CN102621322B - 检测3-甲基喹噁啉-2-羧酸的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测3-甲基喹噁啉-2-羧酸的试剂盒。本发明提供的检测3-甲基喹噁啉-2-羧酸的酶联免疫试剂盒，包括抗保藏号为CGMCC No.5778的喹乙醇代谢物单克隆抗体杂交瘤5A2分泌的单克隆抗体。本发明提供的试剂盒包括所述单克隆抗体和式(I)所示化合物与载体蛋白的偶联物。本发明试剂盒具有灵敏度高、准确度高、精密度高、成本低、操作简单、检测时间短、适合各种单位使用、储存简单、保质期长的优点；能同时快速检测大批量样品，可实现现场高通量快速检测。本发明提供的酶联免疫试剂盒，适用于测定饲料、动物组织或排泄物中喹乙醇代谢物的残留量。本发明的抗体、试剂盒及检测方法在喹乙醇代谢物的检测中将发挥重大作用。
式(I)。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测3-甲基喹噁啉-2-羧酸的试剂盒。
背景技术
3-甲基喹噁啉-2-羧酸(MQCA)是喹乙醇、乙酰甲喹和喹烯酮在动物体内产生的代谢物。通过研究发现喹噁啉类原形药物及代谢物存在着明显的安全性问题，具有明显的致畸、致癌、致突变、光敏和肾上腺皮质损害等毒副作用，严重危害了人和动物的健康。国际上有关喹噁啉类药物的最高残留限量规定非常严格。欧盟规定卡巴氧和喹乙醇以及其代谢产物在动物性食品中不得检出而且规定这两种兽药禁止销售。我国农业部公告第235号规定，喹乙醇最高残留限量为喹乙醇+3-甲基喹噁啉-2-羧酸：4ug/kg(肌肉)，50ug/kg(肝脏)，2mg/kg(饲料)。
目前国内外研究主要有色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)和免疫分析技术等。TLC法的特异性较差，灵敏度也相对较差，所需标准品浓度较高，潜在的污染性较高，HPLC法所需仪器设备投资大，操作技术要求高，净化柱消耗较多，检测成本较高，免疫亲和柱特异性较好，但需结合HPLC仪和荧光光度计才能定量检测，检测技术要求和成本较高，而ELISA法相比而言，操作简便，快捷，污染较小，灵敏度也较高，适合批量样品的普检和筛选，特别是研制成功的试剂盒，给检测人员带来很大的方便，同时，也节省了成本，符合目前国际上检测领域的发展方向。免疫胶体金层析技术不需任何仪器设备和试剂，特别适合于基层单位大批量时间紧的检测和大面积普查，因此酶免疫法在饲料安全分析中应用广泛。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测3-甲基喹噁啉-2-羧酸的试剂盒。
本发明提供的检测3-甲基喹噁啉-2-羧酸的酶联免疫试剂盒，包括抗喹乙醇代谢物单克隆抗体杂交瘤细胞5A2分泌的单克隆抗体。所述抗喹乙醇代谢物单克隆抗体杂交瘤细胞5A2(简称杂交瘤细胞5A2)已于2012年2月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCC No.5778。
所述试剂盒可为如下1)至4)中的任意一种：
1)包括式(I)所示化合物与载体蛋白的偶联物、所述单克隆抗体和酶标记抗抗体的试剂盒；其中，所述偶联物作为包被原；
2)包括式(I)所示化合物的酶标记物、所述单克隆抗体和抗抗体的试剂盒；其中，所述抗抗体作为包被原；
3)包括式(I)所示化合物的酶标记物和所述单克隆抗体的试剂盒；其中，所述单克隆抗体作为包被原；
4)包括式(I)所示化合物与载体蛋白的偶联物和所述单克隆抗体的酶标记物的试剂盒；其中，所述偶联物作为包被原。
所述载体蛋白可为卵清蛋白(OVA)或牛血清白蛋白(BSA)。
所述偶联物中，式(I)所示化合物与载体蛋白的偶联比具体可为(11-8)∶1。所述偶联比指的是摩尔比。式(I)所示化合物与所述载体蛋白具体可通过活性酯法偶联。所述偶联物具体可如式(II)所示。
式(II)。
所述试剂盒还包括洗涤液、样品浓缩液、底物显色液和终止液中的至少一种。
每1升洗涤液可按照如下方法配制得到：将10ml吐温20、5g叠氮化钠和990ml磷酸盐缓冲液混合，得到洗涤液。所述磷酸盐缓冲液可为pH7.2-7.6、0.005M-0.015M的磷酸盐缓冲液，具体可为的浓度可为pH7.4、0.01M)的磷酸钠缓冲液。
所述样品浓缩液可为浓度为0.03mol/L-0.05mol/L的磷酸盐缓冲液，优选为pH7.4、0.04mol/L的PBS缓冲液。
所述底物显色液包括显色液A和显色液B，可为独立包装的显色液A和显色液B，也可直接将显色液A和显色液B等体积混合得到。所述显色液可为过氧化氢溶液或过氧化脲溶液；所述显色液B可为邻苯二胺(OPD)溶液或四甲基联苯胺(TMB)溶液。所述显色液A具体可为2％(g/100ml)过氧化脲水溶液。所述显色液B具体可为1％(g/100ml)四甲基联苯胺水溶液。
所述终止液具体可为0.2M硫酸水溶液。
以上任一所述试剂盒均可用于检测喹乙醇代谢物(如3-甲基喹噁啉-2羧酸或喹噁啉-2羧酸)。
以上任一所述试剂盒均可用于检测待测样本中是否含有喹乙醇代谢物(如3-甲基喹噁啉-2羧酸或喹噁啉-2羧酸)。
本发明采用高特异性的3-甲基喹噁啉-2-羧酸单克隆抗体，检验方法方便易行，具有特异性高、灵敏度高、精确度高、准确度高等特点。本发明试剂盒及检测方法对样品的前处理要求低，样品前处理过程简单，能同时快速检测大批量样品；本发明试剂盒具有灵敏度高、准确度高、精密度高、成本低、操作简单、检测时间短、适合各种单位使用、储存简单、保质期长的优点；能同时快速检测大批量样品，可实现现场高通量快速检测。本发明提供的酶联免疫试剂盒，适用于测定饲料、动物组织或排泄物中喹乙醇代谢物的残留量。本发明的抗体、试剂盒及检测方法在喹乙醇代谢物的检测中将发挥重大作用。
附图说明
图1为3-甲基喹噁啉-2-羧酸人工抗原的紫外光谱图。
图2为采用3-甲基喹噁啉-2-羧酸制作的标准曲线图。
图3为试剂盒的标准曲线图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例中所用的PBS缓冲液，如无特殊说明，均为pH7.4、0.01M的PBS缓冲液。实施例中所用的碳酸盐缓冲液均为pH9.6、0.05mol/L的碳酸钠缓冲液。牛血清白蛋白简称BSA。卵清蛋白简称OVA。
3-甲基喹噁啉-2-羧酸购自德国Dr.Ehrenstorfer公司，产品目录号为81121，结构示意图见式(III)。
式(III)。
N，N-二甲基甲酰胺(DMF)如式(IV)所示。
式(IV)
N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)如式(V)所示。
式(V)
1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)如式(VI)所示。
式(VI)
实施例1、制备3-甲基喹噁啉-2-羧酸半抗原
一、3-甲基喹噁啉-2-羧酸半抗原的制备
1、称取3-甲基喹噁啉-2-羧酸10mg，置于10mL反应瓶中；加入适量丙酮和少量DMF使其完全溶解(丙酮作为反应体系溶解3-甲基喹噁啉-2-羧酸，DMF的作用是促进溶解)，加入亚硫酰氯10μL(作用为活化羧基)，加热回流反应1h；然后加入正己烷0.5ml并用氮气吹至体积恒定，然后加入正己烷0.5ml并用氮气吹至体积恒定，然后加入正己烷0.5ml并用氮气吹至体积恒定，得到溶液I。
2、称取20mgγ-氨基丁酸，溶于1ml 2mol/L的KOH水溶液(作为反应体系溶解γ-氨基丁酸)中，加入0.5ml吡啶(作为3-甲基喹噁啉-2-羧酸和γ-氨基丁酸发生反应的催化剂)，得到溶液II。
3、在冰浴中将溶液I逐滴加入到溶液II中，搅拌反应1.5h，然后用6mol/L HCl调pH至6.0左右，用二氯甲烷萃取两次(每次5ml)，合并两次萃取的有机相，用水洗涤3次，将有机相用无水酸钠干燥后进行旋蒸浓缩，得到15mg产物，即为3-甲基喹噁啉-2-羧酸半抗原，以下简称MQCA-GABA。
二、3-甲基喹噁啉-2-羧酸半抗原的表征
对步骤一制备的产物进行元素分析，结果如下：
C：61.51；H：5.52；N：15.40；O：17.57
结果表明，步骤一制备的产物为式(I)所示化合物。
式(I)。
实施例2、3-甲基喹噁啉-2-羧酸人工抗原的制备和表征
一、3-甲基喹噁啉-2-羧酸免疫原的合成和表征
1、3-甲基喹噁啉-2-羧酸免疫原的制备
(1)将10mg实施例1制备得到的式(I)所示化合物溶于2mL N，N’-二甲基酰胺中，加入10mg N-羟基琥珀酰亚胺和10mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，室温下磁力搅拌2h，得到溶液III。
(2)将30mg牛血清白蛋白加入2mL PBS缓冲液中，充分溶解，即为溶液IV。
(3)将溶液III缓慢滴加至溶液IV中，缓慢搅拌24h后入透析袋，在生理盐水中4℃透析72h(中间换水6次)，然后于4℃条件下，8000rmp离心30min，取上清，即3-甲基喹噁啉-2-羧酸免疫原溶液，分装于安培瓶中，-20℃保存。3-甲基喹噁啉-2-羧酸免疫原简称MQCA-BSA，3-甲基喹噁啉-2-羧酸免疫原溶液简称MQCA-BSA溶液。
(4)将MQCA-BSA溶液用PBS缓冲液稀释后，测定280nm和260nm的分光光度值，按公式计算稀释液中的蛋白浓度，将测得的蛋白浓度值乘以其稀释倍数后即为原MQCA-BSA溶液中的MQCA-BSA浓度。蛋白质浓度(mg/ml)＝1.45×OD280-0.74×OD260。MQCA-BSA溶液中的MQCA-BSA浓度为6.2mg/ml。
2、3-甲基喹噁啉-2-羧酸人工抗原的鉴定
将MQCA-BSA溶液用PBS缓冲液稀释(使MQCA-BSA的浓度为5mg/mL)，作为溶液甲；将含5mg/mL MQCA-GABA的PBS缓冲液作为溶液乙；将含5mg/mL BSA的PBS缓冲液作为溶液丙。分别将溶液甲、溶液乙和溶液丙进行紫外(200-380nm)光谱扫描，紫外光谱扫描结果见图1。与溶液丙相比溶液甲的紫外图谱发生了明显变化，说明化合物与BSA成功偶联。
溶液乙的最大吸收波长值为297nm，溶液丙的最大吸收波长值为280nm。根据公式K＝A/CL(A为最大吸收波长值下的吸光度，C为溶液浓度，L为液层的厚度)计算各个化合物的消光系数(K)。
分别采用溶液乙和溶液丙的最大吸收波长值对溶液甲进行紫外光谱扫描，并根据已经计算出的该化合物的消光系数反向计算该化合物在溶液甲中的浓度，用浓度值除以分子量得到该化合物的摩尔浓度，计算偶联比，式(I)所示化合物和BSA的偶联比为11∶1，即11个式(I)所示化合物结合1个BSA。
二、3-甲基喹噁啉-2-羧酸包被原的制备和表征
1、3-甲基喹噁啉-2-羧酸包被原的制备
用卵清蛋白代替牛血清白蛋白，其它同步骤一的1。
3-甲基喹噁啉-2-羧酸包被原简称MQCA-OVA，3-甲基喹噁啉-2-羧酸包被原溶液简称MQCA-OVA溶液。
MQCA-OVA溶液中的MQCA-OVA浓度为3.2mg/ml。
2、3-甲基喹噁啉-2-羧酸包被原的表征
用MQCA-OVA代替MQCA-BSA，用OVA代替BSA，其它同步骤一的2。
式(I)所示化合物和OVA的偶联比为8∶1，即8个式(I)所示化合物结合1个OVA。
实施例3、3-甲基喹噁啉-2-羧酸单克隆抗体的制备
Balb/c小鼠：购于北京维通利华实验动物技术有限公司；
SP2/0骨髓瘤细胞：购自Sigma-Aldrich公司，产品目录号为08060101。
一、动物免疫
将实施例2制备的MQCA-BSA溶液免疫Balb/c小鼠，每只小鼠单次免疫100μgMQCA-BSA，共免疫4次，每次间隔两周，前三次的免疫方式为颈背部皮下多点注射，后三次的免疫方式为腹膜内注射。
二、细胞融合与克隆化
1、第四次免疫3天后，取脾细胞，按5∶1(数量配比)比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。
2、利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，得到可以分泌3-甲基喹噁啉-2-羧酸单克隆抗体的杂交瘤细胞株。将一株杂交瘤细胞株命名为抗喹乙醇代谢物单克隆抗体杂交瘤细胞5A2(简称杂交瘤细胞5A2)，于2012年2月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCC No.5778。
三、细胞冻存和复苏
用冻存液将杂交瘤细胞5A2制成1×106个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时，取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后移入培养瓶内培养。
四、单克隆抗体的制备与纯化
1、增量培养法
细胞培养基(7.4)的制备方法：向RPMI-1640培养基中添加小牛血清和碳酸氢钠，小牛血清的终浓度为20％(质量百分含量)，碳酸氢钠的终浓度为0.2％(质量百分含量)。
将杂交瘤细胞5A2置于细胞培养基中，37℃培养2天，用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到单克隆抗体溶液(-20℃保存)。
单克隆抗体中的蛋白质浓度(mg/ml)＝1.45×OD280-0.74×OD260。
采用以上公式计算单克隆抗体中的蛋白质浓度，为24.1mg/ml。
2、腹水制备
Balb/c小鼠腹腔注射灭菌石蜡油(0.4mL/只)。7天后腹腔注射杂交瘤细胞5A2(5×105个/只)。7天后采集腹水，用辛酸-饱和硫酸铵法进行纯化，纯化后的腹水-20℃保存。
五、单克隆抗体的鉴定
将步骤四的1得到的单克隆抗体溶液分别进行如下鉴定：
1、采用ELISA单克隆抗体亚型检测试剂盒(Sigma公司产品，产品目录号为19285)检测单克隆抗体的亚型，单克隆抗体的免疫球蛋白亚类为IgG1。
2、利用非竞争性ELISA法测定单克隆抗体的亲和力
(1)用MQCA-OVA作为包被原包被酶标板
采用实施例2制备的MQCA-OVA溶液(用碳酸盐缓冲液稀释)进行包被，100μL/孔；分别设置以下MQCA-OVA包被浓度：1μg/mL、0.5μg/mL、0.25μg/mL、0.125μg/mL。
(2)4℃孵育16小时。
(3)封闭并洗板。
(4)每孔加入100μL单克隆抗体溶液的稀释液(用PBS缓冲液进行稀释)；稀释液中的蛋白质浓度分别为1.25、0.625、0.3125、1.5625×10-1、7.8×10-2、3.9×10-2、1.95×10-2、9.75×10-3、4.88×10-3、2.44×10-3、1.22×10-3、6.1×10-4mg/L；每种稀释液设置三个复孔。
(5)室温孵育2h，洗板。
(6)每孔加入100μL辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，室温孵育2h。
(7)洗板。
(8)加入TMB显色液，避光显色15min。
(9)每孔加入100μL 2mol/L硫酸中止反应；读OD450值。
以单克隆抗体中的蛋白质浓度(mol/L)的自然对数值为横坐标，以其对应的吸光度为纵坐标制作曲线。
每个抗原包被浓度得到1条S型曲线，共得到4条S型曲线。找出S曲线的顶部，对应的OD450值设定为ODMAX。分别找出各条曲线50％ODMAX对应的抗体浓度。采用1μg/mL包被浓度，50％ODMAX对应的抗体浓度为4.2×10-12mol/L。采用0.5μg/mL包被浓度，50％ODMAX对应的抗体浓度为19.4×10-12mol/L。采用0.25μg/mL包被浓度，50％ODMAX对应的抗体浓度为185.7×10-12mol/L。采用0.125μg/mL包被浓度，50％ODMAX对应的抗体浓度为415.8×10-12mol/L。
将4个浓度两两一组，根据公式计算单克隆抗体的亲和常数
Ka＝(n-1)/2(n[Ab]t1-[Ab]t2)
公式中，n为每组中两个包被浓度的倍数，[Ab]t1、[Ab]t2分别为每组中两个50％ODMAX对应的抗体浓度(mol/L)。例如：1μg/mL包被浓度、50％OD450对应的抗体浓度为4.2×10-12mol/L，0.5μg/mL包被浓度、50％OD450对应的抗体浓度为19.4×10-12mol/L，Ka＝(2-1)/2(2×19.4×10-12-4.2×10-12)＝14.4×109M-1。依次类推，得到其余5个Ka值，分别为1.4×109M-1、0.7×109M-1、2.0×109M-1、0.9×109M-1、1.0×109W-1，取平均值计算得出单克隆抗体的亲和常数为3.4×109M-1。
3、单克隆抗体灵敏度的计算
(1)采用实施例2制备的MQCA-OVA溶液(用碳酸盐缓冲液进行稀释)进行包被，100μL/孔；MQCA-OVA的包被浓度为1.0μg/mL。
(2)4℃孵育16小时。
(3)封闭并洗板。
(4)每孔加入50μL 3-甲基喹噁啉-2-羧酸标准品溶液(由3-甲基喹噁啉-2-羧酸和PBS缓冲液组成；3-甲基喹噁啉-2-羧酸的浓度分别为0.5μg/L、1.5μg/L、4.5μg/L、13.5μg/L、40.5μg/L；将只加入PBS缓冲液的孔作为对照孔)，每个浓度设置3个复孔。
(5)每孔加入50μL步骤四的1得到的单克隆抗体溶液。
(6)室温孵育2h，洗板。
(7)每孔加入100μL辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，室温孵育2h。
(8)洗板。
(9)加入TMB显色液，避光显色15min。
(10)每孔加入100μL 2mol/L硫酸中止反应；读OD450值。
将采用各个浓度的标准品溶液得到的吸光值(三个复孔的平均值)除以对照孔的吸光值再乘以100作为纵坐标，以各个标准品溶液中的3-甲基喹噁啉-2-羧酸浓度(μg/L)的自然对数值为横坐标绘制曲线图，见图2。
对照图2，得到纵坐标数值等于50％时对应的3-甲基喹噁啉-2-羧酸浓度即为IC50值。单克隆抗体检测3-甲基喹噁啉-2-羧酸的灵敏度(IC50值)为3.1ng/mL。
实施例4、3-甲基喹噁啉-2-羧酸多克隆抗体的制备
新西兰大白兔：购于北京维通利华实验动物技术有限公司。
将新西兰大白兔以实施例2中制备的3-甲基喹噁啉-2-羧酸免疫原(MQCA-BSA)进行免疫(免疫方式为颈背部皮下多点注射)。每只兔子每次免疫1.5mg(以BSA量计)，每三周免疫一次，第一次免疫时将3-甲基喹噁啉-2-羧酸免疫原与弗氏完全佐剂混合制成乳化剂进行免疫，第二次至第六次免疫将3-甲基喹噁啉-2-羧酸免疫原与弗氏不完全佐剂混合制成乳化剂进行免疫，第七次免疫只将3-甲基喹噁啉-2-羧酸免疫原进行免疫，第七次免疫10天后心脏采血，用硫酸铵分级沉淀得到纯化的多克隆抗体。
实施例5、检测3-甲基喹噁啉-2-羧酸的酶联免疫试剂盒的制备
一、酶联免疫试剂盒的组成
酶联免疫试剂盒由下述物质组成：
1、洗涤液：每1升洗涤液是按照如下方法配制得到的：将10ml吐温20、5g叠氮化钠和990ml PBS缓冲液缓冲液混合，得到洗涤液。
2、包被MQCA-OVA的酶标板
用碳酸盐缓冲液将实施例2制备的MQCA-OVA溶液稀释(使MQCA-OVA的浓度为0.5μg/mL)，即为包被液；将包被液加入96孔聚苯乙烯酶标板(48孔也可)，每孔100μL，37℃温育2h；倾去包被液，用洗涤液洗涤3次，每次30s，拍干；然后在每孔中加入200μL封闭液，37℃温育2h，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存。
每1升所述封闭液按照如下方法配制：将5ml马血清、1g叠氮化钠和30g酪蛋白用磷酸盐缓冲液(pH7.2、0.02M)溶解并定容至1000ml，得到封闭液。
3、样品浓缩液：PBS缓冲液(pH7.4、0.04M)。
将样本浓缩液用水稀释至20倍体积，即为样品稀释液。
4、抗体工作液：将实施例3的步骤四的1得到的单克隆抗体溶液用样品稀释液稀释，使蛋白质浓度为6.5ng/mL。
5、酶标二抗工作液
辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠抗体购自美国Sigma-Aldrich公司，产品目录号为A7058，按说明书配制酶标二抗工作液。
6、标准品溶液
标准品为3-甲基喹噁啉-2-羧酸。
用样品稀释液稀释溶解3-甲基喹噁啉-2-羧酸，得到各个标准品溶液。各个标准品溶液中3-甲基喹噁啉-2-羧酸浓度分别为0.5μg/L、1.5μg/L、4.5μg/L、13.5μg/L、40.5μg/L。
样品稀释液作为3-甲基喹噁啉-2-羧酸浓度为0μg/L的标准品溶液(0标准)。
7、底物显色液
由A液和B液等体积混合而成，A液为2％(g/100ml)过氧化脲水溶液，B液为1％(g/100ml)四甲基联苯胺水溶液。
8、终止液：0.2M硫酸水溶液。
二、试剂盒检测方法
采用步骤一制备的试剂盒进行如下检测：
(一)样品前处理
检测样本为猪肉或猪肝时：准确称取均质后的组织样品于离心管中，加入样品提取液(含0.2％吐温20的样品稀释液)，充分涡动至组织分散，4000g以上离心10min，取50μL上清作为待测样本溶液。
检测样本为尿样时：3000g离心10min，吸取上清与样品稀释液按1∶1体积混合，取50μL混合液作为待测样本溶液。
(二)试剂盒检测方法
1、标准曲线的制作
向包被MQCA-OVA的酶标板中加入标准品溶液(50μL/孔；每个标准品溶液设置三个复孔)，再加入抗体工作液(50μL/孔)，用盖板膜封板，37℃恒温箱中反应60min，倒出孔中液体，洗涤4次(每次洗涤的步骤均为：每孔加入250μL洗涤液，30s后倒出孔中液体)，用吸水纸拍干。加入酶标二抗工作液(100μL/孔)，37℃恒温箱中反应30min，倒出孔中液体，洗涤4次(步骤同上)，每孔加入底物显色液100μL，轻轻振荡混匀，37℃恒温箱避光显色15min，每孔加入终止液50μL，轻轻振荡混匀，用酶标仪测定每孔吸光度值(OD630和OD450双波长，450是主波长，630是参比波长)。
用每个浓度的标准品溶液的吸光度平均值(B)除以第一个标准品溶液(0标准)的吸光度值(B0)再乘以100％，得到百分吸光度值。运用Originpro 7.0软件对数据结果进行分析，以标准品浓度(μg/L)的自然对数值为X轴，百分吸光度值为Y轴拟合出标准曲线。标准曲线见图3。
2、样品中3-甲基喹噁啉-2-羧酸浓度的测定
向包被MQCA-OVA的酶标板中加入待测样本溶液或其稀释液(50μL/孔；设置三个复孔)，再加入抗体工作液(50μL/孔)，用盖板膜封板，37℃恒温箱中反应60min，倒出孔中液体，洗涤4次(步骤同上)，用吸水纸拍干。加入酶标二抗工作液(100μL/孔)，37℃恒温箱中反应30min，洗涤4次(步骤同上)，每孔加入底物显色液100μL，轻轻振荡混匀，37℃恒温箱避光显色15min，每孔加入终止液50μL，轻轻振荡混匀，用酶标仪测定每孔吸光度值(OD630和OD450双波长，450是主波长，630是参比波长)。
结果判断：用每个待测样本溶液的吸光度平均值(B)除以第一个标准品溶液(0标准)的吸光度值(B0)再乘以100％，得到百分吸光度值。相对应每一个待测样本溶液的百分吸光度值，则可从标准曲线上读出3-甲基喹噁啉-2-羧酸的浓度值，再乘以相应样品的稀释倍数，换算出待测样本溶液中3-甲基喹噁啉-2-羧酸的含量。
三、试剂盒检测效果评价
(一)准确度和精密度试验
向不含3-甲基喹噁啉-2-羧酸的猪肉、猪肝和猪尿样品中添加3-甲基喹噁啉-2-羧酸标准品，使3-甲基喹噁啉-2-羧酸标准品在样品中的终浓度分别为4μg/kg、10μg/kg、4μg/kg；将添加后的样品分别按照步骤二的(一)中所述方法进行前处理，得到检测样本溶液。
从三个不同批次的试剂盒中各抽取3个试剂盒进行检测，检测方法如步骤二的(二)中所述，每个实验重复5次，根据待测样本溶液中3-甲基喹噁啉-2-羧酸的含量计算检测样本中3-甲基喹噁啉-2-羧酸的含量，结果见表1。
表1应用各个试剂盒检测得出的样品中3-甲基喹噁啉-2-羧酸的含量(μg/kg)
| 试剂盒1 | 试剂盒2 | 试剂盒3 | |
| 3-甲基喹噁啉-2-羧酸在猪肉中的终浓度为4μg/kg | 3.34 | 3.63 | 3.48 |
| 3-甲基喹噁啉-2-羧酸在猪肝中的终浓度为10μg/kg | 9.31 | 7.93 | 8.52 |
| 3-甲基喹噁啉-2-羧酸在猪尿中的终浓度为4μg/kg | 3.53 | 3.72 | 3.35 |
分别计算回收率和变异系数，结果见表2。
回收率＝应用试剂盒检测计算出的3-甲基喹噁啉-2-羧酸的含量÷牛奶中实际添加的3-甲基喹噁啉-2-羧酸的含量×100％。
变异系数(CV)＝测定结果的标准差与其平均值的百分比。
板内变异系数的计算方法：板内变异系数＝同一次测定的同一块板内某样本(一般为中等水平)重复测定次数所得结果的变异系数。
批内变异系数的计算方法：批内变异系数＝同一次测定中各平行样本的变异系数。
批间变异系数的计算方法：批间变异系数＝同一样本在不同批次测定结果的变异系数，取其平均值。
表2准确度和精密度试验结果
结果表明：所有样品的添加回收率在79.3％～93.1％，批内变异系数在4.3％～8.3％，批间变异系数在12.3％～14.7％。
(二)试剂盒保存期
试剂盒保存条件为2-8℃，经过12个月的测定，试剂盒的最大吸光度值(零标准)、50％抑制浓度、3-甲基喹噁啉-2-羧酸添加实际测定值均在正常范围之内。考虑到运输和使用过程中，会有非正常保存条件出现，将试剂盒在37℃保存的条件下放置8天，进行加速老化实验，结果表明该试剂盒的各项指标完全符合要求。考虑到试剂盒冷冻情况发生，将试剂盒放入-20℃冰箱冷冻8天，测定结果也表明试剂盒各项指标完全正常。从以上结果可得出试剂盒可以在2-8℃至少可以保存12个月以上。
(三)交叉反应率试验
向包被MQCA-OVA的酶标板中加入结构类似物标准品溶液(由结构类似物和PBS缓冲液组成；结构类似物的浓度分别为0.5μg/L、1.5μg/L、4.5μg/L、13.5μg/L、40.5μg/L；将只加入PBS缓冲液的孔作为对照孔；50μL/孔；每个浓度设置3个复孔)，再加入抗体工作液(50μL/孔)，用盖板膜封板，37℃恒温箱中反应60min，倒出孔中液体，洗涤4次(步骤同上)，用吸水纸拍干。加入酶标二抗工作液(100μL/孔)，37℃恒温箱中反应30min，洗涤4次(步骤同上)，每孔加入底物显色液100μL，轻轻振荡混匀，37℃恒温箱避光显色15min，每孔加入终止液50μL，轻轻振荡混匀，用酶标仪测定每孔吸光度值(OD630和OD450双波长，450是主波长，630是参比波长)。
将采用各个浓度的结构类似物得到的吸光值(三个复孔的平均值)除以对照孔的吸光值再乘以100作为纵坐标，以各个标准品溶液中的结构类似物浓度(μg/L)的自然对数值为横坐标绘制曲线图。对照曲线图，得到纵坐标数值等于50％时对应的结构类似物浓度(μg/L)，即结构类似物的IC50值。
用下式计算试剂盒对其它结构类似物的交叉反应率。结果见表3。
表3试剂盒的特异性
| 购买途径 | 交叉反应率 | |
| MQCA | Dr.Ehrenstorfer公司，产品目录号为81121 | 100％ |
| QCA | 武汉汇丰达，货号879652 | 43.2％ |
| 喹乙醇 | Dr.Ehrenstorfer GmbH公司，货号C 15716500 | ＜0.1％ |
| 喹烯酮 | Dr.Ehrenstorfer GmbH公司，货号C 16709000 | ＜0.1％ |
| 乙酰甲喹 | Sigma Aldrich公司，产品目录号为M0189 | ＜0.1％ |
Claims (6)
1.一种检测3-甲基喹噁啉-2-羧酸的酶联免疫试剂盒，包括抗喹乙醇代谢物单克隆抗体杂交瘤细胞5A2分泌的单克隆抗体；所述抗喹乙醇代谢物单克隆抗体杂交瘤细胞5A2的保藏号为CGMCC No.5778。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒为如下1）至4）中的任意一种：
1）包括式（Ⅰ）所示化合物与载体蛋白的偶联物、所述单克隆抗体和酶标记抗抗体的试剂盒；其中，所述偶联物作为包被原；
2）包括式（Ⅰ）所示化合物的酶标记物、所述单克隆抗体和抗抗体的试剂盒；其中，所述抗抗体作为包被原；
3）包括式（Ⅰ）所示化合物的酶标记物和所述单克隆抗体的试剂盒；其中，所述单克隆抗体作为包被原；
4）包括式（Ⅰ）所示化合物与载体蛋白的偶联物和所述单克隆抗体的酶标记物的试剂盒；其中，所述偶联物作为包被原；
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述载体蛋白为卵清蛋白或牛血清白蛋白。
4.如权利要求1至3中任一所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括洗涤液、样品浓缩液、底物显色液和终止液中的至少一种。
5.权利要求1至4中任一所述试剂盒在检测3-甲基喹噁啉-2-羧酸中的应用。
6.权利要求1至4中任一所述试剂盒在检测待测样本是否含有3-甲基喹噁啉-2-羧酸中的应用。
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