CN102614498A

CN102614498A - 一种胰岛素纳米粒及其制备方法

Info

Publication number: CN102614498A
Application number: CN2011100313055A
Authority: CN
Inventors: 徐雄良; 张洪宇; 梁隆; 程志鹏
Original assignee: Sichuan Kelun Pharmaceutical Research Co Ltd
Current assignee: Sichuan Kelun Pharmaceutical Research Institute Co Ltd
Priority date: 2011-01-28
Filing date: 2011-01-28
Publication date: 2012-08-01
Anticipated expiration: 2031-01-28
Also published as: CN102614498B

Abstract

本发明涉及医药技术领域，特别涉及一种胰岛素纳米粒及其制备方法。其中，制备方法包括胰岛素离子对复合物的制备和胰岛素纳米粒的制备两个步骤。本发明所述胰岛素纳米粒包封率和载药量高、粒径分布均匀，同时也具有一定缓释性，可有效防止药物易被蛋白酶降解，增加药物的稳定性，促进药物透过生物膜，从而提高药物疗效，降低药物毒性，增加药物生物利用度，可用于药物的多种给药途径；其制备条件温和，不需要高温和高速剪切力等剧烈条件，可保证药物的生物活性；制备过程中所用的表面活性剂Cremophor EL具有抑制P-糖蛋白的作用，提高药物穿越细胞膜的渗透性，增加药物通过肠道壁进入血液的吸收。

Description

一种胰岛素纳米粒及其制备方法

技术领域

本发明涉及医药技术领域，特别涉及一种胰岛素纳米粒及其制备方法。

背景技术

糖尿病是一种常见的慢性代谢性疾病，由人体内胰岛素缺乏或耐受所致。糖尿病对人体健康具有很大的危害，可导致心血管疾病、血脂异常、失明、肾功能衰竭和截肢等严重的并发症，已成为导致全球人口死亡的第四大疾病。据国际糖尿病联盟(IDF)估计，2007年我国糖尿病患者人数约为3980万，其中绝大多数为II型糖尿病患者，约占糖尿病确诊病例的90％～95％。

胰岛素是最有效的糖尿病治疗药物之一，对于I型糖尿病(约占所有糖尿病的10％)患者而言，胰岛素是唯一的治疗药物；对于II型糖尿病(占所有糖尿病的90％以上)患者而言，仍然需要利用药物控制血糖升高，防治并发症的发生，其中30％～40％的II型糖尿病患者最终需要使用胰岛素。因此，胰岛素是I型和中、重度II型糖尿病患者日常治疗中不可缺少的药物，也是目前世界公认的唯一最有效的治疗药物。由于胰岛素属于蛋白质类物质，分子量大，脂溶性差，不易透过生物膜，一直以来以注射给药为主，但长期和频繁注射给患者带来很大的痛苦和不便，因此，国外已经开始研究胰岛素的长效注射制剂和非注射给药制剂。

近年来，随着各种新型释药装置的诞生以及各种新型制剂技术的发展，研制口服或其他便于使用的胰岛素制剂已引起国内外研究者的广泛兴趣，长效注射剂和非注射胰岛素制剂的研究已经取得了很大的进步，如长效胰岛素注射剂Basulin、吸入型胰岛素制剂Exubera等。Bristol-Myers Squibb公司与法国Flamel Technologies SA.公司合作开发的Basulin，是通过纳米技术Medusa输送的长效胰岛素注射剂，设计为每天注射给药1次，用于I型和II型糖尿病的治疗，现已进入II期临床开发阶段，显示出一定的临床应用前景(US2009110742(A1)，Long-acting colloidal insulin formulation and its preparation，AlainConstancis、Florence Nicolas、Remi Meyrueix、Olivier Soula，FLAMEL TECHNOLOGIES)。法国赛诺菲-安万特(Sanofi-Aventis)公司和美国辉瑞(Pfizer)制药公司合作开发的经肺吸入给药的胰岛素雾化吸入剂Exubera于2006年1月获得美国FDA批准上市，使用专用吸入器经口腔吸入给药，将雾化的胰岛素送达患者肺部。虽然Exubera有可能导致肺功能异常和肺功能的中度损伤，以及通过肺部给药的不稳定性，辉瑞公司于2007年10月宣布Exubera撤市，但这是自1920年胰岛素发明以来的除注射途径外的第一个新的胰岛素给药方法，被视为糖尿病治疗领域的一大创举，对非注射给药途径的发展起到了一定的作用。

目前，国内外正在研制的胰岛素新剂型还包括以高分子材料为载体或加入酶抑制剂、保护剂和吸收促进剂的纳米囊、纳米粒、脂质体或复乳等制剂。国内外研究胰岛素纳米给药系统的文献较多，尤其是对于胰岛素的非注射给药系统，在口服制剂、吸入制剂、透皮制剂、直肠给药等方面已经取得了一定的进展，但仍然存在诸如胰岛素生物利用度低、给药剂量难以精确控制、质量稳定性差、使用依从性差等问题，因此，有必要研究开发具有较高包封率和载药量的纳米粒制剂，达到具有一定缓释性和多种给药途径的制剂来增加患者使用的依从性。

蛋白质分子结构中氨基或胍基在酸性条件下发生解离而带有正电荷，而阴离子表面活性剂含有带负电荷的极性基团，因此，带有正电荷的蛋白质可与带负电荷的阴离子表面活性剂发生电性结合，形成离子对复合物(hydrophobic ion pairs complex，HIP complex)。蛋白质在形成离子对复合物后可以降低其水溶解性，增加在有机溶剂中的溶解度，并且对很多种蛋白质来说，离子对复合物在增加脂溶性的同时还可以使蛋白质的结构和活性保持不变。

胰岛素含有6个碱性基团，即1个精氨酸、1个赖氨酸、2个组氨酸、2个氨基末端，以及4个酸性基团。在pH值为2.5时，由于胰岛素肽链上的精氨酸、赖氨酸、组氨酸等氨基酸残基质子化而带6个正电荷，阴离子表面活性剂如十二烷基硫酸钠(SDS，月桂醇硫酸钠)带1个负电荷，二者可通过静电引力而结合，同时胰岛素的疏水氨基酸残基与SDS的疏水基团碳氢链也有结合作用。因此，在一定浓度条件下，6mol的SDS与1mol的胰岛素形成复合物，在水溶液中形成沉淀。当SDS与胰岛素摩尔之比为6∶1时沉淀最多，同时在水和1-辛醇中的分配也达到最大。上述所形成的沉淀经收集、干燥后，将比胰岛素更稳定，可储存于更高的温度和湿度而对其生物活性无明显影响。同时离子对复合物可溶于一些与水混溶的溶剂，如甲醇、乙醇、N-甲基吡咯烷酮，磷酸三甲酯等中，而在二氧六环、乙腈(ACN)、乙醚、一氯甲烷和乙烷等中难溶。

另外，胰岛素还可与脱氧胆酸钠(DOC)、油酸钠(Sodium oleate)等阴离子表面活性剂形成离子对复合物。

专利US6613358(Sustained-release composition including amorphous polymer，2003，Theodore W.Randolph，Mark C.Manning，Richard F.Falk)和WO/1994/008599(Ion-pairingof drugs for improved efficacy and delivery，SHEFTER，Eli，MANNING，Mark，G.)对离子对复合物的有关制备方法和理化性质进行了较为详细的研究，并提出了离子对复合物具有一定的缓释性。Hong Yuan等(Hong Yuan，Sai-Ping Jiang，Yong-Zhong Du，Jing Miao，Xing-Guo Zhang，Fu-Qiang Hu.Strategic approaches for improving entrapment of hydrophilicpeptide drugs by lipid nanoparticles.Colloids and surfaces.B，Biointerfaces，2009，70(2)：248-253.)研究了亮丙瑞林与油酸钠形成离子对复合物LR-SA-Na(leuprolide-sodiumstearate)后能明显增加药物的包封率，但包封率小于80％，且载药量小于1％。因此，为了能制备出可应用于临床的药物制剂，必须解决药物包封率和载药量较低的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种胰岛素纳米粒及其制备方法，特别提供一种胰岛素纳米粒胶体溶液及其制剂的制备方法。

本发明目的是通过如下技术方案实现的：

本发明所述胰岛素纳米粒的制备方法包括如下步骤：

步骤一：制备胰岛素离子对复合物；

步骤二：以步骤一制得的胰岛素离子对复合物冷冻干燥粉末为原料药，制备胰岛素纳米粒；

上述步骤一所述胰岛素离子对复合物的制备方法包括如下步骤：

(1)将100～200重量份胰岛素、35～65重量份阴离子表面活性剂分别溶于pH值小于5.3的酸性水溶液、缓冲液或水中得到浓度为5～15mg/ml的胰岛素溶液和浓度为0.5～5mg/ml的阴离子表面活性剂溶液；

(2)按照胰岛素溶液中胰岛素所带正电荷数与阴离子表面活性剂所带负电荷数的比例为4～8∶1的比例，将步骤(1)制得的阴离子表面活性剂溶液加入到胰岛素的溶液中，缓慢滴加并不断振摇，即析出白色或近白色沉淀物；将上述得到的白色或近白色沉淀静置，待结合完全后，将溶液进行离心分离，得到离心后的白色沉淀物即为胰岛素离子对复合物；

(3)取步骤(2)制得的胰岛素离子对复合物，用水或缓冲液洗涤除去可能吸附的游离药物和阴离子表面活性剂后，置于冷冻干燥机内冷冻干燥，得到其冷冻干燥粉末。

其中，所述的胰岛素包括但不限于动物胰岛素、重组人胰岛素(Recombinant humaninsulin，rhINS)、生物合成人胰岛素、胰岛素化合物类似物等；所述的胰岛素化合物类似物为具有Lys28和Pro29的人胰岛素、天然胰岛素原化合物等；

其中，所述阴离子表面活性剂的作用是使得所述胰岛素的复合物与相应的未复合的胰岛素化合物相比脂溶性更大、更稳定、可储存于更高的温度和湿度而对其生物活性无明显影响；

其中，所述的离子对为阴离子表面活性剂，包括但不限于十二烷基硫酸钠(SDS)、十二烷基苯磺酸钠、十六烷基硫酸钠(鲸蜡醇硫酸钠)、十八烷基硫酸钠(硬脂醇硫酸钠)、脱氧胆酸钠(DOC)、油酸钠等；

上述步骤一制得的离子对复合物可溶于如二甲亚砜(DMSO)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、琥珀酸二异辛酯磺酸钠(AOT)、甲醇、乙醇、N-甲基吡咯烷酮、磷酸三甲酯、2-丙醇中，而难溶于二氧六环、ACN、乙醚、一氯甲烷和乙烷等溶剂。

上述步骤二所述的胰岛素纳米粒的制备方法包括溶剂扩散(挥发)法、聚合法、共沉淀法、复乳法、自微乳化等，常用的制备方法为溶剂扩散(挥发)法，其主要步骤包括：

(1)将1重量份聚合物溶于有机溶剂中制成浓度为20～500mg/ml的有机相；如需改善制剂特性时，可将适量脂溶性附加剂溶于1～5ml的上述有机溶剂或其它有机溶剂中，再加入到含聚合物的有机相中；

(2)取0.05～1重量份胰岛素离子对复合物冷冻干燥粉末加入到步骤(1)的含有聚合物的有机相中使溶解，或溶于步骤(1)的有机溶剂或其它有机溶剂中，使得到的有机相中含胰岛素离子对复合物的浓度为5～150mg/ml，再将该有机相加入到步骤(1)的有机相中，于室温或冰浴的条件下匀化或超声匀化得到含有药物和聚合物的有机相；

(3)取1体积份步骤(2)中制得的含有药物和聚合物的有机相，缓慢加入到1～10体积倍含有一定浓度的表面活性剂的水相溶液中，于室温或冰浴的条件下充分匀化或超声乳化后形成乳剂；

(4)取1体积份步骤(3)中所形成的乳剂加入到1～10体积倍含有一定浓度的表面活性剂的水相溶液中，于室温或40℃以下水浴条件下旋转蒸发，或磁力搅拌，使有机溶剂扩散、挥发，即得到乳光明显的纳米粒胶体溶液；

(5)将制得的纳米粒胶体溶液，根据给药途径和剂型设计的要求，可加入常规辅料或冻干保护剂，于常规保存、低温保存或冷冻干燥后保存；

其中，步骤二(1)中所用聚合物为可生物降解的高分子聚合物，如聚乳酸(PLA)、聚羟基乙酸(PGA)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚乙二醇(PEG)修饰的PLA、PGA或PLGA的共聚物、聚原酸酯、聚己内酯、聚氰基丙烯酸烷基酯、聚乙二醇修饰的聚氰基丙烯酸烷基酯、聚三亚甲基碳酸酯、聚乳酸与三亚甲基碳酸酯的共聚物、聚羟基乙酸与三亚甲基碳酸酯的共聚物、聚乳酸-羟基乙酸与三亚甲基碳酸酯的共聚物、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)等中的一种或几种；

其中，步骤二(1)中所述的脂溶性附加剂包括磷脂、中链三甘油酯、甘油等；

其中，步骤二(1)、(2)中所用有机溶剂包括乙酸乙酯(EA)、二氯甲烷(DCM)、ACN、丙酮(AC)、乙醇(EtOH)、甲醇(MeOH)、二甲亚砜(DMSO)、N-甲基吡咯烷酮及其多种有机溶剂的混合液，如EA和ACN体积比为60～100∶0～40(v/v)的混合液；

其中，步骤二(3)、(4)中所用表面活性剂包括但不限于聚氧乙烯(35)蓖麻油(Cremophor EL)、聚乙烯醇(PVA)、磷脂类、胆酸钠、脱氧胆酸钠、泊洛沙姆类、吐温类、苄泽类，以及其混合表面活性剂；

其中，步骤二(3)、(4)中所述一定浓度的表面活性剂的水相溶液中，聚氧乙烯(35)蓖麻油、聚乙烯醇等表面活性剂的浓度为0.01％～10％(g/ml)，常用浓度为0.05％～3.0％(g/ml)，最优浓度为0.5％～2.0％(g/ml)。

上述步骤二制得的纳米粒形态圆整，无粘连，粒径主要分布在50nm～300nm范围内，粒度分布较窄，包封率为50％～100％，载药量为3％～50％。

上述步骤二制得的胰岛素纳米粒可用于制备注射剂、冻干粉针剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、干混悬剂、口服液、滴剂、滴丸剂、吸入剂、凝胶剂、软膏剂、贴剂、膜剂、眼用制剂或栓剂等药学上可接受的各种剂型。

本发明所述胰岛素离子对复合物的制备方法包括如下步骤：

取100～200重量份胰岛素，溶于pH值为2.0～3.0的HCl溶液中，制得浓度为5～15mg/ml的胰岛素溶液；另取35～65重量份SDS，溶于pH值为2.0～3.0的HCl溶液或水中，制得浓度为0.5～5mg/ml的SDS溶液；按照SDS与胰岛素的摩尔比为4～8∶1的比例将SDS溶液加入到胰岛素溶液中，缓慢滴加并不断振摇，即析出白色沉淀为胰岛素-十二烷基硫酸钠离子对复合物；将上述得到的白色沉淀静置，待结合完全后，将溶液进行离心分离，取沉淀，用水或缓冲液洗涤除去可能吸附的游离药物和阴离子表面活性剂，经冷冻干燥即得胰岛素离子对复合物粉末；

其中，所述的胰岛素包括动物胰岛素、重组人胰岛素等；

其中，所述的SDS还可以用DOC替代。

本发明所述胰岛素纳米粒胶体溶液的制备方法包括如下步骤：

取胰岛素-脱氧胆酸钠离子对复合物粉末溶于DMSO或体积比为1∶1的DMSO与DCM混合溶液中，得到含胰岛素离子对复合物的浓度为5～150mg/ml的有机相，另取PLGA，其中丙交酯/乙交酯(LA/GA)＝90/10～50/50，Mw＝15000～50000，溶于DCM或EA中，制成含聚合物浓度为20～500mg/ml的有机相，将上述两种溶液混合并超声处理使均匀，得到含药物和聚合物的有机相；将上述含药物和聚合物的有机相在超声条件和室温或冰浴条件下加入到含有0.1～5.0％(w/v)PVA或Cremophor EL的水溶液中，室温或冰浴条件下超声使形成O/W型乳剂，再将O/W型乳剂于搅拌下加入到1～10倍乳剂体积的含有0.1～5.0％(w/v)PVA或Cremophor EL的水溶液中，挥发除去有机溶剂，得乳光明显的胶体溶液，即为胰岛素纳米粒胶体溶液；

其中，所述的胰岛素-脱氧胆酸钠离子对复合物还可以用重组人胰岛素-十二烷基硫酸钠离子对(rhINS-SDS)复合物替代，得到重组人胰岛素纳米粒胶体溶液。

本发明所述胰岛素纳米粒冷冻干燥粉末的制备方法包括如下步骤：

取90～110体积份的重组人胰岛素纳米粒胶体溶液，加入2～10重量份浓度为2％～10％(g/ml)的甘露醇作为冻干保护剂使溶解，混匀，取1～5ml于10ml西林瓶中，于-50℃～-30℃预冻3～5小时，在冷冻干燥机内冷冻干燥，即得重组人胰岛素纳米粒冷冻干燥粉末；

其中，所述的甘露醇还可以用乳糖等药剂学上可接受的冻干保护剂替代。

本发明所述重量份与体积份的关系为g与ml的关系。

本发明所述胰岛素纳米粒具有包封率和载药量高、粒径分布均匀等优点，同时也具有一定缓释性，可有效防止药物易被蛋白酶降解，增加药物的稳定性，促进药物透过生物膜，从而提高药物疗效，降低药物毒性，增加药物生物利用度，可用于药物的多种给药途径；其制备条件温和，不需要高温和高速剪切力等剧烈条件，可保证药物的生物活性；所用表面活性剂可直接注射给药，用量小，制备的纳米粒胶体溶液性质稳定；本发明的胰岛素纳米粒制备过程中，所用的表面活性剂Cremophor EL具有抑制P-糖蛋白(P-gp)来提高药物穿越细胞膜的渗透性，增加药物通过肠道壁进入血液的吸收。

下面结合附图、实验例和实施例对本发明作进一步说明。

附图说明

图1：是实验例2中rhINS、DOC、重组人胰岛素-脱氧胆酸钠离子对(rhINS-DOC)复合物、rhINS与DOC混合物的红外光谱图；

图2：是实验例5中rhINS、SDS、rhINS-SDS复合物、rhINS与SDS混合物的红外光谱图；

图3：是实验例8中重组人胰岛素纳米粒的粒径及其分布、Zeta电位图(Zetasizer NanoZS90；以DCM为油相溶剂，1.0％(w/v)的PVA为表面活性剂；测试温度：30.00℃；溶剂粘度：0.89mPas；溶剂折射率：1.33)；

图4：是实验例10中重组人胰岛素纳米粒的透射电子显微镜图(HITACHI S-4800；以EA为油相溶剂，0.5％(w/v)的PVA为表面活性剂)；

图5：是实施例10中重组人胰岛素纳米粒的冻干曲线图；

图6：是实施例10中重组人胰岛素纳米粒胶体溶液中加入等体积量5.0％(w/v)的甘露醇为冻干保护剂时，重组人胰岛素纳米粒胶体溶液在冷冻干燥前(左)与冷冻干燥后经振摇(中)和添加适量水复溶后(右)的外观图；

图7：是实验例14中重组人胰岛素纳米粒冻干后的粒径及其分布、Zeta电位图(Zetasizer Nano ZS90；以DCM为油相溶剂，1.0％(w/v)的PVA为表面活性剂；测试温度：30.00℃；溶剂粘度：0.89mPas；溶剂折射率：1.33)。

下述实验例和实施例用于进一步说明但不限于本发明。

实验例1重组人胰岛素-脱氧胆酸钠的结合率测定

1、仪器：高效液相色谱仪，包括Alltech 426型色谱泵，UVIS-200型紫外可见检测器，Alltech色谱数据工作站(美国Alltech公司)；TDL-50B低速台式离心机(最大相对离心力2500g，转子为XTS05-2，15ml×8，上海安亭科学仪器厂)；

试药：rhINS原料(效价为29.7IU·mg^-1)；rhINS标准品(26.4IU·mg^-1，140633-200302，中国药品生物制品检定所)；DOC(意大利ICE公司)；ACN(色谱纯，国药集团化学试剂有限公司)；无水硫酸钠(分析纯，天津市博迪化工有限公司)；水为重蒸水；磷酸等其它试剂均为分析纯；

2、色谱条件：色谱柱：Shim-pack VP-ODS色谱柱(150mm×4.6mm，5μm，日本岛津公司)；流动相：0.2mol·l^-1无水硫酸钠溶液(用磷酸调pH值至2.3)-ACN(73∶27，v/v)；流速：0.8ml·min^-1；柱温：40℃；检测波长：214nm；

3、测定方法：取本发明实施例1中离心后的上清液，利用高效液相色谱法测定其中的药物，即为未结合的游离药物，通过比较测定的游离药物量与加入的重组人胰岛素总量之比计算出重组人胰岛素与脱氧胆酸钠的结合率。

4、测定结果：当DOC与重组人胰岛素摩尔比为4∶1时得到的结合率为84.97％(RDS＝0.50％)。

实验例2重组人胰岛素-脱氧胆酸钠复合物的红外光谱鉴别

分别取重组人胰岛素、脱氧胆酸钠、本发明实施例1中所述的重组人胰岛素-脱氧胆酸钠复合物、重组人胰岛素与脱氧胆酸钠物理混合的样品各1～2mg，研细，并加100～200mg的溴化钾混合研匀后用YP-2压片机压制红外样品片，然后分别在PerkinElmerSpectrum 100傅里叶变换红外光谱仪上进行扫描，得到各红外光谱图，其结果见图1。

实验例3胰岛素-十二烷基硫酸钠的结合率测定

试药：胰岛素原料(批号为0312A02，效价28IU·mg^-1，通化东宝药业股份有限公司)；ACN(色谱纯，国药集团化学试剂有限公司)；无水硫酸钠(分析纯，天津市博迪化工有限公司)；水为重蒸水；磷酸等其它试剂均为分析纯；

3、测定方法：取本发明实施例3中离心后的上清液，利用高效液相色谱法测定其中的药物，即为未结合的游离药物，通过比较测定的游离药物量与加入的胰岛素总量之比计算出胰岛素与十二烷基硫酸钠的结合率；

4、测定结果：当SDS与胰岛素摩尔比为6∶1时得到的结合率为98.12％(RDS＝0.94％)。

实验例4重组人胰岛素-十二烷基硫酸钠的结合率测定

试药：rhINS原料(效价为29.7IU·mg^-1)；rhINS标准品(26.4IU·mg^-1，140633-200302，中国药品生物制品检定所)；ACN(色谱纯，国药集团化学试剂有限公司)；无水硫酸钠(分析纯，天津市博迪化工有限公司)；水为重蒸水；磷酸等其它试剂均为分析纯；

2、色谱条件：色谱柱：Shim-pack VP-ODS色谱柱(150mm×4.6mm，5μm，日本岛津公司)；流动相：0.2mol·l^-1无水硫酸钠溶液(用磷酸调pH值至2.3)-ACN(73∶27，v/v)；流速：0.8ml·min^-1；柱温：40℃；检测波长：214nm。

3、测定方法：取本发明实施例4中离心后的上清液，利用高效液相色谱法测定其中的药物，即为未结合的游离药物，通过比较测定的游离药物量与加入的胰岛素总量之比计算出重组人胰岛素与十二烷基硫酸钠的结合率；

4、测定结果：当SDS与重组人胰岛素摩尔比为6∶1时得到的结合率为99.82％(RDS＝0.08％)。

实验例5重组人胰岛素-十二烷基硫酸钠复合物的红外光谱鉴别

分别取重组人胰岛素、十二烷基硫酸钠、本发明实施例4中所述的重组人胰岛素-十二烷基硫酸钠复合物、重组人胰岛素与十二烷基硫酸钠物理混合的样品各1～2mg，研细，并加100～200mg的溴化钾混合研匀后用YP-2压片机压制红外样片，然后分别在PerkinElmer Spectrum 100傅里叶变换红外光谱仪上进行扫描，得到各红外光谱图，其结果见图2。

实验例6胰岛素纳米粒胶体溶液中药物的包封率及载药量测定

1、仪器：高效液相色谱仪，包括Alltech 426型色谱泵，UVIS-200型紫外可见检测器，Alltech色谱数据工作站(美国Alltech公司)；SUPELCO固相萃取装置(Visiprep DLSPE vacuum manifold standard，12-port model，美国SUPELCO公司)；固相萃取柱(3ml，深圳逗点生物技术有限公司)；

试药：胰岛素-脱氧胆酸钠离子对复合物(自制)；葡聚糖凝胶(G-75，Superfine，17-0051-01，Amersham Biosciences公司)；ACN(色谱纯，国药集团化学试剂有限公司)；无水硫酸钠(分析纯，天津市博迪化工有限公司)；水为重蒸水；磷酸、盐酸等其它试剂均为分析纯；

3、测定方法：取本发明实施例5中所述的胰岛素纳米粒胶体溶液经定容后，精密量取0.4ml，于3ml固相萃取柱的Sephadex G-75上，使用1.2ml的纯化水洗脱，得到不含游离药物的纳米粒，再使用0.01mol·l^-1的盐酸溶液洗脱，收集盐酸洗脱溶液至5ml量瓶中至刻度，摇匀，即得胰岛素纳米粒胶体溶液中未包封的游离药物，利用高效液相色谱法测定其中游离药物的浓度，通过比较测定的游离药物量与加入的胰岛素总量之比计算出纳米粒胶体溶液中胰岛素的包封率；

4、测定结果：以胰岛素-脱氧胆酸钠离子对复合物制得的纳米粒胶体溶液中药物的包封率为93.35％(RDS＝0.35％)，载药量达到15.8％。

实验例7重组人胰岛素纳米粒胶体溶液中药物的包封率及载药量测定

试药：rhINS-SDS复合物(自制)；葡聚糖凝胶(G-75，Superfine，17-0051-01，AmershamBiosciences公司)；ACN(色谱纯，国药集团化学试剂有限公司)；无水硫酸钠(分析纯，天津市博迪化工有限公司)；水为重蒸水；磷酸、盐酸等其它试剂均为分析纯；

3、测定方法：取本发明实施例6中所述的重组人胰岛素纳米粒胶体溶液经定容后，精密量取0.4ml，于3ml固相萃取柱的Sephadex G-75上，使用1.2ml的纯化水洗脱，得到不含游离药物的纳米粒，再使用0.01mol·l^-1的盐酸溶液洗脱，收集盐酸洗脱溶液至5ml量瓶中至刻度，摇匀，即得重组人胰岛素纳米粒胶体溶液中未包封的游离药物，利用高效液相色谱法测定其中游离药物的浓度，通过比较测定的游离药物量与加入的重组人胰岛素总量之比计算出纳米粒胶体溶液中重组人胰岛素的包封率；

4、测定结果：以重组人胰岛素-十二烷基硫酸钠离子对复合物制得的纳米粒胶体溶液中药物的包封率为95.73％(RDS＝0.65％)，载药量达到16.5％。

实验例8重组人胰岛素纳米粒的粒径、分布及Zeta电位测定

取本发明实施例6所述的重组人胰岛素纳米粒胶体溶液，利用光子相关光谱法测定纳米粒的粒径大小及其分布。在室温条件下，取纳米粒胶体溶液，用水稀释后，置于激光粒度分析仪/Zeta电位仪(Malvern Zetasizer Nano ZS90)的样品管中测定纳米粒的粒径大小及其分布。同时利用上述激光粒度分析仪/Zeta电位仪测定纳米粒的Zeta电位。结果，纳米粒的Z-平均粒径为154nm，分散度指数(PDI)为0.16，Zeta电位为-5.38mV，测得纳米粒的粒径大小及其分布、Zeta电位图见图3。

实验例9重组人胰岛素纳米粒胶体溶液中药物的包封率及载药量测定

2.色谱条件：色谱柱：Shim-pack VP-ODS色谱柱(150mm×4.6mm，5μm，日本岛津公司)；流动相：0.2mol·l^-1无水硫酸钠溶液(用磷酸调pH值至2.3)-ACN(73∶27，v/v)；流速：0.8ml·min^-1；柱温：40℃；检测波长：214nm；

3、测定方法：取本发明实施例7中所述的重组人胰岛素纳米粒胶体溶液经定容后，精密量取0.4ml，于3ml固相萃取柱的Sephadex G-75上，使用1.2ml的纯化水洗脱，得到不含游离药物的纳米粒，再使用0.01mol·l^-1的盐酸溶液洗脱，收集盐酸洗脱溶液至5ml量瓶中至刻度，摇匀，即得重组人胰岛素纳米粒胶体溶液中未包封的游离药物，利用高效液相色谱法测定其中游离药物的浓度，通过比较测定的游离药物量与加入的重组人胰岛素总量之比计算出纳米粒胶体溶液中重组人胰岛素的包封率；

4、测定结果：以重组人胰岛素-十二烷基硫酸钠离子对复合物制得的纳米粒胶体溶液中药物的包封率为97.39％(RDS＝0.47％)，载药量达到17.2％。

实验例10重组人胰岛素纳米粒的形态

取1～2滴本发明实施例7所述的重组人胰岛素纳米粒胶体溶液，滴于载玻片上干燥，经HITACHI E-1010离子溅射仪喷金，于HITACHI S-4800冷场发射电子显微镜下观察纳米粒的形态并拍照，结果见图4。

实验例11重组人胰岛素纳米粒胶体溶液中药物的包封率及载药量测定

3、测定方法：取本发明实施例8中所述的重组人胰岛素纳米粒胶体溶液经定容后，精密量取0.4ml，于3ml固相萃取柱的Sephadex G-75上，使用1.2ml的纯化水洗脱，得到不含游离药物的纳米粒，再使用0.01mol·l^-1的盐酸溶液洗脱，收集盐酸洗脱溶液至5ml量瓶中至刻度，摇匀，即得重组人胰岛素纳米粒胶体溶液中未包封的游离药物，利用高效液相色谱法测定其中游离药物的浓度，通过比较测定的游离药物量与加入的重组人胰岛素总量之比计算出纳米粒胶体溶液中重组人胰岛素的包封率；

4、测定结果：以重组人胰岛素-十二烷基硫酸钠离子对复合物制得的纳米粒胶体溶液中药物的包封率为92.14％(RDS＝1.22％)，载药量达到16.7％。

实验例12重组人胰岛素纳米粒胶体溶液中药物的包封率及载药量测定

3、测定方法：取本发明实施例9中所述的重组人胰岛素纳米粒胶体溶液经定容后，精密量取0.4ml，于3ml固相萃取柱的Sephadex G-75上，使用1.2ml的纯化水洗脱，得到不含游离药物的纳米粒，再使用0.01mol·l^-1的盐酸溶液洗脱，收集盐酸洗脱溶液至5ml量瓶中至刻度，摇匀，即得重组人胰岛素纳米粒胶体溶液中未包封的游离药物，利用高效液相色谱法测定其中游离药物的浓度，通过比较测定的游离药物量与加入的重组人胰岛素总量之比计算出纳米粒胶体溶液中重组人胰岛素的包封率；

4、测定结果：以重组人胰岛素-十二烷基硫酸钠离子对复合物制得的纳米粒胶体溶液中药物的包封率为94.82％(RDS＝0.97％)，载药量达到18.1％。

实验例13重组人胰岛素纳米粒冷冻干燥品中药物的包封率及载药量测定

3、测定方法：取本发明实施例10中所述重组人胰岛素纳米粒冷冻干燥品，以重蒸水复溶至与冷冻干燥前相同浓度的溶液，经定容后，精密量取0.4ml，于3ml固相萃取柱的Sephadex G-75上，使用1.2ml的纯化水洗脱，得到不含游离药物的纳米粒，再使用0.01mol·l^-1的盐酸溶液洗脱，收集盐酸洗脱溶液至5ml量瓶中至刻度，摇匀，即得重组人胰岛素纳米粒胶体溶液中未包封的游离药物，利用高效液相色谱法测定其中游离药物的浓度，通过比较测定的游离药物量与加入的重组人胰岛素总量之比计算出纳米粒胶体溶液中重组人胰岛素的包封率；

4、测定结果：以重组人胰岛素-十二烷基硫酸钠离子对复合物制得的纳米粒冷冻干燥品中药物的包封率为95.42％(RDS＝0.90％)，载药量达到16.5％。

实验例14重组人胰岛素纳米粒的粒径、分布及Zeta电位测定

取本发明实施例10所述重组人胰岛素纳米粒冷冻干燥品，加入与冷冻干燥前的等量水复溶后，置于激光粒度分析仪/Zeta电位仪(Malvern Zetasizer Nano ZS90)的样品管中测定纳米粒的粒径大小及其分布。同时利用上述激光粒度分析仪/Zeta电位仪测定纳米粒的Zeta电位。结果，纳米粒的Z-平均粒径为251nm，PDI为0.13，Zeta电位为-9.57mV，测得纳米粒的粒径大小及其分布、Zeta电位图，见图7。

具体实施方式

实施例1：重组人胰岛素-脱氧胆酸钠复合物的制备

取100mg重组人胰岛素溶于pH值为2.5的HCl溶液中，制得浓度为6.8mg/ml的重组人胰岛素溶液；另取60mg DOC溶于水中，制得浓度为2.5mg/ml的DOC溶液，按照DOC与重组人胰岛素的摩尔比为4∶1的比例将DOC溶液加入到重组人胰岛素溶液中，缓慢滴加并不断振摇，即析出白色沉淀为重组人胰岛素-脱氧胆酸钠离子对复合物。上述得到的白色沉淀静置，待结合完全后，将溶液进行离心分离，取沉淀，用适量水洗涤除去可能吸附的游离药物和阴离子表面活性剂，经冷冻干燥即得重组人胰岛素复合物粉末。

实施例2：胰岛素-脱氧胆酸钠复合物的制备

取100mg胰岛素溶于pH值为2.5的HCl溶液中，制得浓度为8.4mg/ml的胰岛素溶液，另取60mg DOC溶于水中，制得浓度为0.7mg/ml的DOC溶液，按照DOC与胰岛素的摩尔比分别为8∶1的比例将DOC溶液加入到胰岛素溶液中，缓慢滴加并不断振摇，即析出白色沉淀为胰岛素-脱氧胆酸钠离子对复合物；将上述得到的白色沉淀静置，待结合完全后，将溶液进行离心分离，取沉淀，用适量水洗涤除去可能吸附的游离药物和阴离子表面活性剂，经冷冻干燥即得胰岛素复合物粉末。

实施例3：胰岛素-十二烷基硫酸钠复合物的制备

取100mg胰岛素、35mg SDS分别溶于pH值为2.5的HCl溶液中，制得浓度为9.1mg/ml的胰岛素溶液和浓度为2.1mg/ml的SDS溶液，按照SDS与胰岛素摩尔比为6∶1的比例将SDS溶液加入到胰岛素溶液中，缓慢滴加并不断振摇，即析出白色沉淀为胰岛素-十二烷基硫酸钠离子对复合物，上述得到的白色沉淀静置，待结合完全后，将溶液进行离心分离，取沉淀，用0.01mol·l^-1的盐酸溶液适量洗涤除去可能吸附的游离药物和阴离子表面活性剂，经冷冻干燥即得胰岛素复合物粉末。

实施例4：重组人胰岛素-十二烷基硫酸钠复合物的制备

取200mg重组人胰岛素、65mg SDS分别溶于pH值为2.5的HCl溶液中，制得浓度为10.5mg/ml的重组人胰岛素溶液和浓度为3.4mg/ml的SDS溶液，按照SDS与重组人胰岛素摩尔比为6∶1的比例将SDS溶液加入到重组人胰岛素溶液中，缓慢滴加并不断振摇，即析出白色沉淀为重组人胰岛素-十二烷基硫酸钠离子对复合物，上述得到的白色沉淀静置，待结合完全后，将溶液进行离心分离，取沉淀，用0.01mol·l^-1的盐酸溶液适量洗涤除去可能吸附的游离药物和阴离子表面活性剂，经冷冻干燥即得重组人胰岛素复合物粉末。

实施例5：胰岛素纳米粒胶体溶液的制备

取实施例2制得的13mg胰岛素-脱氧胆酸钠离子对复合物粉末溶于0.5ml的DMSO中，另取50mg的PLGA(LA/GA＝75/25，Mw＝25000)溶于0.5ml的DCM中，将上述两种溶液混合并超声处理使均匀，得到含药物和聚合物的有机相。将上述含药物和聚合物的有机相在超声条件和冰浴条件下加入到3ml含有1.0％(w/v)PVA的水溶液中，超声使形成O/W型乳剂，再将O/W型乳剂于搅拌下加入到20ml的0.5％(w/v)PVA水溶液中，挥发除去有机溶剂，得乳光明显的胶体溶液，即为载胰岛素的纳米粒胶体溶液。

实施例6：重组人胰岛素纳米粒胶体溶液的制备

取实施例4制得的重组人胰岛素-十二烷基硫酸钠离子对复合物粉末13mg溶于1.0ml的DMSO中，另取50mg的PLGA(LA/GA＝75/25，Mw＝15000)溶于1.5ml的DCM中，将上述两种溶液混合并超声处理使均匀，得到含药物和聚合物的有机相。将上述含药物和聚合物的有机相在超声条件和冰浴条件下加入到体积3ml含有1.0％(w/v)PVA的水溶液中，超声使形成O/W型乳剂，再将O/W型乳剂于搅拌下加入到50ml的1.0％(w/v)PVA水溶液中，挥发除去有机溶剂，得乳光明显的胶体溶液，即为载重组人胰岛素的纳米粒胶体溶液。

实施例7：重组人胰岛素纳米粒胶体溶液的制备

取实施例4制得的重组人胰岛素-十二烷基硫酸钠离子对复合物粉末14mg溶于0.5ml的DMSO中，另取50mg的PLGA(LA/GA＝75/25，Mw＝15000)溶于1.2ml的EA中，将上述两种溶液混合并超声处理使均匀，得到含药物和聚合物的有机相。将上述含药物和聚合物的有机相在超声条件和冰浴条件下加入到体积5ml含有0.5％(w/v)PVA的水溶液中，超声使形成O/W型乳剂，再将O/W型乳剂于搅拌下加入到80ml的0.5％(w/v)PVA水溶液中，挥发除去有机溶剂，得乳光明显的胶体溶液，即为载重组人胰岛素的纳米粒胶体溶液。

实施例8：重组人胰岛素纳米粒胶体溶液的制备

取实施例4制得的重组人胰岛素-十二烷基硫酸钠离子对复合物粉末14mg溶于2ml的DMSO中，另取50mg的PLGA(LA/GA＝80/20，Mw＝50000)溶于2ml的DCM中，将上述两种溶液混合并超声处理使均匀，得到含药物和聚合物的有机相。将上述含药物和聚合物的有机相在超声条件和冰浴条件下加入到体积8ml含有0.5％(w/v)CremophorEL的水溶液中，超声使形成O/W型乳剂，再将O/W型乳剂于搅拌下加入到100ml的0.5％(w/v)Cremophor EL水溶液中，挥发除去有机溶剂，得乳光明显的胶体溶液，即为载重组人胰岛素的纳米粒胶体溶液。

实施例9：重组人胰岛素纳米粒胶体溶液的制备

取实施例4制得的重组人胰岛素-十二烷基硫酸钠离子对复合物粉末15mg溶于1ml的体积比为1∶1的DMSO与DCM混合溶液中，另取50mg的PLGA(LA/GA＝75/25，Mw＝15000)溶于2ml的DCM中，将上述两种溶液混合并超声处理使均匀，得到含药物和聚合物的有机相。将上述含药物和聚合物的有机相在超声条件和冰浴条件下加入到体积7ml含有1.0％(w/v)PVA的水溶液中，超声使形成O/W型乳剂，再将O/W型乳剂于搅拌下加入到60ml的0.5％(w/v)PVA水溶液中，挥发除去有机溶剂，得乳光明显的胶体溶液，即为载重组人胰岛素的纳米粒胶体溶液。

实施例10：重组人胰岛素纳米粒冷冻干燥粉末的制备

取实施例6制得的重组人胰岛素纳米粒胶体溶液100ml，加入3.5g的甘露醇作为冻干保护剂使溶解，混匀后，取2.0ml于10ml西林瓶中，于-45℃预冻4h，在LGJ-18S型冷冻干燥机内于-40℃预冻3h后，在1Pa、-45℃的真空条件下冷冻干燥8h，再分别于-30℃、-25℃、-10℃、0℃条件下冷冻干燥4h、5℃条件下冷冻干燥2h，即得重组人胰岛素纳米粒的冻干品。

实施例11：重组人胰岛素-脱氧胆酸钠复合物的制备

取100mg重组人胰岛素溶于pH值为2.5的HCl溶液中，制得浓度为10mg/ml的重组人胰岛素溶液，另取60mg DOC溶于水中，制得浓度为2mg/ml的DOC溶液，按照DOC与重组人胰岛素的摩尔比为8∶1的比例将DOC溶液加入到重组人胰岛素溶液中，缓慢滴加并不断振摇，即析出白色沉淀为重组人胰岛素-脱氧胆酸钠离子对复合物。上述得到的白色沉淀静置，待结合完全后，将溶液进行离心分离，取离心后的离子对复合物经冷冻干燥即得重组人胰岛素复合物粉末。

实施例12：重组人胰岛素纳米粒冷冻干燥粉末的制备

取实施例7制得的重组人胰岛素纳米粒胶体溶液100ml，加入2.0g的甘露醇和1.0g乳糖作为冻干保护剂使溶解，混匀后，取2.0ml于10ml西林瓶中，于-45℃预冻4h，在LGJ-18S型冷冻干燥机内于-40℃预冻3h后，在1Pa、-45℃的真空条件下冷冻干燥8h，再分别于-30℃、-25℃、-10℃、0℃条件下冷冻干燥4h、5℃条件下冷冻干燥2h，即得重组人胰岛素纳米粒的冻干品。

Claims

1.一种胰岛素纳米粒，其特征在于该胰岛素纳米粒的制备方法包括如下步骤：

步骤一：制备胰岛素离子对复合物；

其中，步骤一所述胰岛素离子对复合物的制备方法包括如下步骤：

(2)按照胰岛素溶液中胰岛素所带正电荷数与阴离子表面活性剂所带负电荷数的比例为4～8∶1的比例，将步骤(1)制得的阴离子表面活性剂溶液加入到胰岛素的溶液中，缓慢滴加并不断振摇，即析出白色或近白色沉淀物；将上述得到的白色或近白色沉淀静置，待结合完全后，将溶液进行离心分离，得到离心后的白色或近白色沉淀物即为胰岛素离子对复合物；

(3)取步骤(2)制得的胰岛素离子对复合物，用水或缓冲液洗涤除去可能吸附的游离药物和阴离子表面活性剂后，置于冷冻干燥机内冷冻干燥，得到其冷冻干燥粉末；

其中，步骤二所述的胰岛素纳米粒的制备方法包括如下步骤：

(1)将1重量份聚合物溶于有机溶剂中制成浓度为20～500mg/ml的有机相；

(5)将制得的纳米粒胶体溶液，可加入常规辅料或冻干保护剂，于常规保存、低温保存或冷冻干燥后保存。

2.如权利要求1所述的一种胰岛素纳米粒，其特征在于该胰岛素纳米粒的制备方法步骤一(1)中所述的胰岛素包括但不限于动物胰岛素、重组人胰岛素、生物合成人胰岛素或胰岛素化合物类似物，其中，胰岛素化合物类似物为具有Lys28和Pro29的人胰岛素或天然胰岛素原化合物。

3.如权利要求1或2所述的一种胰岛素纳米粒，其特征在于该胰岛素纳米粒的制备方法步骤一(1)中所述的阴离子表面活性剂包括但不限于十二烷基硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠、十六烷基硫酸钠、十八烷基硫酸钠、脱氧胆酸钠或油酸钠。

4.如权利要求1或2所述的一种胰岛素纳米粒，其特征在于该胰岛素纳米粒的制备方法步骤二(1)中所述聚合物包括但不限于聚乳酸、聚羟基乙酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乙二醇修饰的聚乳酸、聚羟基乙酸或聚乳酸-羟基乙酸的共聚物、聚原酸酯、聚己内酯、聚氰基丙烯酸烷基酯、聚乙二醇修饰的聚氰基丙烯酸烷基酯、聚三亚甲基碳酸酯、聚乳酸与三亚甲基碳酸酯的共聚物、聚羟基乙酸与三亚甲基碳酸酯的共聚物、聚乳酸-羟基乙酸与三亚甲基碳酸酯的共聚物、聚甲基丙烯酸甲酯中的一种或几种。

5.如权利要求3所述的一种胰岛素纳米粒，其特征在于该胰岛素纳米粒的制备方法步骤二(1)中所述聚合物包括但不限于聚乳酸、聚羟基乙酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乙二醇修饰的聚乳酸、聚羟基乙酸或聚乳酸-羟基乙酸的共聚物、聚原酸酯、聚己内酯、聚氰基丙烯酸烷基酯、聚乙二醇修饰的聚氰基丙烯酸烷基酯、聚三亚甲基碳酸酯、聚乳酸与三亚甲基碳酸酯的共聚物、聚羟基乙酸与三亚甲基碳酸酯的共聚物、聚乳酸-羟基乙酸与三亚甲基碳酸酯的共聚物、聚甲基丙烯酸甲酯中的一种或几种。

6.如权利要求1、2或5所述的一种胰岛素纳米粒，其特征在于该胰岛素纳米粒的制备方法步骤二(1)、(2)中所用有机溶剂包括但不限于乙酸乙酯、二氯甲烷、乙腈、丙酮、乙醇、甲醇、二甲亚砜、N-甲基吡咯烷酮中的一种或几种。

7.如权利要求3所述的一种胰岛素纳米粒，其特征在于该胰岛素纳米粒的制备方法步骤二(1)、(2)中所用有机溶剂包括但不限于乙酸乙酯、二氯甲烷、乙腈、丙酮、乙醇、甲醇、二甲亚砜、N-甲基吡咯烷酮中的一种或几种。

8.如权利要求4所述的一种胰岛素纳米粒，其特征在于该胰岛素纳米粒的制备方法步骤二(1)、(2)中所用有机溶剂包括但不限于乙酸乙酯、二氯甲烷、乙腈、丙酮、乙醇、甲醇、二甲亚砜、N-甲基吡咯烷酮中的一种或几种。

9.如权利要求1、2、5、7或8所述的一种胰岛素纳米粒，其特征在于该胰岛素纳米粒的制备方法步骤二(3)、(4)中所用表面活性剂包括但不限于聚氧乙烯(35)蓖麻油、聚乙烯醇、磷脂类、胆酸钠、脱氧胆酸钠、泊洛沙姆类、吐温类、苄泽类中的一种或几种。

10.如权利要求3所述的一种胰岛素纳米粒，其特征在于该胰岛素纳米粒的制备方法步骤二(3)、(4)中所用表面活性剂包括但不限于聚氧乙烯(35)蓖麻油、聚乙烯醇、磷脂类、胆酸钠、脱氧胆酸钠、泊洛沙姆类、吐温类、苄泽类中的一种或几种。

11.如权利要求4所述的一种胰岛素纳米粒，其特征在于该胰岛素纳米粒的制备方法步骤二(3)、(4)中所用表面活性剂包括但不限于聚氧乙烯(35)蓖麻油、聚乙烯醇、磷脂类、胆酸钠、脱氧胆酸钠、泊洛沙姆类、吐温类、苄泽类中的一种或几种。

12.如权利要求6所述的一种胰岛素纳米粒，其特征在于该胰岛素纳米粒的制备方法步骤二(3)、(4)中所用表面活性剂包括但不限于聚氧乙烯(35)蓖麻油、聚乙烯醇、磷脂类、胆酸钠、脱氧胆酸钠、泊洛沙姆类、吐温类、苄泽类中的一种或几种。

13.如权利要求1、2、5、7、8、10、11或12所述的一种胰岛素纳米粒，其特征在于该胰岛素纳米粒的制备方法步骤二(3)、(4)中所述一定浓度的表面活性剂的水相溶液中，表面活性剂的浓度为0.01％～10.0％(g/ml)。

14.如权利要求3所述的一种胰岛素纳米粒，其特征在于该胰岛素纳米粒的制备方法步骤二(3)、(4)中所述一定浓度的表面活性剂的水相溶液中，表面活性剂的浓度为0.01％～10.0％(g/ml)。

15.如权利要求4所述的一种胰岛素纳米粒，其特征在于该胰岛素纳米粒的制备方法步骤二(3)、(4)中所述一定浓度的表面活性剂的水相溶液中，表面活性剂的浓度为0.01％～10.0％(g/ml)。

16.如权利要求6所述的一种胰岛素纳米粒，其特征在于该胰岛素纳米粒的制备方法步骤二(3)、(4)中所述一定浓度的表面活性剂的水相溶液中，表面活性剂的浓度为0.01％～10.0％(g/ml)。

17.如权利要求9所述的一种胰岛素纳米粒，其特征在于该胰岛素纳米粒的制备方法步骤二(3)、(4)中所述一定浓度的表面活性剂的水相溶液中，表面活性剂的浓度为0.01％～10.0％(g/ml)。

18.如权利要求1、2、5、7、8、10、11、12、14、15、16或17所述的一种胰岛素纳米粒，其特征在于该胰岛素纳米粒的粒径为50nm～300nm，包封率为50％～100％，载药量为3％～50％。

19.如权利要求3所述的一种胰岛素纳米粒，其特征在于该胰岛素纳米粒的粒径为50nm～300nm，包封率为50％～100％，载药量为3％～50％。

20.如权利要求4所述的一种胰岛素纳米粒，其特征在于该胰岛素纳米粒的粒径为50nm～300nm，包封率为50％～100％，载药量为3％～50％。

21.如权利要求6所述的一种胰岛素纳米粒，其特征在于该胰岛素纳米粒的粒径为50nm～300nm，包封率为50％～100％，载药量为3％～50％。

22.如权利要求9所述的一种胰岛素纳米粒，其特征在于该胰岛素纳米粒的粒径为50nm～300nm，包封率为50％～100％，载药量为3％～50％。

23.如权利要求13所述的一种胰岛素纳米粒，其特征在于该胰岛素纳米粒的粒径为50nm～300nm，包封率为50％～100％，载药量为3％～50％。

24.如权利要求1、2、5、7、8、10、11、12、14、15、16、17、19、20、21、22或23所述的一种胰岛素纳米粒，其特征在于该胰岛素纳米粒制成注射剂、冻干粉针剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、干混悬剂、口服液、滴剂、滴丸剂、吸入剂、凝胶剂、软膏剂、贴剂、膜剂、眼用制剂或栓剂。

25.如权利要求3所述的一种胰岛素纳米粒，其特征在于该胰岛素纳米粒制成注射剂、冻干粉针剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、干混悬剂、口服液、滴剂、滴丸剂、吸入剂、凝胶剂、软膏剂、贴剂、膜剂、眼用制剂或栓剂。

26.如权利要求4所述的一种胰岛素纳米粒，其特征在于该胰岛素纳米粒制成注射剂、冻干粉针剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、干混悬剂、口服液、滴剂、滴丸剂、吸入剂、凝胶剂、软膏剂、贴剂、膜剂、眼用制剂或栓剂。

27.如权利要求6所述的一种胰岛素纳米粒，其特征在于该胰岛素纳米粒制成注射剂、冻干粉针剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、干混悬剂、口服液、滴剂、滴丸剂、吸入剂、凝胶剂、软膏剂、贴剂、膜剂、眼用制剂或栓剂。

28.如权利要求9所述的一种胰岛素纳米粒，其特征在于该胰岛素纳米粒制成注射剂、冻干粉针剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、干混悬剂、口服液、滴剂、滴丸剂、吸入剂、凝胶剂、软膏剂、贴剂、膜剂、眼用制剂或栓剂。

29.如权利要求13所述的一种胰岛素纳米粒，其特征在于该胰岛素纳米粒制成注射剂、冻干粉针剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、干混悬剂、口服液、滴剂、滴丸剂、吸入剂、凝胶剂、软膏剂、贴剂、膜剂、眼用制剂或栓剂。

30.如权利要求18所述的一种胰岛素纳米粒，其特征在于该胰岛素纳米粒制成注射剂、冻干粉针剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、干混悬剂、口服液、滴剂、滴丸剂、吸入剂、凝胶剂、软膏剂、贴剂、膜剂、眼用制剂或栓剂。