CN102617610A

CN102617610A - 卟啉类光敏剂与抗癌药二联体的制备方法

Info

Publication number: CN102617610A
Application number: CN2012100926970A
Authority: CN
Inventors: 郭喜明; 陈业宏; 郭斌
Original assignee: Harbin Institute of Technology Shenzhen
Current assignee: Harbin Institute of Technology Shenzhen
Priority date: 2012-03-31
Filing date: 2012-03-31
Publication date: 2012-08-01
Anticipated expiration: 2032-03-31
Also published as: CN102617610B

Abstract

卟啉类光敏剂与抗癌药二联体的制备方法，它涉及一种二联体的制备方法。本发明解决了卟啉类光敏剂在光照下不能将癌细胞全部杀死和抗癌药靶向性不足而产生毒副作用的技术问题。本发明方法如下：一、制备中间体；二、制备卟啉类光敏剂与抗癌药二联体。由于卟啉及其金属络合物对癌细胞具有特殊的亲和性，本发明将光敏剂四对羟基苯基卟啉与抗癌药制备成二联体，利用卟啉对癌细胞的亲和性能够提高抗癌药的靶向性，提高其抗癌能力并降低其毒副作用；而抗癌药的抗癌效果又弥补了卟啉类光敏剂抗癌能力不足的缺陷。在光照和暗光条件下，两种不同的抗癌机理将发挥协同作用，实现两种化合物抗癌作用的优势互补，在同等量的使用条件下降低毒副作用，提高抗癌能力。

Description

卟啉类光敏剂与抗癌药二联体的制备方法

技术领域

本发明涉及一种光敏剂与抗癌药二联体的制备方法。

背景技术

卟啉类化合物是所有生物体维持生物活性所必需的物质。其分子中包含一个高度共轭的杂原子大环，还可能带有亚铁或镁等中心金属原子。22∏电子体系的存在使它们产生长波吸收。因此，卟啉引起了世界各国研究人员的重视以期将其应用于医用光敏剂。卟啉因为其自身的特殊结构而具有特殊的性能即与肿瘤细胞有特殊的亲和力，它可以在癌细胞附近大量富集，在医学研究中可用于癌症的检测和治疗。卟啉用于癌细胞检测是因为卟啉可以富集在癌细胞上，因其荧光和电子吸收功能，可以准确检测出癌细胞的大小和具体位置。卟啉之所以具有抗癌能力，是因为其作为一种独特的光敏剂所具有的光动力诱导效应，即卟啉可以选择性的在肿瘤细胞上富集，当使用一定波长的光照射肿瘤区时，卟啉作为光敏剂会诱发生物组织附近产生具有活性的单线态氧(·O2)，这些单线态氧会与生物分子中对氧化作用敏感的基团相互作用，导致肿瘤细胞因氧化失活死亡以达到治疗的目的。这种光动力疗法应用范围很广，例如将卟啉与四价的抗流感药扎纳米韦连接，发现两者组成的系列化合物的抗流感性能是扎纳米韦单体的十到一百倍，原因是卟啉光动力效应所释放的单线态氧具有杀灭病毒的作用。对膀胱癌，食道癌，脑癌，肺癌，腹腔癌，乳腺癌，前列腺癌和皮肤癌治疗中得到了广泛应用，但是卟啉类光敏剂在光照下不能将癌细胞全部杀死，因此对卟啉类光敏剂进行修饰以提高其抗癌能力引起了研究人员的广泛重视。

10-羟基喜树碱(HCPT)是天然产物喜树碱的衍生物之一，该分子为五环结构，分子结构是高度不饱和态，五环之间有连续的共轭系统。目前已经显示出卓越的抗癌作用和良好的临床应用前景。喜树碱类药物目前唯一针对拓扑异构酶I(TOPO I)产生抑制作用的抗癌药，HCPT的抗癌机理与喜树碱相同，但其对TOPO I的抑制作用比喜树碱更强。HCPT与DNA-TOPO I结合后对该二元复合物的稳定作用的机理还不是完全清楚，目前普遍的解释为复制碰壁模型，即HCPT与DNA-TOPO I形成的三元复合物可以与复制酶发生相互作用，造成双股的损伤，导致DNA高级复制叉与该复合物“碰壁”，造成不可修复的双链缺口，从而抑制DNA的合成，而且在多种肿瘤细胞中拓扑异构酶I的含量远远高于正常细胞，HCPT通过阻断拓朴异构酶I的合成，就可以阻止癌细胞的生长，诱导癌细胞死亡。在缓冲介质中，HCPT的内酯环与开环羧酸盐之间存在动态平衡。pH＜5时，以内酯环形式为主；pH＞7.5时，以开环的羧酸盐形式为主，而在抗癌活性上开环的羧酸盐只有其内酯环形式的十分之一。在临床上HCPT主要用于胃癌、食道癌、结肠癌、肝癌等；对口腔癌、头颈部癌、及膀胱癌也有较好疗效；对肺癌、白血病、银屑病及血吸虫病引起的肝脾肿大的治疗也有一定效果。但因为水溶性不足和内酯环结构不稳定等缺陷，使得临床上使用HCPT时要加大剂量，从而引起恶心，呕吐等毒副作用。如何提高HCPT的靶向性和抗癌能力一直是该药物研究的重点。

发明内容

本发明解决了卟啉类光敏剂在光照下不能将癌细胞全部杀死和抗癌药靶向性不足而导致抗癌能力降低，进而产生毒副作用的技术问题，提供了一种卟啉类光敏剂与抗癌药二联体的制备方法。

本发明卟啉类光敏剂与抗癌药二联体的制备方法如下：

一、在250ml两口烧瓶中加入10～100mg卟啉类光敏剂、2～5g无水碳酸钾和20～40mlN，N-二甲基甲酰胺，将两口烧瓶固定在装有冰盐水的搅拌器上，放入磁子搅拌5～10分钟，然后用滴液漏斗30～40分钟内滴加1～5ml的氯乙酰氯，继续反应8～10小时，然后用砂芯漏斗除去产物中的碳酸钾，用饱和食盐水和二氯甲烷各50～100ml分液，取分液漏斗下层溶液，所得下层溶液继续用饱和食盐水萃取3～5次，每次100ml，萃取结束后使用无水硫酸钠干燥24～48小时，再用旋转蒸发仪蒸干溶剂，然后以二氯甲烷为淋洗液经柱色谱分离，得到中间体；

二、在250ml两口烧瓶中加入50mg～100mg中间体，1～3g无水碳酸钾，110～250mg抗癌药和50～400ml N，N-二甲基甲酰胺，在避光条件下将烧瓶固定在搅拌器上，放入磁子搅拌，反应15～24小时后停止反应，使用砂芯漏斗除去产物中的碳酸钾，然后使用饱和食盐水和乙酸乙酯各50～100ml分液，取分液漏斗中上层溶液，所得上层溶液继续用饱和食盐水萃取3～5次，每次50～100ml，萃取结束后使用无水硫酸钠干燥24～48小时，用旋转蒸发仪蒸干溶剂，用二氯甲烷与甲醇按照10∶4～1的体积比作为淋洗液，经柱色谱分离得到卟啉类光敏剂与抗癌药二联体。

由于卟啉及其金属络合物对癌细胞具有特殊的亲和性，本发明将光敏剂四羟基苯基卟啉与抗癌药制备成二联体，利用卟啉对癌细胞的亲和性能够提高抗癌药的靶向性，而抗癌药的抗癌效果又弥补了卟啉类光敏剂抗癌能力不足的缺陷。在光照和暗光条件下，两种不同的抗癌机理将发挥协同作用，实现两种化合物抗癌作用的优势互补，在同等量的使用条件下降低毒副作用，提高抗癌能力。

附图说明

图1是具体实施方式十的实验一中所得中间体的质谱图；图2是具体实施方式十的实验一中所得中间体的紫外吸收光谱图；图3是具体实施方式十的实验一中所得中间体的核磁氢谱图；图4是具体实施方式十的实验一中所得中间体的红外光谱图；图5是具体实施方式十的实验一中所得四对羟基苯基卟啉-10羟基喜树碱二联体的红外光谱图；图6是具体实施方式十的实验一中所得四对羟基苯基卟啉-10羟基喜树碱二联体的质谱图；图7是具体实施方式十的实验一中所得四对羟基苯基卟啉-10羟基喜树碱二联体的紫外吸收光谱图。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式卟啉类光敏剂与抗癌药二联体的制备方法如下：

一、在250ml两口烧瓶中加入10～100mg卟啉类光敏剂、2～5g无水碳酸钾和20～40mlN，N-二甲基甲酰胺，将两口烧瓶固定在装有冰盐水的搅拌器上，放入磁子搅拌5～10分钟，然后用滴液漏斗30～40分钟内滴加1～5ml的氯乙酰氯，继续反应8～10小时，然后用砂芯漏斗除去产物中的碳酸钾，用饱和食盐水和二氯甲烷各50～100ml分液，取分液漏斗下层溶液，所得下层溶液继续用饱和食盐水萃取3～5次，每次100ml，萃取结束后使用无水硫酸钠干燥24～48小时，再用旋转蒸发仪蒸干溶剂，然后以二氯甲烷为淋洗液经柱色谱分离，得到红棕色中间体(产率：45～51％)；

二、在250ml两口烧瓶中加入50mg～100mg中间体，1～3g无水碳酸钾，110～250mg抗癌药和50～400ml N，N-二甲基甲酰胺，在避光条件下将烧瓶固定在搅拌器上，放入磁子搅拌，反应15～24小时后停止反应，使用砂芯漏斗除去产物中的碳酸钾，然后使用饱和食盐水和乙酸乙酯各50～100ml分液，取分液漏斗中上层溶液，所得上层溶液继续用饱和食盐水萃取3～5次，每次50～100ml，萃取结束后使用无水硫酸钠干燥24～48小时，用旋转蒸发仪蒸干溶剂，用二氯甲烷与甲醇按照10∶4～1的体积比作为淋洗液，经柱色谱分离得到卟啉类光敏剂与抗癌药二联体(20～30％)。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中所述的卟啉类光敏剂是四对羟基苯基卟啉。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二之一不同的是步骤二中所述的抗癌药是10-羟基喜树碱、紫杉醇、阿霉素、5-氟尿嘧啶或甲氨蝶吟。其它与具体实施方式一或二之一相同。

本实施方式中10-羟基喜树碱的结构式如下：

本实施方式中紫杉醇的结构式如下：

本实施方式中阿霉素的结构式如下：

本实施方式中5-氟尿嘧啶的结构式如下：

本实施方式中甲氨蝶吟的结构式如下：

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是步骤一中在250ml两口烧瓶中加入50mg卟啉类光敏剂。其它与具体实施方式一至三之一相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是步骤一中在250ml两口烧瓶中加入3g无水碳酸钾。其它与具体实施方式一至四之一相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是步骤一中在250ml两口烧瓶中加入30ml N，N-二甲基甲酰胺。其它与具体实施方式一至五之一相同。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是步骤二中在250ml两口烧瓶中加入60mg～90mg中间体，2g无水碳酸钾，120～240mg抗癌药和60～90ml N，N-二甲基甲酰胺。其它与具体实施方式一至六之一相同。

具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是步骤二中在250ml两口烧瓶中加入70mg～80mg中间体，2g无水碳酸钾，130～220mg抗癌药和70～80ml N，N-二甲基甲酰胺。其它与具体实施方式一至七之一相同。

具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一至八之一不同的是步骤二中在250ml两口烧瓶中加入75mg中间体，2g无水碳酸钾，200mg抗癌药和75ml N，N-二甲基甲酰胺。其它与具体实施方式一至八之一相同。

具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式一至九之一不同的是步骤二中用二氯甲烷与甲醇按照10∶3的体积比作为淋洗液。其它与具体实施方式一至九之一相同。

本实施方式采用下述实验验证本发明的效果：

实验一：四对羟基苯基卟啉-10-羟基喜树碱二联体的制备方法如下：

一、在250ml两口烧瓶中加入100mg四对羟基苯基卟啉、5g无水碳酸钾和40ml N，N-二甲基甲酰胺，将两口烧瓶固定在装有冰盐水的搅拌器上，放入磁子搅拌5分钟，然后用滴液漏斗30分钟内滴加5ml的氯乙酰氯，继续反应8小时，然后用砂芯漏斗除去产物中的碳酸钾，用饱和食盐水和二氯甲烷各100ml分液，取分液漏斗下层溶液，所得下层溶液继续用饱和食盐水萃取3次，每次100ml，萃取结束后使用无水硫酸钠干燥24小时，再用旋转蒸发仪蒸干溶剂，然后以二氯甲烷为淋洗液经柱色谱分离，得到红棕色中间体(产率：51％)(1H NMR(400MHz，DMSO)，δ：8.89(s，8H)，8.31(d，J＝8.4Hz，8H)，7.68(d，J＝8.4Hz，8H)，4.94(s，8H)，-2.92(s，2H)。MASS cacd for C₅₂H₃₄Cl₄N₄O₈984.66，found：[M+H+]IR(KBr)：V3117(w)，1659(s)，1502(m)，1463(m)，968(m)，725(m)cm^-1.UV-vis(CH2Cl2)/nm418，519，549，591，647。)；

二、在250ml两口烧瓶中加入50mg中间体，3g无水碳酸钾，110mg 10-羟基喜树碱和400ml N，N-二甲基甲酰胺，在避光条件下将烧瓶固定在搅拌器上，放入磁子搅拌，反应24小时后停止反应，使用砂芯漏斗除去产物中的碳酸钾，然后使用饱和食盐水和乙酸乙酯各00ml分液，取分液漏斗中上层溶液，所得上层溶液继续用饱和食盐水萃取3次，每次100ml，萃取结束后使用无水硫酸钠干燥24小时，用旋转蒸发仪蒸干溶剂，用二氯甲烷与甲醇按照10∶4的体积比作为淋洗液，经柱色谱分离得到四对羟基苯基卟啉-10羟基喜树碱二联体(产率：20％)(MALDI-TOF MASS cacd for C₁₃₂H₉₄N₁₂O₂₈ 2296.22 found：(M-C₂H₅-OH-3H+K)⁺IR(KBr)：V 3435(s)，1657(s)，1465(m)，1127(s)，928(m)cm^-1。UV-vis(CH₂Cl₂)/nm268，387，422，519，557，595，651)。

制备四对羟基苯基卟啉-10羟基喜树碱二联体的方程式如下：

其中四对羟基苯基卟啉-10羟基喜树碱二联体的结构式如下：

将本实施方式在制备的四对羟基苯基卟啉-10羟基喜树碱二联体进行体外抗肿瘤实验：

在四对羟基苯基卟啉-10羟基喜树碱二联体活性测试中，以合成的四对羟基苯基卟啉-10羟基喜树碱二联体为代表，测试了该二联体对宫颈癌细胞Hela、肝癌细胞BEL-7402、胃癌细胞7901和大肠癌细胞CCL-187的体外抑制作用。实验选用噻哇蓝比色法(MTT法)，将上述细胞制备成1-4×10⁵/ml单个细胞悬液，取其0.1ml加入96孔板，同时加入不同浓度的受试物，每组设三个平行孔，置于37℃，5％CO₂培养48小时后，每孔加入MTT10ul(0.05mg)，继续温育4小时，在避光条件下以波长630run的激光照射各孔细胞，照射的激光能量密度为5J/cm²。照光时遮盖非照光孔以免光线散射影响实验结果。然后每孔加入0.1ml的20％十二烷基硫酸钠和50％二甲基甲酰胺，使生成的结晶完全溶解后，在自动酶标测定仪上侧光密度值，计算细胞存活抑制率。

体外实验结果如表表1所示

表1

注：表1中1为四对羟基苯基卟啉-10羟基喜树碱二联体，2为10-羟基喜树碱，3为四对羟基苯基卟啉

由表1可知四对羟基苯基卟啉-10羟基喜树碱二联体经MTT法进行抑制宫颈癌细胞Hela、肝癌细胞BEL-7402、胃癌细胞7901和大肠癌细胞CCL-187的试验，并与10-羟基喜树碱进行对照，如表1所示。实验结果表明，光照后的二联体对四种肿瘤株均具有较好的抑制活性，且明显优于单一使用抗癌药或仅用光动力疗法时的效果。体外抗肿瘤实验的结果证明了将卟啉类光敏剂与抗癌药结合的协同抗癌作用对宫颈癌细胞Hela、肝癌细胞BEL-7402、胃癌细胞7901和大肠癌细胞CCL-187是行之有效的。

将本实施方式在制备的四对羟基苯基卟啉-10羟基喜树碱二联体进行体内抗肿瘤实验：

针对移植有人肝癌H22和人肺癌A-549的裸鼠进行了体内抗癌活性实验。体内试验中采用了体重在30～40g的ICR雄鼠，每一个测试组有10-11只ICR雄鼠，卟啉-10-羟基喜树碱二联体，10-羟基喜树碱和四对羟基苯基卟啉溶于二甲亚砜中，再以适当的浓度溶在0.9％的生理盐水中，配成溶液，对每个样品，以5～7个不同的用量进行了测试。每次注射量在2.00～2.50ml之间。注射后，观察6天，期间使用激光能量密度为5J/cm²的光对注入二联体和四对羟基苯基卟啉的小鼠进行照射。结果如下表2(四对羟基苯基卟啉-10羟基喜树碱二联体对人肝癌H22裸小鼠移植瘤的实验治疗作用)和表3(四对羟基苯基卟啉-10羟基喜树碱二联体对人肺癌A-549裸小鼠移植瘤的实验治疗作用)所示。

表2

注：表2中对照组1为10-羟基喜树碱，对照组2为四对羟基苯基卟啉，实验组为四对羟基苯基卟啉-10羟基喜树碱二联体。

表3

注：表3中对照组1为10-羟基喜树碱，对照组2为四对羟基苯基卟啉，实验组为四对羟基苯基卟啉-10羟基喜树碱二联体。

从表2和表3中可以发现，在光照条件下，四对羟基苯基卟啉-10羟基喜树碱二联体对肺癌A-549和肝癌H22细胞的抑制率远高于抗癌药10-羟基喜树碱和四对羟基苯基卟啉，进一步证明了这种卟啉与抗癌药二联体的抗癌潜力。

Claims

1.卟啉类光敏剂与抗癌药二联体的制备方法，其特征在于卟啉类光敏剂与抗癌药二联体的制备方法如下：

2.根据权利要求1所述卟啉类光敏剂与抗癌药二联体的制备方法，其特征在于步骤一中所述的卟啉类光敏剂是四对羟基苯基卟啉。

3.根据权利要求1或2所述卟啉类光敏剂与抗癌药二联体的制备方法，其特征在于步骤二中所述的抗癌药是10-羟基喜树碱、紫杉醇、阿霉素、5-氟尿嘧啶或甲氨蝶吟。

4.根据权利要求3所述卟啉类光敏剂与抗癌药二联体的制备方法，其特征在于步骤一中在250ml两口烧瓶中加入50mg卟啉类光敏剂。

5.根据权利要求3所述卟啉类光敏剂与抗癌药二联体的制备方法，其特征在于步骤一中在250ml两口烧瓶中加入3g无水碳酸钾。

6.根据权利要求3所述卟啉类光敏剂与抗癌药二联体的制备方法，其特征在于步骤一中在250ml两口烧瓶中加入30ml N，N-二甲基甲酰胺。

7.根据权利要求3所述卟啉类光敏剂与抗癌药二联体的制备方法，其特征在于步骤二中在250ml两口烧瓶中加入60mg～90mg中间体，2g无水碳酸钾，120～240mg抗癌药和60～90ml N，N-二甲基甲酰胺。

8.根据权利要求3所述卟啉类光敏剂与抗癌药二联体的制备方法，其特征在于步骤二中在250ml两口烧瓶中加入70mg～80mg中间体，2g无水碳酸钾，130～220mg抗癌药和70～80ml N，N-二甲基甲酰胺。

9.根据权利要求3所述卟啉类光敏剂与抗癌药二联体的制备方法，其特征在于步骤二中在250ml两口烧瓶中加入75mg中间体，2g无水碳酸钾，200mg抗癌药和75ml N，N-二甲基甲酰胺。

10.根据权利要求3所述卟啉类光敏剂与抗癌药二联体的制备方法，其特征在于步骤二中用二氯甲烷与甲醇按照10∶3的体积比作为淋洗液。