CN102586327B - 一步法构建携带外源基因的d24纤维蛋白修饰的条件复制型腺病毒载体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种一步法构建携带外源基因的D24纤维蛋白修饰的条件复制型腺病毒载体及其应用，在Ad5 D24条件复制型腺病毒载体基础上，经过以下两方面的改造以提高这类载体插入外源基因的构建效率：(1)突变腺病毒基因组上的BamHI位点；(2)通过同源重组的方法在fiber和E4之间引入BamHI和SfuI，从而可以通过酶切连接的方法一步将外源基因引入腺病毒基因组中。得到的携带外源基因的D24纤维蛋白修饰的条件复制型腺病毒载体经药效试验，证明携带外源基因的D24纤维蛋白修饰的条件复制型腺病毒载体可提高对肿瘤的治疗效果。
Description
技术领域
本发明属于生物基因技术领域，涉及基因的构建和应用，具体涉及到一步法构建携带外源基因的D24纤维蛋白修饰的条件复制型腺病毒载体及其应用。
背景技术
目前已经证明，肿瘤形成的分子和细胞病变过程是由基因突变所致，因而从理论上讲，针对肿瘤病理的不同阶段及不同特性设计基因治疗是可行的。目前，基因治疗主要应用病毒载体和非病毒载体。由于非病毒载体转染效率较低，故目前大多数的基因治疗使用病毒载体介导。
腺病毒载体用于基因治疗领域具有多方面的优势，如：感染细胞类型广，感染率高；理化性质稳定，容易制备高滴度病毒；不整合入细胞基因组，遗传毒性较低；安全性好等。之前的研究结果显示，通过腺病毒携带治疗基因将大幅度提升腺病毒对于肿瘤细胞的杀伤能力。然而，构建携带外源基因的溶瘤腺病毒载体的过程非常复杂，并且需要耗费大量的时间。因此，有必要构建一种通用型的腺病毒载体骨架，使其只需通过一步酶切连接就可实现将外源基因插入到腺病毒骨架载体中。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种一步法构建的携带外源基因的D24纤维蛋白修饰的条件复制型腺病毒载体，在Ad5 D24条件复制型腺病毒载体基础上，经过以下两方面的改造以提高这类载体插入外源基因的构建效率：(1)突变腺病毒基因组上的BamHI位点；(2)通过同源重组的方法在fiber和E4之间引入BamHI和SfuI，从而可以通过酶切连接的方法一步将外源基因引入腺病毒基因组中。得到的携带外源基因的D24纤维蛋白修饰的条件复制型腺病毒载体，可用于制备治疗肿瘤药物中的应用。
为了实现上述任务，本发明采取如下的技术方案：
一种一步法构建的携带外源基因的D24纤维蛋白修饰的条件复制型腺病毒载体，其特征在于，重组腺病毒载体Ad5 E1A中的24bp碱基缺失，该类型重组腺病毒载体可以在pRBnull/mutant的肿瘤细胞中特异性复制；采用同源重组的方法将Ad5腺病毒基因组位于Hexon上第21468bp～21573bp的BamHI进行突变；在Ad5腺病毒基因组第31042bp处插入的修饰纤 维蛋白为5/3，5/6，5/7，5/11，5/35序列中的任意一个；在Ad5腺病毒基因组fiber和E4之间即在Ad5腺病毒基因组第32788bp～32913bp处引入两个单一的酶切位点BamHI、SfuI，在Ad5腺病毒基因组引入的两个单一酶切位点之间插入一个用于筛选的表达元件；在Ad5腺病毒基因组引入的两个单一酶切位点之间插入双向表达框，该双向表达框携带一个报告基因和一个治疗基因，得到携带外源基因的D24纤维蛋白修饰的条件复制型腺病毒载体。
上述24bp碱基缺失的位置在腺病毒基因组的第922bp～947bp，碱基缺失序列为cttacctgccacgaggctggcttt。
上述筛选的表达元件是用于蓝白斑筛选的β-半乳糖苷酶基因表达元件，在细菌中表达的用于筛选的荧光蛋白表达元件、氨苄青霉素表达元件、卡那霉素表达元件、氯霉素表达元件中的任意一种。
上述的报告基因是绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、荧光素酶、β-半乳糖苷酶基因中的任意一种。
上述的治疗基因是TRAIL，IL-24，IL-12，IFN，p53，arresten，endostatin等中的任意一种。
上述一步法构建的携带外源基因的D24纤维蛋白修饰的条件复制型腺病毒载体，具体按下述步骤构建：
(1)用酶切连接的方法构建Ad5 E1A分子中24个碱基缺失的穿梭载体：
以Ad5基因组质粒为模板，经过重叠聚合酶链式反应获得含有Ad5 E1A分子中24bp碱基缺失的基因片段。将聚合酶链式反应片段与pGEMT-T easy载体连接，将连接产物转化DH5α细胞，经碱性裂解法提取质粒DNA，通过酶切及测序鉴定阳性克隆。将所获得阳性克隆命名为pGEMT/Ad5-D24F。
将Ad5-D24F片段从pGEMT/Ad5-D24F上经PacI和SpeI双酶切下来，与用PacI和SpeI双酶切处理的腺病毒E1穿梭载体进行连接。连接产物转化DH5α细胞、提取质粒DNA、酶切鉴定获得阳性克隆，命名为pHBD24 shuttle，此载体为获得的pAd5 E1A 24bp缺失的穿梭载体。
(2)构建pHBD24-backbone：
将ScaI线性化的pHBD24shuttle穿梭载体与ClaI线性化腺病毒骨架载体pTG3602/SwaI按摩尔比3∶1配制，共转化感受态细胞BJ5183，经碱性裂解法提取质粒DNA。经酶切及测序鉴定阳性克隆，所获得的阳性克隆即为Ad5 E1A分子中24个碱基缺失的腺病毒载体骨架，命名为pHBD24-backbone。
(3)构建定点突变六联体蛋白高可变区5中的BamHI位点的pHBD24-backbone：
以腺病毒Ad5基因组为模板，通过PCR的方法获得六联体蛋白高可变区5序列下游2300bp的同源臂序列，连于pGEM-T easy载体上，获得pGEMT/Hexon HR down-1。以pGEMT/Hexon HR down-1为模板，采用PCR反应定点突变六联体蛋白高可变区5下游同源臂序列中的BamHI位点，获得的阳性克隆命名为pGEMT/Hexon BM。
将SwaI线性化的pHBD24-backbone和pGEMT/Hexon BM按摩尔比1∶6配制，共转化感受态细胞BJ5183，经碱性裂解法提取质粒DNA，经酶切及测序鉴定阳性克隆，所获得的阳性克隆即为pHBD24BM。
(4)构建引入单一酶切位点BmaHI的腺病毒纤维蛋白修饰序列的3’上游2.0kb同源臂的质粒载体：
以腺病毒Ad5基因组DNA为模板，通过PCR扩增获得引入单一酶切位点的Ad5纤维蛋白修饰的5’端上游2.0kb的片段，反应扩增产物经质量浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳后回收片段；将回收的聚合酶链式反应产物分别与pGEMT-easy载体连接，经碱性裂解法提取质粒DNA，通过酶切及测序鉴定获得阳性克隆为引入单一酶切位点BamHI的腺病毒纤维蛋白序列5’上游2.0kb同源臂的质粒载体，命名为pGEMT/fiber up-BamHI；合成Ad5的Tail以及纤维蛋白嵌合体的Shaft和Knob序列，在Ad5的Tail序列上含有NdeI位点，在纤维蛋白修饰序列的Knob 3’端引入SpeI位点，通过NdeI和SpeI双酶切，将此序列克隆到pshuttle Ad5-E4-fiber载体的相应的酶切位点中，所获得的新载体称为pGEMT/fiber chimeric up BamHI。
(5)构建引入单一酶切位点SfuI的腺病毒E4序列3’上游2.0kb同源臂的质粒载体：
以腺病毒Ad5基因组DNA为模板，通过PCR扩增获得引入单一酶切位点的Ad5E4区3’端上游2.0kb的片段，反应扩增产物经质量浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳后回收片段；将回收的聚合酶链式反应产物分别与pGEMT-easy载体连接，经碱性裂解法提取质粒DNA，通过酶切及测序鉴定获得阳性克隆为引入单一酶切位点SfuI的腺病毒E4序列3’上游2.0kb同源臂的质粒载体，命名为pGEMT/E4 up-SfuI；
(6)构建腺病毒fiber-E4部位携带筛选基因的穿梭载体：
以pUC19载体为基础，在氨苄抗性基因的开放读码框的两端通过基因突变的方式产生两个单一的酶切位点XbaI及SfuI，然后将卡那抗性基因克隆到XbaI和SfuI的位点中，所获得的卡那抗性载体与EcoRI-HindIII linker连接，获得的载体命名为pUCKanEHL；
将fiber up和E4up分别从pGEMT/fiber chimeric up BamHI和pGEMT/E4 up-SfuI上 经对应的内切酶双酶切下来，再依次连入pUCKanEHL，经碱性裂解法提取质粒DNA、酶切鉴定，获得阳性克隆，命名为pshuttle-fiber-E4HR；
将经过单一酶切位点BamHI和SfuI所对应的内切酶双酶切的筛选表达元件连入经过相同酶双酶切的pshuttle-fiber-E4HR载体，经碱性裂解法提取质粒DNA，酶切鉴定获得阳性克隆为腺病毒fiber-E4部位携带筛选基因的穿梭载体，命名为pshuttle-fiber-E4/screeninggene。
(7)构建引入单一酶切位点的D24纤维蛋白修饰的条件复制型腺病毒载体：
将pshuttle-fiber-E4/screening gene与pHBD24BM分别通过PacI与SwaI酶切线性化后，按摩尔比6∶1配制共转化BJ5183感受态细胞，提取质粒DNA、酶切鉴定获得阳性克隆为引入单一酶切位点的D24纤维蛋白修饰的条件复制型腺病毒载体，命名为pHBD24-fiber chimeric-BS。
(8)构建携带外源基因的穿梭载体：
通过聚合酶链式反应方法扩增miniCMV-SV40表达元件，将产物与pGEMT-T easy载体连接，通过酶切及测序鉴定阳性克隆，所获得阳性克隆命名为pGEMT/miniCMV-SV40；同样扩增PGK-SV40表达元件，将产物与pGEMT-T easy载体连接，通过酶切及测序鉴定阳性克隆，所获得阳性克隆命名为pGEMT/PGK-SV40；将miniCMV-SV40片段与PGK-SV40分别从pGEMT/miniCMV-SV40和pGEMT/PGK-SV40上经相应酶切位点双酶切下来，与经同样酶切的pUCKanEHL进行连接，连接产物采用同样的方法转化，提取质粒DNA，酶切鉴定获得阳性克隆，命名为pshuttle-BS-PGK-miniCMV；然后分别在miniCMV-SV40表达框中连入报告基因以及在PGK-SV40表达框中连入治疗基因，提取质粒DNA，酶切鉴定获得阳性克隆，命名为pshuttle-BS-治疗基因/报告基因。
(9)携带外源基因的D24纤维蛋白修饰的条件复制型腺病毒载体的构建及病毒制备：
将构建好的pshuttle-BS-治疗基因/报告基因与pHBD24-fiber chimeric-BS经BamHI和SfuI酶切处理后连接，连接产物转化、培养、筛选，经摇菌、提取质粒DNA、酶切及测序鉴定获得阳性克隆为携带外源基因的D24纤维蛋白修饰的条件复制型腺病毒，命名为pHBD24-fiber chimeric-治疗基因/报告基因，将pHBD24-fiber chimeric-治疗基因/报告基因载体经PacI线性化后转染HEK293细胞，7-10天后获得病毒原液，经过扩增，通过CsCl梯度离心纯化后获得携带外源基因的D24纤维蛋白修饰的条件复制型腺病毒载体，命名为HBD24-fiber chimeric-治疗基因/报告基因。
本发明采用条件复制型腺病毒载体携带一个报告基因和一个治疗基因，在肿瘤疾病治疗 中具有重要价值。经申请人的药效试验证明，采用本发明的方法所构建的携带外源治疗基因的D24纤维蛋白修饰的条件复制型腺病毒载体，能够提高对肿瘤的治疗效果。
附图说明
图1是E1A分子中24bp碱基缺失条件复制型腺病毒载体骨架pHBD24-backbone示意图。
图2是腺病毒fiber-E4部位携带筛选基因的穿梭载体的示意图。
图3是引入单一酶切位点的D24纤维蛋白修饰的条件复制型腺病毒载体的示意图。
图4为携带外源基因穿梭载体的示意图。
图5为获得的表达绿色荧光蛋白和TRAIL的D24纤维蛋白修饰的条件复制型腺病毒载体的示意图。
图6为HBD24-5/11-TRAIL/eGFP腺病毒载体对脑胶质瘤U251细胞的生长抑制作用结果。
图7为HBD24-5/11-TRAIL/eGFP腺病毒载体对脑胶质瘤U87细胞的感染效率结果。
图8为HBD24-5/11-TRAIL/eGFP腺病毒载体在肿瘤模型动物中的实验治疗结果。
下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明不限于这些实施例。
具体实施方式
实施例1：
本实施例给出携带eGFP和TRAIL的D24纤维蛋白修饰的条件复制型腺病毒载体HB D24-5/11-TRAIL/eGFP，具体如下：
(1)在人腺病毒载体5型基因组中第922bp～947bp之间缺失的24碱基序列，该缺失的24bp碱基序列为：cttacctgccacgaggctggcttt。
(2)在人腺病毒载体5型基因组中31042bp处即纤维蛋白Tail处，插入一个修饰的纤维蛋白5/11。其插入的序列为：
atgaagcgcgcaagaccgtctgaagataccttcaaccccgtgtatccatatgacacggaaaccggtcctccaactgtgccttttcttactcctccctttgtatcccccaatgggtttcaagagagtccccctggtcttactttaaaatgtttaaccccgctaacaaccacaggcgggtctctacagctaaaagtgggagggggacttacagtagatgacactgatgggaccttacaagaaaacataggtaccaccacaccacttgttaagactgggcactctataggtttatccctaggagccggattgggaacagatgaaaataaactttgtaccaaattgggaaaaggacttacattcaattcaaacaacatttgcattgatgacaatattaacaccctgtggacaggaattaaccccaccgaagccaactgtcaaatgatggactccagtgaatctaatgattgcaaattaattctaacactagttaaaactggagccctagtcactgcatttgtttatgttataggagtatctaacaattttaatatgctaactacatacagaaatataaattttactgcggagctgttttttgattctgcgggtaatttactaactagcctgtcatccctaaaaactccacttaatcataaatcaggacaaaacatggctactggtgccattactaatgctaaaagtttcatgcccagcacaactgcttatcctttcaataataattctagagaaaaagaaaactacatttacggaacctgtcactacacagctagtgatcacactgcttttcccattgacatatctgtcatgcttaaccaaagagcaataagagctgatacatcatattgtattcgtataacttggtcctggaacacaggagatgccccagaggggcaaacctctgctacaaccctagttacctccccatttaccttttactacatcagagaagacgactga。
(3)在人腺病毒载体5型基因组中32021bp～32022bp之间插入双表达TRAIL与eGFP的表达元件，其序列如下：
agatctccatagagcccaccgcatccccagcatgcctgctattgtcttcccaatcctcccccttgctgtcctgccccaccccaccccccagaatagaatgacacctactcagacaatgcgatgcaatttcctcattttattaggaaaggacagtgggagtggcaccttccagggtcaaggaaggcacgggggaggggcaaacaacagatggctggcaactagaaggcacagtctagattacttgtacagctcgtccatgccgagagtgatcccggcggcggtcacgaactccagcaggaccatgtgatcgcgcttctcgttggggtctttgctcagggcggactgggtgctcaggtagtggttgtcgggcagcagcacggggccgtcgccgatgggggtgttctgctggtagtggtcggcgagctgcacgctgccgtcctcgatgttgtggcggatcttgaagttcaccttgatgccgttcttctgcttgtcggccatgatatagacgttgtggctgttgtagttgtactccagcttgtgccccaggatgttgccgtcctccttgaagtcgatgcccttcagctcgatgcggttcaccagggtgtcgccctcgaacttcacctcggcgcgggtcttgtagttgccgtcgtccttgaagaagatggtgcgctcctggacgtagccttcgggcatggcggacttgaagaagtcgtgctgcttcatgtggtcggggtagcggctgaagcactgcacgccgtaggtcagggtggtcacgagggtgggccagggcacgggcagcttgccggtggtgcagatgaacttcagggtcagcttgccgtaggtggcatcgccctcgccctcgccggacacgctgaacttgtggccgtttacgtcgccgtccagctcgaccaggatgggcaccaccccggtgaacagctcctcgcccttgctcaccatctcgagatacagctccaccgcacatgccaccctccggatatattcgtctcgagcaaatcactcgagtatgtcgaggtggcgtgtacggtgggaggcctatataagcagagctcgtttagtgttggcagtctagcggctagcacgcgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcatcgatatggctatgatggaggtccaggggggacccagcctgggacagacctgcgtgctgatcgtgatcttcacagtgctcctgcagtctctctgtgtggctgtaacttacgtgtactttaccaacgagctgaagcagatgcaggacaagtactccaaaagtggcattgcttgtttcttaaaagaagatgacagttattgggaccccaatgacgaagagagtatgaacagcccctgctggcaagtcaagtggcaactccgtcagctcgttagaaagatgattttgagaacctctgaggaaaccatttctacagttcaagaaaagcaacaaaatatttctcccctagtgagagaaagaggtcctcagagagtagcagctcacataactgggaccagaggaagaagcaacacattgtcttctccaaactccaagaatgaaaaggctctgggccgcaaaataaactcctgggaatcatcaaggagtgggcattcattcctgagcaacttgcacttgaggaatggtgaactggtcatccatgaaaaagggttttactacatctattcccaaacatactttcgatttcaggaggaaataaaagaaaacacaaagaacgacaaacaaatggtccaatatatttacaaatacacaagttatcctgaccctatattgttgatgaaaagtgctagaaatagttgttggtctaaagatgcagaatatggactctattccatctatcaagggggaatatttgagcttaaggaaaatgacagaatttttgtttctgtaacaaatgagcacttgatagacatggaccatgaagccagttttttcggggcctttttagttggctaaactagtggatccggctgtggaatgtgtgtcagttagggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatcacaattagtcagcaaccaggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccatagtcccgcccctaactccgcccatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgactaattttttttatttatgcagaggccgaggccgcctcggcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttgcaaaaagcttgaattcgctgtctgcgagggccggctgttggggtgagtactccctctcaaaagcgggcatgacttctgcggccgc。
上述表达绿色荧光蛋白eGFP和TRAIL基因的D24纤维蛋白修饰的条件复制型腺病毒载体构建方法步骤如下：
1、构建Ad5 E1A分子中24bp碱基缺失的穿梭载体
通过设计两对引物，以Ad5基因组质粒为模板，经过重叠聚合酶链式反应获得含有Ad5 E1A分子中24bp碱基缺失的基因片段。P1-P4为两对引物的序列：
P1：ATTAATTAACATCATCAATAATATACCTTATTTTGGATT；
P2：TCCTCGTCGTCACTGGGTGGAATCCAAAATAAGGTATATTATTGATGATG；
P3：CCACCCAGTGACGACGAGGATGAAGAGGGTGAGGAGTTT；
P4：TACTAGTCCGCTCTCCACAGATGCATGGCCAG。
聚合酶链式反应扩增条件是：94℃、2分钟，94℃、50秒，55℃、60秒，72℃、2分钟，30个循环。重叠聚合酶链式反应产物经质量浓度为1.0％的琼脂糖电泳后回收片段。将聚合酶链式反应片段与pGEMT-T easy载体连接。连接条件是：2μl酶切纯化片段，5μl 2×T4连接酶缓冲液，0.5μl pGEMT-T easy载体，0.5μl T4连接酶，2μl三蒸水，25℃连接1小时，将连接产物转化感受态的DH5α细胞，并涂布于含有100μg/ml的氨苄青霉素的LB平板中。挑取菌落接种到含有100μg/ml的氨苄青霉素的LB培养液中，14～16小时后，经碱性裂解法提取质粒DNA，通过酶切及测序鉴定阳性克隆。将所获得阳性克隆命名为pGEMT/Ad5-D24F。将Ad5-D24F片段从pGEMT/Ad5-D24F上经PacI和SpeI双酶切下来，经质量浓度为1.0％的琼脂糖电泳纯化后与用PacI和SpeI双酶切处理的腺病毒E1穿梭载体进行连接。连接条件同上，连接产物采用同样的方法转化、提取质粒DNA、酶切鉴定获得阳性克隆，命名为pHBD24shuttle，此载体为获得的Ad5 E1A分子中24bp碱基缺失的穿梭载体。
2、构建Ad5 E1A分子中24个碱基缺失的腺病毒载体骨架
将ScaI线性化的Ad5 E1A分子24个碱基缺失的穿梭载体与ClaI线性化腺病毒骨架载体pTG3602/SwaI按摩尔比3∶1配制，共转化感受态细胞BJ5183，经碱性裂解法提取质粒DNA。经酶切及测序鉴定阳性克隆，所获得的阳性克隆即为Ad5 E1A分子中24个碱基缺失的腺病毒载体骨架，命名为pHBD24-backbone，见图1。在图1中，黑色加宽部分代表Ad5 E1A分子中24个碱基缺失部分。
3、构建定点突变六联体蛋白高可变区5中的BamHI位点的pHBD24-backbone：
以腺病毒Ad5基因组为模板，通过PCR的方法获得六联体蛋白高可变区5序列下游2300bp的同源臂序列，设计引物序列如下：
P5：AGGATCCATATTCGAACCTAAAGTGGTATTGTACAGTGAA
P6：TATCGATGAAACATGCAGCAGAATAGTCCACAG，
扩增产物连于pGEM-T easy载体上，获得pGEMT/Hexon HR down-1。
以pGEMT/Hexon HR down-1为模板，采用PCR反应定点突变六联体蛋白高可变区5下游 同源臂序列中的BamHI位点，设计引物序列如下：
P7：AGACATGACTTTTGAGGTCGATCCCATGGACGAGCCCA
P8：TGGGCTCGTCCATGGGATCGACCTCAAAAGTCATGTCT。
获得的阳性克隆命名为pGEMT/Hexon BM。
将SwaI线性化的pHBD24-backbone和pGEMT/Hexon BM按摩尔比1∶6配制，共转化感受态细胞BJ5183，经碱性裂解法提取质粒DNA。经酶切及测序鉴定阳性克隆，所获得的阳性克隆即为pHBD24BM。
4、构建引入单一酶切位点BmaHI的腺病毒纤维蛋白修饰序列的3’上游2.0kb同源臂的质粒载体：
以腺病毒Ad5基因组DNA为模板，通过PCR扩增获得引入单一酶切位点的Ad5纤维蛋白修饰的5′端上游2.0kb的片段，反应扩增产物经质量浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳后回收片段；将回收的聚合酶链式反应产物分别与pGEMT-easy载体连接，经碱性裂解法提取质粒DNA，通过酶切及测序鉴定获得阳性克隆为引入单一酶切位点BamHI的腺病毒纤维蛋白序列5’上游2.0kb同源臂的质粒载体，命名为pGEMT/fiber up-BamHI；合成Ad5的Tai l以及纤维蛋白嵌合体Ad11的Shaft和Knob序列，在Ad5的Tail序列上含有NdeI位点，在纤维蛋白修饰序列的Knob 3’端引入SpeI位点，通过NdeI和SpeI双酶切，将此序列克隆到pshuttleAd5-E4-fiber载体的相应的酶切位点中，所获得的新载体称为pGEMT/fiber5/11 up BamHI。
5、构建引入单一酶切位点SfuI的腺病毒E4序列3’上游2.0kb同源臂的质粒载体：
以腺病毒Ad5基因组DNA为模板，通过PCR扩增获得引入单一酶切位点的Ad5E4区3′端上游2.0kb的片段，反应扩增产物经质量浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳后回收片段；将回收的聚合酶链式反应产物分别与pGEMT-easy载体连接，经碱性裂解法提取质粒DNA，通过酶切及测序鉴定获得阳性克隆为引入单一酶切位点SfuI的腺病毒E4序列3’上游2.0kb同源臂的质粒载体，命名为pGEMT/E4 up-SfuI；
6、构建腺病毒fiber-E4部位携带筛选基因的穿梭载体：
以pUC19载体为基础，在氨苄抗性基因的开放读码框的两端通过基因突变的方式产生两个单一的酶切位点XbaI及SfuI，然后将卡那抗性基因克隆到XbaI和SfuI的位点中，所获得的卡那抗性载体与EcoRI-HindIII linker连接，获得的载体命名为pUCKanEHL，见图2；
将fiber up和E4up分别从pGEMT/fiber5/11 up BamHI和pGEMT/E4up-SfuI上经对应的内切酶双酶切下来，再依次连入pUCKanEHL，经碱性裂解法提取质粒DNA、酶切鉴定，获得阳性克隆，命名为pshuttle-fiber5/11-E4HR；将经过单一酶切位点BamHI和SfuI所对应 的内切酶双酶切的筛选表达元件Lacza连入经过相同酶双酶切的pshuttle-fiber5/11-E4HR载体，经碱性裂解法提取质粒DNA，酶切鉴定获得阳性克隆为腺病毒fiber-E4部位携带筛选基因的穿梭载体，命名为pshuttle-fiber5/11-E4/Lacza。
7、构建引入单一酶切位点的Ad5D24条件复制型腺病毒载体
将pshuttle-fiber5/11-E4/Lacza与pHBD24BM分别通过PacI与SwaI酶切线性化后按摩尔比6∶1配制共转化BJ5183感受态细胞，提取质粒DNA、酶切鉴定获得阳性克隆为引入单一酶切位点的Ad5D24条件复制型腺病毒载体，命名为pHBD24-5/11-BS，见图3。
8、构建携带外源基因的穿梭载体
通过聚合酶链式反应方法扩增miniCMV-SV40表达元件，将产物与pGEMT-T easy载体连接，通过酶切及测序鉴定阳性克隆，所获得阳性克隆命名为pGEMT/miniCMV-SV40；同样扩增PGK-SV40表达元件，将产物与pGEMT-T easy载体连接，通过酶切及测序鉴定阳性克隆，所获得阳性克隆命名为pGEMT/PGK-SV40；将miniCMV-SV40片段与PGK-SV40分别从pGEMT/miniCMV-SV40和pGEMT/PGK-SV40上经相应酶切位点双酶切下来，与经同样酶切的pUCKanEHL进行连接，连接产物采用同样的方法转化，提取质粒DNA，酶切鉴定获得阳性克隆，命名为pshuttle-BS-PGK-miniCMV；然后分别在miniCMV-SV40表达框中连入报告基因eGFP以及在PGK-SV40表达框中连入治疗基因TRAIL，提取质粒DNA，酶切鉴定获得阳性克隆，命名为pshuttle-BS-TRAIL/eGFP，见图4。
9、携带TRAIL和eGFP的D24纤维蛋白修饰的条件复制型腺病毒载体的构建及病毒制备：
将构建好的pshuttle-BS-TRAIL/eGFP与pHBD24-5/11-BS经BamHI和SfuI酶切处理后连接，连接产物转化、培养、筛选，经摇菌、提取质粒DNA、酶切及测序鉴定获得阳性克隆为携带TRAIL与eGFP的D24纤维蛋白修饰的条件复制型腺病毒载体，命名为pHBD24-5/11-TRAIL/eGFP，将pHBD24-5/11-TRAIL/eGFP载体经PacI线性化后转染HEK293细胞，7-10天后获得病毒原液，经过扩增，通过CsCl梯度离心纯化后获得获得携带TRAIL和eGFP的D24纤维蛋白修饰的条件复制型腺病毒，命名为HBD24-5/11-TRAIL/eGFP，见图5。
实施例2：
以表达红色荧光蛋白和TRAIL基因的D24纤维蛋白修饰的条件复制型腺病毒载体构建方法步骤如下：
实施例1中构建携带外源基因的穿梭载体在miniCMV-SV40表达框中连入报告基因eGFP以及在PGK-SV40表达框中连入治疗基因TRAIL中的绿色荧光蛋白eGFP用红色荧光蛋白代替。载体的其他结构与实施例1相同。
实施例3：
以表达荧光素酶和TRAIL基因的D24纤维蛋白修饰的条件复制型腺病毒载体构建方法步骤如下：
实施例1中构建携带外源基因的穿梭载体在miniCMV-SV40表达框中连入报告基因eGFP以及在PGK-SV40表达框中连入治疗基因TRAIL中的绿色荧光蛋白eGFP用荧光素酶代替。载体的其他结构与实施例1相同。
实施例4：
以表达β-半乳糖苷酶和TRAIL基因的D24纤维蛋白修饰的条件复制型腺病毒载体构建方法步骤如下：
实施例1中构建携带外源基因的穿梭载体在miniCMV-SV40表达框中连入报告基因eGFP以及在PGK-SV40表达框中连入治疗基因TRAIL中的绿色荧光蛋白eGFP用β-半乳糖苷酶代替。载体的其他结构与实施例1相同。
实施例5：
以表达绿色荧光蛋白eGFP和IL-24基因的D24纤维蛋白修饰的条件复制型腺病毒载体构建方法步骤如下：
实施例1中构建携带外源基因的穿梭载体在miniCMV-SV40表达框中连入报告基因eGFP以及在PGK-SV40表达框中连入治疗基因TRAIL中的TRAIL用IL-24代替。载体的其他结构与实施例1相同。
实施例6：
以表达绿色荧光蛋白eGFP和IL-12基因的D24纤维蛋白修饰的条件复制型腺病毒载体构建方法步骤如下：
实施例1中构建携带外源基因的穿梭载体在miniCMV-SV40表达框中连入报告基因eGFP以及在PGK-SV40表达框中连入治疗基因TRAIL中的TRAIL用IL-12代替。载体的其他结构与实施例1相同。
实施例7：
以表达绿色荧光蛋白eGFP和IFN基因的D24纤维蛋白修饰的条件复制型腺病毒载体构建方法步骤如下：
实施例1中构建携带外源基因的穿梭载体在miniCMV-SV40表达框中连入报告基因eGFP以及在PGK-SV40表达框中连入治疗基因TRAIL中的TRAIL用IFN代替。载体的其他结构与实施例1相同。
实施例8
以表达绿色荧光蛋白eGFP和p53基因的D24纤维蛋白修饰的条件复制型腺病毒载体构建方法步骤如下：
实施例1中构建携带外源基因的穿梭载体在miniCMV-SV40表达框中连入报告基因eGFP以及在PGK-SV40表达框中连入治疗基因TRAIL中的TRAIL用p53代替。载体的其他结构与实施例1相同。
实施例9：
以表达绿色荧光蛋白eGFP和arresten基因的D24纤维蛋白修饰的条件复制型腺病毒载体构建方法步骤如下：
实施例1中构建携带外源基因的穿梭载体在miniCMV-SV40表达框中连入报告基因eGFP以及在PGK-SV40表达框中连入治疗基因TRAIL中的TRAIL用arresten代替。载体的其他结构与实施例1相同。
实施例10：
以表达绿色荧光蛋白eGFP和endostatin基因的D24纤维蛋白修饰的条件复制型腺病毒载体构建方法步骤如下：
实施例1中构建携带外源基因的穿梭载体在miniCMV-SV40表达框中连入报告基因eGFP以及在PGK-SV40表达框中连入治疗基因TRAIL中的TRAIL用endostatin代替。载体的其他结构与实施例1相同。
实施例11：
以表达绿色荧光蛋白eGFP和endostatin基因的D24纤维蛋白修饰的条件复制型腺病毒载体构建方法步骤如下：
实施例1中构建携带外源基因的穿梭载体在miniCMV-SV40表达框中连入报告基因eGFP以及在PGK-SV40表达框中连入治疗基因TRAIL中的TRAIL用endostatin代替。载体的其他结构与实施例1相同。
实施例12：
以上的实施例1～11，在腺病毒5型基因组第31042bp处即纤维蛋白Tail处，插入的修饰的纤维蛋白5/11序列用5/3序列替换。其它元件的结构与相应的实施例相同。
上述的5/3序列如下：
atgaagcgcgcaagaccgtctgaagataccttcaaccccgtgtatccatatgacacggaaaccggtcctccaactgtgccttttcttactcctccctttgtatcccccaatgggtttcaagagagtccccctttaagtcttaaatgtgttaatccacttaccactgcaagcggctccctccaacttaaagtgggaagtggtcttacagtagacactactgatggatccttagaaga aaacatcaaagttaacacccccctaacaaagtcaaaccattctataaatttaccaataggaaacggtttgcaaatagaacaaaacaaactttgcagtaaactcggaaatggtcttacatttgactcttccaattctattgcactgaaaaataacactttatggacaggtccaaaaccagaagccaactgcataattgaatacgggaaacaaaacccagatagcaaactaactttaatccttgtaaaaaatggaggaattgttaatggatatgtaacgctaatgggagcctcagactacgttaacaccttatttaaaaacaaaaatgtctccattaatgtagaactatactttgatgccactggtcatatattaccagactcatcttctcttaaaacagatctagaactaaaatacaagcaaaccgctgactttagtgcaagaggttttatgccaagtactacagcgtatccatttgtccttcctaatgcgggaacacataatgaaaattatatttttggtcaatgctactacaaagcaagcgatggtgccctttttccgttggaagttactgttatgcttaataaacgcctgccagatagtcgcacatcctatgttatgacttttttatggtccttgaatgctggtctagctccagaaactactcaggcaaccctcataacctccccatttaccttttcctatattagagaagatgactga。
实施例13：
以上的实施例1～11，在腺病毒5型基因组第31042bp处即纤维蛋白Tail处，插入的修饰的纤维蛋白5/11序列用5/6序列替换。其它元件的结构与相应的实施例相同。
上述纤维蛋白5/6序列如下：
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实施例14：
以上的实施例1～11，在腺病毒5型基因组第31042bp处即纤维蛋白Tail处，插入的修饰的纤维蛋白5/11序列用5/7序列替换。其它元件的结构与相应的实施例相同。
上述纤维蛋白5/7序列如下：
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实施例15：
以上的实施例1～11，在腺病毒5型基因组第31042bp处即纤维蛋白Tail处，插入的修饰的纤维蛋白5/11序列用5/35序列替换。其它元件的结构与相应的实施例相同。
上述纤维蛋白5/35序列如下：
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为了验证本发明的有益效果，发明人采用本发明实施例1所构建的条件复制型腺病毒载体HBD24-5/11-TRAIL/eGFP进行了药效试验，试验情况如下：
1、细胞生长抑制作用的检测
实验方法：取对数生长期的U251肿瘤细胞，0.1％胰酶消化后接种于96孔板，每孔细胞数为5×103；设培养基空白组、复制缺陷型腺病毒载体Ad5-eGFP对照组、表达绿色荧光蛋白和TRAIL的D24纤维蛋白修饰的条件复制型腺病毒载体HBD24-5/11-TRAIL/eGFP实验组，对照组及实验组分别加入腺病毒量为5MOI，每组设6个复孔；分别培养24、48、72、96小时后加入5g/L的3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐20μL，继续培养4小时，去掉培养基，加入二甲基亚砜150μL，水平摇床室温作用10分钟。用酶标仪570nm处测得吸光值。用细胞生长抑制方法所获得的数据用统计软件SPSS 13.0软件的One Way ANOVA进行统计分析，各组间差异比较采用方差分析。实验结果见图6。
由图6可见，实验组与培养基空白组与Ad5-eGFP对照组相比较，实验组病毒对U251细 胞生长具有显著抑制作用，具有明显的抗肿瘤效果(*，p＜0.01)。
2、细胞感染效率的检测
接种U87细胞于24孔板，每孔1×105个细胞，将HBD24-5/11-TRAIL/eGFP腺病毒载体和对照腺病毒载体Ad-eGFP分别感染U87细胞，腺病毒载体感染浓度均为5MOI，在荧光显微镜下随机选取10个视野，对有绿色荧光的细胞进行计数，计算腺病毒对U87细胞的感染效率，实验结果见图7。由图7可见，对照组感染细胞数量少，说明对照腺病毒的载体Ad5-eGFP对U87细胞系的感染效率低，实验组与对照组相比，感染细胞数量增多，说明当腺病毒经过纤维蛋白遗传修饰后，HBD24-5/11-TRAIL/eGFP腺病毒载体对U87细胞的感染效率显著提高(*，p＜0.05)。
3、建立脑胶质瘤动物模型检测其药效试验
采用U87细胞，取对数生长期细胞，经胰酶消化，离心后，无血清、无双抗、无谷氨酰胺的DMEM培养液悬浮，制备7.5×106/mL的细胞悬液。选用21只约4～6周龄BALB/C雌性裸鼠，裸鼠用乙醚吸入麻醉，每只右后肢上部皮下注射200μl的7.5×106/mL的细胞悬液，U87MG细胞注射量为2×106个细胞，在细胞接种约3天后均可见肿块近似大小的肿瘤生长。接种一周后，肿瘤平均体积达到约70～100mm3时，建立脑胶质瘤动物模型。
将21只裸鼠模型随机分成3组，每组7只。裸鼠用乙醚吸入麻醉，根据分组注射空白组生理盐水、对照组复制缺陷型腺病毒载体Ad5-eGFP以及实验组腺病毒载体HBD24-5/11-TRAIL/eGFP。每只裸鼠每两天重复注射病毒1次，共4次，每次剂量均为5×108PFU。开始治疗后每2天测量肿瘤体积1次，统计体积变化趋势并绘制肿瘤生长曲线，测量3周肿瘤体积。并用统计软件SPSS 13.0中的Oneway-ANOVA进行显著性差异分析。实验结果见图8。
由图8可见，与空白组生理盐水和对照组复制缺陷型腺病毒Ad5-eGFP相比，HBD24-5/11-TRAIL/eGFP腺病毒载体可以明显抑制实验模型中肿瘤细胞的生长速度，具有明显的抗肿瘤治疗效果(*，p＜0.05)。
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Claims (2)
1.一种一步法构建的携带外源基因的D24纤维蛋白修饰的条件复制型腺病毒载体，其特征在于，所述的腺病毒载体是HB D24-5/11-TRAIL/eGFP，具体如下：
(1)在人腺病毒载体5型基因组中第922bp～947bp之间缺失的24 碱基序列，该缺失的24bp碱基序列为：cttacctgccacgaggctggcttt；
(2)在人腺病毒载体5型基因组中31042bp处即纤维蛋白Tail处，插入一个修饰的纤维蛋白5/11，其插入的序列为：
Atgaagcgcgcaagaccgtctgaagataccttcaaccccgtgtatccatatgacacggaaaccggtcctccaactgtgccttttcttactcctccctttgtatcccccaatgggtttcaagagagtccccctggtcttactttaaaatgtttaaccccgctaacaaccacaggcgggtctctacagctaaaagtgggagggggacttacagtagatgacactgatgggaccttacaagaaaacataggtaccaccacaccacttgttaagactgggcactctataggtttatccctaggagccggattgggaacagatgaaaataaactttgtaccaaattgggaaaaggacttacattcaattcaaacaacatttgcattgatgacaatattaacaccctgtggacaggaattaaccccaccgaagccaactgtcaaatgatggactccagtgaatctaatgattgcaaattaattctaacactagttaaaactggagccctagtcactgcatttgtttatgttataggagtatctaacaattttaatatgctaactacatacagaaatataaattttactgcggagctgttttttgattctgcgggtaatttactaactagcctgtcatccctaaaaactccacttaatcataaatcaggacaaaacatggctactggtgccattactaatgctaaaagtttcatgcccagcacaactgcttatcctttcaataataattctagagaaaaagaaaactacatttacggaacctgtcactacacagctagtgatcacactgcttttcccattgacatatctgtcatgcttaaccaaagagcaataagagctgatacatcatattgtattcgtataacttggtcctggaacacaggagatgccccagaggggcaaacctctgctacaaccctagttacctccccatttaccttttactacatcagagaagacgactga；
(3) 在人腺病毒载体5型基因组中32021bp～32022 bp之间插入双表达TRAIL 与eGFP的表达元件，其序列如下：
agatctccatagagcccaccgcatccccagcatgcctgctattgtcttcccaatcctcccccttgctgtcctgccccaccccaccccccagaatagaatgacacctactcagacaatgcgatgcaatttcctcattttattaggaaaggacagtgggagtggcaccttccagggtcaaggaaggcacgggggaggggcaaacaacagatggctggcaactagaaggcacagtctagattacttgtacagctcgtccatgccgagagtgatcccggcggcggtcacgaactccagcaggaccatgtgatcgcgcttctcgttggggtctttgctcagggcggactgggtgctcaggtagtggttgtcgggcagcagcacggggccgtcgccgatgggggtgttctgctggtagtggtcggcgagctgcacgctgccgtcctcgatgttgtggcggatcttgaagttcaccttgatgccgttcttctgcttgtcggccatgatatagacgttgtggctgttgtagttgtactccagcttgtgccccaggatgttgccgtcctccttgaagtcgatgcccttcagctcgatgcggttcaccagggtgtcgccctcgaacttcacctcggcgcgggtcttgtagttgccgtcgtccttgaagaagatggtgcgctcctggacgtagccttcgggcatggcggacttgaagaagtcgtgctgcttcatgtggtcggggtagcggctgaagcactgcacgccgtaggtcagggtggtcacgagggtgggccagggcacgggcagcttgccggtggtgcagatgaacttcagggtcagcttgccgtaggtggcatcgccctcgccctcgccggacacgctgaacttgtggccgtttacgtcgccgtccagctcgaccaggatgggcaccaccccggtgaacagctcctcgcccttgctcaccatctcgagatacagctccaccgcacatgccaccctccggatatattcgtctcgagcaaatcactcgagtatgtcgaggtggcgtgtacggtgggaggcctatataagcagagctcgtttagtgttggcagtctagcggctagcacgcgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcatcgatatggctatgatggaggtccaggggggacccagcctgggacagacctgcgtgctgatcgtgatcttcacagtgctcctgcagtctctctgtgtggctgtaacttacgtgtactttaccaacgagctgaagcagatgcaggacaagtactccaaaagtggcattgcttgtttcttaaaagaagatgacagttattgggaccccaatgacgaagagagtatgaacagcccctgctggcaagtcaagtggcaactccgtcagctcgttagaaagatgattttgagaacctctgaggaaaccatttctacagttcaagaaaagcaacaaaatatttctcccctagtgagagaaagaggtcctcagagagtagcagctcacataactgggaccagaggaagaagcaacacattgtcttctccaaactccaagaatgaaaaggctctgggccgcaaaataaactcctgggaatcatcaaggagtgggcattcattcctgagcaacttgcacttgaggaatggtgaactggtcatccatgaaaaagggttttactacatctattcccaaacatactttcgatttcaggaggaaataaaagaaaacacaaagaacgacaaacaaatggtccaatatatttacaaatacacaagttatcctgaccctatattgttgatgaaaagtgctagaaatagttgttggtctaaagatgcagaatatggactctattccatctatcaagggggaatatttgagcttaaggaaaatgacagaatttttgtttctgtaacaaatgagcacttgatagacatggaccatgaagccagttttttcggggcctttttagttggctaaactagtggatccggctgtggaatgtgtgtcagttagggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatcacaattagtcagcaaccaggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccatagtcccgcccctaactccgcccatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgactaattttttttatttatgcagaggccgaggccgcctcggcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttgcaaaaagcttgaattcgctgtctgcgagggccggctgttggggtgagtactccctctcaaaagcgggcatgacttctgcggccgc。
2.权利要求1所述的携带外源基因的D24纤维蛋白修饰的条件复制型腺病毒载体用于制备治疗脑胶质瘤药物中的应用。
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