CN102605050A - 各类癌症化疗前耐药基因（FBW7）mRNA水平原位杂交检测试剂盒及检测方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针和标记物。还公开使用本试剂盒原位杂交检测与癌症化疗药物耐药有密切相关的肿瘤抑制因子FBW7基因一级转录产物mRNA方法，包括以下步骤：（1）在杂交探针与靶序列可形成稳定杂交复合体的条件下，将底物中待测RNA与杂交探针接触，形成杂交复合体；和（2）检测所述杂交复合体。本发明的试剂盒和检测方法可在mRNA水平上检测FBW7基因的表达量，能指导临床医师对癌症病人实施有效治疗。同时，本发明的检测方法简单方便，成本低，便于县区级医院推广应用。

Description

各类癌症化疗前耐药基因(FBW7)mRNA水平原位杂交检测试剂盒及检测方法和应用

技术领域

本发明涉及生物检测领域，更具体地说，是涉及与癌症耐药基因mRNA表达改变的相关检测技术。  

背景技术

根据国内外权威机构提供的资料，我国每年癌症的新增人数260万，死亡人数近210万，患者700多万，全球每年新增癌症患者800万，死亡人数接近800万，患者约有8400多万人，到2020年以上人数将翻一番，这是一组可怕的数字。癌症诊治成本越来越高，按癌症患者的年治疗费用20万（贫穷地区可能偏高，发达地区可能远远高出20万），700多万患者，每年的花费是1.4万亿人民币，扣除成本35%约4千亿，每年约有1万亿人民币白白消耗了。而且，癌症患者大部分会在治疗后不久死亡。因此，现有的临床癌症诊治模式一定要改变，本发明的创新点是提前做到预防性筛查，然后及时介入预防性调控和预防性治疗，做到基因水平癌症的治未病。 

2005年美国卫生研究院、癌症研究院、疾控中心等八家单位做了一个年度报告，对1972年发起的抗癌大战进行回顾，报告认为人类在抗癌大战中是失败，结论是癌症死亡率没有降低，其列举出造成抗癌大战失败的几个因素是：1.肿瘤细胞异质性（多态性）；2.肿瘤细胞耐药性；3.抗癌药物设计思路不完善（动物模型设计不科学）等。同时，该报告中亦提出应重新审视现有诊治癌症的措施。 

症药物治疗中的耐药问题是个比较严重临床问题。目前，临床上有个性化基因SNP突变点检测，这还不够，能够发现一些与耐药相关基因，查清楚突变的原因（发现与疾病相关的基因才是大方向）。有报道FBW7是肿瘤耐药机制相关的基因。化疗是目前临床上治疗恶性肿瘤的最重要手段之一，然而由于肿瘤细胞常常会对化疗药物产生耐药而导致患者对治疗不再敏感，最终导致化疗失败甚至疾病复发。近年来科学家们针对肿瘤耐药机制开展了大量的研究工作，研究结果表明肿瘤耐药与药物摄取减少，排出增多，活化减少，失活增加，DNA损伤修复增加，DNA甲基化以及信号传导通路异常等多种机制相关。在最新一期的《自然》（Nature）杂志上两个研究小组将肿瘤的耐药机制指向了同一基因—— FBW7。这一研究发现有助于肿瘤学家预测化疗患者将对紫杉醇及类似活性药物产生的药物反应，并为癌症治疗指明了新的研究靶点。紫杉醇是目前临床上应用最广泛的一类化疗药物。紫杉醇可通过促进微管聚合和稳定已聚合微管导致细胞内大量微管积聚，从而最终干扰细胞的各种功能，使细胞分裂停止于有丝分裂其，阻断细胞的正常分裂。大量研究表明紫杉醇对于卵巢癌、乳腺癌、肺癌、大肠癌、黑色素瘤、头颈部癌、淋巴瘤、脑瘤等多种肿瘤有着广谱的疗效。然而近年来临床亦有不少病例报道患者在接受紫杉醇治疗后显示药物耐受，最终导致治疗失败。在第一篇论文中，Wertz和同事发现接受紫杉醇以及另一种抗微管药物长春新碱治疗后的反应细胞内的促存活蛋白MCL1显着降低。在进一步的研究中，她们证实一种已知的肿瘤抑制因子FBW7在泛素-蛋白酶体介导的MCL1蛋白降解中发挥了关键性的作用。过去的研究证实FBW7缺陷与多种癌症包括乳腺癌和结肠癌相关。Wertz等观察到FBW7缺陷的卵巢癌和结肠癌细胞中表达高水平的MCL1蛋白，并且更易于对抗微管药物产生耐受。在另一篇论文中，来自美国柏斯以色列狄肯尼斯医学中心（Beth Israel Deaconess Medical Center）Wenyi Wei以及同事针对FBW7在T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）细胞中的效应进行了研究，发现FBW7缺陷的T-ALL细胞中Jun、Myc 及 Jadded1 1蛋白呈高水平表达。正常情况下这些蛋白高表达通常会诱导细胞发生凋亡，而FBW7缺陷的T-ALL细胞却未表现出这一效应。Wenyi Wei与同事在进一步的研究中得到了与Wertz一样的研究结论：在缺失FBW7蛋白的情况下，细胞无法降解MCL1，从而使得细胞逃逸了凋亡。此外，Wenyi Wei和他的同事还证实了FBW7与肿瘤药物耐受之间的联系。在实验中，Wenyi Wei等尝试用一种实验性药物处理FBW7缺陷的T-ALL细胞，发现细胞对药物不敏感。而当他们利用索拉菲尼降低细胞中的MCL1水平后，发现这些细胞对实验性药物恢复了敏感性。弗莱德.哈钦森癌症研究中心的肿瘤学家和分子生物学家Bruce Clurman对这一研究结果发表评论称这是令人感到兴奋的发现，但他同时强调目前取得的还仅是初步结果。他指出FWB7对肿瘤细胞中的多种蛋白均具有破坏效应，而不仅仅是MCL1。“当你扰乱FBW7时，很难确定下游的哪些靶分子在肿瘤发生中发挥了怎样的效应。这两项研究重要集中研究了FBW7对MCL1的调控作用，这有可能离完整的故事还有一定的距离，”Bruce Clurman说。阿尔伯特爱因斯坦医学院的肿瘤生物学家Hayley McDaid建议进一步研究紫杉醇类药物治疗癌症患者的档案。她认为如果Wertz等的结论确实成立的话，研究人员应致力探究FBW7与紫杉醇反应之间的相互关系。“对这些样本做一些序列分析是非常有必要的，”Hayley McDaid说道 

将FBW7基因的mRNA作为癌症患者化疗用药前的早期筛查有非常重要的临床诊断意义。FBW7的mRNA在肺癌和乳腺癌化疗耐药病人中低表达或零表达，能指导临床医师对化疗药物筛选有重要作用。

目前对FBW7基因的研究都采用高通量基因芯片、Northern Blot、蛋白谱分析技术，而这些方法多用于科研方面，不适应临床应用，而检测mRNA比基因分析更科学（DNA分析大部分在易感性的表象上，mRNA是功能性体现），比蛋白分析更可靠（mRNA与蛋白转录有时候不同步）。根据现有的文献资料FBW7基因mRNA水平的检测技术及试剂盒未见报道。 

本发明人在针对创新性发明的要求，采用了用原位杂交技术进行检测，结果表明肺癌和乳腺癌耐药病人FBW7基因低表达或零表达，表明FBW7基因是癌症耐药相关基因。 

原位杂交技术（in situ hybridization）是将分子生物学与细胞化学技术结合起来，以标记的核酸分子为探针，在组织细胞原位检测特异性核酸分子的技术。其原理是使含有特异序列、经过标记的核酸单链（即探针），在适宜条件下与组织细胞中的互补核酸单链即靶核酸发生杂交，再以放射自显影或免疫细胞化学方法对标记探针进行探测，从而在细胞原位显示特异的DNA或RNA分子。 

原位杂交的探针是已知序列的分子或序列未知但分子已知的核酸分子（虽不明确该分子全部序列，但已知其针对何靶分子），探针的种类按核酸性质不同又可分为DNA探针、cDNA探针、cRNA探针和合成寡核苷酸探针。为了便于示踪，探针必须用一定的手段加以标记，以利于以后的检测。常用的标记物包括放射性核素和非放射性标记物两大类。常用的同位素标记物有³H、³⁵S、¹²⁵I和³²P。同位素标记物虽然有灵敏性高、背底较为清晰等优点，但是由于放射性同位素对人和环境均会造成伤害，近来有被非同位素取代的趋势。非同位素标记物中目前最常用的有生物素、地高辛和荧光素三种。检测这些标记物的方法都是极其灵敏的。 

根据所用探针及所要检测核酸的不同又可分为DNA-DNA,RNA-DNA, RNA-RNA杂交。但不论哪一种形式的杂交，都必须经过五大过程，即组织细胞的固定，预杂交、杂交、冲洗和显示。本发明采用RNA-RNA的杂交方式，合成的探针（mRNA）和检测的靶mRNA是采用碱基互补（杂交互补）的原理，同时经过长时间研究和观察，启动和中止处得残基对检测的结果没有影响（因为，发明人采用的mRNA序列都超过600bp以上）。 

发明内容

本发明的目的首先是提供一种原位杂交检测试剂盒，其包含原位杂交检测探针和标记物。 

其次，本发明还要提供上述试剂盒用于与癌症患者化疗耐药相关基因的原位杂交检测方法。 

为实现本发明的目的，本发明的技术方案如下： 

本发明首先提供一种原位杂交检测试剂盒，其包括杂交探针和标记物，其中，所述的杂交探针为SEQ ID NO.1所示序列，是FBW7基因中得一段序列，从200到1000bp取得，FBW7基因序列号：AY033553，为SEQ ID NO.2所示序列，基因的核苷酸序列长度是2063bp，CDS是97……1980bp。（在探针标记过程中如果基因序列太长，超过1000bp以上，我们会用CDS的序列来设计探针，如果CDS的序列也超过1000bp以上，会采用基因的中间一段碱基序列来合成探针，碱基序列不少于500bp，探针合成后要做序列检测，并对功能进行临床意义的分析）。

本发明试剂盒的一个优选方案是，所述的标记物选自放射性物质、化学发光或显色物质、生物素、金属鲎、荧光素、酶及纳米材料。 

本发明试剂盒的一个优选方案是还包括杂交液。 

本发明试剂盒的一个优选方案是还包括增强剂。 

本发明试剂盒的一个优选方案是还包括显色剂。 

本发明的癌变前期FBW7基因筛查试剂盒应用价值在于，能在mRNA水平，对癌症患者化疗前耐药基因检测，进一步配合和指导临床治疗。 

本发明还提供一种FBW7基因原位杂交的检测方法，包括以下步骤： 

（1）在上面所述的杂交探针与靶序列可形成稳定杂交复合体的条件下，将底物中待测RNA与杂交探针接触，形成杂交复合体；和

（2）检测所述杂交复合体。

本发明所述的检测方法，其中优选地是，所述的可形成稳定杂交复合体的条件为：核酸杂交的温度为42℃；核酸杂交的时间为16－24小时。 

本发明所述的检测方法，其中优选地是，所述的底物选用人的血液白细胞标本或其它器官组织细胞标本。更优选地是，所述的血液标本或其它器官组织细胞标本来自癌症患者。 

本发明所述的检测方法，其中优选地是，所述的临床各类癌症患者化疗前检测标本。 

本发明的检测试剂盒是采用核酸杂交技术和组化免疫方法相结合，以FBW7基因的一级转录功能产物mRNA为检测对象，合成探针是FBW7基因的RNA序列，检测的底物是人体血液标本白细胞或组织细胞的RNA的表达量。原位杂交技术的显示方法能提供FBW7基因的半定量或定量表达程度判定。根据杂交后免疫组化显色判定以上基因的表达量，肺癌和乳腺癌病人FBW7基因低表达，即小量显色或不显色，FBW7基因在癌症耐药病人表达量都低，大部分耐药病人零表达。在正常人群是高表达，大量细胞染色。 

本发明的诊断试剂盒的组份是由杂交探针，杂交液，显色剂，增效剂等组成。本试剂盒的核酸杂交原理是分子生物学业内人士均熟知，具体操作步骤是标本处理、预杂交、杂交、免疫组化染色、镜下进行定量分析、结果报告，其中杂交的具体步骤包括： 

1).将待测标本放入反应槽中；

2).仪器自动弃去液体，自动加消化液； 

3).仪器自动弃去液体，自动后固定；

4).仪器自动弃去液体，自动预杂交（42℃）；

5).仪器自动弃去液体，自动清洗；

6).仪器自动弃去液体，自动杂交（42℃）；

7).仪器自动弃去液体，自动清洗；

8).仪器自动弃去液体，自动与DIG抗体培养（室温）；

9).仪器自动弃去液体，自动清洗，显色；

10).取出封片镜检。

本发明的一个优选实施例的方案是：以FBW7基因为目的基因合成的核酸探针用地高辛标记（地高辛标记的cDNA、RNA和寡核苷酸探针，不但探针的具有生物素标记优点，还克服了生物素标记的探针在原位杂交过程中受组织内源性生物素干忧等缺点），将该杂交探针与人体血液白细胞的待测RNA核酸进行杂交，再用免疫组化的方法显色，在光镜下观察mRNA的存在和定位,根据染色的细胞数，判断目的基因的表达量。 

本发明方法是目前常用的核酸原位杂交技术，该方法通过检测底物细胞中的FBW7基因表达量，用来观察癌症患者耐药基因的mRNA变化量，预测癌症患者耐药情况。因为FBW7基因在正常人中高表达，如果癌症患者FBW7基因表达量低，说明患者有耐药，从而获得癌症患者耐药的信息。一个试剂盒可以多人份使用或一人份使用。 

本发明具有如下有益效果： 

本发明的临床意义是化疗前期检测耐药基因，能指导临床医师化疗用药。

此外，本发明提供的试剂盒具有灵敏度高、特异性强的特点，同时，本发明的检测方法操作方便、简单，能在区级以上医院普遍使用和推广。 

附图说明

图1是本发明FBW7基因原位杂交技术流程图。 

图2是本发明实施例中肺癌病人FBW7表达降低图片。 

图3是本发明实施例中乳腺癌病人FBW7表达降低图片。 

图4是本发明实施例中正常人FBW7表达图片。 

具体实施方式

下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应该理解，下面的实施例用于说明而非限定本发明内容，任何形式上的改变或变通将落入本发明的保护范围。 

实施例1 

按照常规方法制备本实施例的原位杂交试剂盒，该试剂盒包括以FBW7基因为检测目的基因设计的杂交探针、标记物、说明书，其中：

本实施例的探针标记物选用地高辛。

试剂盒杂交液组成： 

消化液	100μL/管	1管/盒	无色透明液体
				保护液	100μL/管	1管/盒	无色透明液体
预杂交液	1300μL/管	2管/盒	无色透明液体
				正义杂交液	10μL/管	1管/盒	无色透明液体
反义杂交液	10μL/管	1管/盒	无色透明液体
				封闭液	1000μL/管	1管/盒	无色透明液体
碱性磷酸酶抗体	1μL/管	1管/盒	无色透明液体
				显色剂A	175μL/管	1管/盒	黄色液体
显色剂B	320μL/管	1管/盒	无色透明液体
				缓冲液Ⅰ	90mL/瓶	1瓶/盒	浅黄色或无色透明液体
缓冲液Ⅱ	80mL/瓶	1瓶/盒	浅黄色或无色透明液体
				缓冲液Ⅲ	20mL/瓶	3瓶/盒	浅黄色或无色透明液体
缓冲液Ⅳ	90mL/瓶	1瓶/盒	浅黄色或无色透明液体
				固定液	90mL/瓶	1瓶/盒	无色透明液体
阳性对照标本	6片/盒

配制试剂使用浓度

1).将10×缓冲液Ⅰ用三蒸水按1:10稀释成1×缓冲液Ⅰ；

2).将20×缓冲液Ⅱ用三蒸水按1:10稀释成2×缓冲液Ⅱ；

按1:100稀释成0.2×缓冲液Ⅱ; 按1:200稀释成0.1×缓冲液Ⅱ；

3).将10×缓冲液Ⅲ用三蒸水按1:10稀释成1×缓冲液Ⅲ；

4).10×缓冲液Ⅳ用三蒸水按1:10稀释成×缓冲液 Ⅳ (取1#，2#，3#各10mL, 加水至100mL既可)。

实施例2 

应用核酸原位杂交检测方法对各组血液标本FBW7基因表达量的实施过程：

1).取待测标本两张；

2).在玻璃缸里加入消化液(消化液100μL加1×缓冲液Ⅰ99.9ml，即为使用浓度)50 ml，37℃水浴预热10min，放进16张玻片，37℃处理12 min, 再用1×缓冲液Ⅰ洗5min；

3).用0.2%的保护液(保护液1ml加1×缓冲液 

, 99ml即为使用浓度)洗10min, 三蒸水洗5min（以上过程都在玻璃缸进行），取出玻片，让其自然干燥；

4).将玻片放入保湿盒内, 加预杂交液25μL/片（加在有细胞的地方），盖上盖玻片，盖紧保湿盒，放在42℃恒温水浴箱中3h以上；

5).取出玻片,弃去盖玻片，将玻片放入玻璃缸内,用70%、90%、95%的乙醇各洗2min，取出，自然干燥；

6).将玻片放入保湿盒内，一张加正义杂交液25μL/片，另一张加反义杂交液25μL/片，盖上盖玻片, 盖紧保湿盒，放在42℃恒温水浴箱中16-24h；

7).取出玻片,弃去盖玻片, 将玻片放入玻璃缸内：

  在42℃恒温水浴箱中用2×缓冲液Ⅱ洗两次,每次15min；

  在42℃恒温水浴箱中用0.2×缓冲液Ⅱ洗一次,每次15min； 

  在42℃恒温水浴箱中用0.1×缓冲液Ⅱ洗两次,每次15min；

8).用1×缓冲液Ⅲ洗30s,取出玻片,自然干燥；

9).将玻片放入保湿盒内,加0.5%封闭液（1ml封闭液加5ml 1×缓冲液Ⅲ）100μL/片, 盖紧保湿盒，在室温下作用30min。（此步骤不需加盖玻片）；

10).取出玻片,用1×缓冲液Ⅲ洗30s,自然干燥；

11).将玻片放入保湿盒内, 加X-AP抗体(取一管碱性磷酸酶抗体，向其中加入1.8ml 1×缓冲液Ⅲ)100μL/片,盖紧保湿盒在室温下作用30min，时间不能过长，否则会产生假阳性（此步骤不需加盖玻片）；

12).取出玻片，用1×缓冲液Ⅲ洗3次, 每次15min；

13).用1×缓冲液Ⅳ洗2min，加显色剂(显色剂A73.3μL，显色剂B157.5μL加到30mL 1×缓冲液Ⅳ中,混匀)，室温避光16h到18h以上；

14).用三蒸水洗5min，自然干燥，（用甘油加10%的1×缓冲液Ⅰ混匀）封片镜检。

本发明的核酸原位杂交检测方法将目的基因用地高辛标记，成为RNA核酸探针，将探针与人体白细胞的待测RNA核酸进行杂交，再用免疫组化的方法显色，因此在光镜下观察mRNA的存在和定位,根据染色的细胞数，判断目的基因的表达量。 

肺癌病人20名，乳腺癌20名，正常对照组20名。抽所有待检人的外周血3-5毫升（分离白细胞）做原位杂交。结果表示，所有癌症患者FBW7基因表达量低，细胞多数不染色，具体结果见图2、图3、图4。 

肺癌人数	表达量%	乳腺癌人数	表达量%	正常人数	表达量%
						1	0	1	0	1	72
2	0	2	2	2	76
						3	0	3	0	3	79
4	0	4	0	4	86
						5	2	5	0	5	78
6	0	6	2	6	86
						7	0	7	0	7	60
8	0	8	0	8	68
						9	2	9	0	9	82
10	0	10	0	10	84
						11	0	11	2	11	72
12	3	12	0	12	80
						13	0	13	0	13	76
14	0	14	2	14	80
						15	2	15	2	15	79
16	0	16	0	16	76
						17	0	17	0	17	74
18	0	18	2	18	78
						19	0	19	0	19	82
20	2	20	0	20	87

。 

序列表

 

SEQ ID NO：1（探针序列）

200 catgtccaca ttagaatctg tgacatacct acctgaaaaa

      241 ggtttatatt gtcagagact gccaagcagc cggacacacg ggggcacaga atcactgaag

      301 gggaaaaata cagaaaatat gggtttctac ggcacattaa aaatgatttt ttacaaaatg

      361 aaaagaaagt tggaccatgg ttctgaggtc cgctcttttt ctttgggaaa gaaaccatgc

      421 aaagtctcag aatatacaag taccactggg cttgtaccat gttcagcaac accaacaact

      481 tttggggacc tcagagcagc caatggccaa gggcaacaac gacgccgaat tacatctgtc

      541 cagccaccta caggcctcca ggaatggcta aaaatgtttc agagctggag tggaccagag

      601 aaattgcttg ctttagatga actcattgat agttgtgaac caacacaagt aaaacatatg

      661 atgcaagtga tagaacccca gtttcaacga gacttcattt cattgctccc taaagagttg

      721 gcactctatg tgctttcatt cctggaaccc aaagacctgc tacaagcagc tcagacatgt

      781 cgctactgga gaattttggc tgaagacaac cttctctgga gagagaaatg caaagaagag

      841 gggattgatg aaccattgca catcaagaga agaaaagtaa taaaaccagg tttcatacac

      901 agtccatgga aaagtgcata catcagacag cacagaattg atactaactg gaggcgagga

  961 gaactcaaat ctcctaaggt gctgaaagga catgatgatc atgtgatcac

 

SEQ ID NO：2  FBW7基因序列号：AY033553  基因序列如下：

1 agtcaaggct ttgacagggc atagtctcct ccaataatct tctccgttct ctctcattat

       61 tccctcgagt tcttctcagt caagctgcat gtatgtatgt gtgtcccgag aagcggtttg

      121 atactgagct gcatttgcct ttactgtgga gttttgttgc cggttctgct ccctaatctt

      181 ccttttctga cgtgcctgag catgtccaca ttagaatctg tgacatacct acctgaaaaa

      241 ggtttatatt gtcagagact gccaagcagc cggacacacg ggggcacaga atcactgaag

      301 gggaaaaata cagaaaatat gggtttctac ggcacattaa aaatgatttt ttacaaaatg

      361 aaaagaaagt tggaccatgg ttctgaggtc cgctcttttt ctttgggaaa gaaaccatgc

      421 aaagtctcag aatatacaag taccactggg cttgtaccat gttcagcaac accaacaact

      481 tttggggacc tcagagcagc caatggccaa gggcaacaac gacgccgaat tacatctgtc

      541 cagccaccta caggcctcca ggaatggcta aaaatgtttc agagctggag tggaccagag

      601 aaattgcttg ctttagatga actcattgat agttgtgaac caacacaagt aaaacatatg

      661 atgcaagtga tagaacccca gtttcaacga gacttcattt cattgctccc taaagagttg

      721 gcactctatg tgctttcatt cctggaaccc aaagacctgc tacaagcagc tcagacatgt

      781 cgctactgga gaattttggc tgaagacaac cttctctgga gagagaaatg caaagaagag

      841 gggattgatg aaccattgca catcaagaga agaaaagtaa taaaaccagg tttcatacac

      901 agtccatgga aaagtgcata catcagacag cacagaattg atactaactg gaggcgagga

      961 gaactcaaat ctcctaaggt gctgaaagga catgatgatc atgtgatcac atgcttacag

     1021 ttttgtggta accgaatagt tagtggttct gatgacaaca ctttaaaagt ttggtcagca

     1081 gtcacaggca aatgtctgag aacattagtg ggacatacag gtggagtatg gtcatcacaa

     1141 atgagagaca acatcatcat tagtggatct acagatcgga cactcaaagt gtggaatgca

     1201 gagactggag aatgtataca caccttatat gggcatactt ccactgtgcg ttgtatgcat

     1261 cttcatgaaa aaagagttgt tagcggttct cgagatgcca ctcttagggt ttgggatatt

     1321 gagacaggcc agtgtttaca tgttttgatg ggtcatgttg cagcagtccg ctgtgttcaa

     1381 tatgatggca ggagggttgt tagtggagca tatgatttta tggtaaaggt gtgggatcca

     1441 gagactgaaa cctgtctaca cacgttgcag gggcatacta atagagtcta ttcattacag

     1501 tttgatggta tccatgtggt gagtggatct cttgatacat caatccgtgt ttgggatgtg

     1561 gagacaggga attgcattca cacgttaaca gggcaccagt cgttaacaag tggaatggaa

     1621 ctcaaagaca atattcttgt ctctgggaat gcagattcta cagttaaaat ctgggatatc

     1681 aaaacaggac agtgtttaca aacattgcaa ggtcccaaca agcatcagag tgctgtgacc

     1741 tgtttacagt tcaacaagaa ctttgtaatt accagctcag atgatggaac tgtaaaacta

     1801 tgggacttga aaacgggtga atttattcga aacctagtca cattggagag tggggggagt

     1861 gggggagttg tgtggcggat cagagcctca aacacaaagc tggtgtgtgc agttgggagt

     1921 cggaatggga ctgaagaaac caagctgctg gtgctggact ttgatgtgga catgaagtga

     1981 agagcagaaa agatgaattt gtccaattgt gtagacgata tactccctgc ccttccccct

     2041 gcaaaaagaa aaaaaaaaaa aaa

 

Claims (10)

1.一种原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针和标记物，其特征在于，所述的杂交探针为序列表SEQ ID NO.1所示的序列。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的标记物选自放射性物质、化学发光或显色物质、生物素、金属鲎、荧光素、酶及纳米材料。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括杂交液。

4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括增效剂。

5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括显色剂。

6.一种FBW7基因原位杂交检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

（1）在权利要求1所述的杂交探针与靶序列可形成稳定杂交复合体的条件下，将底物中待测RNA与杂交探针接触，形成杂交复合体；和

（2）检测所述杂交复合体。

7.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述的可形成稳定杂交复合体的条件为：核酸杂交的温度为42℃；核酸杂交的时间为16－24小时。

8.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述的底物选用人的血液白细胞标本。

9.如权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述的血液白细胞标本选自癌症患者。

10.FBW7基因在制备检测各种癌症病变原位杂交试剂盒中的应用。

Images