CN102604953A - 家蚕表皮蛋白BmCP274启动子及其重组表达载体和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一个家蚕表皮蛋白BmCP274启动子，由SEQ ID No.1所示核苷酸序列组成；该启动子可以驱动外源蛋白在家蚕前部丝腺特异表达，可作为家蚕前部丝腺特异性启动子应用；本发明还公开了含有该启动子的重组表达载体，为下一步研究通过调控家蚕前部丝腺的离子通路蛋白表达来影响家蚕吐丝行为和改良丝纤维性能提供了有力的工具。

Description

家蚕表皮蛋白BmCP274启动子及其重组表达载体和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种组织特异性启动子及其表达载体和应用。

背景技术

家蚕在天然条件下产出的丝纤维是一种在纺织工业、生物医学等领域具有广泛应用的纤维材料。蜘蛛与家蚕具有相似的纺丝体，但其产出的丝纤维却较蚕丝具有更强的硬度和更出色的韧性。丝纤维在生物体内的形成是一个极其复杂的过程，至今都没有获得完全阐明。现有的合成纤维都是人工模拟昆虫天然产丝的过程，在体外进行合成，但是其力学性能还远不能和蜘蛛丝纤维进行对比。如果能使家蚕高效、特异地产出大量优质的类蜘蛛丝纤维，对于优质纤维材料的获取具有非常重要的意义。家蚕前部丝腺是向列型液晶形成的场所，离子强度对丝纤维的形成具有重要作用。利用家蚕前部丝腺特异启动子过量表达外源蛋白例如家蚕前部丝腺的某些离子通路蛋白，可能使丝纤维性质发生改变，获得更加优良的蚕丝纤维。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种家蚕表皮蛋白启动子及其重组表达载体和应用，该启动子可以使外源蛋白在家蚕前部丝腺特异性表达，利用该启动子在家蚕前部丝腺调控某些离子通路蛋白的表达，可能使丝纤维性质发生改变，获得更加优良的蚕丝纤维。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、家蚕表皮蛋白BmCP274启动子，由SEQ ID No.1所示核苷酸序列组成。

2、含有所述家蚕表皮蛋白BmCP274启动子的重组表达载体。

进一步，所述重组表达载体为pBac[BmCP274-表达基因-SV40, 3xP3EGFP]，是将由家蚕表皮蛋白BmCP274启动子、表达基因序列和SV40终止信号组成的表达框[BmCP274-表达基因-SV40]插入穿梭载体pSLfa1180fa的多克隆位点中，获得重组载体pSL[BmCP274-表达基因-SV40]，再用Asc I从重组载体pSL[BmCP274-表达基因-SV40]中切下[BmCP274-表达基因-SV40]片段，与同样经Asc I酶切的载体pBac[3xP3-EGFPafm]连接，即得。

进一步，所述表达基因为红色荧光蛋白DeRed基因。

3、所述家蚕表皮蛋白BmCP274启动子作为家蚕前部丝腺特异性启动子的应用。

本发明的有益效果在于：本发明利用蛋白质组学手段鉴定到一个在家蚕前部丝腺特异并且高量表达的表皮蛋白BmCP274，对其启动子序列进行了克隆，并以DsRed基因为代表基因构建了由BmCP274启动子调控的DsRed表达载体，将该表达载体显微注射入家蚕体内获得了转基因家蚕阳性个体，对该转基因家蚕阳性个体的研究发现，BmCP274启动子驱动DsRed在家蚕前部丝腺特异表达，因此，BmCP274启动子可以作为家蚕前部丝腺特异性启动子应用。利用BmCP274启动子在家蚕前部丝腺调控某些离子通路蛋白的表达，可能使丝纤维性质发生改变，获得更加优良的蚕丝纤维，从而本发明为下一步研究通过调控家蚕前部丝腺的离子通路蛋白表达来影响家蚕吐丝行为和改良丝纤维性能打下了基础，而本发明提供的含有BmCP274启动子的重组表达载体为上述研究提供了有力的工具。

附图说明

图1为BmCP274启动子转基因家蚕不同时期在白光和荧光照射下的照片，其中a和b分别为白光和荧光照射下的卵，c和d分别为白光和荧光照射下的成虫，e和f分别为白光和荧光照射下的家蚕茧壳。

图2为BmCP274启动子转基因家蚕的丝腺解剖图，其中a和b分别为白光和荧光照射下的转基因家蚕丝腺，c和d分别为白光和荧光照射下的非转基因家蚕大造丝腺。

图3为BmCP274启动子转基因家蚕的Southern blot分析，其中1为Tran 2K plus DNA Marker，2为经Bgl Ⅱ酶切的非转基因家蚕大造蚕蛾DNA，3为经Bgl Ⅱ酶切的转基因家蚕G1代蚕蛾DNA，4为增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因（阳性对照）。

图4为BmCP274启动子转基因家蚕在前部丝腺特异表达DsRed的Western blot分析，其中1为转基因家蚕前部丝腺蛋白，2为非转基因家蚕大造前部丝腺蛋白。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南（第三版，J.萨姆布鲁克等著）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例中使用的家蚕品种为大造，由中国西南大学家蚕基因资源库提供。

一、家蚕表皮蛋白BmCP274启动子的克隆

根据家蚕基因组数据库中序列nscaf1681，设计1对上下游引物。设计的引物委托生工生物工程（上海）有限公司进行合成。引物序列如下： 

274-F：5'-ttgtcgacgtagcctttacataatatgccg-3'（SEQ ID No.2，下划线部分为Sal I酶切位点）；

274-R：5'-gaagatctctttcctggtgatcgatgg-3'（SEQ ID No.3，下划线部分为Bgl II酶切位点）。

以五龄第三天的大造基因组DNA为模板，采用引物274-F和274-R扩增BmCP274启动子片段（SEQ ID No.1）。PCR反应条件为：94℃预变性4分钟；然后94℃变性40秒，51℃退火40秒，72℃延伸1.5分钟，共24个循环；最后72℃延伸10分钟。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，切胶回收纯化目的片段，再克隆入载体pMD19-T Simple（TaKaRa），获得重组载体pMD19-BmCP274。

二、BmCP274启动子调控的DsRed表达载体的构建

将重组载体pMD19-BmCP274用Sal I和Bgl II双酶切，回收BmCP274启动子片段，再与同样经Sal I和Bgl II双酶切的载体pSL[MCS-DsRed-SV40]进行连接，获得重组载体pSL[BmCP274-DsRed-SV40]。所述载体pSL[MCS-DsRed-SV40]系参照文献方法（Horn and Wimmer, 2000），利用pSLfa1180fa克隆穿梭载体，采用两步克隆法构建而得，具体构建方法见中国专利申请20110423280.3。

将重组载体pSL[BmCP274-DsRed-SV40]用Asc I酶切，回收BmCP274-DsRed-SV40片段，再与同样经Asc I酶切的载体pBac[3xP3-EGFPafm]进行连接，获得重组载体pBac[BmCP274-DsRed-SV40, 3xP3EGFP]。所述载体pBac[3xP3-EGFPafm]系参照文献方法（Horn and Wimmer, 2000）构建而得。

三、BmCP274启动子调控的DsRed表达载体转基因家蚕的获得

将重组载体pBac[BmCP274-DsRed-SV40, 3xP3EGFP]与编码piggyBac转座酶的转基因辅助载体pHA3PIG等摩尔比混合，通过显微注射入已解除滞育的大造早期胚胎（产卵后2~5小时，G0代）中，注射后的蚕卵用无毒胶水封口，25℃催青至孵化，孵化的幼虫采用人工饲料饲育，至成虫后进行自交制种，获得的卵期第7天的蚕卵（G1代）在宏观体视荧光显微镜（Olympus MVX10）下利用波长为460~490nm的激发光检测绿色荧光，筛选出在眼睛或神经特异激发绿色荧光的转基因阳性个体（图1 a-d），即获得BmCP274启动子转基因家蚕。

随机选取BmCP274启动子转基因家蚕G1代蚕蛾，提取基因组DNA进行Southern blot检测，结果如图3所示，EGFP的插入拷贝数为1个，DsRed与EGFP处在同一个转座子区域中，其插入拷贝数也为1个，表明携带DsRed的piggyBac转座元件在BmCP274启动子转基因家蚕的基因组中发生了1次转座事件。

四、BmCP274启动子调控的DsRed表达载体在转基因家蚕前部丝腺的特异表达

1、荧光观察DsRed在转基因家蚕中的时期与组织特异性

随机选取BmCP274启动子转基因家蚕，于胚胎发育后期开始进行连续的荧光检测，结果发现，在蚁蚕时就可以观察到前部丝腺发出红色荧光，之后随着转基因家蚕的发育，红色荧光越来越强。

将五龄第一天的BmCP274启动子转基因家蚕进行解剖后发现，红色荧光是从前部丝腺发出且无性别差异，而在其它组织如中肠、生殖腺等中没有观察到红色荧光，在转基因家蚕的茧壳中也没有观察到红色荧光（图1 e, f）。将BmCP274启动子转基因家蚕与非转基因家蚕的丝腺进行解剖后发现，只有在BmCP274启动子转基因家蚕的前部丝腺中才能检测到红色荧光（图2）。

2、RT-PCR检测DsRed基因在转基因家蚕中的时期与组织特异性

分别取自五龄起蚕时期至蛹期第二天的转基因家蚕个体，以及五龄第三天转基因家蚕的各组织样品，在液氮中快速研磨并提取总RNA，反转录成cDNA，采用DsRed基因特异引物［DsRed-F：5'-atggtgcgctcctccaagaacg-3'（SEQ ID No.4）；DsRed-R：5'-ctacaggaacaggtggtggc-gg-3'（SEQ ID No.5）］进行RT-PCR检测，以Actin3为对照。PCR反应条件为：94℃预变性4分钟；然后94℃变性15秒，65℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共24个循环；最后72℃延伸10分钟。PCR产物采用1%琼脂糖凝胶电泳检测。结果显示，在时期特异性方面，DsRed基因自五龄起蚕时期至上蔟12小时都有高量表达，而自上蔟12小时后表达量急剧下降；在组织特异性方面，DsRed基因只在家蚕前部丝腺表达。

3、Western blot检测DsRed在转基因家蚕前部丝腺中的表达

分别取五龄第三天的BmCP274启动子转基因家蚕和非转基因家蚕的前部丝腺，在液氮中快速研磨溶于8mol/L尿素缓冲液中，4℃放置1小时，离心取上清，测定总蛋白浓度，再与5×加样缓冲液混合，100℃变性10分钟，进行10% SDS-聚丙稀酰胺胶凝胶电泳，电泳完毕后，以Anti-DsRed抗体为一抗、Tubulin抗体为内参照抗体进行Western blot分析。结果如图4所示，DsRed在BmCP274启动子转基因家蚕的前部丝腺中表达，而在非转基因家蚕前部丝腺中没有表达。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

<110>  西南大学

<120>  家蚕表皮蛋白BmCP274启动子及其表达载体和应用

 

<160>  5

 

<210>  1

<211>  1564

<212>  DNA

<213>  家蚕（Bombyx mori Linnaeus）

<220> 

<223>  家蚕表皮蛋白BmCP274启动子序列

<400>  1

ctaatttatt ttttttatat ttcccaaagt tttggtagcc tttacataat atgccggtcc   60

ggcgtctgtg ggacggcggg atggatgtca tatgctctac gtcaaccctg tcccgccgtc  120

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acggtgcctg ttttaaatct tcattaacat tttaattgtc ctcttctatt catctagtct 1440

gcgacattga tggtttgttt cggtattacc gaacagcata ttttggcaca acaaagcgcc 1500

ttttataagg cgtgccacat tctgaaaaat atcagttgtc ttccatcgat caccaggaaa 1560

gatg 1564

 

<210>  2

<211>  30

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220> 

<223>  扩增引物274-F

<400>  2

ttgtcgacgt agcctttaca taatatgccg   30

 

<210>  3

<211>  27

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220> 

<223>  扩增引物274-R

<400>  3

gaagatctct ttcctggtga tcgatgg   27

 

<210>  4

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220> 

<223>  扩增引物DsRed-F

<400>  4

atggtgcgct cctccaagaa cg   22

 

<210>  5

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220> 

<223>  扩增引物DsRed-R

<400>  5

ctacaggaac aggtggtggc gg   22

 

Claims (5)

1.家蚕表皮蛋白BmCP274启动子，其特征在于，由SEQ ID No.1所示核苷酸序列组成。

2.含有权利要求1所述家蚕表皮蛋白BmCP274启动子的重组表达载体。

3.根据权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体为pBac[BmCP274-表达基因-SV40, 3xP3EGFP]，是将由家蚕表皮蛋白BmCP274启动子、表达基因序列和SV40终止信号组成的表达框[BmCP274-表达基因-SV40]插入穿梭载体pSLfa1180fa的多克隆位点中，获得重组载体pSL[BmCP274-表达基因-SV40]，再用Asc I从重组载体pSL[BmCP274-表达基因-SV40]中切下[BmCP274-表达基因-SV40]片段，与同样经Asc I酶切的载体pBac[3xP3-EGFPafm]连接，即得。

4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述表达基因为红色荧光蛋白DsRed基因。

5.权利要求1所述的家蚕表皮蛋白BmCP274启动子作为家蚕前部丝腺特异性启动子的应用。

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