至所述荚膜多糖。或者，这个参数可以表达为百分比。例如，在给定的CP5免疫原性缀合物中，缀合的赖氨酸的百分比可以为40％-60％。在一些实施方案中，40％-60％的赖氨酸可以共价连接至CP5。或者，30％-50％的CRM197赖氨酸可以共价连接至CP5；20％-40％的CRM197赖氨酸、10％-30％的CRM197赖氨酸、50％-70％的CRM197赖氨酸、35％-65％的CRM197赖氨酸、30％-60％的CRM197赖氨酸、25％-55％的CRM197赖氨酸、20％-50％的CRM197赖氨酸、15％-45％的CRM197赖氨酸、10％-40％的CRM197赖氨酸、40％-70％的CRM197赖氨酸、或者45％-75％的CRM197赖氨酸共价连接至CP5。
荚膜多糖链附着至所述载体分子上的赖氨酸的频率是表征荚膜多糖缀合物的另一参数。例如，在一实施方案中，对于所述荚膜多糖的至少每5-10个糖重复单元，存在至少一个CRM197和多糖之间的共价键。在另一实施方案中，对于所述荚膜多糖的每5-10个糖重复单元，每2-7个糖重复单元，每3-8个糖重复单元，每4-9个糖重复单元，每6-11个糖重复单元，每7-12个糖重复单元，每8-13个糖重复单元，每9-14个糖重复单元，每10-15个糖重复单元，每2-6个糖重复单元，每3-7个糖重复单元，每4-8个糖重复单元，每6-10个糖重复单元，每7-11个糖重复单元，每8-12个糖重复单元，每9-13个糖重复单元，每10-14个糖重复单元，每10-20个糖重复单元，或者每5-10个糖重复单元，存在至少一个CRM197和荚膜多糖之间的共价键。在另一实施方案中，对于所述荚膜多糖的每2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个糖重复单元，存在至少一个CRM197和荚膜多糖之间的键。
本发明的一实施方案提供包含任何免疫原性缀合物的免疫原性组合物，所述免疫原性缀合物包含缀合至上文所述的载体蛋白的金黄色葡萄球菌血清型5或8荚膜多糖。
术语“免疫原性组合物”涉及含有抗原的任何药物组合物，例如微生物或者其组分，所述组合物可以用来引起对象中的免疫应答。本发明的免疫原性组合物可以用于通过全身性、透皮或粘膜途径施用所述免疫原性组合物来保护或治疗对金黄色葡萄球菌感染易感的人，或者用于产生可以用来赋予另一对象被动免疫的多克隆或单克隆抗体制品。这些施用可以包括通过肌肉内、腹腔内、皮内或皮下途径注射；或者通过粘膜给至口腔/消化道、呼吸道或泌尿生殖道。在一实施方案中，鼻内施用用于治疗或预防金黄色葡萄球菌的鼻咽携带，从而在感染的最初阶段减弱感染。免疫原性组合物还可以用来产生抗体，如通过在动物效力模型中杀死细菌或通过调理吞噬杀死测定所测量的，所述抗体是有功能的。
特定免疫原性组合物的组分的最佳量可以通过标准研究来确定，包括观察对象中的适当免疫应答。初始免疫接种之后，对象可以接受充分间隔的一次或多次加强免疫。
本发明的免疫原性组合物还可以包括一种或多种以下抗原：ClfA、ClfB、SdrC、SdrD、SdrE MntC/SitC/唾液结合蛋白、IsdB、IsdA、Opp3a、DltA、HtsA、LtaS、SdrH、SrtA、SpA、SBI、α-溶血素(hla)、β-溶血素、纤连蛋白结合蛋白A(fnbA)、凝固酶、map、Panton-Valentine杀白细胞素(pvl)、γ-毒素(hlg)、ica、免疫显性ABC转运蛋白、RAP、自溶素、层粘连蛋白受体、IsaA/PisA、IsaB/PisB、SPOIIIE、SsaA、EbpS、SasF、SasH、EFB(FIB)、FnbB、Npase、EBP、骨唾液酸结合蛋白II(bone sialo bindingprotein II)、金黄色葡萄球菌金属蛋白酶(aureolysin)前体(AUR)/Sepp1、Can、TSST-1、mecA、dPNAG、GehD、EbhA、EbhB、SSP-1、SSP-2 HBP、玻连蛋白结合蛋白、HarA、肠毒素A、肠毒素B、肠毒素C1以及新自溶素。
在一实施方案中，本发明的免疫原性组合物进一步包含佐剂、缓冲剂、冷冻保护剂、盐、二价阳离子、非离子型去污剂、自由基氧化抑制剂、稀释剂或载体中的至少一种。在一实施方案中，本发明的免疫原性组合物内的佐剂是基于铝的佐剂。在一实施方案中，所述佐剂是选自磷酸铝、硫酸铝和氢氧化铝的基于铝的佐剂。在一实施方案中，所述佐剂为磷酸铝。
佐剂是在与免疫原或抗原一起施用时增强免疫应答的物质。据证实许多细胞因子或淋巴因子具有免疫调节活性，并且因此可以与佐剂相同或相似的方式有用，其包括但不限于白介素1-α、1-β、2、4、5、6、7、8、10、12(参见，例如，美国专利第5,723,127号)、13、14、15、16、17和18(及其突变形式)；干扰素-α、β和γ；粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(参见，例如，美国专利第5,078,996号和ATCC登录号39900)；巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)；粒细胞集落刺激因子(G-CSF)；以及肿瘤坏死因子α和β。有益于本文所述的免疫原性组合物的其他佐剂包括趋化因子，包括但不限于MCP-1、MIP-1α、MIP-1β和RANTES；粘附分子，例如选择素，如L-选择素、P-选择素和E-选择素；粘蛋白样分子，例如，CD34、GlyCAM-1和MadCAM-1；整联蛋白家族成员，如LFA-1、VLA-1、Mac-1和p150.95；免疫球蛋白超家族成员，例如PECAM，ICAM，如ICAM-1、ICAM-2和ICAM-3，CD2和LFA-3；共刺激分子，如B7-1、B7-2、CD40和CD40L；生长因子，包括血管生长因子、神经生长因子、成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、PDGF、BL-1和血管内皮生长因子；受体分子，包括Fas、TNF受体、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2和DR6；以及半胱天冬蛋白酶，包括ICE。
用来增强免疫应答的合适的佐剂可以进一步包括但不限于美国专利第4,912,094号所述的MPLTM(3-O-脱酰单磷酰脂质A，Corixa；Hamilton，MT)。合成的脂质A类似物或氨基烷基磷酸葡糖胺化合物(AGP)，或者其衍生物或类似物也适合用作佐剂，其可从Corixa获得，并且如美国专利第6,113,918号所述。一种这样的AGP为2-[(R)-3-十四酰基氧基十四酰氨基]乙基2-脱氧-4-O-膦酰基-3-O-[(R)-3-四癸酰基氧基十四酰]-2-[(R)-3-十四酰氧十四酰-氨基]-b-D-吡喃葡萄糖苷，其也称为529(以前称为RC529)。这种529佐剂配制为水性形式(AF)或者为稳定的乳剂(SE)。
其他佐剂包括胞壁酰肽，如N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-降胞壁酰-L-丙氨酸-2-(1′-2′二棕榈酰基-sn-甘油基-3-羟基磷酰基氧基)-乙胺(MTP-PE)；水包油乳剂，如MF59(美国专利第6,299,884号)(含有5％角鲨烯、0.5％聚山梨酯80和0.5％司盘85(任选含有各种量的MTP-PE)，利用诸如Model 110Y微射流机(Microfluidics，Newton，MA)的微射流机配制为亚微粒子)和SAF(含有10％角鲨烯、0.4％聚山梨酯80、5％普流罗尼克-嵌段聚合物L121和thr-MDP，微射流为亚微乳剂或者涡旋以产生较大粒径的乳剂)；不完全弗氏佐剂(IFA)；铝盐(明矾)，如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝；爱菲金；阿夫立定；L121/角鲨烯；D-丙交酯-聚交酯/苷；普流罗尼克多元醇；杀死的博德特氏菌(Bordetella)；皂草苷，如美国专利第5,057,540号所述的StimulonTM QS-21(Antigenics，Framingham，MA.)，美国专利第5,254,339号所述的
Figure BPA00001514847900241
(CSL Limited，Parkville，Australia)以及免疫刺激复合物(ISCOMS)；结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)；细菌脂多糖；合成的多核苷酸，如含有CpG基序的寡核苷酸(例如，美国专利第6,207,646号)；IC-31(Intercell AG，Vienna，Austria)，如EP专利第1,296,713号和第1,326,634号所述；百日咳毒素(PT)或其变体、霍乱毒素或其变体(例如，美国专利号7,285,281、7,332,174、7,361,355和7,384,640)；或者大肠杆菌不耐热毒素(LT)或其变体，特别是LT-K63、LT-R72(例如，美国专利号6,149,919、7,115,730和7,291,588)。
所述免疫原性组合物可以任选包含药学可接受的载体。术语“药学可接受的载体”表示联邦管理机构、州政府或其他管理机构批准的载体，或者美国药典或用于动物(包括人以及非人哺乳动物)的其他普遍公认的药典所列的载体。术语“载体”指与药物组合物一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。水、盐溶液以及水性葡萄糖和甘油溶液可以用作液体载体，特别是用于可注射的溶液。合适的药物载体的实例如E.W.Martin的″Remington′s Pharmaceutical Sciences″所述。制剂应当适合施用模式。
本发明的免疫原性组合物可以进一步包含一种或多种额外的“免疫调节剂”，所述免疫调节剂是扰乱或改变免疫系统的物质，从而观察到体液和/或细胞介导的免疫的上调或下调。在一实施方案中，提供免疫系统的体液和/或细胞介导的上调的手段。某些免疫调节剂的实例包括，例如，美国专利第5,254,339号等所述的佐剂或细胞因子，或者
Figure BPA00001514847900242
(C SL Limited；Parkville，Australia)。可以用于本发明的免疫原性组合物的佐剂的非限制性实例包括RIBI佐剂系统(Ribi Inc.；Hamilton，MT)，明矾，诸如氢氧化铝凝胶的矿物凝胶，水包油乳剂，油包水乳剂，例如弗氏完全和不完全佐剂，嵌段共聚物(CytRx；Atlanta，GA)，QS-21(Cambridge Biotech Inc.；Cambridge，MA)，SAF-M(Chiron；Emeryville，CA)，佐剂，皂草苷，Quil A或其他皂草苷组分，单磷酰脂质A以及阿夫立定脂质-胺佐剂。在本发明的免疫原性组合物中有用的水包油乳剂的非限制性实例包括改良的SEAM62和SEAM 1/2制剂。改良的SEAM62是含有5％(v/v)角鲨烯(Sigma)、1％(v/v)
Figure BPA00001514847900244
85去污剂(ICI表面活性剂)、0.7％(v/v)聚山梨酯80去污剂(ICI表面活性剂)、2.5％(v/v)乙醇、200mcg/ml Quil A、100mcg/ml胆固醇以及0.5％(v/v)卵磷脂的水包油乳剂。改良的SEAM 1/2是包含5％(v/v)角鲨烯、1％(v/v)
Figure BPA00001514847900251
85去污剂、0.7％(v/v)聚山梨酯80去污剂、2.5％(v/v)乙醇、100mcg/ml Quil A以及50mcg/ml胆固醇的水包油乳剂。可以包括在所述免疫原性组合物中的其他“免疫调节剂”包括，例如，一种或多种白介素、干扰素、或者其他已知的细胞因子或趋化因子。在一实施方案中，所述佐剂可以是环糊精衍生物或聚阴离子聚合物，分别如美国专利第6,165,995号和第6,610,310号所述。应当理解待使用的免疫调节剂和/或佐剂取决于施用所述免疫原性组合物的对象、注射途径以及待施用的注射的数量。
除了多种葡萄球菌荚膜多糖-蛋白缀合物，本发明的免疫原性组合物可以进一步包含一种或多种防腐剂。FDA要求多个剂量(多剂量)小瓶中的生物制品含有防腐剂，仅有少数例外。含有防腐剂的疫苗产品包括含有苄索氯铵(炭疽)、2-苯氧乙醇(DTaP、HepA、Lyme、脊髓灰质炎(肠胃外))、苯酚(Pneumo、伤寒(肠胃外)、牛痘)和硫柳汞(DTaP、DT、Td、HepB、Hib、流感、JE、Mening、Pneumo、狂犬病)的疫苗。批准用于可注射的药物的防腐剂包括，例如，三氯叔丁醇、间甲苯酚、羟苯甲酯、羟苯丙酯、2-苯氧乙醇、苄索氯铵、苯扎氯铵、苯甲酸、苯甲醇、苯酚、硫柳汞以及硝酸苯汞。
本发明的制剂可以进一步包含缓冲剂、盐、二价阳离子、非离子型去污剂、冷冻保护剂(诸如糖)以及抗氧化剂(诸如自由基清除剂或螯合剂)中的一种或多种，或者它们的任何多种组合。任何一种组分(例如，螯合剂)的选择可以决定另一组分(例如，清除剂)是否可取。为施用配制的最终组合物应当无菌和/或无热原。技术人员可以根据各种因素，例如所需的特定储存和施用条件，凭经验确定这些和其他组分的哪种组合包括在本发明的含有防腐剂的免疫原性组合物中是最佳的。
在某些实施方案中，与肠胃外施用相容的本发明的制剂包含一种或多种生理可接受的缓冲剂，其选自但不限于Tris(trimethamine)、磷酸盐、乙酸盐、硼酸盐、柠檬酸盐、甘氨酸、组氨酸和琥珀酸盐。在某些实施方案中，将所述制剂缓冲至约6.0-约9.0的pH范围内，优选约6.4-约7.4。
在某些实施方案中，调整本发明的免疫原性组合物或制剂的pH是可取的。可以利用本领域的标准技术调整本发明的制剂的pH。可以将所述制剂的pH调整至3.0-8.0。在某些实施方案中，所述制剂的pH可以是、或者可以调整至3.0-6.0、4.0-6.0或5.0-8.0。在其他实施方案中，所述制剂的pH可以是、或者可以调整至约3.0、约3.5、约4.0、约4.5、约5.0、约5.5、约5.8、约6.0、约6.5、约7.0、约7.5或约8.0。在某些实施方案中，pH可以是、或者可以调整至范围为4.5-7.5、或者4.5-6.5、5.0-5.4、5.4-5.5、5.5-5.6、5.6-5.7、5.7-5.8、5.8-5.9、5.9-6.0、6.0-6.1、6.1-6.2、6.2-6.3、6.3-6.5、6.5-7.0、7.0-7.5或7.5-8.0。在特定实施方案中，所述制剂的pH为约5.8。
在某些实施方案中，与肠胃外施用相容的本发明的制剂包含一种或多种二价阳离子，包括但不限于MgCl2、CaCl2和MnCl2，浓度范围为约0.1mM-约10mM，优选最多约5mM。
在某些实施方案中，与肠胃外施用相容的本发明的制剂包含一种或多种盐，包括但不限于氯化钠、氯化钾、硫酸钠和硫酸钾，以肠胃外施用时对象生理可接受的离子强度存在，并且以在最终制剂中产生所选的离子强度或摩尔渗透压浓度的终浓度包括在内。所述制剂的最终离子强度或重量摩尔渗透压浓度是由多种组分(例如，来自缓冲化合物和其他非缓冲盐的离子)决定的。优选的盐NaCl以多达约250mM的范围存在，选择盐浓度以补足其他组分(例如，糖)使得所述制剂的最终总摩尔渗透压浓度与肠胃外施用(例如，肌肉内或皮下注射)相容，并且会提高所述免疫原性组合物制剂的免疫原性组分在各种温度范围中的长期稳定性。不含盐的制剂会容忍增加的一种或多种所选冷冻保护剂的范围以维持期望的最终摩尔渗透压浓度水平。
在某些实施方案中，与肠胃外施用相容的本发明的制剂包含一种或多种冷冻保护剂，其选自但不限于二糖(例如，乳糖、麦芽糖、蔗糖或海藻糖)和多羟基烃(例如，卫矛醇、甘油、甘露醇和山梨醇)。
在某些实施方案中，所述制剂的摩尔渗透压浓度在约200mOs/L-约800mOs/L的范围内，优选约250mOs/L-约500mOs/L或者约300mOs/L-约400mOs/L的范围。不含盐的制剂可以含有例如约5％-约25％蔗糖，并且优选约7％-约15％或者约10％-约12％蔗糖。或者，不含盐的制剂可以含有例如约3％-约12％山梨醇，并且优选约4％-7％或者约5％-约6％山梨醇。如果加入诸如氯化钠的盐，则蔗糖或山梨醇的有效范围相对减少。这些和其他这样的重量摩尔渗透压浓度和摩尔渗透压浓度考虑因素在本领域技术范围内。
在某些实施方案中，与肠胃外施用相容的本发明的制剂包含一种或多种自由基氧化抑制剂和/或螯合剂。各种自由基清除剂和螯合剂是本领域已知的，并且应用于本文所述的制剂和使用方法。实例包括但不限于乙醇、EDTA、EDTA/乙醇组合、三乙醇胺、甘露醇、组氨酸、甘油、柠檬酸钠、肌醇六磷酸酯、三聚磷酸盐、抗坏血酸/抗坏血酸盐、琥珀酸/琥珀酸盐、苹果酸/马来酸盐、得斯芬、EDDHA和DTPA，以及两种或更多种以上物质的各种组合。在某些实施方案中，可以有效提高所述制剂的长期稳定性的浓度加入至少一种非还原性自由基清除剂。还可以各种组合加入一种或多种自由基氧化抑制剂/螯合剂，例如清除剂与二价阳离子。螯合剂的选择会决定是否需要加入清除剂。
在某些实施方案中，与肠胃外施用的相容的本发明的制剂包含一种或多种非离子表面活性剂，包括但不限于聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯，聚山梨酯-80(吐温80)、聚山梨酯-60(吐温60)、聚山梨酯-40(吐温40)和聚山梨酯-20(吐温20)，聚氧乙烯烷基醚，包括但不限于Brij 58、Brij 35，以及其他如曲通X-100；曲通X-114、NP40、司盘85和非离子表面活性剂的普流罗尼克系列(例如，普流罗尼克121)，优选组分为约0.001％-约2％(优选最多约0.25％)浓度的聚山梨酯-80或约0.001％-1％(优选最多约0.5％)浓度的聚山梨酯-40。
在某些实施方案中，本发明的制剂包含一种或多种额外的适合肠胃外施用的稳定剂，例如，包含至少一个巯基(-SH)的还原剂(例如，半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸、还原谷胱甘肽、巯基乙酸钠、硫代硫酸盐、硫代甘油，或者它们的混合物)。可选地或任选地，可以通过从储存容器去除氧、保护所述制剂免受光照(例如，通过使用琥珀色玻璃容器)来进一步稳定本发明的含有防腐剂的免疫原性组合物制剂。
本发明的含有防腐剂的免疫原性组合物制剂可以包含一种或多种药学可接受的载体或赋形剂，其包括本身不诱导免疫应答的任何赋形剂。合适的赋形剂包括但不限于大分子，例如蛋白、糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物、蔗糖(Paoletti et al，2001，Vaccine，19：2118)、海藻糖、乳糖和脂质团聚体(如油滴或脂质体)。这类载体是技术人员公知的。药学可接受的赋形剂如Gennaro，2000，Remington：The Science and Practice ofPharmacy，20th edition，ISBN：0683306472所讨论。
本发明的组合物可以是冻干的或水性形式，即溶液剂或混悬剂。液体制剂可以有利地直接从其包装形式施用，因此对于注射是理想的，不需要如本发明的冻干组合物另有要求地重建于水性介质中。
将本发明的免疫原性组合物直接递送至对象可以通过肠胃外施用(肌肉内、腹腔内、皮内、皮下、静脉内或者至组织的胞间隙)来完成；或者通过直肠、口服、阴道、体表、透皮、鼻内、眼部、耳部、肺部或其他粘膜施用。在一优选实施方案中，肠胃外施用通过肌肉内注射，例如至对象的大腿或上臂。注射可以通过针(例如，皮下针)，但是可替代地使用无针注射。典型的肌肉内剂量为0.5mL。本发明的组合物可以制备为各种形式，例如，作为液体溶液剂或混悬剂用于注射。在某些实施方案中，所述组合物可以制备为粉剂或喷雾剂用于肺部施用，例如，在吸入器中。在其他实施方案中，所述组合物可以制备为栓剂或阴道栓剂，或者对于鼻部、耳部、或眼部施用，例如，作为喷雾剂、滴剂、凝胶剂或粉剂。
每个免疫原性组合物剂量中缀合物的量选择为诱导没有显著副作用的免疫保护应答的量。这样的量可以根据葡萄球菌血清型变化。通常，每个剂量包含0.1-100μg多糖，特别是0.1-10μg，并且更特别是1-5μg。
特定免疫原性组合物的组分的最佳量可以通过标准研究来确定，包括观察对象中的适当免疫应答。初始免疫接种之后，对象可以接受充分间隔的一次或多次加强免疫。
包装和剂型
本发明的免疫原性组合物可以包装为单位剂量或多剂量形式(例如2个剂量、4个剂量或更多)。对于多剂量形式，小瓶相对于预灌装注射器一般是优选的但非必须优选的。合适的多剂量形式包括但不限于：2-10剂量/容器，0.1-2mL/剂量。在某些实施方案中，所述剂量为0.5mL剂量。参见，例如，国际专利申请WO2007/127668，其援引加入本文。
组合物可以存在于小瓶或其他合适的储存容器中，或者可以存在于预灌装的递送装置中，例如，单一组分或多组分注射器，其可以带或不带针头供应。虽然也设想多剂量、预灌装注射器，但是注射器通常但不必须含有单剂量的本发明的含有防腐剂的免疫原性组合物。同样地，小瓶可以包括单剂量，但是可替代地包括多剂量。
有效剂量体积可以常规建立，但是注射用组合物的一般剂量具有0.5mL的体积。在某些实施方案中，将所述剂量配制为施用于人类对象。在某些实施方案中，将所述剂量配制为施用于成年、青年(teen)、少年(adolescent)、幼儿或婴儿(即，不超过一岁)人类对象，并且在优选实施方案中可以通过注射施用。
本发明的液体免疫原性组合物还适合重建以冻干形式存在的其他免疫原性组合物。当免疫原性组合物用于这种即时重建时，本发明提供试剂盒，其具有两个或更多个小瓶，两个或更多个已灌装的注射器，或者每种一个或多个，所述注射器的内容物用来在注射之前重建所述小瓶的内容物，或者反之亦然。
或者，本发明的免疫原性组合物可以冻干和重建，例如，利用本领域公知的用于冻干的多种方法中的一种以形成干燥、规则形状(例如，球形)的颗粒，例如微颗粒或微球体，其具有诸如平均直径大小的颗粒特征，所述平均直径大小可以通过改变用于制备它们的确切方法来选择和控制。所述免疫原性组合物可以进一步包含佐剂，其可以任选与单独的干燥、规则形状(例如，球形)的颗粒(例如，微颗粒或微球体)制备，或者包含在单独的干燥、规则形状(例如，球形)的颗粒(例如，微颗粒或微球体)中。在这类实施方案中，本发明进一步提供免疫原性组合物试剂盒，其包含第一组分和第二组分，所述第一组分包括稳定的干燥免疫原性组合物，任选进一步包含本发明的一种或多种防腐剂，所述第二组分包含用于重建所述第一组分的无菌的水溶液。在某些实施方案中，所述水溶液包含一种或多种防腐剂，并且可以任选包含至少一种佐剂(参见，例如，WO2009/109550(援引加入本文)。
在另一实施方案中，多剂量形式的容器选自由以下容器组成的组中的一种或多种，但是不限于一般实验室玻璃器皿、瓶、烧杯、量筒、发酵罐、生物反应器、管(tubing)、管(pipe)、袋、罐、小瓶、小瓶塞(例如，胶塞、螺帽)、安瓿、注射器、双室或多室注射器、注射器塞、注射器柱塞、橡皮塞、塑料瓶盖、玻璃瓶塞、药筒和一次性笔等。本发明的容器不受制造材料限制，并且包括诸如玻璃、金属(例如，钢、不锈钢、铝等)和聚合物(例如，热塑性塑料、弹性体、热塑性塑料-弹性体)的材料。在特定实施方案中，所述形式的容器是具有丁基瓶塞的5mL Schott 1型玻璃小瓶。技术人员应当理解上文所示的形式并不是详尽的清单，而仅仅作为对技术人员的关于本发明可用的各种形式的指导。考虑用于本发明的其他形式可以在来自诸如United States Plastic Corp.(Lima，OH)，VWR的实验室设备供应商和制造商的出版的产品目录中找到。
制备免疫原性缀合物的方法
本发明还包括制备本文所述的免疫原性缀合物的方法。制备本发明的免疫原性缀合物的方法包括利用缀合化学将所述荚膜多糖与所述载体蛋白共价缀合，所述缀合化学包括CDI(1，1-羰基二咪唑)、CDT(1，1-羰基-二-1，2，4-三唑)或PDPH(3-(2-吡啶二硫代)-丙酰肼)。
相应地，本发明的一实施方案提供制备包含缀合至载体蛋白的金黄色葡萄球菌血清型5或8荚膜多糖的免疫原性缀合物的基于CDT的方法，所述方法包括以下步骤：a)使金黄色葡萄球菌血清型5或8荚膜多糖与咪唑或三唑复合以产生复合多糖；b)使所述多糖与CDT在有机溶剂和约0.1％-约0.3％w/v水中反应以产生活化的血清型5或8荚膜多糖；c)纯化所述活化的血清型5或8荚膜多糖以产生纯化的活化的血清型5或8荚膜多糖；d)使所述纯化的活化的血清型5或8荚膜多糖与载体蛋白在有机溶剂中反应以产生血清型5或8荚膜多糖∶载体蛋白缀合物；以及e)水解所述血清型5或8荚膜多糖∶载体蛋白缀合物以去除未反应的活化基团；从而产生包含缀合至载体蛋白的金黄色葡萄球菌血清型5或8荚膜多糖的免疫原性缀合物。在一实施方案中，在步骤(d)之前，将所述纯化的活化的血清型5或8荚膜多糖与载体蛋白复合。
在本发明的一实施方案中，提供制备包含缀合至载体蛋白的金黄色葡萄球菌血清型5或8荚膜多糖的免疫原性缀合物的另一基于CDT的方法，所述方法包括以下步骤：a)将金黄色葡萄球菌血清型5或8荚膜多糖与咪唑或三唑复合以产生复合多糖；b)使所述复合多糖与CDT在有机溶剂和约0.1％-约0.3％w/v水中反应以产生活化的血清型5或8荚膜多糖；c)使所述活化的血清型5或8荚膜多糖与载体蛋白在有机溶剂中反应以产生血清型5或8荚膜多糖∶载体蛋白缀合物；以及d)水解所述血清型5或8荚膜多糖∶载体蛋白缀合物以去除未反应的活化基团；从而产生包含缀合至载体蛋白的金黄色葡萄球菌血清型5或8荚膜多糖的免疫原性缀合物。
在一实施方案中，制备免疫原性缀合物的基于CDT的方法内的有机溶剂是极性非质子溶剂。在一实施方案中，所述有机溶剂是选自二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基乙酰胺、N-甲基-2-吡咯烷酮和六甲基磷酰胺(HMPA)的极性非质子溶剂。在一实施方案中，所述有机溶剂是DMSO。
在一实施方案中，制备免疫原性缀合物的基于CDT的方法内的使所述复合多糖与CDT反应的步骤包括提供与所述多糖相比约20倍摩尔过量的CDT。
在一实施方案中，制备免疫原性缀合物的基于CDT的方法内的纯化所述活化的血清型5或8荚膜多糖的步骤包括渗滤。
在一实施方案中，制备免疫原性缀合物的基于CDT的方法内的载体蛋白是CRM197。在一实施方案中，使制备免疫原性缀合物的方法内的活化的血清型5或8荚膜多糖与所述CRM197以约1∶1的重量比反应。
在一实施方案中，制备免疫原性缀合物的基于CDT的方法内的水解所述血清型5或8多糖∶载体蛋白缀合物以去除未反应的活化基团的步骤包括稀释入缓冲液，并且在约20℃-约26℃下维持约8.8-约9.2的pH至少4小时。在一实施方案中，水解所述血清型5或8荚膜多糖∶载体蛋白缀合物的步骤包括稀释入缓冲液，并且在约23℃下维持约9.0的pH至少4小时。
在一实施方案中，将根据制备免疫原性缀合物的基于CDT的方法制备的血清型5或8荚膜多糖∶载体蛋白缀合物纯化。在一实施方案中，所述血清型5或8荚膜多糖∶载体蛋白缀合物的纯化包括渗滤。
在一实施方案中，在制备免疫原性缀合物的基于CDT的方法内使所述复合多糖与CDT反应之前，将所述复合血清型5或8多糖冻干并重悬。在一实施方案中，在使所述复合多糖与CDT反应之前，将所述复合多糖和所述载体蛋白分别冻干和重悬。在一实施方案中，将冻干的复合多糖和/或冻干的载体蛋白重悬在有机溶剂中。在一实施方案中，所述有机溶剂是DMSO。
在一实施方案中，在制备免疫原性缀合物的基于CDT的方法内使所述活化的复合血清型5或8荚膜多糖与载体蛋白反应之前，将所述纯化的活化的血清型5或8荚膜多糖和所述载体蛋白分别冻干和重悬。在一实施方案中，所述载体蛋白是CRM197，并且在冻干之前将所述CRM197对NaCl渗滤。在一实施方案中，冻干之前，将所述CRM197对NaCl渗滤，并且将NaCl/CRM的w/w比例调整至约0.5-约1.5。
本发明的一实施方案提供制备包含缀合至载体蛋白的金黄色葡萄球菌血清型5或8荚膜多糖的免疫原性缀合物的基于PDPH的方法，所述方法包括以下步骤：a)使金黄色葡萄球菌血清型5或8荚膜多糖与PDPH和碳二亚胺在有机溶剂中反应以产生PDPH连接的多糖；b)使所述PDPH连接的多糖与还原剂反应以产生活化的多糖；c)纯化所述活化的血清型5或8荚膜多糖以产生纯化的活化的血清型5或8荚膜多糖；d)使载体蛋白与溴乙酸在有机溶剂中反应以产生活化的载体蛋白；e)纯化所述活化的载体蛋白以产生纯化的活化的载体蛋白；f)使所述纯化的活化的血清型5或8荚膜多糖与所述纯化的活化的载体蛋白反应以产生血清型5或8荚膜多糖∶载体蛋白缀合物；以及g)水解所述血清型5或8荚膜多糖∶载体蛋白缀合物以去除未反应的活化基团；从而产生包含缀合至载体蛋白的金黄色葡萄球菌血清型5或8荚膜多糖的免疫原性缀合物。
在一实施方案中，在制备免疫原性缀合物的基于PDPH的方法内使用的溴乙酸是溴乙酸的N-羟基琥珀酰亚胺酯(BAANS)。在一实施方案中，在本发明的基于PDPH的方法内使用的载体蛋白是CRM197，并且以约1∶0.1-约1∶0.5的CRM197∶BAANS重量比加入所述BAANS。
在一实施方案中，制备免疫原性缀合物的基于PDPH的方法内的有机溶剂是极性非质子溶剂。在一实施方案中，所述有机溶剂是选自DMSO、DMF、二甲基乙酰胺、N-甲基-2-吡咯烷酮和HMPA的极性非质子溶剂。在一实施方案中，所述有机溶剂是DMSO。
在一实施方案中，在制备免疫原性缀合物的基于PDPH的方法内使用的碳二亚胺是1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDAC)。在一实施方案中，使所述血清型5或8荚膜多糖与PDPH和EDAC在有机溶剂中反应的步骤包括维持约1∶5∶3的多糖∶PDPH∶EDAC重量比。
在一实施方案中，在制备免疫原性缀合物的基于PDPH的方法内使用的还原剂是二硫苏糖醇(DTT)。
在一实施方案中，制备免疫原性缀合物的基于PDPH的方法内的纯化所述活化的血清型5或8荚膜多糖和纯化所述载体蛋白的步骤各自包括渗滤。
在一实施方案中，制备免疫原性缀合物的基于PDPH的方法内的载体蛋白是CRM197。在一实施方案中，使制备免疫原性缀合物的方法内的活化的血清型5或8多糖与所述CRM197以约1∶1的重量比反应。
在一实施方案中，制备免疫原性缀合物的基于PDPH的方法内的水解所述血清型5或8多糖∶载体蛋白缀合物以去除未反应的活化基团的步骤包括添加半胱胺盐酸盐。
在一实施方案中，将根据制备免疫原性缀合物的基于PDPH的方法制备的血清型5或8荚膜多糖∶载体蛋白缀合纯化。在一实施方案中，所述血清型5或8荚膜多糖∶载体蛋白缀合物的纯化包括渗滤。
在一实施方案中，在制备免疫原性缀合物的基于PDPH的方法内使所述纯化的活化的血清型5或8荚膜多糖与所述纯化的活化的载体蛋白反应之前，将所述分离的活化的多糖和所述纯化的活化的载体蛋白分别冻干和重悬。在一实施方案中，将冻干的活化的多糖和/或冻干的活化的载体蛋白重悬在有机溶剂中。在一实施方案中，所述有机溶剂是DMSO。
在本文中使用时，“冻干”表示脱水过程，其中将细菌荚膜多糖冷冻，同时在存在足够热量的情况下降低周围压力以允许冷冻水从固相直接升华至气相。可以使用本领域已知的用于冻干多糖的任何方法。参见，例如，Harris & Angal(1989)″Protein Purification Methods，″In：Kennedy & Cabral，eds.″Recovery Processes for Biological Materials″(John Wiley & Sons；1993)；美国专利第4,134,214号；以及国际专利申请公开第WO 2003/086471号；每个整体援引加入本文。任选地，冻干期间可以包括冷冻保护剂，例如蔗糖、葡萄糖、乳糖、海藻糖、阿拉伯糖、木糖、半乳糖、山梨醇或甘露醇。
在本文中使用时，“活化(activate)”和“活化(activation)”表示以这样的方式修饰细菌荚膜多糖或载体蛋白，使其适合缀合(即，必须使至少一个部分能够共价结合至载体分子)。例如，对于本发明的基于CDT的缀合方法，将所述多糖在低湿度环境中(例如，在DMSO中)活化以形成具有可用的羟基的三唑氨基甲酸酯部分和具有羧酸的酰基三唑部分。然后可以使活化的多糖与CRM197蛋白反应，这导致三唑被CRM197内的赖氨酸残基亲核置换，并且形成氨基甲酸酯键(活化的羟基)和酰胺键(活化的羧酸)。相比之下，对于本发明的基于PDPH的缀合方法，在缀合之前将所述载体蛋白和所述多糖活化：1)CRM197的活化包括通过使胺基与溴乙酸的N-羟基琥珀酰亚胺酯反应来将溴乙酰基引入所述CRM197蛋白；以及2)多糖的活化包括将所述多糖中碳二亚胺活化的N-乙酰甘露糖氨基糖醛酸(N-acetylmannosaminouronic acid)的羧酸酯基团偶联至巯基反应性的酰肼异型双功能接头PDPH的酰肼基团，然后用DTT还原。然后可以使活化的多糖与活化的载体蛋白反应，从而PDPH-硫醇化多糖的巯基与活化的载体蛋白的溴乙酰基反应，导致通过溴置换形成共价硫醚键。
根据本发明的方法，可以纯化荚膜多糖、载体蛋白和/或多糖-蛋白缀合物。可以使用本领域已知的用于纯化多糖或蛋白的任何方法，如浓缩/渗滤、沉淀/洗脱、柱层析和深层过滤。参见，例如，Farrés et al.(1996)Biotechnol.Tech.10：375-380；
Figure BPA00001514847900341
et al.In：Communicating Current Research andEducational Topics and Trends in Applied Microbiology(Antonio Mendez Vilas，ed.1st ed.Badajoz，Espanha：Formatex；2007.pp.450-457)；Tanizaki et al.(1996)J.Microbiol.Methods 27：19-23；以及美国专利第6,146,902号；以及美国专利申请公开第2008/0286838号；每个整体援引加入本文。
在本文中使用时，术语“分离的”或“纯化的”表示物质被从其原来的环境移出(例如，如果其是天然存在的，自然环境，或者如果其是重组实体，从其宿主生物，或者从一个环境移至不同环境)。例如，分离的多糖、肽或蛋白基本上不含来自细胞或组织来源的细胞物质或其他污染蛋白，所述蛋白来源于所述细胞或组织来源，或者基本上不含化学合成时或以其他方式存在于作为化学反应的部分的混合物中的化学前体或其他化学物质。在本发明中，所述蛋白或多糖可以分离自细菌细胞或细胞碎片，从而以有益于制备免疫原性组合物的方式提供它们。术语“分离的(isolated)”或“分离(isolating)”可以包括纯化(purifying)或纯化(purification)，包括例如，如本文所述的纯化所述荚膜多糖的方法。语言“基本上不含细胞物质”包括多糖/多肽/蛋白制品，其中所述多糖/多肽/蛋白分离自细胞的细胞组分，所述多糖/多肽/蛋白从所述细胞分离或重组产生。因此，基本上不含细胞物质或其他化合物的多肽/蛋白、多糖或缀合物包括含有少于约30％、20％、10％、5％、2.5％或1％(干重)的污染蛋白、多糖或其他化合物的多肽/蛋白、多糖或缀合物制品。当所述多肽/蛋白是重组产生的时，其还优选基本上不含培养基，即，培养基占少于约20％、10％、5％、4％、3％、2％或1％的蛋白制品体积。当多肽/蛋白或多糖是通过化学合成产生的时，其优选基本上不含化学前体或其他化学物质，即，其与所述蛋白或多糖合成所涉及的化学前体或其他化学物质分开。相应地，这类多肽/蛋白或多糖制品含有少于约30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％或1％(干重)的除所关注的多肽/蛋白或多糖片段之外的化学前体或化合物。
可以将通过本文所述的任何方法制备的免疫原性缀合物储存在水或低离子强度中性pH缓冲液中，或者冻干为干粉。
诱导免疫应答和防范金黄色葡萄球菌感染的方法
本发明还包括使用本文所述的免疫原性组合物的方法。例如，本发明的一实施方案提供诱导针对金黄色葡萄球菌的免疫应答的方法，所述方法包括向对象施用免疫原性量的任何本文所述的免疫原性组合物。本发明的一实施方案提供保护对象免受金黄色葡萄球菌感染的方法，或者预防感染金黄色葡萄球菌的方法，或者降低与金黄色葡萄球菌所引起的感染相关的至少一种症状的严重程度或延迟与金黄色葡萄球菌所引起的感染相关的至少一种症状的发生的方法，所述方法包括向对象施用免疫原性量的任何本文所述的免疫原性组合物。本发明的一实施方案提供治疗或预防对象中葡萄球菌感染、与葡萄球菌(Staphylococcus sp.)相关的疾病或疾病状况的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗或预防有效量的本文所述的免疫原性组合物的步骤。在一些实施方案中，治疗或预防葡萄球菌感染、疾病或疾病状况的方法包括人、兽医、动物或农业治疗。另一实施方案提供治疗或预防对象中的葡萄球菌感染、与葡萄球菌相关的疾病或疾病状况的方法，所述方法包括从本文所述的免疫原性组合物产生多克隆或单克隆抗体制品，并且利用所述抗体制品赋予所述对象被动免疫。本发明的一实施方案提供预防接受外科手术的对象中的葡萄球菌感染的方法，所述方法包括在所述外科手术之前向所述对象施用预防有效量的本文所述的免疫原性组合物的步骤。
对抗原或免疫原性组合物的“免疫应答”是对象中针对存在于所关注的抗原或疫苗组合物中的分子的体液和/或细胞介导的免疫应答的发展。为了本发明的目的，“体液免疫应答”是抗体介导的免疫应答，并且包括诱导和产生识别并亲和性结合本发明的免疫原性组合物中的抗原的抗体，而“细胞介导的免疫应答”是T-细胞和/或其他白细胞介导的免疫应答。“细胞介导的免疫应答”是由与主要组织相容性复合体(MHC)的I类分子或II类分子、CD1或者其他非经典MHC样分子相关的抗原表位的呈递激发的。这激活抗原特异性CD4+T辅助细胞或CD8+细胞毒性T淋巴细胞(″CTL″)。CTL对与经典或非经典MHC编码并在细胞表面上表达的蛋白联合呈递的肽抗原具有特异性。CTL辅助诱导和促进细胞内消灭细胞内微生物，或者裂解感染这类微生物的细胞。细胞免疫的另一方面包括辅助T-细胞的抗原特异性反应。辅助T-细胞辅助刺激功能，并且集中于非特异性效应细胞针对在细胞表面上与经典或非经典MHC分子联合展示肽或其他抗原的细胞的活性。“细胞介导的免疫应答”还指产生细胞因子、趋化因子以及活化的T-细胞和/或其他白细胞所产生的其他这类分子，包括来源于CD4+和CD8+T-细胞的分子。特定抗原或组合物刺激细胞介导的免疫应答的能力可以通过许多测定来确定，例如通过淋巴细胞增殖(淋巴细胞活化)测定、CTL细胞毒性细胞测定，通过测定敏化对象中所述抗原的特异性T-淋巴细胞，或者通过测量对抗原重新刺激反应的T细胞产生的细胞因子。这类测定是本领域公知的。参见，例如，Erickson et al.(1993)J.Immunol.151：4189-4199；和Doe et al.(1994)Eur.J.Immunol.24：2369-2376。
在本文中使用时，“治疗(treatment)”(包括其变体，例如，“治疗(treat)”或“治疗(treated)”)表示以下的任何一种或多种：(i)如在传统疫苗中，预防感染或再感染，(ii)降低症状的严重程度，或者消除症状，以及(iii)基本上或完全消除有问题的病原体或病症。因此，可以预防性(感染之前)或治疗性(感染之后)地实现治疗。在本发明中，预防性治疗是优选模式。根据本发明的具体实施方案，提供组合物和方法，其针对微生物感染(例如细菌，如葡萄球菌)治疗宿主动物，包括预防性和/或治疗性免疫。本发明的方法有益于赋予对象预防性和/或治疗性免疫。本发明的方法还可以施用于生物医学研究应用的对象。
在本文中使用时，“哺乳动物”表示人或非人动物。更特别地，哺乳动物指归类为哺乳动物的任何动物，包括人，家畜和农场动物，以及动物园、运动和宠物伴侣动物，如家庭宠物，以及其他驯化动物，包括但不限于牛、绵羊、雪貂、猪、马、兔、山羊、犬、猫等。优选伴侣动物为犬和猫。优选地，所述哺乳动物为人。
在本文中可交换使用的“免疫原性量”和“免疫学有效量”指如通过本领域技术人员已知的标准测定所测量的，足以引起免疫应答的抗原或免疫原性组合物的量，所述免疫应答为细胞(T-细胞)或体液(B-细胞或抗体)应答。
组合物中特定缀合物的量一般基于对所述缀合物缀合和非缀合的总多糖来计算。例如，含有20％游离多糖的CP5缀合物在100mcg CP5多糖剂量中会含有约80mcg缀合的CP5多糖和约20mcg非缀合的CP5多糖。在计算缀合物的剂量时通常不考虑蛋白对所述缀合物的贡献。缀合物的量可以根据葡萄球菌血清型变化。通常，每个剂量会包含0.01-100mcg多糖，特别地0.1-10mcg，并且更特别地1-10mcg。所述免疫原性组合物中不同多糖组分的“免疫原性量”可以不同，并且各自可以包含1mcg、2mcg、3mcg、4mcg、5mcg、6mcg、7mcg、8mcg、9mcg、10mcg、15mcg、20mcg、30mcg、40mcg、50mcg、60mcg、70mcg、80mcg、90mcg或者约100mcg的任何特定多糖抗原。
金黄色葡萄球菌“侵袭性疾病”是从正常无菌的部位分离细菌，其中有相关的疾病的临床体征/症状。正常无菌的身体部位包括血液、CSF、胸膜液、心包液、腹膜液、关节/滑液、骨、内部身体部位(淋巴结、脑、心脏、肝、脾、玻璃体液、肾、胰、卵巢)或者其他正常无菌的部位。特征为侵袭性疾病的临床疾病状况包括菌血症、肺炎、蜂窝组织炎、骨髓炎、心内膜炎、败血性休克等。
抗原作为免疫原的有效性可以通过增殖测定，通过细胞溶解测定(如铬释放测定以测量T细胞裂解其特异性靶细胞的能力)，或者通过测量B-细胞活性水平(通过测量血清中所述抗原的特异性循环抗体的水平来测量B-细胞活性水平)来测量。如本文所述，免疫应答还可以通过测量施用所述抗原之后诱导的抗原特异性抗体的血清水平来检测，并且更特别地，通过测量这样诱导的抗体增强特定白细胞的调理吞噬能力的能力。所述免疫应答的保护水平可以通过用已施用的抗原攻击免疫的宿主来测量。例如，如果期望免疫应答的抗原是细菌，免疫原性量的抗原所诱导的保护水平可以通过检测用所述细菌细胞攻击动物之后的存活百分比或死亡百分比来测量。在一实施方案中，保护量可以通过测量与细菌感染相关的至少一种症状来测量，例如，与感染相关的发热。多抗原或多组分疫苗或免疫原性组合物中每种抗原的量会相对于每种其他组分变化，并且可以通过技术人员已知的方法来确定。这类方法包括测量免疫原性和/或体内效力的方法。在某些实施方案中，术语“约”表示在20％内，优选在10％内，并且更优选在5％内。
本发明进一步提供抗体和抗体组合物，其特异性和选择性结合至本发明的血清型5或8荚膜多糖或者免疫原性缀合物。在一些实施方案中，在向对象施用本发明的血清型5或8荚膜多糖或者免疫原性缀合物时产生抗体。在一些实施方案中，本发明提供针对本发明的血清型5或8荚膜多糖或者免疫原性缀合物中的一种或多种的纯化或分离的抗体。在一些实施方案中，如通过在动物效力模型中杀死细菌或通过调理吞噬杀死测定所测量的，本发明的抗体是有功能的。在一些实施方案中，本发明的抗体赋予对象被动免疫。本发明进一步提供编码本发明的抗体或抗体片段的多核苷酸，以及利用本领域技术人员公知的技术产生本发明的抗体或抗体组合物的细胞、细胞系(例如杂交瘤细胞或者用于重组产生抗体的其他工程细胞系)或转基因动物。
本发明的抗体或抗体组合物可以用于治疗或预防与对象中的葡萄球菌感染、葡萄球菌相关的疾病或疾病状况，所述方法包括产生多克隆或单克隆抗体制品，并且利用所述抗体或抗体组合物赋予所述对象被动免疫。本发明的抗体还可以用于诊断方法，例如，检测CP5、CP8或其缀合物的存在或者定量CP5、CP8或其缀合物的水平。
本领域已知的几种动物模型可以用来评价本文所述的免疫原性组合物中的任何一种的效力。例如：
被动小鼠败血症模型：将小鼠用免疫IgG或单克隆抗体腹腔内(i.p.)被动免疫。24小时后将小鼠用致死剂量的金黄色葡萄球菌攻击。静脉内(i.v.或i.p.)施用细菌攻击，确保任何存活均可以归因于抗体与细菌的特异性体内相互作用。细菌攻击剂量确定为达到约20％未免疫的对照小鼠的致死败血症所需的剂量。存活研究的统计评价可以通过Kaplan-Meier分析来进行。
主动免疫和攻击模型：在这个模型中，将小鼠在第0、3和6周(或者本领域技术人员已知的相似的时间表)用靶抗原皮下(s.c.)主动免疫，并且在第8周(或者本领域技术人员已知的其他相似的时间表)通过静脉内或腹腔内途径用金黄色葡萄球菌攻击。细菌攻击剂量标定为在14天的时间内于对照组中达到约20％存活。存活研究的统计评价可以通过Kaplan-Meier分析来进行。
被动感染性心内膜炎模型：金黄色葡萄球菌所引起的感染性心内膜炎(IE)的被动免疫模型先前已用来显示ClfA可以诱导保护性免疫。参见，Vernachio et al.(2006)Antmicro.Agents & Chemo.50：511-518。在IE的这个模型中，兔或大鼠用来模拟临床感染，包括中心静脉导管、菌血症以及血行接种(hematogenous seeding)至远端器官。向具有无菌的主动脉瓣赘生物的插入导管的兔或大鼠施用对靶抗原特异性的单克隆或多克隆抗体的单个静脉内注射。24小时后，将动物用异源葡萄球菌菌株或MRSA菌株i.v.攻击。然后，攻击后48小时，将心脏赘生物、肾和血液收获并培养。然后测量贲门瓣赘生物、肾和血液中葡萄球菌感染的频率。在一研究中，当用MRSEATCC 35984或MRSA PFESA0003攻击动物时，利用ClfA的多克隆抗体制品或单克隆抗体显示出感染率的显著减少。参见上文的Vernachio et al.。
被动感染性心内膜炎模型：还使感染性心内膜炎模型适合主动免疫研究。将兔或大鼠用靶抗原肌肉内(i.m.)免疫，并且2周后通过i.v.途径用金黄色葡萄球菌攻击。
肾盂肾炎模型：在肾盂肾炎模型中，将小鼠在第0、3和6周(或者本领域技术人员已知的相似的时间表)用靶抗原免疫。在第8周，通过例如i.p.注射例如1.7x 108cfu金黄色葡萄球菌PFESA0266来攻击动物。48小时后，将肾和/或其他组织收获并培养。最后，在肾和/或组织中计数攻击细菌的菌落形成单位。这个模型评价动物中的全身性散布。
利用调理吞噬杀死测定监测功能抗体
来自细胞系(例如HL60)或多形核细胞(PMN)的分化的效应细胞可以用于本测定，所述多形核细胞(PMN)是利用
Figure BPA00001514847900391
-聚溶液(Cedarlane laboratories limited，Ontario，Canada)按照制造商的方案从供体人体血液分离的。将效应细胞以约2X107个细胞/ml的浓度重悬于测定缓冲液(含有1％牛血清白蛋白的改良伊格尔培养基)中，并且放置在37℃培养箱中直至准备使用。使金黄色葡萄球菌菌株PFESA0266在胰胨豆胨琼脂平板上生长过夜。将细菌细胞刮下，洗涤2次并重悬于含有5％甘油的测定缓冲液中至OD600＝1，这等于约5X108cfu/ml的浓度。将1ml等分的细菌悬浮液冷冻并储存在-40℃下直至准备使用。将冷冻的细菌悬浮液解冻，在测定缓冲液中调整至106cfu/ml的浓度并放置在冰上。利用无菌的96深孔1ml聚丙烯板进行测定。制备2倍连续稀释的抗体样品(50μl)，然后将300μl测定缓冲液加入抗体混合物。将细菌加入(50μl)板，并且在4℃下放置于旋转振荡器上30分钟。调理步骤之后加入50μl人补体(1％终浓度)。最后，将50μl效应细胞(107个细胞/ml的浓度)加入板，并且通过反复吹打将悬浮液混合均匀。将50μl等分的悬浮液在无菌的1％皂苷溶液中10倍连续稀释，涡旋以最小化细菌聚集，并且一式两份平板接种在胰胨豆胨琼脂上。将测定板在37℃下孵育1小时，利用电转烤肉架风格摇床连续混合。孵育结束时，将50μl等分的悬浮液在无菌的1％皂苷溶液中10倍连续稀释，通过涡旋混合以最小化细菌聚集，并且一式两份平板接种在胰胨豆胨琼脂上。通过测定60分钟时含有细菌、抗体、补体和效应细胞的孔中存活的cfu的数量比缺少抗体但含有细菌、补体和效应细胞的管中存活的cfu的数量的比例来计算百分比杀死。将含有细菌、补体和血清的对照包括在内以便为归因于聚集的cfu的任何减少调整。
补体吸附
对金黄色葡萄球菌菌株PFESA0266、PFESA0286和PFESA0270吸附的来自人供体的血清可以在测定中用作补体的来源。使金黄色葡萄球菌菌株在37℃下于TSA平板上生长过夜。将细胞从平板刮下并重悬在无菌的PBS中。将细菌细胞以10,000rpm在4℃下离心10分钟，并且将细胞沉淀重悬于人血清中用于吸附。将血清与细菌在4℃下于章动器上孵育30分钟。将细胞离心，将血清转移至含有细菌的另一管，并且将吸附步骤再次重复30分钟。最后，将细胞离心，并且使血清通过0.2微米滤器，然后将0.5ml等分试样在液氮中冷冻下来。
方法II-利用HL-60细胞的OPA
根据S.Romero-Steiner，et al.，Clin Diagn Lab Immunol 4(4)(1997)，pp.415-422使HL-60细胞分化。将收获的HL-60细胞以约108个细胞/ml重悬于测定缓冲液(含有1％牛血清白蛋白的改良伊格尔培养基)中，并且放置在37℃培养箱中直至准备使用。使金黄色葡萄球菌在胰胨豆胨琼脂平板上生长过夜。将细菌细胞刮下，洗涤两次并重悬于含有5％甘油的测定缓冲液中至OD600＝1，这等于约5X108cfu/ml。将1ml等分的细菌悬浮液冷冻并储存在-40℃下直至准备使用。将冷冻的细菌悬浮液解冻，在测定缓冲液中调整至106cfu/ml的浓度并放置在冰上。利用无菌的96深孔1ml聚丙烯板进行测定。制备2倍连续稀释的单克隆抗体样品(25μl)，然后将150μl测定缓冲液加入抗体悬浮液。将细菌加入(25μl)板，并且在4℃下放置于旋转振荡器上30分钟，然后加入25μl人补体(1％终浓度)。最后，将25μl HL-60细胞(107个细胞/ml)加入板，并且通过反复吹打将悬浮液混合均匀。将25μl等分的悬浮液在无菌的1％皂苷溶液中10倍连续稀释，通过涡旋混合以最小化细菌聚集，并且一式两份平板接种在胰胨豆胨琼脂上。将测定板在37℃下孵育1小时，利用电转烤肉架风格摇床连续混合。孵育结束时，将25μl等分的悬浮液在无菌的1％皂苷溶液中10倍连续稀释，通过涡旋混合，并且一式两份平板接种在胰胨豆胨琼脂上。通过测定60分钟时含有细菌、抗体、补体和HL-60细胞的孔中存活的cfu的数量比缺少抗体但含有细菌、补体和HL-60细胞的管中存活的cfu的数量的比例来计算百分比杀死。将含有细菌、补体和mAb的对照包括在内以便为归因于聚集的cfu的任何减少调整。
以下实施例以说明方式而不是限制方式提供。
实施例
实施例1：金黄色葡萄球菌血清型8荚膜多糖的制备。
在这个实施例中，描述了各种大小范围的金黄色葡萄球菌血清型8荚膜多糖的制备。金黄色葡萄球菌血清型8荚膜多糖重复单元的结构如图1所示。本文所述的方法在制备具有约20kDa-700kDa的分子量的血清型8荚膜多糖中是有效的。通过适当选择条件，可以分离和纯化分子量范围为50kDa-700kDa的高分子量血清型8荚膜多糖。为了用于免疫原性组合物，可以分离和纯化分子量范围为70kDa-300kDa和许多期望范围的血清型8荚膜多糖。基于生长特征和所产生的荚膜的质量，菌株PFESA0005或PFESA0286用于制备血清型8荚膜多糖。据证实分离自菌株PFESA0005或PFESA0286的荚膜是相同的。
为了制备血清型8荚膜多糖，使所述菌株在主要由碳源(乳糖或蔗糖)、水解大豆粉(作为氮源)和痕量金属组成的复杂培养基中生长。使所述菌株在生物反应器中生长2-5天。
高压灭菌之前，取出样品以检测培养物中的葡萄球菌肠毒素B(SEB)水平。在0.05％聚山梨酯80存在的情况下，发酵液中SEB的浓度为15-20ng/ml。以前的实验显示将培养物高压灭菌1小时将SEB的水平降低至少于0.1ng/ml，这低于TECRA试剂盒的检测下限。
如上文所述，将经渗滤、乙醇分级分离的多糖装上Q-琼脂糖AEC柱，并且用线性梯度的NaCl洗脱。通过O-乙酰基测定、双向免疫扩散测试和磷酸盐测定分析级分，其中O-乙酰基测定和双向免疫扩散测试用于检测血清型5多糖的存在，磷酸盐测定用于检测磷壁酸(TA)的存在。在级分35-95中检测到血清型8多糖的存在(图2A-B)。
为了减少磷壁酸污染，将级分35-75集中，并且将任何残余的磷壁酸用偏过碘酸钠氧化以允许通过对diH2O进行3K渗滤来去除。
用于制备缀合物的血清型8荚膜多糖的纯化是通过两种不同方法来进行的，所述方法依靠升高的温度和低pH以影响荚膜从细胞释放并降低所述多糖的分子量。所得的分子量取决于水解步骤的时间、温度和pH。
利用表1所指定的技术进行血清型8荚膜多糖的表征。
表1：纯化的金黄色葡萄球菌血清型8荚膜多糖的表征测定。
Figure BPA00001514847900421
通过下文所述的方法制备的荚膜多糖导致具有低水平的蛋白、核酸、肽聚糖和磷壁酸污染物的纯的良好表征的多糖。
在第一种方法中，荚膜多糖从细胞释放并降低分子量之后，将制品用酶混合物(例如，核糖核酸酶、脱氧核糖核酸酶、溶菌酶和蛋白酶)处理以消化杂质。孵育之后，通过加入乙醇(终浓度约25％)来沉淀残余杂质。去除残余乙醇之后，将含有荚膜多糖的溶液装上阴离子交换柱(Q-琼脂糖)并用线性盐梯度洗脱。将含有荚膜多糖的级分集中并用偏过碘酸钠处理。这种处理导致残余的磷壁酸污染物氧化水解，但是不影响血清型8荚膜多糖。通过加入乙二醇来猝灭该反应。将该物质浓缩并对dH2O渗滤以去除任何残余试剂和副产物。
第二种方法用来制备荚膜多糖，其不使用酶消化各种细胞来源的杂质。在这种方法中，荚膜多糖从细胞释放并降低分子量之后，通过微孔过滤然后超滤和渗滤来使水解的发酵培养液澄清。将该溶液用活性炭处理以去除杂质。炭处理之后，将该物质用偏过碘酸钠处理以氧化残余磷壁酸，然后用丙二醇猝灭。将该物质浓缩并对dH2O渗滤以去除任何残余试剂和副产物。
利用任一方法制备的制品导致具有低水平的蛋白、核酸和磷壁酸污染物的纯荚膜多糖。所述方法可以用于通过改变水解条件来产生特定范围的期望的高分子量多糖。通过本文所述的方法可获得的荚膜多糖的实例如下文表2所示。如无磷壁酸(TA)、肽聚糖和低残余蛋白所示，纯化的血清型8荚膜多糖的批次具有高纯度。参见，表2。较低分子量的范围跨越20.4kDa-65.1kDa，并且纯化的多糖是高度O-乙酰化的(～100％)。核酸污染的水平很低(0.12-2.45％)。
表2：血清型8荚膜多糖制品的表征。
Figure BPA00001514847900431
荚膜多糖的分子量选择：动力学分析证实通过本文所述的方法可以产生广泛分子量的荚膜多糖。最初，通过细菌细胞产生较大的多糖，随后，通过操纵加热和水解步骤的pH和加热条件来选择期望的分子量范围然后纯化。
金黄色葡萄球菌发酵培养液的加热处理是发酵和荚膜多糖回收之间的加工步骤。这个加工步骤利用加热处理pH已调整的培养液一段指定的时间。在低pH下加热处理的目的是杀死细胞、灭活肠毒素、释放细胞结合多糖并将分子量降低至期望大小。在这些目的中，就这个步骤所需的加工时间而言，降低分子量是最慢的。因此，在所考虑的处理时间内其他目的必然实现。
加热处理：确定用于选择各种分子量范围的荚膜多糖的pH和温度条件。15L Biolafitte发酵罐用于这些研究。通过蠕动泵将发酵培养液转移至发酵罐。利用约200rpm的搅拌速度，用浓硫酸调整培养液pH。然后，将培养液温度提高至设定值。温度一达到设定点加热处理时间就开始。当达到期望的处理时间时，将培养液冷却至室温。采集过程中样品分别通过HPLC和SEC-MALLS系统测定多糖浓度和分子量。分子量(MW)数据用于动力学分析。随着时间的推移在pH 3.5、4.0和5.0下测定MW谱。参见，图3A。
利用获得自所述方法的纯化的血清型8荚膜多糖进行多糖的温和酸水解的动力学。将纯化的多糖溶液用硫酸调整至实验期望的pH。每个15mL离心管转移入约1.5mL的所述溶液。将所述管放置在装备有精确温度控制系统的油浴中。将所述管在预定的时间间隔取出并在冰桶中急速冷却。在实验结束时，将等分的1M Tris缓冲液(pH 7.5)加入样品以将pH调回至约7。通过SEC-MALLS系统分析样品。MW数据用于动力学分析。随着时间的推移测定在pH 3.5下温度对CP8的MW谱的影响。参见，图3B。
结果
如图3A所示，较低pH在降低所述多糖的分子量中更有效。利用pH 5在95℃下持续15分钟-120分钟可以产生300kDa-600kDa的分子量。同样地，利用pH 4在95℃下持续15分钟-120分钟可以产生250kDa-450kDa的分子量。此外，利用pH 3.5在95℃下持续15分钟-120分钟可以产生120kDa-450kDa的分子量。
如图3B所示，温度越高，水解速率越快，并且随时间产生的多糖的分子量范围越广。在相同pH下，使用较低的温度55℃对95℃产生较窄的多糖分子量范围。
此外，图4证实纯化的CP8的分子量与温和酸(pH 3.5在95℃下)水解处理时间之间的相关性。纯化的多糖是获得自先前详述的回收过程的终产物。也如图4所示，增加在pH 3.5下加热处理金黄色葡萄球菌PFESA0005菌株的时间导致较小分子量的CP8，而在pH 3.5下较短的加热处理时间导致较高分子量的CP8。血清型8荚膜多糖的大小范围为约80kDa-约220kDa，取决于在pH 3.5下加热处理的时间长度。如图4所示，在低pH下加热处理的时间与纯化的CP8的大小之间的相关性允许估计产生具有指定范围的分子量的纯化的多糖所需的处理时间。
重要的是注意到如上文所证实的，可以产生、释放和纯化20kDa至超过500kDa的分子量全范围的血清型8荚膜多糖。因此所述方法可以用来产生特定范围的期望的高分子量荚膜多糖，如表3所示。其中峰分子量范围为87kDa-108kDa的产生的相对窄范围分子量的多糖代表可以通过本文所述的方法获得的良好表征范围的分子量。范围为70kDa-300kDa或者70kDa-150kDa的特别有利范围的高分子量多糖有利于通过将所述荚膜多糖缀合至载体分子或蛋白来制备免疫原性组合物(参见，表3)。用来产生具有约80-120kDa的分子量范围的CP8荚膜多糖的条件如下：95℃、pH 3.5持续300分钟。
表3：特定范围的高分子量血清型8荚膜多糖的产生。
Figure BPA00001514847900451
实施例2：将血清型8荚膜多糖缀合至CRM197。
这个实施例描述用于制备金黄色葡萄球菌血清型8荚膜多糖-CRM197缀合物的方法和表征测定。为了将金黄色葡萄球菌血清型8荚膜多糖缀合至这种载体蛋白，开发了不同的缀合化学。例如，利用PDPH(3-(2-吡啶二硫代)-丙酰肼)缀合导致CP与载体蛋白之间的共价硫醚键。或者，利用CDI/CDT(1，1-羰基二咪唑/1，1-羰基-二-1，2，4-三唑)缀合导致CP与载体蛋白之间的1-碳或0-碳接头。
通过PDPH缀合化学将血清型8荚膜多糖缀合至CRM197。
PDPH缀合化学是多步骤过程，其包括活化所述多糖、去除巯基保护基团、纯化活化的多糖中间体、活化和纯化CRM197蛋白以及缀合活化的组分然后纯化。将含有巯基的接头引入所述多糖并将卤代乙酰基引入CRM197蛋白载体之后，将金黄色葡萄球菌血清型8荚膜多糖通过硫醚键连接至蛋白载体。通过使胺基与溴乙酸的N-羟基琥珀酰亚胺酯反应来将溴乙酰基引入CRM197蛋白。为了产生硫醇化多糖，将所述多糖中的N-乙酰甘露糖氨基糖醛酸的碳二亚胺活化的羧酸酯基团偶联至巯基反应的酰肼异型双功能接头3-(2-吡啶二硫代)-丙酰肼(PDPH)的酰肼基团。使通过用DTT还原产生并通过SEC在Sephadex G25柱上纯化的PDPH-硫醇化多糖的巯基与活化的蛋白的溴乙酰基反应，导致通过多糖与载体蛋白之间的溴置换所形成的共价硫醚键。将非反应的溴乙酰基用半胱胺盐酸盐(2-巯基乙胺盐酸盐)“加帽”。然后将反应混合物浓缩并渗滤。将剩余的未缀合的溴乙酰基用半胱胺盐酸盐加帽以确保缀合之后没有反应性溴乙酰基留下。这在溴置换之后形成半胱胺的巯基端与赖氨酸残基上的乙酰基之间的共价键。
1.用PDPH硫醇化金黄色葡萄球菌血清型8荚膜多糖：首先用PDPH通过硫醇化来活化所述多糖。将所述多糖与新鲜制备的PDPH贮存液(DMSO中250mg/mL)、EDAC贮存液(diH2O中90mg/mL)和MES缓冲液贮存液(0.5M，pH 4.85)混合以制备最终溶液0.1M MES、以及2和4mg多糖/mL，同时保持血清型8荚膜多糖的多糖∶PDPH∶EDAC重量比为1∶0.6∶1.25。将这个混合物在室温下孵育1小时，然后在4-8℃下利用3500MWCO透析装置对1000X体积的蒸馏H2O透析4次以去除未反应的PDPH。使PDPH连接的多糖制备成0.2M DTT，并且在室温下孵育3小时或者在4-8℃下孵育过夜。利用Sephadex G25树脂和蒸馏水作为流动相通过SEC从活化的糖分离过量的DTT以及反应的副产物。通过巯基的DTDP测定来测定级分，并且将洗脱的接近柱的空体积的巯基阳性级分集中。通过PAHBAH和O-乙酰基测定来测定级分的池以确定活化程度，所述活化程度表达为含有巯基的重复单元的摩尔百分比(巯基的摩尔浓度/重复单元的摩尔浓度)。将活化的多糖冻干并储存在-25℃下直至需要缀合。
来自用PDPH的血清型8多糖硫醇化的重复性的结果如表4所示。血清型8多糖的活化程度在12％-16％的范围中，这对应于大约每10个荚膜多糖重复单元1个接头分子连接至每5个重复单元1个接头分子。
表4：用PDPH活化血清型8荚膜多糖-重复性研究。
2.载体蛋白活化：单独地，通过溴乙酰化来活化载体蛋白。将CRM197用10mM磷酸盐缓冲的0.9％NaCl pH 7(PBS)稀释至5mg/mL，然后利用1M贮存液使其制备成0.1M NaHCO3 pH 7.0。利用20mg/mL DMSO的BAANS贮存液以CRM197∶BAANS比例1∶0.25(w∶w)加入溴乙酸的N-羟基琥珀酰亚胺酯(BAANS)。将这个反应混合物在4-8℃下孵育1小时，然后在Sephadex G-25上利用SEC纯化。通过Lowry测定来测定纯化的活化的CRM197以确定蛋白浓度，然后用PBS稀释至5mg/mL。加入蔗糖至5％wt/vol作为冷冻保护剂，将活化的蛋白冷冻并储存在-25℃下直至需要缀合。
CRM197的赖氨酸残基的溴乙酰化非常一致，导致可用的39个赖氨酸中的19-25个赖氨酸活化(参见，表5)。该反应产生高产率的活化的蛋白。
表5：CRM197的溴乙酰化产率和程度。
3.偶联反应：一旦制备了活化的荚膜多糖和活化的载体蛋白，将这两者在缀合反应中混合。将冻干和硫醇化的多糖溶解于0.16M硼酸盐pH 8.95中，与解冻的溴乙酰化的CRM197和蒸馏水混合以制备最终溶液0.1M硼酸盐、1∶1wt/wt比例的CRM197∶CP以及1mg/mL多糖。将这个混合物在室温下孵育16-24小时。通过利用溶解于0.1M硼酸盐pH 8.95中的半胱胺的135mg/mL贮存液以1∶2(wt/wt)的CRM197∶半胱胺的比例加入半胱胺盐酸盐来将蛋白上未反应的溴乙酰基加帽，并且在室温下孵育4小时。通过利用100K聚醚砜超滤器对0.9％NaCl渗滤50倍来纯化荚膜多糖-CRM197缀合物(缀合物)。
来自用PDPH的血清型8荚膜多糖硫醇化研究的重复性的结果证实所述多糖的活化程度在12-16％的范围中，这对应于大约每10个多糖重复单元1个接头分子连接至每5个重复单元1个接头分子。
通过CDI/CDT缀合化学将血清型8荚膜多糖缀合至CRM197。
CDI和CDT提供一步缀合方法，其中将所述多糖在无水环境(DMSO)中活化以形成具有可用的羟基的咪唑或三唑氨基甲酸酯部分以及具有羧酸的酰基咪唑或酰基三唑部分。蛋白载体(DMSO中)的加入导致咪唑或三唑通过赖氨酸亲核置换，并且形成氨基甲酸酯键(活化的羟基)和酰胺键(活化的羧酸)。
CDI和CDT缀合化学均产生共价连接至载体蛋白的血清型8荚膜多糖，这是通过来自大小排阻层析的级分中糖和蛋白的存在以及通过乙醇醛加帽或半胱胺盐酸盐加帽的缀合物的氨基酸分析来显示的。
来自几批缀合物的制品的结果的总结如下文表6所示，所述缀合物是通过PDPH和CDI/CDT化学制备的具有20-40kDa的多糖大小的荚膜血清型8的缀合物。游离荚膜多糖、多糖-蛋白的比例以及通过这两种缀合方法产生的缀合物的产率没有显著差异。如缀合物与天然多糖之间相同的沉淀素线所示，缀合未改变缀合的血清型8荚膜多糖的抗原性。
表6：通过两种缀合化学制备的血清型8荚膜多糖-CRM197的表征。
Figure BPA00001514847900491
如上文所示，本文所述的方法可以用来产生特定范围的期望的高分子量荚膜多糖。我们试图制备预先选择范围的高分子量的缀合物用于免疫原性组合物，其可以是过滤和纯化的血清型8荚膜多糖。表7总结了血清型8荚膜多糖缀合物的分析，其中利用分子量范围为约80kDa-120kDa的血清型8荚膜多糖和咪唑缀合化学。所得的缀合物的分子量范围为595kDa-1708kDa。每CRM197缀合的赖氨酸的数目范围从高达9到低至3。游离荚膜多糖范围从高达6％到低至2％。
表7：具有预先选择的分子量范围的血清型8荚膜多糖的缀合物。
Figure BPA00001514847900492
两种缀合化学均产生共价连接至载体蛋白的血清型8荚膜多糖。游离荚膜多糖、血清型8荚膜多糖∶蛋白的比例以及通过这两种方法产生的缀合物的产率没有显著差异。
实施例3：CDI/CDT一罐(one pot)法对复杂法。
如上文所述，制备本发明的免疫原性缀合物的方法包括利用缀合化学将荚膜多糖与载体蛋白共价缀合，所述缀合化学包括CDI(1，1-羰基二咪唑)、CDT(1，1-羰基-二-1，2，4-三唑)或PDPH(3-(2-吡啶二硫代)-丙酰肼)。使用CDI/CDT导致荚膜多糖与载体蛋白之间的1-碳或0-碳接头，而使用PDPH导致荚膜多糖与载体蛋白之间的共价硫醚键。
基于PDPH的方法是多步骤过程，其包括活化所述多糖、去除所述多糖上的巯基保护基团、纯化活化的多糖中间体、活化和纯化蛋白载体以及缀合活化的组分然后纯化。在这种方法中，使金黄色葡萄球菌血清型8荚膜多糖与PDPH和碳二亚胺在诸如0.1M MES的水性溶液中反应以产生PDPH连接的多糖。使PDPH连接的多糖与还原剂反应以产生活化的多糖，然后将其纯化。使载体蛋白与溴乙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯在水性溶液中反应以产生活化的载体蛋白，然后将其纯化。然后使纯化的活化的血清型8多糖与纯化的活化的载体蛋白反应以产生血清型8多糖∶载体蛋白缀合物。
相比之下，基于CDI和CDT的方法是一步或两步缀合过程，其中将所述荚膜多糖在无水环境(即，DMSO)中活化以形成具有可用的羟基的咪唑或三唑氨基甲酸酯部分以及具有羧酸的酰基咪唑或酰基三唑部分。蛋白载体(DMSO中)的加入导致咪唑或三唑通过赖氨酸亲核置换，并且形成氨基甲酸酯键(活化的羟基)和酰胺键(活化的羧酸)。相应地，开发了两种基于CDI或CDT的方法：较复杂的方法和较简单的一罐(one-pot)法。在较复杂的方法中，将金黄色葡萄球菌血清型8荚膜多糖与咪唑或三唑复合，冻干，然后使其与CDI或CDT在有机溶剂(如DMSO)中反应以产生活化的血清型8多糖。将活化的血清型8多糖纯化，然后使其与载体蛋白在所述有机溶剂中反应以产生血清型8多糖-载体蛋白缀合物。一步法与复杂方法相似，除了在与载体蛋白反应之前不纯化活化的血清型8多糖。
CDI/CDT复杂方法。
多糖的活化：将血清型8多糖与10g三唑/g血清型8混合并冻干。将所得的饼以2.0mg血清型8多糖/mL溶解于DMSO中。测定水含量。加入新鲜制备的DMSO中的100mg/mL的CDT贮存液以达到CDT的摩尔量等于水。或者，可以调整加入的CDT的量以达到较高或较低程度的活化。将这个在23℃下维持30分钟。
活化的血清型8多糖的纯化：将活化的血清型8(ACP8)的溶液倒入25个体积的水中以破坏过量的CDT。在10kDa PES膜上以约1mg/cm2浓缩至其原始体积，并且对水渗滤至少10个体积。在少于4小时内完成这个步骤。将渗滤的物质与10g三唑/g原始血清型8多糖混合并冻干。
冻干的CRM的制备：在10kDa PES膜上将CRM对恒定体积的0.4％NaCl/5％蔗糖渗滤至少10个体积。测定蛋白浓度，并且加入足量的渗滤缓冲液以产生5.0g/L的蛋白浓度，因此提供NaCl/CRM＝0.8的w/w比例。将CRM冻干。
缀合：将活化的渗滤的血清型8多糖以1mg/mL溶解于DMSO中。加入100mM的硼酸盐溶液以达到2％v/v。
将CRM以2mg/mL重悬，并且在溶解完成时与ACP8溶液混合。使其在23℃下反应20小时。
将缀合反应物倒入24个体积的5mM硼酸盐pH 9.0中，并且允许在室温下搅拌1小时。然后将其用0.5M磷酸盐缓冲液、pH 6.5调整至pH 7.5。将这个通过5微米滤器过滤，在300kDa PES膜上以～1mg/cm2的装载浓缩至原始体积，并且对至少10个体积的水渗滤。将所得的浓缩液通过0.22微米滤器过滤并储存在2℃-8℃下。
CDI/CDT一罐法。
CRM197基质交换：将CRM197渗滤以从约10mM磷酸盐/80mMNaCl/15％蔗糖、pH 7的大部分基质交换至5mM咪唑/0.72％NaCl/15mM辛基-β-D-葡糖苷、pH 7。该交换允许去除对缀合有害的磷酸盐和蔗糖，并且确定带入缀合的氯化钠含量。加入辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷以防止无菌过滤之后形成颗粒。
通过利用10K MWCO PES膜以约4mg/mL的截留浓度对5mM咪唑/0.72％/15mM辛基-B-D-吡喃葡萄糖苷pH 7通过10个置换体积(diavolume)切向流过滤来交换CRM197的基质。典型的膜挑战为2克/ft2，并且基质中目标最终CRM197浓度为6mg/mL。将CRM197储存在2℃-8℃下。
活化/缀合：金黄色葡萄球菌血清型8荚膜多糖的活化/缀合方法由以下步骤组成：1)CRM197的基质交换；2)多糖的复合；3)CRM197和复合多糖的壳冷冻(shell frozen)和冻干；4)冻干的多糖和CRM197的溶解；5)所述多糖的活化；6)将活化的多糖缀合至CRM197；以及7)缀合物的纯化(稀释、渗滤、无菌过滤)。
将所述多糖与10克1，2，4-三唑赋形剂/克多糖复合。将所述赋形剂作为粉末加入所述多糖，在环境温度下混合少于15分钟之后获得溶液。
利用-75℃乙醇浴将复合多糖和CRM197分别壳冷冻。每1L瓶的体积为约500mL。
为了溶解所述多糖，将DMSO加入所述多糖的各个冻干瓶以获得悬浮液，然后转移至活化/缀合反应容器用于加热。加入DMSO以获得2g/L浓度。在该悬浮液达到约45℃同时混合时获得澄清溶液。然后将该溶液冷却至23℃±2℃。
为了溶解CRM197，将DMSO加入含有CRM197的各个冻干瓶以获得悬浮液，然后转移至第二容器用于混合。加入DMSO以获得2g/L浓度。在少于15分钟内通常获得澄清溶液。
将多糖/DMSO溶液采样用于Karl Fischer分析以测定含湿量。将CDT制备为DMSO中的100mg/mL溶液，并且基于测定的含湿量来添加。CDT溶液的连续添加在23℃±2℃下于约5分钟内进行，同时混合。允许该反应在23℃±2℃下进行最少30分钟。将该反应采样以测定活化水平(UV220/205nm)，然后加入100mM四硼酸钠、pH 9以获得1.5％水性溶液。然后将该反应溶液在23℃±2℃下搅拌最少30分钟。
为了将活化的多糖缀合至CRM197，加入DMSO以达到0.8mg/mL反应浓度。然后将DMSO中的溶解的CRM197加入活化的多糖溶液，同时混合。将该反应物在23℃±2℃下搅拌最少4小时。
通过将其加入5mM四硼酸钠、pH 9同时混合来将反应溶液10X稀释以水解残余的活化基团。使稀释的溶液通过5μm滤器，并且浓缩至2g/L的靶截留浓度。利用300K再生纤维素膜通过20个置换体积用5mM琥珀酸盐、pH 7进行切向流过滤。典型膜挑战为1克/ft2。使纯化的缀合物通过0.22微米滤器并储存在2℃-8℃下。
实施例4：利用一罐缀合方法和复杂缀合方法缀合血清型8荚膜多糖
这个实施例证实预先选择范围的分子量的荚膜多糖可以用于在一步或复杂方法中缀合。最初通过细菌细胞产生较大的多糖，并且可以通过实施例1中水解过程的pH和加热来控制纯化的所得的分子量范围(如表3所示)。
在这个实施例中，选择其中血清型8荚膜多糖分子量范围为约80kDa-约120kDa的8个批次，并且利用1，1-羰基-二-(1，2，4-三唑)活化血清型8荚膜多糖来进行缀合。参见，表8。所得的缀合物的分子量范围为595kDa-1708kDa。每CRM缀合的赖氨酸的数目范围从高达13到低至3。游离糖范围从高达11％到低至1％。
表8：用80kDa-120kDa荚膜多糖制备的血清型8荚膜多糖缀合物。
Figure BPA00001514847900531
实施例5：在小鼠菌血症模型中评价缀合的天然的和碱处理的血清型8荚膜多糖。
对于荚膜多糖缀合物，评价了缀合之前存在于天然血清型8荚膜多糖上的O-乙酰基对诱导功能抗体应答的重要性。将血清型8荚膜多糖在温和碱性条件下去O-乙酰化，并且NMR和离子层析(IC)均证实在血清型8荚膜多糖去O-Ac-CRM中不存在O-乙酰化。通过如实施例2所述的PDPH化学将去O-Ac CP8多糖缀合至CRM来制备CP8去O-Ac-CRM缀合物。
血清型8荚膜多糖缀合物出乎意料地显示没有通过IC方法可测量的乙酰基。这可以归因于与其他金黄色葡萄球菌荚膜多糖相比结构、O-乙酰化位点的差异，这反过来可以在缀合期间引起血清型8荚膜多糖中乙酰基的去除或修饰。
小鼠菌血症模型用来评价缀合至CRM197的天然的对碱处理的血清型8荚膜多糖的效力。将雌性BALB/c小鼠的组(15/组)在第0、3和6周用1mcg血清型8荚膜多糖去O-Ac-CRM或1μg血清型8荚膜多糖O-Ac-CRM免疫接种。疫苗与22mcg AlPO4一起配制。用金黄色葡萄球菌PFESA0003攻击动物，并且3小时后从血液计数细菌。数据显示如通过学生t检验所测定的，从用未处理的天然血清型8荚膜多糖缀合物免疫的动物的血液回收的细菌cfu统计上显著(p＝0.0362)减少(表9)。在用碱处理的血清型8荚膜多糖缀合物免疫的动物中，从血液回收的细菌cfu与盐水对照组相似。
表9：血清型8荚膜多糖-CRM197缀合物减少小鼠中金黄色葡萄球菌PFESA0003所引起的菌血症。
Figure BPA00001514847900541
实施例6：在小鼠菌血症模型中评价缀合的天然的和碱处理的血清型8荚膜多糖。
评价血清型8荚膜多糖缀合物在肾盂肾炎模型中保护小鼠的能力。当与用PBS免疫的对照相比时，接受i.p.金黄色葡萄球菌攻击的小鼠的血液中的细菌计数显著减少。
如先前所述，用金黄色葡萄球菌PFESA0268(8型)攻击之后，进行两个研究以评价CP8-CRM197缀合物在小鼠菌血症模型中的效力。第一个研究(图5)显示菌血症显著减少(p＝0.0308)。为了该研究，将6-8周龄的SwissWebster小鼠的组(n＝30)在第0、2和4周用与100μg AlPO4一起配制的1μg血清型8荚膜多糖-CRM197和盐水通过皮下注射主动免疫，并且在第6周用金黄色葡萄球菌PFESA0268(8型)通过静脉内途径攻击。攻击之前进行实验以最优化在3次免疫接种之后小鼠达到的周龄攻击菌株的剂量。通过Kaplan-Meier分析进行存活的统计评价。
实施例7：来自用天然的和化学修饰的血清型8荚膜多糖缀合物免疫的小鼠的血清的调理活性。
选择来自免疫接种研究的具有高血清型8荚膜多糖效价的小鼠血清(n＝5)，利用PFESA0005菌株比较调理活性。OPA结果(表10)显示仅通过缀合天然血清型8荚膜多糖制备的缀合物激发小鼠中的调理抗体。值得注意的是去OAc血清型8荚膜多糖缀合物在小鼠中是有免疫原性的，但是所激发的抗体在这个测定中没有调理。OPA效价报道为观察到40％杀死的稀释的倒数。
表10：天然血清型8荚膜多糖对去O-Ac血清型8荚膜多糖-CRM免疫的小鼠血清的调理活性。
Figure BPA00001514847900551
实施例8：添加天然血清型8荚膜多糖可以抑制血清型8缀合物抗血清杀死金黄色葡萄球菌菌株。
为了证实杀死的特异性，在天然血清型8荚膜多糖或无关的肺炎球菌多糖(Pn 14聚)存在的情况下进行调理吞噬测定，基本上如上文所述。
结果(表11)显示反应混合物中天然血清型8荚膜多糖的存在抑制金黄色葡萄球菌PFESA0286(8型)的调理吞噬杀死。这些结果证实免疫血清的调理吞噬杀死是有荚膜特异性抗体介导的。
表11：添加血清型8荚膜多糖抑制免疫血清调理吞噬杀死金黄色葡萄球菌。
Figure BPA00001514847900561
总结
所有缀合化学均产生共价连接至载体蛋白CRM197的血清型8荚膜多糖。这些方法所产生的缀合物的游离糖、血清型8荚膜多糖∶蛋白的比例以及产率没有显著差异。
实施例9：金黄色葡萄球菌血清型5荚膜多糖的制备。
在这个实施例中，描述了各种大小范围的金黄色葡萄球菌血清型5荚膜多糖的制备。金黄色葡萄球菌血清型5荚膜多糖重复单元的结构如图6所示。本文所述的方法在制备具有约20kDa-800kDa的分子量的血清型5荚膜多糖中是有效的。通过适当选择条件，可以分离和纯化分子量范围为50kDa-800kDa的高分子量血清型5荚膜多糖。为了用于免疫原性组合物，可以分离和纯化分子量范围为70kDa-300kDa、70kDa-150kDa以及许多期望范围的血清型5荚膜多糖。基于生长特征和所产生的荚膜的质量，选择菌株PFESA0266用于血清型5荚膜多糖制备。
为了产生血清型5荚膜多糖，使菌株PFESA0266在主要由碳源(乳糖或蔗糖)、水解大豆粉(作为氮源)和痕量金属组成的复杂培养基中生长。使所述菌株在生物反应器中生长2-5天。
如上文所详述进行PFESA0266菌株的发酵。在收获时，培养物的OD600为7.38。将培养物高压灭菌1小时，并且在冷却之后如上文所述加工培养物以从上清物质分离细胞。回收每个约1L过滤和浓缩的上清液和细胞。
高压灭菌之前，取出样品以检测培养物中的葡萄球菌肠毒素B(SEB)水平。在0.05％聚山梨酯80存在的情况下，发酵液中SEB的浓度为15-20ng/ml。以前的实验显示将培养物高压灭菌1小时将SEB的水平降低至少于0.1ng/ml，这低于TECRA试剂盒的检测下限。
如上文所述，将经渗滤、乙醇分级分离的多糖装上Q-琼脂糖AEC柱，并且用线性梯度的NaCl洗脱。通过O-乙酰基测定、双向免疫扩散测试和磷酸盐测定分析级分，其中O-乙酰基测定和双向免疫扩散测试用于检测血清型5多糖的存在，磷酸盐测定用于检测磷壁酸的存在。在级分60-105中检测到血清型5多糖的存在(图7A-B)。为了减少磷壁酸污染，将级分60-85集中，并且将任何残余的磷壁酸用偏过碘酸钠氧化以允许通过对diH2O的3K渗滤来去除。
用于制备缀合物的血清型5荚膜多糖的纯化是通过两种不同方法来进行的，所述方法依靠升高的温度和低pH以影响荚膜从细胞释放并降低所述多糖的分子量。所得的分子量取决于水解步骤的时间、温度和pH。
利用上文表1所指定的技术进行血清型5荚膜多糖的表征。
通过下文所述的方法制备的荚膜多糖导致具有低水平的蛋白、核酸、肽聚糖和磷壁酸污染物的纯多糖。
在第一种方法中，荚膜多糖从细胞释放并降低分子量之后，将制品用酶混合物(例如，核糖核酸酶、脱氧核糖核酸酶、溶菌酶和蛋白酶)处理以消化杂质。孵育之后，通过加入乙醇(终浓度约25％)来沉淀残余杂质。去除残余乙醇之后，将含有荚膜多糖的溶液装上阴离子交换柱(Q-琼脂糖)并用线性盐梯度洗脱。将含有荚膜多糖的级分集中并用偏过碘酸钠处理。这种处理导致残余的磷壁酸污染物氧化水解，但是不影响血清型5荚膜多糖。通过加入乙二醇来猝灭该反应。将该物质浓缩并对蒸馏水(dH2O)渗滤以去除任何残余试剂和副产物。
第二种方法用来制备荚膜多糖，其不使用酶消化各种细胞来源的杂质。在这种方法中，荚膜多糖从细胞释放并降低分子量之后，通过微孔过滤然后超滤和渗滤来使水解的发酵培养液澄清。将该溶液用活性炭处理以去除杂质。炭处理之后，将该物质用偏过碘酸钠处理以氧化残余磷壁酸，然后用丙二醇猝灭。将该物质浓缩并对dH2O渗滤以去除任何残余试剂和副产物。
利用任一方法制备的制品导致具有低水平的蛋白、核酸和磷壁酸污染物的纯荚膜多糖。所述方法可以用于通过操纵水解条件来产生特定范围的期望的高分子量多糖。
通过本文所述的方法可获得的荚膜多糖的实例如下文表12所示。如无磷壁酸(TA)、肽聚糖和低残余蛋白所示，纯化的血清型5荚膜多糖的批次具有高纯度。参见，表12和13。分子量范围跨越132.7kDa-800kDa，纯化的多糖是高度O-乙酰化的(90％-100％)，并且是100％N-乙酰化的。血清型5荚膜多糖纯化的产率为39％-63％，并且纯化的血清型5多糖的大小从35kDa变化至65kDa(参见，表12)。磷壁酸(TA)污染水平可接受，并且残余蛋白和核酸的水平也在可接受的范围内。血清型5多糖的NMR谱与文献所报道的相同。
表12：血清型5荚膜多糖表征。
Figure BPA00001514847900581
表13：额外的血清型5荚膜多糖表征。
Figure BPA00001514847900582
ND＝未检测
荚膜多糖的分产量选择：动力学分析证实通过本文所述的方法可以产生广泛分子量的荚膜多糖。最初，通过细菌细胞产生较大的多糖，随后，通过操纵加热和水解步骤的pH和加热条件来选择期望的分子量范围然后纯化。
金黄色葡萄球菌发酵培养液的加热处理是发酵和荚膜多糖回收之间的加工步骤。这个加工步骤利用加热处理pH已调整的培养液一段指定的时间。在低pH下加热处理的目的是杀死细胞、灭活肠毒素、释放细胞结合多糖并将分子量降低至期望大小。在这些目的中，就这个步骤所需的加工时间而言，降低分子量是最慢的。因此，在所考虑的处理时间内其他目的必然实现。
加热处理：确定用于选择各种分子量范围的荚膜多糖的pH和温度条件。15L Biolafitte发酵罐用于这些研究。通过蠕动泵将发酵培养液转移至发酵罐。利用约200rpm的搅拌速度，用浓硫酸调整培养液pH。然后，将培养液温度提高至设定值。温度一达到设定点加热处理时间就开始。当达到期望的处理时间时，将培养液冷却至室温。采集过程中样品以分别通过HPLC和SEC-MALLS系统测定多糖浓度和分子量。分子量(MW)数据用于动力学分析。随着时间的推移在pH 3.5、4.0和5.0下测定MW谱。参见，图8A。
利用获得自所述方法的纯化的血清型8荚膜多糖进行多糖的温和酸水解的动力学。将纯化的多糖溶液用硫酸调整至实验期望的pH。每个15mL离心管转移入约1.5mL的所述溶液。将所述管放置在装备有精确温度控制系统的油浴中。将所述管在预定的时间间隔取出并在冰桶中急速冷却。在实验结束时，将等分的1M Tris缓冲液(pH 7.5)加入样品以将pH调回至约7。通过SEC-MALLS系统分析样品。MW数据用于动力学分析。随着时间的推移测定在pH 4.5下温度对CP5的MW谱的影响。参见，图8B。
结果
如图8A所示，较低pH在降低所述多糖的分子量中更有效。在这个实施例中，利用pH 5在95℃下持续15分钟-120分钟可以产生约300kDa-约600kDa的分子量范围。参见图8A。同样地，选择pH 4.5在95℃下持续15分钟-120分钟可以产生200kDa-400kDa的多糖分子量范围。此外，选择pH 4.0在95℃下持续15分钟-120分钟可以产生120kDa-300kDa的多糖分子量范围。
如图8B所示，温度越高，水解速率越快，并且随时间产生的多糖的分子量越广。以另一种方式表示，在相同pH下，使用较低的温度(55℃对95℃)产生较窄的多糖分子量范围。
此外，图4证实纯化的血清型5荚膜多糖的分子量与温和酸(pH 4.5在95℃下)水解处理时间之间的相关性。纯化的多糖是获得自先前详述的回收过程的终产物。也如图4所示，增加在pH 4.5下加热处理金黄色葡萄球菌PFESA0266菌株的时间导致较小分子量的血清型8荚膜多糖，而在pH 4.5下较短的加热处理时间导致较高分子量的血清型5荚膜多糖。血清型5荚膜多糖的大小范围为约90kDa-约220kDa，取决于在pH 4.5下加热处理的时间长度。如图4所示，在低pH下加热处理的时间与纯化的血清型5荚膜多糖的大小之间的相关性允许估计产生具有指定范围的分子量的纯化的多糖所需的处理时间。
如上文所证实的，可以产生、释放和纯化20kDa至超过500kDa的分子量全范围的血清型5荚膜多糖。所述方法可以用来产生特定范围的期望的高分子量荚膜多糖，如表14所示。其中峰分子量范围为63kDa-142kDa的产生的相对窄范围分子量的多糖代表可以通过本文所述的方法获得的良好表征范围的分子量。范围为70kDa-300kDa或者70kDa-150kDa的特别有利范围的高分子量多糖有利于通过将所述荚膜多糖缀合至载体分子或蛋白来制备免疫原性组合物。用来产生具有约100-140kDa的分子量范围的CP5荚膜多糖的条件如下：95℃、pH 4.5持续135分钟。然而，pH、温度和时间的不同组合也会产生具有约100-140kDa的分子量范围的CP5分子。
表14：特定范围的高分子量血清型5荚膜多糖的产生。
Figure BPA00001514847900601
Figure BPA00001514847900611
ND＝未进行
实施例10：将血清型5荚膜多糖缀合至CRM197。
这个实施例描述用于制备金黄色葡萄球菌血清型5荚膜多糖-CRM197缀合物的方法和表征测定。为了将金黄色葡萄球菌血清型5荚膜多糖缀合至这种载体蛋白，开发了不同的缀合化学。例如，利用PDPH(3-(2-吡啶二硫代)-丙酰肼)缀合导致CP与载体蛋白之间的共价硫醚键；而利用CDT(1，1-羰基-二-1，2，4-三唑)缀合导致荚膜多糖与载体蛋白之间的1-碳或0-碳接头。
通过PDPH缀合化学将血清型5荚膜多糖缀合至CRM 197 。
PDPH缀合化学是多步骤过程，其包括活化所述多糖、去除巯基保护基团、纯化活化的多糖中间体、活化和纯化CRM197蛋白以及缀合活化的组分然后纯化。将含有巯基的接头引入所述多糖并将卤代乙酰基引入CRM197蛋白载体之后，将金黄色葡萄球菌血清型5荚膜多糖通过硫醚键连接至蛋白载体。通过使胺基与溴乙酸的N-羟基琥珀酰亚胺酯反应来将溴乙酰基引入CRM197蛋白。为了产生硫醇化多糖，将所述多糖中的N-乙酰甘露糖氨基糖醛酸的碳二亚胺活化的羧酸酯基团偶联至巯基反应的酰肼异型双功能接头3-(2-吡啶二硫代)-丙酰肼(PDPH)的酰肼基团。使通过用DTT还原产生并通过SEC在Sephadex G25柱上纯化的PDPH-硫醇化多糖的巯基与活化的蛋白的溴乙酰基反应，导致通过多糖与载体蛋白之间的溴置换所形成的共价硫醚键。将非反应的溴乙酰基用半胱胺盐酸盐(2-巯基乙胺盐酸盐)“加帽”。然后将反应混合物浓缩并渗滤。将剩余的未缀合的溴乙酰基用半胱胺盐酸盐加帽以确保缀合之后没有反应性溴乙酰基留下。这在溴置换之后形成半胱胺的巯基端与赖氨酸残基上的乙酰基之间的共价键。
1.用PDPH硫醇化金黄色葡萄球菌血清型5荚膜多糖：首先用PDPH通过硫醇化来活化所述多糖。将所述多糖与新鲜制备的PDPH贮存液(DMSO中250mg/mL)、EDAC贮存液(diH2O中90mg/mL)和MES缓冲液贮存液(0.5M，pH 4.85)混合以制备最终溶液0.1M MES、以及2mg和4mg荚膜多糖/mL，同时保持血清型5荚膜多糖的荚膜多糖∶PDPH∶EDAC重量比为1∶5∶3。将这个混合物在室温下孵育1小时，然后在4-8℃下利用3500MWCO透析装置对1000X体积的蒸馏H2O透析4次以去除未反应的PDPH。使PDPH连接的多糖为0.2M DTT，并且在室温下孵育3小时或者在4-8℃下孵育过夜。利用Sephadex G25树脂和蒸馏水作为流动相通过SEC从活化的糖分离过量的DTT以及反应的副产物。通过巯基的DTDP测定来测定级分，并且将洗脱的接近柱的空体积的巯基阳性级分集中。通过PAHBAH和O-乙酰基测定来测定级分的池以确定活化程度，所述活化程度表达为含有巯基的重复单元的摩尔百分比(巯基的摩尔浓度/重复单元的摩尔浓度)。将活化的多糖冻干并储存在-25℃下直至需要缀合。
来自用PDPH的血清型5多糖硫醇化的重复性的结果如表15所示。血清型5多糖的活化程度在11％-19％的范围中，这对应于大约每10个荚膜多糖重复单元1个接头分子连接至每5个重复单元1个接头分子。
表15：用PDPH活化血清型5荚膜多糖-重复性研究。
2.载体蛋白活化：单独地，通过溴乙酰化来活化载体蛋白。将CRM197用10mM磷酸盐缓冲的0.9％NaCl pH 7(PBS)稀释至5mg/mL，然后利用1M贮存液制备为0.1M NaHCO3 pH 7.0。利用20mg/mL DMSO的BAANS贮存液以CRM197∶BAANS比例1∶0.25(w∶w)加入溴乙酸的N-羟基琥珀酰亚胺酯(BAANS)。将这个反应混合物在4-8℃下孵育1小时，然后在SephadexG-25上利用SEC纯化。通过Lowry测定来测定纯化的活化的CRM197以确定蛋白浓度，然后用PBS稀释至5mg/mL。加入蔗糖至5％wt/vol作为冷冻保护剂，将活化的蛋白冷冻并储存在-25℃下直至需要缀合。
CRM197的赖氨酸残基的溴乙酰化非常一致，导致可用的39个赖氨酸中的19-25个赖氨酸活化(参见，表16)。该反应产生高产率的活化的蛋白。
表16：CRM 197 的溴乙酰化产率和程度。
Figure BPA00001514847900631
3.偶联反应：一旦制备了活化的荚膜多糖和活化的载体蛋白，将这两者在缀合反应中混合。将冻干和硫醇化的多糖溶解于0.16M硼酸盐pH 8.95中，与解冻的溴乙酰化的CRM197和蒸馏水混合以制备最终溶液0.1M硼酸盐、1∶1wt/wt比例的CRM197∶多糖以及2mg/mL血清型5荚膜多糖。将这个混合物在室温下孵育16-24小时。通过利用溶解于0.1M硼酸盐pH 8.95中的半胱胺的135mg/mL贮存液以1∶2(wt/wt)的CRM197∶半胱胺的比例加入半胱胺盐酸盐来将蛋白上未反应的溴乙酰基加帽，并且在室温下孵育4小时。通过利用100K聚醚砜超滤器对0.9％NaCl渗滤50倍来纯化荚膜多糖-CRM197缀合物(缀合物)。
来自用PDPH的血清型5荚膜多糖硫醇化研究的重复性的结果证实活化程度在11％-19％的范围中，这对应于大约每10个CP重复单元1个接头分子连接至每5个重复单元1个接头分子。
通过CDT缀合化学将血清型5荚膜多糖缀合至CRM 197 。
CDT提供一步缀合方法，其中将所述多糖在无水环境(DMSO)中活化以形成具有可用的羟基的三唑氨基甲酸酯部分以及具有羧酸的酰基咪唑或酰基三唑部分。蛋白载体(DMSO中)的加入导致三唑通过赖氨酸亲核置换，并且形成氨基甲酸酯键(活化的羟基)和酰胺键(活化的羧酸)。将该反应溶液10倍稀释入水性溶液，准备通过切向流过滤来纯化。
CDT缀合化学产生共价连接至载体蛋白的血清型5荚膜多糖，这是通过来自大小排阻层析的级分中糖和蛋白的存在以及通过乙醇醛加帽或半胱胺盐酸盐加帽的缀合物的氨基酸分析来显示的。
来自几批缀合物的制品的结果的总结如下文表17所示，所述缀合物是通过PDPH和CDT化学制备的大小范围为20-40kDa的血清型5荚膜多糖的缀合物。游离荚膜多糖、多糖∶蛋白的比例以及通过这些缀合化学产生的缀合物的产率没有显著差异。如缀合物与天然多糖之间相同的沉淀素线所示，缀合未改变缀合的血清型5荚膜多糖的抗原性。
17：通过两种缀合化学制备的血清型5荚膜多糖-CRM 197 的表征。
Figure BPA00001514847900641
ND＝未检测
如上文所示，本文所述的方法可以用来产生特定范围的期望的高分子量荚膜多糖。我们试图制备预先选择范围的高分子量的缀合物用于免疫原性组合物，其可以是过滤和纯化的血清型5荚膜多糖。表18总结了血清型5荚膜多糖缀合物的分析，其中血清型5荚膜多糖分子量范围为约92kDa-约119kDa，并且用三唑(CDT)活化。所得的缀合物的分子量范围为1533kDa-2656。每CRM197缀合的赖氨酸的数目范围从高达22到低至15。游离荚膜多糖范围从高达18％到低至11％。
表18：具有预先选择的分子量范围的血清型5荚膜多糖的缀合物。
Figure BPA00001514847900651
两种缀合化学均产生共价连接至载体蛋白的血清型5荚膜多糖。游离荚膜多糖、血清型5荚膜多糖∶蛋白的比例以及通过这两种方法产生的缀合物的产率没有显著差异。
实施例11：复杂对一罐CDT方法。
如上文所述，制备本发明的免疫原性缀合物的方法包括利用缀合化学将荚膜多糖与载体蛋白共价缀合，所述缀合化学包括CDT(1，1-羰基-二-1，2，4-三唑)或PDPH(3-(2-吡啶二硫代)-丙酰肼)。使用CDT导致荚膜多糖与载体蛋白之间的1-碳或0-碳接头，而使用PDPH导致含有荚膜多糖与载体蛋白之间的共价硫醚键的5碳接头。
基于PDPH的方法是多步骤过程，其包括活化所述多糖、去除所述多糖上的巯基保护基团、纯化活化的多糖中间体、活化和纯化蛋白载体以及缀合活化的组分然后纯化。在这种方法中，使金黄色葡萄球菌血清型5荚膜多糖与PDPH和碳二亚胺在诸如DMSO的有机溶剂中反应以产生PDPH连接的多糖。使PDPH连接的多糖与还原剂反应以产生活化的多糖，然后将其纯化。使载体蛋白与溴乙酸在有机溶剂中反应以产生活化的载体蛋白，然后将其纯化。然后使纯化的活化的血清型5多糖与纯化的活化的载体蛋白反应以产生血清型5多糖∶载体蛋白缀合物。
相比之下，基于CDT的方法是一步缀合过程，其中将所述荚膜多糖在无水环境(即，DMSO)中活化以形成具有可用的羟基的三唑氨基甲酸酯部分以及具有羧酸的酰基咪唑或酰基三唑部分。蛋白载体(DMSO中)的加入导致咪唑或三唑通过赖氨酸亲核置换，并且形成氨基甲酸酯键(活化的羟基)和酰胺键(活化的羧酸)，从而允许缀合在“一罐”内进行。相应地，开发了两种基于CDT的方法：较复杂的方法和较简单的一罐法。在较复杂的方法中，将金黄色葡萄球菌血清型5荚膜多糖与咪唑或三唑复合，然后使其与CDT在有机溶剂(如DMSO)和约0.2％w/v水中反应以产生活化的血清型5多糖。将活化的血清型5多糖纯化，然后使其与载体蛋白在所述有机溶剂中反应以产生血清型5多糖∶载体蛋白缀合物。一罐法与复杂方法相似，除了在与载体蛋白反应之前不纯化活化的血清型5多糖。
CDT复杂方法
血清型5荚膜多糖的活化：将血清型5荚膜多糖与10g三唑/g血清型5荚膜多糖混合并冻干。将所得的饼以2.0mg血清型5荚膜多糖/mL溶解于DMSO中。测定水含量并将其调整至0.2％。加入新鲜制备的DMSO中的100mg/mL的CDT贮存液以达到与CP5的量相比CDT 20倍摩尔过量。或者，可以调整加入的CDT的量以达到较高或较低程度的活化。在23℃下维持30分钟。
活化的血清型5荚膜多糖的纯化：将活化的血清型5荚膜多糖(ACP5)的溶液倒入25个体积的水中以破坏过量的CDT。在10kDa PES膜上以约1mg/cm2浓缩至其原始体积，并且对水渗滤至少10个体积。在少于4小时内完成这个步骤。将渗滤的物质与10g三唑/g原始血清型5多糖混合并冻干。
冻干的CRM的制备：在10kDa PES膜上将CRM对恒定体积的0.4％NaCl/5％蔗糖渗滤至少10个体积。测定蛋白浓度，并且加入足量的渗滤缓冲液以产生5.0g/L的蛋白浓度，因此提供NaCl/CRM＝0.8的w/w比例。将CRM冻干。
缀合：将活化的渗滤的血清型5荚膜多糖以1mg/mL溶解于DMSO中。加入100mM的硼酸盐溶液以达到2％v/v。
将CRM以2mg/mL重悬，并且在溶解完成时与ACP5溶液混合。使其在4℃下反应20小时。
将缀合反应物倒入24个体积的5mM硼酸盐pH 9.0中，并且使得在室温下搅拌1小时。然后将其用0.5M磷酸盐缓冲液、pH 6.5调整至pH 7.5。。将这个通过5微米滤器过滤，在300kDa PES膜上以～1mg/cm2的装载浓缩至原始体积，并且对至少10个体积的水渗滤。将所得的浓缩液通过0.22微米滤器过滤并储存在2℃-8℃下。
CDT一罐法
CRM197基质交换：将CRM197渗滤以从约10mM磷酸盐/80mMNaCl/15％蔗糖、pH 7的大部分基质交换至5mM咪唑/0.72％NaCl，/15mM辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷、pH 7。该交换使得去除对缀合有害的磷酸盐和蔗糖，并且确定带入缀合的氯化钠含量。加入辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷以防止无菌过滤之后形成颗粒。
通过利用10K MWCO PES膜以约4mg/mL的截留浓度对5mM咪唑/0.72％Nacl/15mM辛基-B-D-吡喃葡萄糖苷、pH 7通过10个置换体积切向流过滤来交换CRM197的基质。典型膜挑战为2克/ft2，并且基质中目标最终CRM197浓度为6mg/mL。将CRM197储存在2℃-8℃下。
活化/缀合：金黄色葡萄球菌血清型5荚膜多糖的活化/缀合方法由以下步骤组成：1)多糖的复合；2)CRM197和复合多糖的壳冷冻和冻干；3)冻干的多糖和CRM197的溶解；4)所述多糖的活化；5)将活化的多糖缀合至CRM197；以及6)缀合物的纯化(稀释、渗滤、无菌过滤)。
将所述多糖与10克1，2，4-三唑赋形剂/克多糖复合。将所述赋形剂作为粉末加入所述多糖，在环境温度下混合少于15分钟之后获得溶液。
利用-75℃乙醇浴将复合多糖和CRM197分别壳冷冻。每1L瓶的体积为约500mL。
为了溶解所述多糖，将DMSO加入所述多糖的各个冻干瓶以获得悬浮液，然后转移至活化/缀合反应容器用于加热。加入DMSO以获得2g/L浓度。混合5-10分钟之后获得澄清溶液。
为了溶解CRM197，将DMSO加入含有CRM197的各个冻干瓶以获得悬浮液，然后转移至第二容器用于混合。加入DMSO以获得2g/L浓度。在少于15分钟内通常获得澄清溶液。
将多糖/DMSO溶液采样用于Karl Fischer分析以测定含湿量。将CDT制备为DMSO中的100mg/mL溶液，并且以超过5型多糖5摩尔添加(复杂方法使用20摩尔当量CDT，而一罐法使用5摩尔当量CDT∶CP5)。CDT溶液的连续添加在23℃+2℃下于约5分钟内进行，同时混合。使得该反应在23℃±2℃下进行最少30分钟。将该反应采样以测定活化水平(UV220/205nm)，然后加入100mM四硼酸钠、pH 9以获得1.5％水性溶液。然后将该反应溶液在23℃+2℃下搅拌最少30分钟。
为了将活化的多糖缀合至CRM197，加入DMSO以达到0.55mg/mL反应浓度。然后将DMSO中的溶解的CRM197加入活化的多糖溶液，同时混合。将该反应物在23℃+2℃下搅拌最少16小时。
将反应溶液用5mM四硼酸钠、pH 8.6 10X稀释以获得最终稀释的pH9±0.2。将该溶液在23±3℃下搅拌最少4小时。使稀释的溶液通过5μm滤器，并且浓缩至2g/L的靶截留浓度。利用300K再生纤维素膜通过20个置换体积用5mM琥珀酸盐、pH 7进行切向流过滤。典型膜挑战为1克/ft2。使纯化的缀合物通过0.22微米滤器并储存在2℃-8℃下。
实施例12：利用一步和复杂缀合方法缀合血清型5荚膜多糖。
这个实施例证实预先选择范围的分子量的荚膜多糖可以用于在一罐或复杂方法中缀合。最初通过细菌细胞产生较大的多糖，并且可以通过实施例9中水解过程的pH和加热来控制纯化的所得的分子量范围。在这个实施例中，选择其中血清型5荚膜多糖分子量范围为约90kDa-约140kDa的8个批次，并且利用三唑(CDT)活化在上文所述的一罐或复杂方法中进行缀合。参见，表19。所得的缀合物的分子量范围为1125kDa-2656kDa。每CRM缀合的赖氨酸的数目范围从高达22到低至15。游离糖范围从高达23％到低至11％。
表19：用90kDa-140kDa荚膜多糖制备的血清型5荚膜多糖缀合物。
Figure BPA00001514847900681
实施例13：血清型5荚膜多糖缀合物在小鼠肾盂肾炎模型中一致地表现出保护。
评价血清型5荚膜多糖缀合物在肾盂肾炎模型中保护小鼠的能力。当与用PBS免疫的对照相比时，接受i.p.金黄色葡萄球菌攻击的小鼠的血液中的细菌计数显著减少。
所有6个单独研究均显示在免疫的动物中cfu/ml肾显著减少(图9)。当将这些研究集中用于meta分析时，这些研究的总显著性作为整体增加至低于0.0001。数据显示用荚膜多糖缀合物主动免疫接种之后肾定殖一致减少。
实施例14：通过不同缀合化学制备的血清型5荚膜多糖缀合物保护小鼠对抗实验感染。
用通过PDPH或CDT化学制备的血清型5荚膜多糖缀合物进行小鼠肾盂肾炎模型中的主动免疫研究。将荚膜多糖缀合至CRM197的方法如上文所述。结果显示与假免疫的动物相比两种缀合物均降低小鼠中的定殖(表20)。
表20：PDPH对CDT缀合在肾盂肾炎模型中 防范金黄色葡萄球菌攻击的效应。
Figure BPA00001514847900691
实施例15：血清型5荚膜多糖缀合物的主动免疫在大鼠心内膜炎模型中保护大鼠。
用CP5-CRM197 PDPH缀合物进行4个研究。在3个实验中的2个中，血清型5荚膜多糖缀合物显著减少心脏和肾中用金黄色葡萄球菌PFESA0266攻击之后回收的CFU(表21)。在第三个研究中，几何平均效价(GMT)抗CP5效价是这3个实验中最低的，但是其仅略低于以前的实验。
表21：血清型5荚膜多糖-CRM 197 免疫减少大鼠心内膜炎模型中的CFU。
实施例16：小鼠中HMW CP5缀合物疫苗与LMW CP5缀合物疫苗相比增强的免疫原性
进行小鼠肾盂肾炎研究以评价不同CP5缀合物制剂的免疫原性和有效性。测试两种制剂：第一种制剂由缀合至CRM197的高分子量(HMW)CP5(约300kDa)组成。第二种制剂含有缀合至CRM197的低分子量(LMW)CP5(约25kDa)。对HMW疫苗测试3个剂量水平(1、0.1和0.01mcg)。以1mcg测试LMW疫苗。还包括阴性对照组，其由缀合至CRM197的来源于肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的多糖缀合物疫苗(PP5)组成。在第0、3和6周将多糖与22mcg AlPO4配制，并且在第8周用金黄色葡萄球菌PFESA0266攻击。攻击之后48小时收获肾并计数细菌菌落。两种疫苗均有效产生免疫应答，并且从用HMW和LMW疫苗的1μg组免疫接种的小鼠的肾观察到金黄色葡萄球菌PFESA0266的CFU减少。如通过来自较低疫苗剂量的有效性降低所证实的，这是剂量依赖性的(图10)。CFU读出不够灵敏，不足以检测HMW和LMW疫苗效力的差异。因此通过OPA检测来自小鼠的血清。OPA效价定义为在OPA测定中杀死40％金黄色葡萄球菌菌株PFESA0266所需的血清的稀释。与LMW制剂相比，对HMW疫苗观察到提高的OPA效价(图11)。
实施例17：包含高分子量多糖的荚膜多糖缀合物表现出与包含低分子量多糖的缀合物相比增强的免疫原性。
进行非人灵长类(NHP)研究以评价不同荚膜缀合物制剂的免疫原性。以两个不同剂量水平(2和20μg)检测两种制剂。第一种制剂含有缀合至CRM197的高分子量(HMW)多糖(约130kDa)。第二种制剂含有缀合至CRM197的低分子量(LMW)多糖(约25kDa)。将5只灵长类的组用单一剂量的任一疫苗免疫接种，并且在免疫接种之前和免疫接种后2周监测免疫效价。OPA效价定义为在OPA测定中杀死40％金黄色葡萄球菌菌株PFESA0266所需的血清的稀释。还通过ELISA监测抗体效价。观察到HMW疫苗与LMW制剂相比增强的活性(表22)，这由HMW疫苗与LMW疫苗相比抗体效价升高10倍所证实。接受HMW疫苗的NHP的OPA有效率也更高(80％相比40％)。
表22.观察到HMW多糖缀合物疫苗与LMW多糖缀合物疫苗 相比增强的免疫原性。
Figure BPA00001514847900711
Figure BPA00001514847900721
实施例18：多糖O-乙酰化对于诱导对血清型5荚膜多糖缀合物的保护性抗体应答很重要。
为了评价血清型5荚膜多糖的O-乙酰化的重要性，如上文所讨论的，将天然荚膜多糖去O-乙酰化(dOAc)，并且利用PDPH缀合化学缀合至CRM197(dOAc-CRM197)。在小鼠肾盂肾炎模型中将dOAcCP-CRM197缀合物的效力与CP5-CRM197并行比较。
用缺少O-乙酰基的缀合物(dOAc CP5-CRM)免疫未减少肾中回收的细菌CFU。这些数据(表23)显示O-乙酰化对于引发针对CP5的功能抗体很重要。
表23：用去O-乙酰化血清型5荚膜多糖缀合物免疫不保护小鼠免受肾定殖。
Figure BPA00001514847900722
实施例19：利用具有已知特异性的单克隆抗体通过OPA证实O-乙酰化作为血清型5荚膜多糖的功能表位的重要性。
评价具有对OAc+(CP5-7-1)、OAc+/-(CP5-5-1)和OAc-(CP5-6-1)的特异性的血清型5荚膜多糖单克隆抗体对5型菌株PFESA0266的OP杀死活性(表24)。血清型8荚膜多糖的单克隆抗体(CP8 OAc+特异性的CP8-3-1)用作阴性对照。
OAc特异性抗CP5mAb CP5-7-1介导金黄色葡萄球菌PFESA0266的杀死(表24)。而且识别CP5 OAc+和CP5 OAc-共享的表位的单克隆抗体CP5-5-1介导PFESA0266菌株的杀死。存在于血清型5 OAc-荚膜多糖上的表位的特异性单克隆抗体不介导PFESA0266菌株的杀死。这些结果显示血清型5荚膜多糖上的O-乙酰基表位是激发血清型5特异性抗体的功能活性所必需的。
如通过在动物效力模型中杀死细菌或通过证实抗体杀死细菌的调理吞噬杀死测定所测量的，抗体需要有功能。利用仅单独监测抗体的产生的测定不可以证实功能性杀死，这不是O-乙酰化在效力中的重要性的指示。
表24：O-乙酰化(+)血清型5荚膜多糖以及O-和去O-乙酰化(+/-)血清型5 荚膜多糖特异性单克隆抗体是对金黄色葡萄球菌PFESA0266(5型)调理的。
Figure BPA00001514847900731
实施例20：在非人灵长类(NHP)中观察到由高分子量多糖组成的CP5缀合物与低分子量多糖相比增强的免疫原性。
进行非人灵长类(NHP)研究以评价不同荚膜缀合物制剂的免疫原性。以两个不同剂量水平(2和20μg)检测两种制剂。第一种制剂由缀合至CRM197的高分子量(HMW)多糖(约130kDa)组成。第二种制剂含有缀合至CRM197的低分子量(LMW)多糖(约25kDa)。将5只灵长类的组用单一剂量的任一疫苗免疫接种，并且在免疫接种之前和免疫接种后2周监测免疫效价。OPA效价定义为在OPA测定中杀死40％金黄色葡萄球菌菌株PFESA0266所需的血清的稀释。还通过ELISA监测抗体效价。观察到HMW疫苗与LMW制剂相比增强的活性(表25)。HMW疫苗与LMW疫苗相比抗体效价升高3-10倍。接受HMW疫苗的NHP的OPA有效率也更高(80％相比40％)。
表25：观察到HMW多糖缀合物疫苗与LMW多糖缀合物疫苗 相比增强的免疫原性。
Figure BPA00001514847900741
总结
本文所述的两种缀合化学均产生共价连接至载体蛋白CRM197的血清型5荚膜多糖。这两种方法所产生的缀合物的游离糖、血清型5多糖∶蛋白的比例以及产率没有显著差异。
本说明书所提到的所有出版物和专利申请代表本发明所属领域的技术人员的水平。所有出版物和专利申请均援引加入本文，其援引程度就如将每一个别出版物或专利申请特定且个别地援引加入本文。
虽然上述发明已通过说明的方式和为了清楚理解的目的的实例来详细描述，但是某些变化和修改可以在所附权利要求的范围内实施。

Claims (103)

1.免疫原性多糖-蛋白缀合物，其包含分离的缀合至载体蛋白的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)血清型8荚膜多糖，其中：
a)所述多糖具有20kDa-1000kDa的分子量。
2.权利要求1的免疫原性缀合物，其中所述免疫原性缀合物具有200kDa-5000kDa的分子量。
3.免疫原性多糖-蛋白缀合物，其包含分离的缀合至载体蛋白的金黄色葡萄球菌血清型5荚膜多糖，其中：
a)所述多糖具有20kDa-1000kDa的分子量。
4.权利要求3的免疫原性缀合物，其中所述免疫原性缀合物具有200kDa-5000kDa的分子量。
5.权利要求1-4中任一项的免疫原性缀合物，其中所述多糖具有70kDa-300kDa的分子量。
6.权利要求1-5中任一项的免疫原性缀合物，其中所述缀合物具有500kDa-2500kDa的分子量。
7.权利要求1-4中任一项的免疫原性缀合物，其中所述多糖具有10-100％的O-乙酰化程度。
8.权利要求7的免疫原性缀合物，其中所述多糖具有50-100％的O-乙酰化程度。
9.权利要求7的免疫原性缀合物，其中所述多糖具有75-100％的O-乙酰化程度。
10.权利要求7-9中任一项的免疫原性缀合物，其中所述免疫原性缀合物可以产生抗体，如通过在动物效力模型中杀死细菌或通过调理吞噬杀死测定所测量的，所述抗体是有功能的。
11.权利要求1-10中任一项的免疫原性缀合物，其中所述载体蛋白为CRM197。
12.权利要求11的免疫原性缀合物，其中所述CRM197通过氨基甲酸酯键、酰胺键或两者共价连接至所述多糖。
13.权利要求11或12的免疫原性缀合物，其中缀合的赖氨酸比CRM197的摩尔比为约10∶1-约25∶1。
14.权利要求13的免疫原性缀合物，其中在所述多糖的至少每5-10个糖重复单元存在至少一个CRM197和多糖之间的共价键。
15.权利要求13或14的免疫原性缀合物，其中在所述多糖的每5个糖重复单元存在至少一个CRM197和多糖之间的键。
16.权利要求11-15中任一项的免疫原性缀合物，其中所述CRM197包含5-22个共价连接至所述多糖的赖氨酸。
17.权利要求16的免疫原性缀合物，其中所述CRM197包含8-15个共价连接至所述多糖的赖氨酸。
18.权利要求1-17中任一项的免疫原性缀合物，与5型或8型多糖的总量相比，其包含少于30％的游离5型或8型多糖。
19.权利要求18的免疫原性缀合物，与5型或8型多糖的总量相比，其包含少于20％的游离5型或8型多糖。
20.免疫原性组合物，其包含权利要求1-19中任一项的免疫原性缀合物以及包含佐剂、稀释剂或载体中的至少一种。
21.权利要求20的免疫原性组合物，其中所述佐剂是基于铝的佐剂。
22.权利要求21的免疫原性组合物，其中所述佐剂选自磷酸铝、硫酸铝和氢氧化铝。
23.权利要求21的免疫原性组合物，其中所述佐剂为磷酸铝。
24.权利要求20-23中任一项的免疫原性组合物，与5型或8型多糖的总量相比，其包含少于30％的游离5型或8型多糖。
25.权利要求24的免疫原性组合物，与5型或8型多糖的总量相比，其包含少于20％的游离5型或8型多糖。
26.一种诱导对象中对金黄色葡萄球菌血清型5或血清型8荚膜多糖缀合物的免疫应答的方法，其包括向所述对象施用免疫学有效量的权利要求20-25中任一项的免疫原性组合物。
27.一种产生包含分离的缀合至载体蛋白的金黄色葡萄球菌血清型8荚膜多糖的免疫原性多糖-蛋白缀合物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)使分离的金黄色葡萄球菌血清型8荚膜多糖与羰基二三唑(CDT)在有机溶剂中反应以产生活化的血清型8多糖；以及
b)使所述活化的血清型8多糖与载体蛋白在有机溶剂中反应以产生血清型8多糖∶载体蛋白缀合物；
其中产生包含金黄色葡萄球菌血清型8荚膜多糖-载体蛋白缀合物的免疫原性缀合物。
28.一种产生包含分离的缀合至载体蛋白的金黄色葡萄球菌血清型5荚膜多糖的免疫原性多糖-蛋白缀合物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)使分离的金黄色葡萄球菌血清型5荚膜多糖与羰基二三唑(CDT)在有机溶剂中反应以产生活化的血清型8多糖；以及
b)使所述活化的血清型5多糖与载体蛋白在有机溶剂中反应以产生血清型5多糖∶载体蛋白缀合物；
其中产生包含金黄色葡萄球菌血清型5荚膜多糖-载体蛋白缀合物的免疫原性缀合物。
29.权利要求27或28的方法，其进一步包括：
冻干所述分离的多糖；以及将所述冻干的多糖重悬于有机溶剂中。
30.权利要求27-29中任一项的方法，其中在与所述载体蛋白反应之前将所述活化的分离的多糖从所述活化反应。
31.权利要求30的方法，其中步骤b)包括：
i)冻干所述分离的活化的分离的多糖以产生冻干的活化的分离的多糖；
ii)冻干所述载体蛋白以产生冻干的载体蛋白；和
iii)将所述冻干的活化的分离的多糖和所述冻干的载体蛋白重悬于有机溶剂中以产生与载体蛋白混合的活化的分离的多糖。
32.权利要求27-31中任一项的方法，其进一步包括将步骤b)的反应混合物稀释入缓冲液，并且在约20℃-约26℃下维持约8.8-约9.2的pH至少4小时。
33.权利要求27-31中任一项的方法，其进一步包括将步骤b)的反应混合物稀释入缓冲液，并且在约23℃下维持约9.0的pH至少4小时。
34.权利要求27-33中任一项的方法，其进一步包括分离所述金黄色葡萄球菌血清型荚膜多糖载体蛋白缀合物。
35.权利要求27-34中任一项的方法，其中所述有机溶剂为极性非质子溶剂。
36.权利要求35的方法，其中所述极性非质子溶剂选自二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基乙酰胺、N-甲基-2-吡咯烷酮和六甲基磷酰胺(HMPA)。
37.权利要求36的方法，其中所述有机溶剂为二甲基亚砜(DMSO)。
38.权利要求27和29-37中任一项的方法，其中使所述多糖与CDT反应的步骤包括测定存在于所述金黄色葡萄球菌血清型8荚膜多糖中的水，并且在所述有机溶剂中将所述CDT浓度调整至约1∶1的CDT∶水的摩尔比。
39.权利要求27和29-38中任一项的方法，其中使所述多糖与CDT反应的步骤包括测定存在于所述金黄色葡萄球菌血清型8荚膜多糖中的水，并且在所述有机溶剂中将所述CDT浓度调整至约0.5∶1的CDT∶水的摩尔比。
40.权利要求27和29-38中任一项的方法，其中使所述多糖与CDT反应的步骤包括测定存在于所述金黄色葡萄球菌血清型荚膜8多糖中的水，并且在所述有机溶剂中将所述CDT浓度调整至约0.75∶1的CDT∶水的摩尔比。
41.权利要求28-37中任一项的方法，其中使所述血清型5多糖与CDT反应的步骤包括提供与所述多糖相比约20倍摩尔过量的CDT。
42.权利要求28-37和41中任一项的方法，其中将有机溶剂混合物中的血清型5多糖CDT调整至水浓度为0.1-0.3％。
43.权利要求42的方法，其中将所述水浓度调整至0.2％。
44.权利要求29-43中任一项的方法，其中分离所述活化的血清型多糖的步骤包括渗滤。
45.权利要求27-44中任一项的方法，其中冻干之前将所述载体蛋白对NaCl渗滤，并且将NaCl/蛋白载体蛋白的w/w比例调整至约0.5-约1.5。
46.权利要求27-45中任一项的方法，其中所述载体蛋白为CRM197。
47.权利要求46的方法，其中使所述活化的血清型多糖与所述CRM197以约1∶1的重量比反应。
48.权利要求27-47中任一项的方法，其中在与CDT在有机溶剂中混合之前使所述分离的金黄色葡萄球菌血清型荚膜多糖与咪唑或三唑混合。
49.权利要求27-48中任一项的方法，其进一步包括水解所述血清型多糖-载体蛋白缀合物以去除未反应的活化基团。
50.一种制备包含分离的缀合至载体蛋白的金黄色葡萄球菌血清型8荚膜多糖的免疫原性缀合物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)使金黄色葡萄球菌血清型8荚膜多糖与3-(2-吡啶二硫代)-丙酰肼(PDPH)和碳二亚胺在有机溶剂中反应以产生PDPH连接的多糖；
b)使所述PDPH连接的多糖与还原剂反应以产生活化的多糖；
c)分离所述活化的血清型8多糖以产生分离的活化的血清型8多糖；
d)提供活化的载体蛋白；
e)使所述分离的活化的血清型8多糖与所述活化的载体蛋白反应以产生血清型8多糖-载体蛋白缀合物；从而产生包含分离的缀合至载体蛋白的金黄色葡萄球菌血清型8荚膜多糖的免疫原性缀合物。
51.一种制备包含分离的缀合至载体蛋白的金黄色葡萄球菌血清型5荚膜多糖的免疫原性缀合物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)使金黄色葡萄球菌血清型5荚膜多糖与3-(2-吡啶二硫代)-丙酰肼(PDPH)和碳二亚胺在有机溶剂中反应以产生PDPH连接的多糖；
b)使所述PDPH连接的多糖与还原剂反应以产生活化的多糖；
c)分离所述活化的血清型5多糖以产生分离的活化的血清型5多糖；
d)提供活化的载体蛋白；
e)使所述分离的活化的血清型5多糖与所述活化的载体蛋白反应以产生血清型5多糖-载体蛋白缀合物；从而产生包含分离的缀合至载体蛋白的金黄色葡萄球菌血清型5荚膜多糖的免疫原性缀合物。
52.权利要求50或51的方法，其中在使所述活化的载体蛋白与所述活化的多糖反应之前分离所述活化的载体蛋白。
53.权利要求50-52中任一项的方法，其中：
步骤c)进一步包括冻干所述分离的活化的血清型8多糖以产生冻干的活化的血清型多糖。
54.权利要求50-53中任一项的方法，其中所述有机溶剂为极性非质子溶剂。
55.权利要求54的方法，其中所述极性非质子溶剂选自二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基乙酰胺、N-甲基-2-吡咯烷酮和六甲基磷酰胺(HMPA)。
56.权利要求55的方法，其中所述极性非质子溶剂为二甲基亚砜(DMSO)。
57.权利要求50-56中任一项的方法，其中所述碳二亚胺为1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDAC)。
58.权利要求50-57中任一项的方法，其中使所述血清型荚膜多糖与PDPH和EDAC在有机溶剂中反应的步骤包括维持约1∶5∶3的多糖∶PDPH∶EDAC重量比。
59.权利要求50-58中任一项的方法，其中所述还原剂为二硫苏糖醇(DTT)。
60.权利要求50-59中任一项的方法，其中所述载体蛋白的活化包括使所述载体蛋白与溴乙酸反应。
61.权利要求60的方法，其中所述溴乙酸包括溴乙酸的N-羟基琥珀酰亚胺酯(BAANS)。
62.权利要求50-61中任一项的方法，其中分离所述活化的血清型多糖的步骤包括渗滤。
63.权利要求50-62中任一项的方法，其中分离所述活化的载体蛋白的步骤包括渗滤。
64.权利要求50-63中任一项的方法，其进一步包括水解所述血清型多糖-载体蛋白缀合物以去除未反应的活化基团的步骤。
65.权利要求64的方法，其中水解所述血清型多糖-载体蛋白缀合物的步骤包括加入半胱胺盐酸盐。
66.权利要求50-65中任一项的方法，其进一步包括分离所述包含分离的缀合至载体蛋白的金黄色葡萄球菌血清型荚膜多糖的免疫原性缀合物。
67.权利要求66的方法，其中所述血清型多糖∶载体蛋白缀合物的分离包括渗滤。
68.权利要求50-67中任一项的方法，其中所述载体蛋白为CRM197。
69.权利要求68的方法，其中使所述活化的血清型多糖与所述CRM197以约1∶1的重量比反应。
70.权利要求27-69中任一项的方法，其中所述活化的多糖具有约20kDa-约1000kDa的大小。
71.权利要求70的方法，其中所述活化的多糖具有约50kDa-500kDa的大小。
72.权利要求27-71中任一项的方法，其中所述免疫原性多糖-蛋白缀合物具有400kDa-约5000kDa的大小。
73.通过权利要求27-72中任一项所述的方法制备的免疫原性缀合物。
74.权利要求73的免疫原性缀合物，其包含超过约1％的游离多糖和少于约30％的游离多糖。
75.权利要求73的免疫原性缀合物，其包含少于约20％的游离多糖。
76.免疫原性组合物，其包含权利要求73-75中任一项的免疫原性缀合物以及包含佐剂、稀释剂或载体中的至少一种。
77.权利要求76的免疫原性组合物，其中所述佐剂是基于铝的佐剂。
78.权利要求77的免疫原性组合物，其中所述佐剂选自磷酸铝、硫酸铝和氢氧化铝。
79.权利要求78的免疫原性组合物，其中所述佐剂为磷酸铝。
80.权利要求76-79中任一项的免疫原性组合物，与类型多糖的总量相比，其包含少于30％的游离型多糖。
81.权利要求80的免疫原性组合物，与类型多糖的总量相比，其包含少于20％的游离型多糖。
82.具有20kDa-1000kDa的分子量的金黄色葡萄球菌8型荚膜多糖，其共价结合至载体蛋白；其中共价结合至所述载体蛋白的多糖的组合分子量为约200kDa-5000kDa。
83.具有20kDa-1000kDa的分子量的金黄色葡萄球菌5型荚膜多糖其共价结合至载体蛋白；其中共价结合至所述载体蛋白的多糖的组合分子量为约200kDa-5000kDa。
84.权利要求82或83的共价结合至载体蛋白的多糖，其中所述多糖具有70kDa-300kDa的分子量范围。
85.权利要求82或83的共价结合至载体蛋白的多糖，其具有500kDa-2500kDa的分子量范围。
86.权利要求82或83的共价结合至载体蛋白的多糖，其中所述载体蛋白为CRM197。
87.权利要求86的共价结合至载体蛋白的多糖，其中所述CRM197通过氨基甲酸酯键、酰胺键或两者共价连接至所述多糖。
88.权利要求86或87的共价结合至载体蛋白的多糖，其中缀合的赖氨酸比CRM197的摩尔比为约10∶1-约25∶1。
89.权利要求88的共价结合至载体蛋白的多糖，其中在所述多糖的至少每5-10个糖重复单元存在至少一个CRM197和多糖之间的共价键。
90.权利要求88或89的共价结合至载体蛋白的多糖，其中在所述多糖的至少每5个糖重复单元存在至少一个CRM197和多糖之间的键。
91.权利要求88-89中任一项的共价结合至载体蛋白的多糖，其中所述CRM197包含5-22个共价连接至所述多糖的赖氨酸。
92.权利要求91的共价结合至载体蛋白的多糖，其中所述CRM197包含8-15个共价连接至所述多糖的赖氨酸。
93.一种免疫原性组合物，其包含权利要求82-92中任一项所述的共价结合至载体蛋白的多糖以及包含佐剂、稀释剂或载体中的至少一种。
94.权利要求93的免疫原性组合物，其中所述佐剂是基于铝的佐剂。
95.权利要求94的免疫原性组合物，其中所述佐剂选自磷酸铝、硫酸铝和氢氧化铝。
96.权利要求95的免疫原性组合物，其中所述佐剂为磷酸铝。
97.一种减少或预防与对象中的葡萄球菌感染、葡萄球菌细菌相关的疾病或疾病状况的方法，所述方法包括向所述对象施用免疫学有效量的权利要求20-25和76-81和93-96中任一项的免疫原性组合物的步骤。
98.权利要求97的方法，其中所述感染、疾病或疾病状况选自侵袭性金黄色葡萄球菌、败血症和携带。
99.一种减少或预防接受外科手术的对象中的葡萄球菌感染的方法，所述方法包括在所述外科手术之前向所述对象施用免疫学有效量的权利要求20-25和76-81和93-96中任一项所述的免疫原性组合物的步骤。
100.权利要求97-99中任一项的方法，其中所述对象是人、家庭宠物或家畜。
101.分离具有20-1000kDa的分子量的金黄色葡萄球菌荚膜多糖的方法，所述方法包括使细菌细胞悬浮液接受酸加热处理的步骤。
102.本发明的荚膜多糖、免疫原性缀合物或免疫原性组合物所产生的抗体。
103.权利要求102的抗体，其中如通过在动物效力模型中杀死细菌或通过调理吞噬杀死测定所测量的，所述抗体是有功能的。
CN2010800372767A 2009-06-22 2010-06-22 用于制备金黄色葡萄球菌血清型5和8荚膜多糖缀合物免疫原性组合物的组合物和方法 Pending CN102625713A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US21915109P 2009-06-22 2009-06-22
US21914309P 2009-06-22 2009-06-22
US61/219,143 2009-06-22
US61/219,151 2009-06-22
PCT/US2010/039473 WO2011041003A2 (en) 2009-06-22 2010-06-22 Compositions and methods for preparing staphylococcus aureus serotype 5 and 8 capsular polysaccharide conjugate immunogenic compositions

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN102625713A true CN102625713A (zh) 2012-08-01

Family

ID=43599164

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2010800372767A Pending CN102625713A (zh) 2009-06-22 2010-06-22 用于制备金黄色葡萄球菌血清型5和8荚膜多糖缀合物免疫原性组合物的组合物和方法

Country Status (22)

Country Link
US (2) US9125951B2 (zh)
EP (2) EP3461496B1 (zh)
JP (4) JP2012530785A (zh)
KR (2) KR101774062B1 (zh)
CN (1) CN102625713A (zh)
AR (1) AR077190A1 (zh)
AU (1) AU2010301043B2 (zh)
BR (1) BRPI1011753B8 (zh)
CA (1) CA2766418C (zh)
CO (1) CO6480930A2 (zh)
ES (2) ES2729934T3 (zh)
IL (1) IL217085B (zh)
MX (1) MX2012000045A (zh)
MY (1) MY158231A (zh)
NZ (1) NZ597191A (zh)
PE (1) PE20110065A1 (zh)
PH (2) PH12015502508A1 (zh)
RU (1) RU2531234C2 (zh)
SA (1) SA114350400B1 (zh)
SG (2) SG10201406432RA (zh)
TW (2) TW201544119A (zh)
WO (1) WO2011041003A2 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104661684A (zh) * 2012-08-16 2015-05-27 辉瑞公司 糖缀合方法和组合物
CN111228478A (zh) * 2020-02-25 2020-06-05 江南大学 三糖重复单元寡糖链在制备金黄色葡萄球菌疫苗中的应用

Families Citing this family (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010151544A1 (en) 2009-06-22 2010-12-29 Wyeth Llc Immunogenic compositions of staphylococcus aureus antigens
MX373250B (es) * 2009-09-30 2020-05-04 Glaxosmithkline Biologicals S A Star Conjugación de polisacáridos capsulares de tipo 5 y de tipo 8 de staphylococcus aureus.
RS56000B1 (sr) * 2009-10-30 2017-09-29 Glaxosmithkline Biologicals Sa Prečišćavanje stafilokokus aureus tip 5 i tip 8 kapsuliranih saharida
AR091902A1 (es) 2012-07-25 2015-03-11 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Formulacion liquida de un conjugado de insulina de accion prolongada
NZ708523A (en) * 2012-11-21 2018-09-28 Serum Institute Of India Pvt Ltd Production of high yields of bacterial polysaccharides
GB201310008D0 (en) 2013-06-05 2013-07-17 Glaxosmithkline Biolog Sa Immunogenic composition for use in therapy
EP4286000A3 (en) * 2014-01-21 2024-02-14 Pfizer Inc. Streptococcus pneumoniae capsular polysaccharides and conjugates thereof
AU2015259298A1 (en) 2014-05-12 2017-01-05 Purdue Research Foundation Selectin and ICAM/VCAM peptide ligand conjugates
US10307474B2 (en) * 2014-08-08 2019-06-04 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Modified host cells and hybrid oligosaccharides for use in bioconjugate production
EP3229833A1 (en) 2014-12-10 2017-10-18 GlaxoSmithKline Biologicals SA Method of treatment
TWI807252B (zh) * 2015-05-04 2023-07-01 美商輝瑞股份有限公司 Ｂ型鏈球菌多醣-蛋白質軛合物、製造軛合物之方法、含軛合物之免疫原性組成物、及其用途
TWI720448B (zh) * 2015-07-21 2021-03-01 美商輝瑞股份有限公司 包含經共軛之莢膜糖抗原的致免疫性組成物、包含該致免疫性組成物之套組及彼等之用途
KR20180108619A (ko) * 2016-02-15 2018-10-04 히프라 사이언티픽, 에스.엘.유 면역원성 작용제로서 스트렙토코쿠스 우베리스 추출물
MX2018010920A (es) * 2016-03-15 2019-03-06 Msd Wellcome Trust Hilleman Laboratories Pvt Ltd Nuevos conjugados de polisacarido-proteina, y procedimiento para obtener los mismos.
US11400162B2 (en) 2017-02-24 2022-08-02 Merck Sharp & Dohme Llc Processes for the formulation of pneumococcal polysaccharides for conjugation to a carrier protein
AU2018225099B2 (en) * 2017-02-24 2024-08-22 Merck Sharp & Dohme Llc Enhancing immunogenicity of Streptococcus pneumoniae polysaccharide-protein conjugates
CN111050794B (zh) * 2017-09-07 2025-03-11 默沙东有限责任公司 将肺炎球菌多糖与载体蛋白缀合的配制方法
CA3074711A1 (en) 2017-09-07 2019-03-14 Merck Sharp & Dohme Corp. Pneumococcal polysaccharides and their use in immunogenic polysaccharide-carrier protein conjugates
KR102734995B1 (ko) 2017-09-07 2024-11-26 머크 샤프 앤드 돔 엘엘씨 폐렴구균 폴리사카라이드 및 면역원성 폴리사카라이드-담체 단백질 접합체에서의 그의 용도
KR20210005158A (ko) 2018-04-30 2021-01-13 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 피막 폴리사카라이드 담체 단백질 접합체를 제조하는 방법
WO2019212842A1 (en) 2018-04-30 2019-11-07 Merck Sharp & Dohme Corp. Methods for producing streptococcus pneumoniae capsular polysaccharide carrier protein conjugates from lyospheres
WO2019212844A1 (en) * 2018-04-30 2019-11-07 Merck Sharp & Dohme Corp. Methods for providing a homogenous solution of lyophilized mutant diptheria toxin in dimethylsulfoxide
US11260119B2 (en) 2018-08-24 2022-03-01 Pfizer Inc. Escherichia coli compositions and methods thereof
JP7239509B6 (ja) 2019-02-22 2023-03-28 ファイザー・インク 細菌多糖類を精製するための方法
WO2021165847A1 (en) 2020-02-21 2021-08-26 Pfizer Inc. Purification of saccharides
US12138302B2 (en) 2020-10-27 2024-11-12 Pfizer Inc. Escherichia coli compositions and methods thereof
US20220387576A1 (en) * 2021-05-28 2022-12-08 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1688343A (zh) * 2002-08-30 2005-10-26 启龙有限公司 修饰糖、其缀合物及其制备方法
CN1747748A (zh) * 2003-05-23 2006-03-15 尼克塔治疗亚拉巴马公司 具有特定原子排列的聚合物衍生物
CN1787839A (zh) * 2003-03-07 2006-06-14 惠氏控股公司 用于抗医院内感染的免疫的多糖－葡萄球菌表面粘附素载体蛋白缀合物
WO2007113223A2 (en) * 2006-03-30 2007-10-11 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Immunogenic composition
CN101132810A (zh) * 2004-12-14 2008-02-27 Nabi生物制药公司 含有肽聚糖的糖缀合物疫苗
WO2008084411A2 (en) * 2007-01-11 2008-07-17 Novartis Ag Modified saccharides
CN101410135A (zh) * 2006-03-30 2009-04-15 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 免疫原性组合物

Family Cites Families (68)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US150688A (en) 1874-05-12 Improvement in centrifugal machines
US4134214A (en) 1977-08-05 1979-01-16 Merck & Co., Inc. Freeze-drying process for the preparation of meningococcus vaccine without degradation of potency
US4902506A (en) 1983-07-05 1990-02-20 The University Of Rochester Immunogenic conjugates
US4673574A (en) 1981-08-31 1987-06-16 Anderson Porter W Immunogenic conjugates
US4708871A (en) 1983-03-08 1987-11-24 Commonwealth Serum Laboratories Commission Antigenically active amino acid sequences
SE8405493D0 (sv) 1984-11-01 1984-11-01 Bror Morein Immunogent komplex samt sett for framstellning derav och anvendning derav som immunstimulerande medel
NZ214503A (en) * 1984-12-20 1990-02-26 Merck & Co Inc Covalently-modified neutral bacterial polysaccharides, stable covalent conjugates of such polysaccharides and immunogenic proteins, and methods of preparing such polysaccharides and conjugates
IL78775A (en) 1985-05-15 1992-06-21 Biotech Australia Pty Ltd Oral vaccines
US5078996A (en) 1985-08-16 1992-01-07 Immunex Corporation Activation of macrophage tumoricidal activity by granulocyte-macrophage colony stimulating factor
US5057540A (en) 1987-05-29 1991-10-15 Cambridge Biotech Corporation Saponin adjuvant
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
HU212924B (en) 1989-05-25 1996-12-30 Chiron Corp Adjuvant formulation comprising a submicron oil droplet emulsion
CA2047031A1 (en) 1990-07-19 1992-01-20 Stephen Marburg Peptide-polysaccharide-protein conjugate vaccines
NZ239643A (en) 1990-09-17 1996-05-28 North American Vaccine Inc Vaccine containing bacterial polysaccharide protein conjugate and adjuvant (c-nd-che-a-co-b-r) with a long chain alkyl group.
CA2123811C (en) 1991-11-22 2005-07-05 Ali Ibrahim Fattom Type i and type ii surface antigens associated with staphylococcus epidermidis
IT1253009B (it) 1991-12-31 1995-07-10 Sclavo Ricerca S R L Mutanti immunogenici detossificati della tossina colerica e della tossina lt, loro preparazione ed uso per la preparazione di vaccini
ATE280235T1 (de) 1993-03-05 2004-11-15 Wyeth Corp Plasmid zur herstellung von crm-protein und diphtherie-toxin
ATE254475T1 (de) 1993-09-22 2003-12-15 Jackson H M Found Military Med Verfahren zur aktivierung von löslichem kohlenhydraten durch verwendung von neuen cyanylierungsreagenzien, zur herstellung von immunogenischen konstrukten
US5571515A (en) 1994-04-18 1996-11-05 The Wistar Institute Of Anatomy & Biology Compositions and methods for use of IL-12 as an adjuvant
US6207646B1 (en) 1994-07-15 2001-03-27 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
WO1996014873A2 (en) * 1994-11-16 1996-05-23 Sri International COVALENTLY BOUND β-GLUCAN CONJUGATES IN TARGETED DELIVERY
BE1008978A5 (fr) 1994-12-27 1996-10-01 Solvay Adjuvants pour vaccins.
IL121585A0 (en) * 1995-06-07 1998-02-08 Alberta Res Council Immunogenic and immunostimulatory oligosaccharide compositions and methods of preparing and using them
GB9622159D0 (en) 1996-10-24 1996-12-18 Solvay Sociutu Anonyme Polyanionic polymers as adjuvants for mucosal immunization
GB9622660D0 (en) 1996-10-31 1997-01-08 Biocine Spa Immunogenic detoxified mutant toxin
US6113918A (en) 1997-05-08 2000-09-05 Ribi Immunochem Research, Inc. Aminoalkyl glucosamine phosphate compounds and their use as adjuvants and immunoeffectors
US6027925A (en) 1997-06-12 2000-02-22 Shin-Etsu Bio, Inc. Production of non-native bacterial exopolysaccharide in a recombinant bacterial host
WO1999003871A1 (en) 1997-07-17 1999-01-28 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Hexadecasaccharide-protein conjugate vaccine for shigella dysenteriae type 1
WO1999027109A2 (en) 1997-11-26 1999-06-03 Inhibitex, Inc. EXTRACELLULAR MATRIX-BINDING PROTEINS FROM $i(STAPHYLOCOCCUS AUREUS)
US7252828B2 (en) 1998-07-15 2007-08-07 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Polysaccharide vaccine for staphylococcal infections
WO2000012131A1 (en) 1998-08-31 2000-03-09 Inhibitex, Inc. Multicomponent vaccines
US6703025B1 (en) 1998-08-31 2004-03-09 Inhibitex, Inc. Multicomponent vaccines
US6146902A (en) 1998-12-29 2000-11-14 Aventis Pasteur, Inc. Purification of polysaccharide-protein conjugate vaccines by ultrafiltration with ammonium sulfate solutions
EP1035137A1 (en) 1999-03-12 2000-09-13 Pasteur Merieux Serums Et Vaccins Method for the reductive amination of polysaccharides
SI1163000T1 (sl) 1999-03-19 2008-06-30 Glaxosmithkline Biolog Sa Vakcina proti antigenom iz bakterij
US6936258B1 (en) 1999-03-19 2005-08-30 Nabi Biopharmaceuticals Staphylococcus antigen and vaccine
US7115730B1 (en) 1999-04-27 2006-10-03 Chiron Srl Immunogenic detoxified mutant E. coli LT-A-toxin
US7384640B1 (en) 1999-09-30 2008-06-10 Wyeth Holdings Corporation Mutant cholera holotoxin as an adjuvant
EP2298736B1 (en) 2000-03-22 2015-07-15 Solulink, Inc. Hydrazine-based and carbonyl-based bifunctional crosslinking reagents
GB0007432D0 (en) 2000-03-27 2000-05-17 Microbiological Res Authority Proteins for use as carriers in conjugate vaccines
ATE249839T1 (de) 2000-06-08 2003-10-15 Intercell Biomedizinische Forschungs & Entwicklungs Gmbh Immunstimulierende oligodeoxynukleotide
AT410635B (de) 2000-10-18 2003-06-25 Cistem Biotechnologies Gmbh Vakzin-zusammensetzung
US7105333B2 (en) * 2001-03-27 2006-09-12 Deadreon Corporation Nucleic acid molecules encoding a transmembrane serine protease 9, the encoded polypeptides and methods based thereon
US7332174B2 (en) 2001-06-07 2008-02-19 Wyeth Holdings Corporation Mutant forms of cholera holotoxin as an adjuvant
JP2004535187A (ja) 2001-06-07 2004-11-25 ワイス・ホールデイングス・コーポレーシヨン アジュバントとしてのコレラホロトキシンの突然変異形
CA2351018A1 (en) 2001-07-09 2003-01-09 Universite De Sherbrooke Dna vaccine against staphylococcus aureus
FR2828404B1 (fr) 2001-08-10 2005-07-15 Neovacs Superimmunogene composite a usage vaccinal bifonctionnel pour le traitement des maladies associees a un desordre tissulaire stromal
US20030113350A1 (en) 2001-09-19 2003-06-19 Fattom Ali I. Glycoconjugate vaccines for use in immune-compromised populations
US20030092062A1 (en) * 2001-10-24 2003-05-15 Reddy M. Parameswara Immobilizing biological molecules
ES2318117T3 (es) 2002-03-26 2009-05-01 Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. Sacaridos modificados que tienen una estabilidad mejorada en agua.
TW200306314A (en) 2002-04-16 2003-11-16 Tanabe Seiyaku Co Liquid preparation comprising camptothecin derivative and pharmaceutical composition producible by lyophilizing the preparation
PT1565478T (pt) 2002-11-12 2017-11-14 The Brigham And Women`S Hospital Inc Vacina de polissacáridos para infeções estafilocócicas
JP4078417B2 (ja) 2003-03-04 2008-04-23 独立行政法人産業技術総合研究所 好熱菌由来オリゴペプチダーゼ
WO2004083251A2 (en) 2003-03-17 2004-09-30 Wyeth Holdings Corporation Mutant cholera holotoxin as an adjuvant and an antigen carrier protein
GB0323103D0 (en) 2003-10-02 2003-11-05 Chiron Srl De-acetylated saccharides
BRPI0417744B8 (pt) 2003-12-17 2021-05-25 Wyeth Corp método para produzir um conjugado imunogênico, e,conjugado imunogênico
US7537766B2 (en) 2004-08-30 2009-05-26 Wyeth Neisseria meningitidis inner core lipo-oligosaccharide epitopes, multivalent conjugates thereof and immunogenic compositions thereof
US20080085289A1 (en) 2004-09-22 2008-04-10 Cindy Castado Immunogenic Composition
PT1896061T (pt) * 2005-06-27 2019-08-01 Glaxosmithkline Biologicals Sa Composição imunogénica
US20100021503A1 (en) * 2006-03-30 2010-01-28 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Immunogenic composition
FR2899110A1 (fr) * 2006-03-31 2007-10-05 Sanofi Pasteur Sa Polysaccharides capsulaires de type 5 et de type 8 des souches surproductrices de staphylococcus aureus
WO2007127668A2 (en) 2006-04-26 2007-11-08 Wyeth Novel processes for coating container means which inhibit precipitation of polysaccharide-protein conjugate formulations
EP2436700B8 (en) 2007-03-23 2018-08-01 Wyeth LLC Shortened purification process for the production of capsular streptococcus pneumoniae polysaccharides
BRPI0909820A2 (pt) 2008-03-05 2015-08-11 Sanofi Pasteur Processo para estabilização de composição de vacina contra gripe, para estabilização de composição de vacina contendo adjuvante e para preparação de vacina, composições de vacina, kit de vacina e método de estocagem de uma matéria prima
WO2010151544A1 (en) * 2009-06-22 2010-12-29 Wyeth Llc Immunogenic compositions of staphylococcus aureus antigens
GB0913681D0 (en) 2009-08-05 2009-09-16 Glaxosmithkline Biolog Sa Immunogenic composition
RS56000B1 (sr) 2009-10-30 2017-09-29 Glaxosmithkline Biologicals Sa Prečišćavanje stafilokokus aureus tip 5 i tip 8 kapsuliranih saharida
WO2012085872A2 (en) 2010-12-22 2012-06-28 Wyeth Llc Stable immunogenic compositions of staphylococcus aureus antigens

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1688343A (zh) * 2002-08-30 2005-10-26 启龙有限公司 修饰糖、其缀合物及其制备方法
CN1787839A (zh) * 2003-03-07 2006-06-14 惠氏控股公司 用于抗医院内感染的免疫的多糖－葡萄球菌表面粘附素载体蛋白缀合物
CN1747748A (zh) * 2003-05-23 2006-03-15 尼克塔治疗亚拉巴马公司 具有特定原子排列的聚合物衍生物
CN101132810A (zh) * 2004-12-14 2008-02-27 Nabi生物制药公司 含有肽聚糖的糖缀合物疫苗
WO2007113223A2 (en) * 2006-03-30 2007-10-11 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Immunogenic composition
CN101410135A (zh) * 2006-03-30 2009-04-15 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 免疫原性组合物
WO2008084411A2 (en) * 2007-01-11 2008-07-17 Novartis Ag Modified saccharides

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FATTOM.A.L ET.AL: "《Development of StaphVAX(TM), a polysaccharide conjugate vaccine against S.aureus infection: from the lab bench to phase III clinical trials》", 《VACCINE》 *
SCHAFFER A.C ET.AL: "《Vaccination and Passive Immunisation against Staphylococcus aureus》", 《INTERNATIONAL JOURNAL OF ANTIMICROBIAL AGENTS》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104661684A (zh) * 2012-08-16 2015-05-27 辉瑞公司 糖缀合方法和组合物
CN104661684B (zh) * 2012-08-16 2018-03-20 辉瑞公司 糖缀合方法和组合物
CN111228478A (zh) * 2020-02-25 2020-06-05 江南大学 三糖重复单元寡糖链在制备金黄色葡萄球菌疫苗中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
US20120276137A1 (en) 2012-11-01
PH12015502508A1 (en) 2019-06-03
SG177310A1 (en) 2012-02-28
IL217085A0 (en) 2012-02-29
MY158231A (en) 2016-09-15
KR20120048568A (ko) 2012-05-15
JP2012530785A (ja) 2012-12-06
TWI505834B (zh) 2015-11-01
US9125951B2 (en) 2015-09-08
SG10201406432RA (en) 2014-11-27
AU2010301043B2 (en) 2014-01-09
AR077190A1 (es) 2011-08-10
KR101774062B1 (ko) 2017-09-01
BRPI1011753B8 (pt) 2021-05-25
PE20110065A1 (es) 2011-01-31
CA2766418C (en) 2016-03-29
JP6393804B2 (ja) 2018-09-19
CO6480930A2 (es) 2012-07-16
NZ597191A (en) 2013-11-29
BRPI1011753B1 (pt) 2021-03-02
EP2445523A2 (en) 2012-05-02
WO2011041003A3 (en) 2011-10-27
US9623100B2 (en) 2017-04-18
EP3461496B1 (en) 2023-08-23
ES2959890T3 (es) 2024-02-28
AU2010301043A1 (en) 2012-01-19
WO2011041003A2 (en) 2011-04-07
JP2013237693A (ja) 2013-11-28
ES2729934T3 (es) 2019-11-07
EP2445523B1 (en) 2019-04-17
EP3461496A1 (en) 2019-04-03
TW201544119A (zh) 2015-12-01
RU2011152045A (ru) 2013-07-27
MX2012000045A (es) 2012-01-30
BRPI1011753A2 (pt) 2016-03-29
JP6153581B2 (ja) 2017-06-28
SA114350400B1 (ar) 2016-05-26
WO2011041003A9 (en) 2011-06-09
PH12021551159A1 (en) 2022-02-21
JP2017179378A (ja) 2017-10-05
KR20140119165A (ko) 2014-10-08
RU2531234C2 (ru) 2014-10-20
TW201110977A (en) 2011-04-01
JP2016053051A (ja) 2016-04-14
CA2766418A1 (en) 2011-04-07
US20160022798A1 (en) 2016-01-28
IL217085B (en) 2018-10-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102625713A (zh) 用于制备金黄色葡萄球菌血清型5和8荚膜多糖缀合物免疫原性组合物的组合物和方法
US10745438B2 (en) Glycoconjugation process
RU2536981C9 (ru) Иммуногенные композиции антигенов staphylococcus aureus

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1173955

Country of ref document: HK

RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20120801

REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: WD

Ref document number: 1173955

Country of ref document: HK