CN102617458A

CN102617458A - 抗癌用化合物的制备方法

Info

Publication number: CN102617458A
Application number: CN2012100146269A
Authority: CN
Inventors: 张南; 钟荣
Original assignee: SUZHOU MAIDIXIAN MEDICAL TECHNOLOGY CO LTD
Current assignee: SUZHOU MAIDIXIAN MEDICAL TECHNOLOGY CO LTD
Priority date: 2010-05-18
Filing date: 2010-05-18
Publication date: 2012-08-01

Abstract

本发明公开了两种具有抗癌作用的新化合物N-[4-氯-3-(三氟甲基)苯基]-[4-(N-甲基-甲酰胺)(4-吡啶氧基)苯基]-硫脲、N-[4-氯-3-(三氟甲基)苯基]-[4-(N-甲基-甲酰胺)(4-吡啶硫基)苯基]-硫脲，以及它们的盐，本发明还公开了两种新化合物的制备方法，以及含有新化合物的药物组合物，经实验研究发现，该两种新化合物均能有效地抑制Raf和VEGFR蛋白激酶的活性，并且能广泛抑制多种类型的人肿瘤细胞系生长，并进一步诱导肿瘤细胞凋亡。在人肿瘤异种移植模型研究中，该两种新化合物被证明是有效的抗肿瘤剂，能强烈抑制人肝癌，肺癌和肠癌细胞在体内生长，而且，它们的抗癌作用明显优于索拉非尼。

Description

抗癌用化合物的制备方法

本申请是名称为“抗癌用化合物及制备方法”，申请号为201010174968.8，申请日为2010.05.18的专利申请的分案申请

技术领域

本发明涉及抗癌用化合物的制备方法。

背景技术

原发性肝癌是临床上常见的恶性肿瘤，高发于我国、东南亚、非洲东南部和地中海沿岸。我国肝癌发病率位居全球之首，在国内位居肿瘤的第2位，特别是在东南沿海高发，江苏省更是高达第1位。肝癌发病凶险、进展快、死亡率高、治疗效果差。中国内地、东南亚及非洲是全球三个肝癌高发地区。世界卫生组织年度健康报告显示，肝癌发病率为23.7/10万，全球每年有62万人死于肝癌，中国占45％。

由于起病隐袭，大多数患者在确诊时已达中晚期，往往失去了手术根治机会。初诊患者中仅10％～15％可以根治性切除，而术后5年复发率高达50％～80％。晚期患者治疗非常棘手，效果很差，生存时间短，诊断后平均生存时间仅3～4个月，平均5年生存率仅5％，因此肝癌的确存在早期诊断率低、手术切除率低、预后恶劣等特点，因此被称为“癌中之王”。

有关肝癌的治疗手段，目前主要有手术切除、肝移植、肝动脉介入治疗、经皮消融、系统化疗以及传统医药治疗等。国内外学者一直致力于肝癌治疗研究。我国的吴孟超、汤钊猷院士在上个世纪70、80年代曾进行了许多有意义的探索，如改进手术方法，包括小肝癌的诊治、肝癌的不规则切除和二期切除等，贡献巨大。对于中晚期肝癌，肝动脉介入治疗是最重要的保守治疗手段，对部分患者具有明显的疗效。然而，介入治疗临床应用受到诸多限制，不少病例并不符合介入治疗的指征，比如，有严重的肝肾功能不全、重度腹水、骨髓造血功能抑制或凝血功能障碍、肿瘤太大(占肝脏的体积超过70％)、门静脉主干癌栓完全闭塞、重度门脉高压、合并活动性消化道溃疡或远处转移的患者就不能采取介入治疗。此时，虽然可以采取全身化疗来作为姑息治疗手段，然而肝癌细胞对多种化疗药物抗拒，传统的化疗药物疗效很低，同时，患者通常存在病毒性肝炎、肝硬变等基础肝病，肝功能不良，对化疗的耐受性差，往往不能接受强烈化疗。近年来，临床上正在积极探索一些新的化疗药物如奥沙利铂、吉西他滨和卡培他滨等应用于肝癌治疗，已有苗头，但都仍然在研究之中，还未获得最终结果。

Sorafenib(索拉非尼)由德国拜耳公司研发，是一种新型信号转导抑制剂，综合两种抗癌途径Raf/MEK/ERK信号通路和VEGFR、PDGFR，达到抑制肿瘤细胞增殖、抗血管生成目的。索拉非尼是分子靶向治疗药物，这是一种完全崭新的肝癌治疗药物和策略方法，而其结果显著，能有效地延长了晚期肝癌患者的生存时间，应该说是晚期肝癌治疗上的一个突破性进展和里程碑，真正地开创了肝癌靶向治疗的新时代，。

我们通过化学分子修饰方法改造索拉非尼的化学结构生产出二种全新的化合物实体物质，能广泛抑制包括肝癌细胞在内的多种类型的人肿瘤细胞系的生长，诞生了本发明。

发明内容

本发明的第一个目的是提供两种具有抗癌作用的新化合物和它们的盐；本发明的第二个目的是提供新化合物的制备方法；本发明的第三个目的是提供含有新化合物的药物组合物。

本发明提供两种新化合物，N-[4-氯-3-(三氟甲基)苯基]-[4-(N-甲基-甲酰胺)(4-吡啶氧基)苯基]-硫脲和N-[4-氯-3-(三氟甲基)苯基]-[4-(N-甲基-甲酰胺)(4-吡啶硫基)苯基]-硫脲，或者它们的药学上可接受的盐。

该两种化合物的结构式如式I和式II所示：

式I中的化合物，通过核磁共振技术阐明其结构和质谱计算化合物分子量：

1H-NMR(400MHz，DMSO)δ10.159(s，1H)，10.182(s，1H)，8.777-8.790(d，J＝5.2Hz，1H)，8.525-8.539(d，J＝5.6Hz，1H)，8.086-8.092(d，J＝2.4Hz，1H)，7.804-7.832(dd，J1＝8.8Hz，J2＝2.4Hz，1H)，7.671-7.692(d，J＝8.4Hz，1H)，7.567-7.589(d，J＝8.8Hz，2H)，7.419-7.426(d，J＝2.8Hz，1H)，7.221-7.243(d，J＝8.8Hz，2H)，7.175-7.195(dd，J1＝5.6Hz，J2＝2.4Hz，1H)，2.781-2.793(d，J＝4.8Hz，3H).MS 497[M+H]+.

合成式I中的化合物的反应方程式如下所示：

式I中的化合物与甲苯磺酸反应生成该化合物的甲苯磺酸盐。

式II中的化合物，通过核磁共振技术阐明其结构和质谱计算化合物分子量：

1H-NMR(400MHz，DMSO)δ10.300(s，1H)，10.370(s，1H)，8.738-8.749(d，J＝4.4Hz，1H)，8.417-8.430(d，J＝5.2Hz，1H)，8.088-8.094(d，J＝2.4Hz，1H)，7.807-7.813(d，J＝2.4Hz，1H)，7.687-7.726(m，3H)，7.591-7.612(m，3H)，7.254-7272(dd，J1＝5.2Hz，J2＝2.0Hz，1H)，2.762-2.774(d，J＝4.8Hz，3H).MS 481[M+H]+.

合成式II中的化合物的反应方程式如下所示：

式II中的化合物与甲苯磺酸反应生成该化合物的甲苯磺酸盐。

式I中的化合物或式II中的化合物或者它们的盐如甲苯磺酸盐，可与药用载体和/或赋形剂制成抗癌药物，该抗癌药物可制成片剂、冲剂、胶囊、滴丸、口服液或注射液。药用载体和/或赋形剂可选择谷物油、羧甲基纤维素钠等。式I中的化合物或式II中的化合物或者它们的盐，一般口服推荐剂量为每天100mg/体表面积m²，每天总剂量一次于早餐后半小时口服，连续三周，休息一周为一疗程，具体病例可由医师根据病情调整。

经实验研究发现，N-[4-氯-3-(三氟甲基)苯基]-[4-(N-甲基-甲酰胺)(4-吡啶氧基)苯基]-硫脲和N-[4-氯-3-(三氟甲基)苯基]-[4-(N-甲基-甲酰胺)(4-吡啶硫基)苯基]-硫脲，均能有效地抑制Raf和VEGFR蛋白激酶的活性，并且能广泛抑制多种类型的人肿瘤细胞系生长，并进一步诱导肿瘤细胞凋亡。在人肿瘤异种移植模型研究中，该两种新化合物被证明是有效的抗肿瘤剂，能强烈抑制人肝癌，肺癌和肠癌细胞在体内生长，而且，它们的抗癌作用明显优于索拉非尼。

附图说明

附图1为化合物ZTP和ZTQ、Sorafenib以及对照组治疗皮下接种的人肝癌(HepG3B)肿瘤细胞的肿瘤体积-移植后天数曲线图；

附图2为化合物ZTP和ZTQ、Sorafenib以及对照组治疗皮下接种的人结肠癌(HCT-116)肿瘤细胞的肿瘤体积-移植后天数曲线图；

附图3为化合物ZTP和ZTQ、Sorafenib以及对照组治疗皮下接种的人肺癌(NCI-H23)肿瘤细胞的肿瘤体积-移植后天数曲线图。

具体实施方式

(1)N-[4-氯-3-(三氟甲基)苯基]-[4-(N-甲基-甲酰胺)(4-吡啶氧基)苯基]-硫脲的制备

具体操作如下：

1、4-氯吡啶-2-碳酰氯(ZTP-1)的制备：

40℃下，往20克(0.16mol)吡啶-2-羧酸的80mL氯化亚砜溶液中滴加2mL二甲基甲酰胺，滴加毕，在此温度下搅拌10分钟，然后将温度升至72℃，搅拌过夜，LC-MS(液相色谱-质谱仪)显示反应仍未完毕，补加20mL氯化亚砜，继续在72℃下反应3小时，LC-MS显示反应没有变化，冷却至室温，减压除去氯化亚砜，加入200mL甲苯，减压蒸干，再加入30mL甲苯，该溶液直接用于下一步反应；

2、4-氯(2-吡啶)-N-甲基羧酸胺(ZTP-2)的制备：

将60mL的25％甲胺水溶液冷却至-5℃，往该溶液中滴加约60克ZTP-1的甲苯溶液，保持温度低于20℃，滴加毕，在20℃下搅拌1小时，往反应液中加入200mL乙酸乙酯与50mL水，有机层用饱和盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩至橘黄色油状物20.1克，不经纯化直接用于下一步反应；质谱计算ZTP-2分子量，MS 171[M+H]+；

3、4-[(4-氨基苯氧基)(2-吡啶)]-N-甲基羧酸胺(ZTP-3)的制备：

在氮气保护下，将5.12克(46.89mmol)4-氨基苯酚溶解在80毫升二甲基甲酰胺中，加入5.47克(48.77mmol)叔丁醇钾，室温搅拌2小时，然后加入8克(46.89mmol)ZTP-2和3.43克(24.85mmol)碳酸钾，加热至80℃反应过夜，TLC(薄层色谱)显示反应完毕，冷却至室温，加入200毫升水和150毫升乙酸乙酯，有机层依次用饱和碳酸钠水溶液与饱和盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，残余物柱层析，石油醚∶乙酸乙酯＝3/1～0/1，V/V，得到4.9克黄色固体产物ZTP-3，收率43％，LC-MS显示仍然有副产物(吡啶6位上有氯)；质谱计算ZTP-3分子量，MS 244[M+H]+；

4、N-[4-氯-3-(三氟甲基)苯基]-[4-(N-甲基-甲酰胺)(4-吡啶氧基)苯基]-硫脲(ZTP)的制备：

在氮气保护下，20℃时，将2.0克(8.2mmol)ZTP-3与2.2克(9.8mmol)4-氯-3-三氟甲基苯异氰酸酯加入到10毫升二氯甲烷中，搅拌过夜，TLC显示反应完毕，反应液浓缩，残余物经柱层析，二氯甲烷∶甲醇＝1/0～200/1～50/1，V/V，纯化，得到黄色粗品，粗品溶解在3毫升二氯甲烷中，缓缓加入约10毫升乙醚，有晶体析出，过滤，以乙醚洗涤，干燥，得到2.3克白色固体物质ZTP，收率59％。

(2)N-[4-氯-3-(三氟甲基)苯基]-[4-(N-甲基-甲酰胺)(4-吡啶氧基)苯基]-硫脲的甲苯磺酸盐的制备

在装有冷凝器、搅拌、温度计的1升反应瓶中，加入48克ZTP和750毫升无水乙醇，搅拌升温至回流，溶清后加入18克甲苯磺酸，回流反应约1小时20分钟，反应毕，冷却至室温，过滤，以30毫升乙醇洗涤，干燥，得粗品54g，将粗品加入到200毫升蒸馏水中，搅拌，加热回流，溶清后加入2克活性炭，10分钟后趁热过滤，滤液室温放置约1天后过滤，干燥，得50克，收率77％。(3)N-[4-氯-3-(三氟甲基)苯基]-[4-(N-甲基-甲酰胺)(4-吡啶硫基)苯基]-硫脲的制备

1、4-氯吡啶-2-碳酰氯(ZTQ-1)的制备：

40℃下，往20克(0.16mol)吡啶-2-羧酸的80mL氯化亚砜溶液中滴加2mL二甲基甲酰胺，滴加毕，在此温度下搅拌10分钟，然后将温度升至72℃，搅拌过夜，LC-MS显示反应仍未完毕，补加20mL氯化亚砜，继续在72℃下反应3小时，LC-MS显示反应没有变化，冷却至室温，减压除去氯化亚砜，加入200mL甲苯，减压蒸干，再加入30mL甲苯，该溶液直接用于下一步反应；

2、4-氯(2-吡啶)-N-甲基羧酸胺(ZTQ-2)的制备：

将60mL的25％甲胺水溶液冷却至-5℃，往该溶液中滴加约60克ZTQ-1的甲苯溶液，保持温度低于20℃，滴加毕，在20℃下搅拌1小时，往反应液中加入200mL乙酸乙酯与50mL水，有机层用饱和盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩至橘黄色油状物20.1克，不经纯化直接用于下一步反应；质谱计算ZTQ-2分子量，MS 171[M+H]+；

3、4-[(4-氨基苯硫基)(2-吡啶)]-N-甲基羧酸胺(ZTQ-3)的制备：

在氮气保护下，将5.87克(46.89mmol)4-氨基苯硫酚溶解在80毫升二甲基甲酰胺中，加入5.47克(48.77mmol)叔丁醇钾，室温搅拌2小时，然后加入8克(46.89mmol)ZTQ-2和3.43克(24.85mmol)碳酸钾，加热至80℃反应过夜，TLC显示反应完毕，冷却至室温，加入200毫升水和150毫升乙酸乙酯，有机层依次用饱和碳酸钠水溶液与饱和盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，残余物柱层析，石油醚∶乙酸乙酯＝3/1～0/1，V/V，得到6.5克黄色固体产物ZTQ-3，收率54.2％，LC-MS显示仍然有副产物(吡啶6位上有氯)，质谱计算ZTQ-3分子量，MS 260[M+H]+；

4、N-[4-氯-3-(三氟甲基)苯基]-[4-(N-甲基-甲酰胺)(4-吡啶硫基)苯基]-硫脲(ZTQ)的制备：

在氮气保护下，20℃时，将2.0克(7.7mmol)ZTQ-3与2.0克(9.3mmol)4-氯-3-三氟甲基苯异氰酸酯加入到10毫升二氯甲烷中，搅拌过夜，TLC显示反应仍未完毕，补加0.5克4-氯-3-三氟甲基苯异氰酸酯，继续反应5小时，TLC显示原料消耗完毕，反应液浓缩，残余物经柱层析纯化，二氯甲烷∶甲醇＝1/0～200/1～50/1，V/V，得到黄色粗品，粗品溶解在3毫升二氯甲烷中，缓缓加入约10毫升乙醚，有晶体析出，过滤，以乙醚洗涤，干燥，得到1.9克白色固体物质ZTQ，收率50％。

(4)N-[4-氯-3-(三氟甲基)苯基]-[4-(N-甲基-甲酰胺)(4-吡啶氧基)苯基]-硫脲(ZTQ)甲苯磺酸盐的制备：

在装有冷凝器、搅拌、温度计的1升反应瓶中，加50克ZTP和750毫升无水乙醇，搅拌升温至回流，溶清后加入18克甲苯磺酸，回流反应约1小时20分钟，反应毕，冷却至室温，过滤，以30毫升乙醇洗涤，干燥，得粗品57g，将粗品加入到200毫升蒸馏水中，搅拌，加热回流，溶清后加入2克活性炭，10分钟后趁热过滤，滤液室温放置约1天后过滤，干燥，得52克，收率77.6％。上述(1)-(4)为制备实施例，下述(5)-(9)为试验实施例。

(5)化合物ZTP和ZTQ抑制Raf和VEGFR蛋白激酶活性：

Raf是一种原癌基因产物，它的活化受细胞外生长因子刺激所调节的。一旦Raf被活化则能磷酸化MEK使其活化，并进一步将活化信号传递给ERK，从而促进肿瘤细胞生长。本试验利用检测细胞内被磷酸化的MEK多少来衡量细胞内Raf蛋白激酶活性的高低。MDA-MB-321是一种人性乳腺癌细胞系，富含大量的Raf蛋白。我们用MDA-MB-321细胞来检测ZTP和ZTQ是否能抑制Raf蛋白激酶活性。MDA-MB-321细胞在37℃、5％CO2的条件下，在含10％小牛血清的RPMI 1640培养基(GIBCO-BRL)中贴壁生长。以不同浓度ZTP和ZTQ(0、10ng/ml、100ng/ml、500ng/ml，1μg/ml、10μg/ml)处理细胞，于处理后1小时收集细胞蛋白，Bradford法测定蛋白浓度后以western blot测定被磷酸化的MEK水平。免疫印迹实验：用聚丙烯酰胺变性凝胶分离蛋白，上样量为60μg总蛋白，将蛋白电转到PVDF上，封闭后加鼠抗人抗磷酸化MEK抗体(1∶1000稀释)(购买于美国波士顿信号传递公司)、辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IG抗体(1∶5000稀释)(购买于美国波士顿信号传递公司)，用化学发光试剂增强反应，X光片压片曝光，凝胶成像系统分析结果。洗膜后以未磷酸化MEK抗体检测以校正结果。

结果显示，ZTP和ZTQ抑制Raf蛋白激酶活性的半数抑制浓度(IC₅₀)分别是45nM和20M浓度。

VEGFR是血管内皮细胞生长因子受体，调节血管内皮细胞生长，迁移和分化，它决定肿瘤血管新生重要开关。当血管内皮细胞生长因子刺激VEGFR后，VEGFR形成二聚体并活化其激酶并使其自身磷酸化，根据VEGFR自身磷酸化的强弱来检测VEGFR蛋白激酶活性的高低，本试验我们用人微血管内皮细胞HUMEC来检测ZTP和ZTQ是否能抑制VEGFR蛋白激酶活性。HUMEC细胞在37℃、5％CO2的条件下，在含10％小牛血清的DMEM培养基(GIBCO-BRL)中贴壁生长。以不同浓度ZTP和ZTQ(0、10ng/ml、100ng/ml、500ng/ml，1μg/ml、10μg/ml)处理细胞，于处理后1小时收集细胞蛋白，Bradford法测定蛋白浓度后以western blot测定被磷酸化的VEGFR水平。免疫印迹实验用聚丙烯酰胺变性凝胶分离蛋白，上样量为60μg总蛋白，将蛋白电转到PVDF上，封闭后加鼠抗人抗磷酸化VEGFR抗体(1∶1000稀释)(购买于美国波士顿信号传递公司)、辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IG抗体(1∶5000稀释)(购买于美国波士顿信号传递公司)，用化学发光试剂增强反应，X光片压片曝光，凝胶成像系统分析结果。洗膜后以未磷酸化VEGFR抗体检测以校正结果。

结果显示，ZTP和ZTQ抑制VEGFR蛋白激酶活性的半数抑制浓度(IC₅₀)分别是21nM和9nM。

(6)化合物ZTP和ZTQ广泛抑制人体肿瘤细胞株，但对正常细胞株没有作用：

应用人肿瘤细胞株分析ZTP和ZTQ的细胞毒性。人肿瘤细胞株购自ATCC和NCI，在10％FBS的DMEM培养液中，置于5％CO₂的37℃孵箱中培养。细胞生长汇合后作毒性分析，胰蛋白酶消化细胞后用培养液洗涤，然后计数。培养33种肿瘤细胞株，96孔板每孔传3000-6000个细胞孵育16-24小时，再加入溶解于DMSO的不同浓度的ZTP或ZTQ，培养72小时后，应用MTT分析药物处理后的细胞和对照细胞。

结果如表1所示，表1显示大多数人体肿瘤细胞对本试验化合物ZTP和ZTQ比较敏感。有些肿瘤细胞对本试验化合物的EC50低于1μm。对本试验化合物ZTP和ZTQ最敏感的细胞是人微血管内皮细胞，对于人微血管内皮细胞来说本试验化合物ZTP和ZTQ是一种极强的肿瘤血管抑制剂。另外正常人乳腺上皮细胞(MCF-10a)和正常小鼠成纤维细胞(MEF)对本试验化合物ZTP和ZTQ不敏感，即便这两种化合物的浓度高达30μm，这些细胞仍然生长良好。

表1化合物ZTP和ZTQ体外抑制人肿瘤细胞生长

(7)化合物ZTP和ZTQ在小鼠体内的药代动力学研究：

取4只8周龄BALB/c小鼠(2只雄性和2只雌性)，单次剂量100mg/kg给予化合物ZTP和ZTQ(用15％Captsol或载体配制)。分别于给药后0.5、1、3、6、12、24、48、72小时，经眼静脉取血并制得血浆，以测定给予ZTP和ZTQ的血浆浓度。口饲给药的化合物ZTP和ZTQ在4个小鼠体内的药代动力学参数总结如下(表2和3)：

表2.化合物ZTP在小鼠体内的药代动力学参数

药代动力学参数

均数+/-标准差

T1/2(hour)	4.1+/-0.26
		Tmax(min)	6.4+/-7.5
Cmax(uM)	51+/-5.7

表3.化合物ZTQ在小鼠体内的药代动力学参数

药代动力学参数	均数+/-标准差
		T1/2(hour)	4.2+/-0.24
Tmax(min)	6.6+/-7.6
		Cmax(uM)	52+/-5.5

(8)给药后化合物ZTP和ZTQ对小鼠的急性毒性研究：

取两组8周龄的BALB/c小鼠，每组10只(5只雄性和5只雌性)，分别以单次剂量500mg/kg和多次剂量100mg/kg口饲给予化合物ZTP和ZTQ(15％Captsol或载体配制))，然后分别观察1周和4周，每两天称体重，试验结束后，将受试小鼠处死，进行病理分析。

结果显示，以单次剂量500mg/kg和多次剂量100mg/kg给予化合物ZTP和ZTQ，均未观察到毒性，所有受试小鼠生长良好，无一死亡，因此化合物ZTP和ZTQ是具有很大开发前景的广谱抗肿瘤新药，化合物ZTP和ZTQ可作为抗肿瘤药物的原料药，优先作为抗恶性实体瘤药物的原料药，化合物ZTP和ZTQ也可与可药用载体和/或赋形剂制成不同剂型的抗肿瘤药物包括片剂、冲剂、胶囊、滴丸、口服液或注射液。可药用载体和/或赋形剂例如谷物油，羧甲基纤维素钠等。

化合物ZTP和ZTQ一般口服推荐剂量为每天100mg/体表面积m²，连续三周，休息一周为一疗程。化合物ZTP和ZTQ每天总剂量一次于早餐后半小时口服，具体病例可由医师根据病情调整。

(9)应用人肿瘤移植裸鼠模型进行化合物ZTP和ZTQ的有效性研究：

T细胞缺陷裸小鼠(nu/nu)，6周龄，购自Charles River实验室，按照大学动物饲养和使用委员会条例，在无菌环境中饲养、处理。48只鼠肋腹部分别皮下接种5×10⁶个悬浮于0.2ml HBSS/基质胶(50∶50，V/V)中的人肝癌细胞HepG3B、人肺癌细胞NCI-H23和人结肠癌细胞HCT-116。当肿瘤平均直径长至7-8mm，肿瘤体积约在100-200mm³大小时，从中挑选出24只鼠，该24只鼠被分成治疗组(16只/2组)、对照组(8只)，2组治疗组分别按30mg/kg化合物ZTP和60mg/kg化合物ZTQ给药，化合物ZTP和ZTQ溶解在15％Captsol中，对照组只接受赋形剂(15％Captsol)。

为保证化合物ZTP和ZTQ治疗组和对照组在处理开始时肿瘤大小的分布基本相同，小鼠被分成三类：小体积肿瘤(＜4mm)、中等体积肿瘤(4-8mm)和大体积肿瘤(＞8mm)。将每一类中相同数目的小鼠分别分在对照组和化合物ZTP和ZTQ治疗组中。

肿瘤移植裸鼠的本试验化合物给药方案：口服给药，化合物ZTP和ZTQ溶解在15％Captsol，每日给予200μl含0.75mg和1.5mg化合物ZTP和ZTQ的药液，每周5天，连续3周，休息1周；对照组给予200μl安慰剂15％Captsol3周，休息1周。两组动物分开饲养，自由进食。

抗肿瘤效果的评价：每3或4天测量肿瘤大小，采用下面的公式计算肿瘤体积：V＝(a×b)/2，其中a代表宽(较小的直径)，b代表长(较长的直径)。每个瘤体的相对肿瘤体积(RTV)指给定时间的体积与治疗开始时的体积的比率。每个治疗组计算平均RTV。应用下面的公式计算肿瘤生长抑制值确定抗肿瘤活性。

TGI(％)＝T/C×100

其中T代表实验结束点治疗组肿瘤的平均RTV，C代表对照组的平均RTV。采用国立癌症研究所制定的抗肿瘤活性最低水平(T/C 42％)标准。实验结束后切除瘤体，甲醇固定。

在化合物ZTP和ZTQ有效抑制多种肿瘤细胞和人微血管内皮细胞体外增殖的基础上，应用人肿瘤移植裸鼠(皮下接种)评价化合物ZTP和ZTQ的抗肿瘤作用，受试的肿瘤细胞包括人肝癌细胞HepG3B、人结肠癌细胞HCT-116和人肺癌细胞NCI-H23。结果显示，ZTP、ZTQ和Sorafenib给药对人肝癌细胞HepG3B TGI值分别为13％、1.75％、14％；ZTP、ZTQ和Sorafenib给药对人结肠癌细胞HCT-116 TGI值分别为29.2％、6.45％、33％；ZTP、ZTQ和Sorafenib给药对人肺癌细胞NCI-H23 TGI值分别为10％、9.21％、11.25％。同时未发现ZTP和ZTQ具有明显的副作用，包括体重的变化。而Sorafenib对受试小鼠产生相当大的副作用。图1-3中显示了化合物ZTP和ZTQ、Sorafenib和对照组治疗人肝癌细胞HepG3B、人结肠癌细胞HCT-116和人肺癌细胞NCI-H23的肿瘤体积-移植后天数曲线图，这些数据强烈提示，化合物ZTP和ZTQ强烈抑制这三种肿瘤生长，并且ZTP和ZTQ将成为优于Sorafenib的新的抗肿瘤药物。由于Sorafenib与甲苯磺酸反应能形成Sorafenib甲苯磺酸盐，而Sorafenib甲苯磺酸盐抗肿瘤药效作用明显强过Sorafenib。我们推测ZTP和ZTQ化合物与甲苯磺酸反应形成的盐类化合物，其抗肿瘤药效作用也会强过ZTP和ZTQ化合物本身，因此，ZTP和ZTQ盐类化合物将也会成为有效的抗肿瘤新药。

Claims

1.制备式I表示的化合物的方法，

其中该化合物的名称为N-[4-氯-3-(三氟甲基)苯基]-[4-(N-甲基-甲酰胺)(4-吡啶氧基)苯基]-硫脲，其特征在于：所述方法包括以下步骤：

(1)40℃下，往吡啶-2-羧酸的氯化亚砜溶液中滴加二甲基甲酰胺，搅拌，然后将温度升至72℃，搅拌过夜，待反应完成后冷却至室温，减压除去氯化亚砜，加入甲苯，减压蒸干，再加入甲苯，得到4-氯吡啶-2-碳酰氯的甲苯溶液；

(2)将甲胺水溶液冷却至-5℃，往所述甲胺水溶液中滴加所述4-氯吡啶-2-碳酰氯的甲苯溶液，在温度低于20℃时进行搅拌，然后再加入乙酸乙酯与水，有机层用饱和盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩至橘黄色油状物，得到4-氯(2-吡啶)-N-甲基羧酸胺；

(3)在氮气保护下，将4-氨基苯酚溶解在二甲基甲酰胺中，然后加入叔丁醇钾，室温搅拌，然后加入所述4-氯(2-吡啶)-N-甲基羧酸胺、碳酸钾，加热至80℃反应过夜，待反应完成后冷却至室温，加入水和乙酸乙酯，有机层依次用饱和碳酸钠水溶液与饱和盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，残余物柱层析，石油醚∶乙酸乙酯＝3/1～0/1，V/V，得到黄色固体产物4-[(4-氨基苯氧基)(2-吡啶)]-N-甲基羧酸胺：

(4)在氮气保护下，20℃时，将所述4-[(4-氨基苯氧基)(2-吡啶)]-N-甲基羧酸胺与4-氯-3-三氟甲基苯异氰酸酯加入到二氯甲烷中，搅拌过夜，待反应完成后浓缩反应液，残余物柱层析，二氯甲烷∶甲醇＝1/0～200/1～50/1，V/V，得到黄色粗品，将该黄色粗品溶解在二氯甲烷中，加入乙醚，有晶体析出，过滤，以乙醚洗涤，干燥，得到式I中所述化合物N-[4-氯-3-(三氟甲基)苯基]-[4-(N-甲基-甲酰胺)(4-吡啶氧基)苯基]-硫脲。

2.制备式I的化合物的甲苯磺酸盐的方法，其特征在于：将式I中所述化合物N-[4-氯-3-(三氟甲基)苯基]-[4-(N-甲基-甲酰胺)(4-吡啶氧基)苯基]-硫脲和无水乙醇加入反应瓶中，搅拌升温至回流，溶清后加入甲苯磺酸，进行回流反应，待反应完成后冷却至室温，过滤，以乙醇洗涤，干燥，得粗品，将该粗品加入到蒸馏水中，搅拌，加热回流，溶清后加入活性炭，趁热过滤，滤液室温放置后过滤，干燥，得到式I中所述化合物的甲苯磺酸盐。