CN102580120B - 一种靶向性mri对比剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医学材料领域，公开了一种靶向性MRI对比剂及其制备方法。本发明所述MRI对比剂的制备方法、将外层包被有羧基葡聚糖的超顺磁性氧化铁微粒与在SEQ ID NO：1所示序列5′端修饰有氨基的RNA共价偶联即得，所述共价偶联为RNA 5′端氨基与葡聚糖上的羧基共价偶联。本发明所述MRI对比剂为阴性对比剂，其上连接的在SEQ ID NO：1所示序列5′端引入氨基的RNA为修饰后的VEGF165-Aptamer，能够靶向于肿瘤细胞中的VEGF165，且避免了免疫原性缺陷，能够应用于多种肿瘤诊断中。

Description

一种靶向性MRI对比剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物医学材料领域，具体涉及一种靶向性MRI对比剂及其制备方法。

背景技术

MRI，即磁共振成像，英文全称为Magnetic Resonance Imaging，又称为核磁共振成像。MRI利用核磁共振原理，依据所释放的能量在物质内部不同结构环境中不同的衰减，通过外加梯度磁场检测所发射出的电磁波，即可得知构成这一物体原子核的位置和种类，据此可以绘制成物体内部的结构图像。

人体各种组织含有大量的水和碳氢化合物，所以氢核以其核磁共振灵活度高、信号强等特点作为人体MRI首选。核磁共振信号强度与样品中氢核密度有关，人体中各种组织以及病灶组织含水比例不同，即含氢核数的多少不同，则核磁共振信号强度有差异，利用这种差异作为特征量，把各种组织分开，这就是氢核密度的磁共振图像。MRI可对人体各部位多角度、多平面成像，其分辨力高，能更客观更具体地显示人体内的解剖组织及相邻关系，对病灶能更好地进行定位定性，对全身各系统疾病的诊断，尤其是早期肿瘤的诊断有很大的价值。

在MRI发展早期，一般认为无需使用MRI对比剂(MRI造影剂)即可完成人体MRI诊断检查。但是，随着MRI在临床上的广泛应用，人们需要MRI能显示一些较小的病变，使一部分疑难病症得以确诊，例如肿瘤的早期诊断，这就需要进一步提高MRI影像的对比度。目前提高MRI影像的对比度的常用手段就是将MRI对比剂引入被诊断者体内，人为地改变病灶组织的磁共振(MR)特征参数，使得病灶组织与正常组织间的区别更加明显。

MRI对比剂是通过内外界弛豫效应和磁化率效应间接地改变组织的信号强度，按增强类型可分为阳性和阴性对比剂二大类，目前应用最广泛的阳性对比剂为Gd-DTPA，中文名为二乙三胺五醋酸钆或钆喷酸葡甲胺盐，商品名为马根维显(Magnevist)，我们通常称作钆剂；应用最广泛的阴性对比剂为葡聚糖包被的超顺磁性氧化铁颗粒，商品名为菲立磁。钆剂能够应用于肿瘤的诊断，但是其注射量较大，本身带有一定的毒性，并且现在有关注射钆剂出现的过敏反应病例越来越多，使得其安全性受到质疑；而葡聚糖包被的超顺磁性氧化铁颗粒的阴性对比剂则更加安全，由于人体能够吸收利用铁原子，故合理剂量的超顺磁性氧化铁不会对人体造成影响，然而如菲立磁这种的阴性对比剂只能应用于淋巴结及网状内皮系统非靶向成像，无肿瘤靶向MRI显像能力，无法应用于肿瘤的诊断中。

针对上述问题，有研究者根据肿瘤细胞膜上表达的特异性蛋白为抗原，制备成抗体，连接到阴性MRI对比剂中，以便阴性MRI对比剂能够与肿瘤细胞特异性结合，使阴性MRI对比剂具有靶向性，从而增加肿瘤早期诊断的灵敏性和准确性。但是，阴性MRI对比剂中所连接的抗体分子量通常比较大，免疫原性较强，易被人体免疫系统识别、吞噬与降解，使得阴性MRI对比剂的靶向性大大降低，故MRI靶向阴性对比剂基本都停留在实验室阶段。此外，不同肿瘤细胞膜表达的特异性蛋白不同，故阴性MRI对比剂所携带的抗体只能针对一种肿瘤的诊断，应用范围比较狭窄。因此，研发一种新型的靶向性、广泛性阴性MRI对比剂对肿瘤诊断具有重要意义。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种靶向性MRI对比剂及其制备方法，使得该MRI对比剂能够靶向于肿瘤细胞，避免免疫原性问题，应用于多种肿瘤诊断中。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

一种靶向性MRI对比剂的制备方法，将外层包被有羧基葡聚糖的超顺磁性氧化铁微粒与在SEQ ID NO：1所示序列5′端修饰有氨基的RNA共价偶联即得，所述共价偶联为RNA 5′端氨基与葡聚糖上的羧基共价偶联。

其中，所述超顺磁性氧化铁微粒直径优选为18-22nm，更优选为20nm，所述外层包被有羧基葡聚糖的超顺磁性氧化铁微粒与所述RNA的质量比优选为3-4∶1-1.2。

本发明所述外层包被有羧基葡聚糖的超顺磁性氧化铁微粒从上海交通大学微纳研究院购得，也可以通过氧化葡聚糖上羟基为羧基获得羧基葡聚糖，然后用共沉淀一步法与FeCl₃·6H₂O、FeCl₂·4H₂O制备即得外层包被有羧基葡聚糖的超顺磁性氧化铁微粒。

SEQ ID NO：1所示序列的核苷酸为人血管内皮细胞生长因子(VEGF165)的核酸适配子(Aptamer)，即VEGF165-Aptamer。本发明的VEGF165-Aptamer是人工合成的经过修饰后在空气中不被降解的可与VEGF165特异结合的RNA。其中，除从5′端起第4、5位碱基未修饰外，其余碱基均人工修饰，所有嘧啶(C，U)为核糖环2’位被氟修饰(2’-F-C或2’-F-U)，所有嘌呤(A，G)为核糖环2’位被甲基修饰(2’-O-CH3-A或2’-O-CH3-G)，同时，5′端修饰游离氨基。本发明所述的在SEQ ID NO：1所示序列5′端修饰有氨基的RNA(即VEGF165-Aptamer)从大连宝生物工程有限公司修饰并购得。

本发明所述共价偶联为RNA 5′端氨基与葡聚糖上的羧基共价偶联，偶联的具体方法本发明不做限制，在明确了偶联方式的前提下，利用本领域常规技术即可偶联得到。

作为优选，所述RNA 5′端氨基与葡聚糖上的羧基共价偶联的具体方法为：

将外层包被有羧基葡聚糖的超顺磁性氧化铁微粒用N-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺活化后，与所述RNA在37℃、200r/min下偶联4h。

其中，所述外层包被有羧基葡聚糖的超顺磁性氧化铁微粒、N-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺的质量比优选为3-4∶2.5∶5。

本发明还提供一种由本发明所述制备方法制备的MRI对比剂。本发明所述MRI对比剂为阴性对比剂(造影剂)，核心为超顺磁性氧化铁(USPIO)微粒，也称四氧化三铁微粒，USPIO外层由改性葡聚糖-羧基葡聚糖(dextran)包被，葡聚糖带有的羧基与本发明所述RNA的5′端游离氨基共价偶联。

本发明所述MRI对比剂的结构示意图见图1，图1只是为方便理解各组分的连接关系的示意图，并不代表所述MRI对比剂真实三维结构以及限制所述MRI对比剂结构为图1所示。

其中，在本发明的某些具体实施例中，所述MRI对比剂的偶联量为每1mg外层包被有羧基葡聚糖的超顺磁性氧化铁微粒偶联1221pmol的所述RNA。

VEGF165主要生物学功能就是增加肿瘤区血管内皮增生，增加新生血管通透性，促进肿瘤细胞增殖。一旦有肿瘤发生，肿瘤细胞高表达VEGF165，VEGF165引起内皮细胞增殖失控以及血管通透性增加，对肿瘤的发生、发展、转移起重要作用，它几乎在所有肿瘤细胞中都表达，如肠癌、食管癌、胆管癌、肝癌、胰腺癌、肺癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、甲状腺癌、成骨肉瘤、慢性淋巴细胞白血病、脑肿瘤、头颈肿瘤、多发性骨髓瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤、乳腺癌、宫颈癌、上皮性卵巢肿瘤、舌癌。

而本发明所述RNA(即VEGF165-Aptamer)，对VEGF165有专一的高亲和性，所以在进行肿瘤早期诊断时，将本发明所述靶向性MRI对比剂通过静脉注射到被检测者体内，靶向性MRI对比剂就会与VEGF165特异性结合，如果有肿瘤疾病发生，则通过磁共振成像技术(MRI)就可以判读是否发生肿瘤疾病。同时，VEGF165-Aptamer与抗体相比，分子量较小，避免了免疫源性问题。

由于VEGF165-Aptamer本身带有氨基，且没有相关研究能够表明VEGF165-Aptamer本身带有的氨基与羧基葡糖共价偶联后是否会影响其生物活性，为了严谨起见，本发明人为在VEGF165-Aptamer的5′端引入游离的氨基。VEGF165-Aptamer本身带有的氨基的结合力要远大于引入的游离氨基的结合力，故能够有效保证与羧基葡聚糖偶联时是通过5′端氨基来实现。

在本发明所述MRI对比剂的体外靶向性细胞增殖试验中，除空白对照组(不加VEGF165及本发明对比剂)外其余各组脐静脉内皮细胞均提前加入等量VEGF165，试验结果显示加入本发明对比剂高、中、低组的细胞数量高于空白组的细胞数量，而低于非靶向性阴性MRI对比剂(菲立磁)组，且随加入本发明对比剂减少，脐静脉内皮细胞数量递增。表明本发明所述MRI对比剂能够在体外特异性与VEGF165有效结合，拮抗VEGF165引起细胞增殖，对VEGF165有很强靶向性。

在荷瘤小鼠靶向性试验中，注射本发明所述MRI对比剂后的肿瘤区MRI图像的信号明显下降、变暗，而注射非靶向性阴性MRI对比剂(菲立磁)的肿瘤区MRI图像的信号未有明显变化，表明本发明所述MRI对比剂在体内也能特异性与VEGF165结合，从而改变肿瘤区域的弛豫效应和磁化率效应，间接地改变组织的信号强度。

由以上技术方案可知，本发明所述MRI对比剂为阴性对比剂，以超顺磁性氧化铁为核心微粒，其外层包被羧基葡聚糖，羧基再与所述VEGF165-Aptamer的5′端氨基共价偶联，其连接的VEGF165-Aptamer能够靶向于肿瘤细胞中的VEGF165，且避免了免疫源性缺陷，能够应用于多种肿瘤诊断中。

附图说明

图1所示为本发明所述MRI对比剂结构示意图；

图2所示为本发明所述MRI对比剂偶联检测凝胶电泳图；

其中，1泳道为Marker，最下为50bp条带；2泳道为本发明所述RNA条带；3泳道为本发明所述MRI对比剂条带；

图3所示为本发明所述MRI对比剂体外靶向性细胞增殖试验柱形图；

其中，1为空白组，2为本发明所述MRI对比剂高剂量组(50μL)，3为本发明所述MRI对比剂中剂量组(25μL)，4为本发明所述MRI对比剂低剂量组(12.2μL)，5为菲立磁组(50μL)；

柱形图纵坐标表示HUVEC细胞光密度值，与细胞数量呈正比关系；

图4所示为注射MRI对比剂前荷瘤小鼠的磁共振仪的平扫图；

其中，图中白色箭头所指为肿瘤区域，A为拟注射本发明所述MRI对比剂的平扫图，信号强度为2346特斯拉，B为拟注射菲立磁的平扫图，信号强度为2100特斯拉；

图5所示为注射MRI对比剂3小时后荷瘤小鼠的磁共振仪扫描图；

其中，图中白色箭头所指为肿瘤区域，A为注射本发明所述MRI对比剂3小时后的扫描图，信号强度为172特斯拉，B为注射菲立磁3小时后的扫描图，信号强度为1900特斯拉；

图6所示为注射MRI对比剂6小时后荷瘤小鼠的磁共振仪扫描图；

其中，图中白色箭头所指为肿瘤区域，A为注射本发明所述MRI对比剂6小时后的扫描图，信号强度为2076特斯拉，B为注射菲立磁6小时后的扫描图，信号强度为1900特斯拉。

具体实施方式：

本发明公开了一种靶向性MRI对比剂及其制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

依照本发明所述一种靶向性MRI对比剂的制备方法，所述外层包被有羧基葡聚糖的超顺磁性氧化铁微粒可以通过氧化葡聚糖上羟基为羧基获得羧基葡聚糖，然后用共沉淀一步法与FeCl₃·6H₂O、FeCl₂·4H₂O制备即得，其具体方法为：

步骤1、将0.2g/ml的葡聚糖加热至70℃搅拌，同时加入10mol/L的NaOH反应5h，再加入5mol/L氯乙酸，70℃恒温20min，待反应体系冷却后，调节pH＝8，用甲醇沉淀反应物，然后纯化、浓缩、冻干，得到带有羧基的葡聚糖，备用；

步骤2、隔绝氧气条件下，向1mol/L的FeCl₃·6H₂O中加入FeCl₂·4H₂O制得FeCl₃·6H₂O-FeCl₂·4H₂O混合液备用，加热0.33g/mL带有羧基的葡聚糖至75℃，加入配制好的混合液，然后滴加NH₄OH调节pH值为7获得黑色悬浮液，离心取上清，利用凝胶色谱法分离并收集首峰溶液，所得首峰溶液透析后超滤浓缩成10mg/mL，制得外层包被有羧基葡聚糖的超顺磁性氧化铁微粒的浓缩液。

其中，作为优选，步骤1所述葡聚糖、NaOH、氯乙酸的体积比为50∶5∶3，步骤2所述FeCl₃·6H₂O和FeCl₂·4H₂O的质量比为2.05∶1，步骤2所述混合液与带有羧基的葡聚糖的体积比为1∶3，步骤2所述透析时间为24h。

将上述外层包被有羧基葡聚糖的超顺磁性氧化铁微粒制成MRI对比剂，其中所述RNA 5′端氨基与葡聚糖上的羧基共价偶联的具体方法为：

洗涤上述制得的浓缩液，加入5mg/mL的N-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和10mg/mL的N-羟基硫代琥珀酰亚胺活化，磁分离去上清后洗涤，然后加入所述RNA，PBS调节RNA的浓度为1-1.2μg/μL进行偶联，然后磁分离去上清后封闭，再次磁分离去上清后洗涤即得所述MRI对比剂。

其中，所述包被有羧基葡聚糖的超顺磁性氧化铁微粒、N-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、N-羟基硫代琥珀酰亚胺的质量比为3-4∶2.5∶5，所述包被有羧基葡聚糖的超顺磁性氧化铁微粒与所述核苷酸的质量比为3-4∶1-1.2，所述洗涤为采用pH值为5.0-6.0的PBS进行洗涤，所述活化为在37℃、150-200转/分的转速下活化20-30分钟，所述封闭为37℃下用质量百分数为1％的BSA封闭。

在上述偶联步骤中，N-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)与葡聚糖上的羧基反应形成可与氨基反应的O-酰基脲中间体，但是此种中间体不稳定，容易被水解重新释放出羧基。在N-羟基硫代琥珀酰亚胺(suflo-NHS)存在下，EDC可将羧基转化成氨基反应活性的suflo-NHS酯，然后其上的羧基与本发明所述RNA共价偶联。

除上述方法外，还可以选用本领域其他常规方法。下面结合实施例进一步阐述本发明。

实施例1：制备本发明所述MRI对比剂

将10g葡聚糖T-40溶解在50ml水中，加热至70℃，搅拌，同时加入5ml的10mol/L的NaOH反应5h，再加入3ml的5mol/L氯乙酸，70℃恒温20min，待反应体系冷却后，用稀盐酸调节pH＝8；用甲醇沉淀反应物，在苯乙烯型阴阳离子型树脂(阴与阳离子型树脂的比例为1.5∶1)中纯化，在旋转蒸发器上50℃真空浓缩，然后将产物冻干，即得到带有羧基的葡聚糖T-40，备用。

制备5ml 1mol/L的FeCl₃·6H₂O，并加入660mg FeCl₂·4H₂O，N₂保护待用。称取上述带有羧基的葡聚糖T-405.0g溶解在15mL一次蒸馏水中，N₂保护下加热到75℃，加入配制好的FeCl₃·6H₂O-FeCl₂·4H₂O混合液，同时匀速滴加NH₄OH，充分搅拌，调节PH＝7，得到黑色的悬浮液，1500r/min离心10min，取上层清液。用凝胶色谱柱Sephacryl S-300HR(2.6cm×40cm)分离并收集首峰溶液，洗脱液为10mol/L的醋酸钠(pH＝6.5)，所得溶液在去离子水中透析24h，然后超滤浓缩为10mg/mL，制得由羧基葡聚糖T-40包被的超顺磁性氧化铁微粒的浓缩液，4℃存储备用。

取200μL上述浓缩液到2mL离心管，用500μL PBS(pH5.0-6.0)洗涤两次，磁分离后去上清；加入250μL EDC(5mg/mL)和250μLsuflo-NHS(10mg/mL)，涡旋混匀，37℃摇床内活化20-30分钟，转速150-200转/分；离心管放入磁分离器内磁分离去上清，加入500μl PBS(pH8.0-9.0)，混匀后磁分离器内磁分离去上清，PBS反复洗涤3-4次；加入600μg 5′端带有氨基的VEGF165-aptamer(本发明所述RNA)，用PBS将溶液调制500μL，充分混匀；37℃摇床内偶联4小时；离心管放入磁分离器磁分离去上清，加入1％BSA 0.5-1mL，37℃摇床内1小时封闭磁株；离心管放入磁分离器磁分离去上清，用PBS洗涤5次即得，4℃保存。经检测，所述MRI对比剂VEGF165-aptamer偶联量为1221pmol/mg。

实施例2：本发明所述MRI对比剂的偶联检测

将实施例1制备的MRI对比剂和本发明所述RNA进行1.8％琼脂糖凝胶电泳，结果见图2。由图2可知，未与羧基葡聚糖T-40包被的超顺磁性氧化铁微粒偶联的RNA条带大小在50bp以下，与实际一致。而偶联后的条带由于交联了羧基葡聚糖T-40包被的超顺磁性氧化铁微粒而阻碍了其在电泳中的迁移，紧邻点样孔，由此表明本发明所述MRI对比成功偶联。

实施例3：本发明所述MRI对比剂的体外靶向性细胞增殖试验

试验设计：设空白组、本发明所述MRI对比剂高剂量组、本发明所述MRI对比剂中剂量组、本发明所述MRI对比剂低剂量组以及非靶向性阴性MRI对比剂(菲立磁)组。

5组内添加同等数量的人脐静脉内皮细胞(HUVEC细胞)，空白组不添加VEGF165，剩余4组添加等量VEGF165刺激HUVEC细胞生长，高、中、低3组分别添加50μL、25μL、12.2μL本发明所述MRI对比剂，菲立磁组添加50μL菲立磁，用酶标仪统计检测结果，见图3。

由图3可知，50μL、25μL、12.2μL各组HUVEC细胞光密度值逐渐增加，表明HUVEC细胞数量逐渐增加，但始终大于空白组而小于菲立磁组，各组统计分析P＜0.05，有统计学意义。证明本发明所述MRI对比剂体外可与VEGF165有效结合，具有很强靶向性。

实施例4：本发明所述MRI对比剂的荷瘤小鼠活体靶向性试验

试验荷瘤小鼠为肝癌小鼠模型，对比剂采用实施例1制备的MRI对比剂和市售菲立磁。在注射对比剂前分别用磁共振仪平扫小鼠，扫描结果见图4，图中清晰可见小鼠腋下移植瘤肿瘤细胞，信号强度分别为2346(图4A)和2100(图4B)特斯拉。

然后，荷瘤鼠分别鼠尾静脉注射本发明所述MRI对比剂和菲立磁3.5mg后3小时MRI扫描，结果见图5，由图5可以看出，注射本发明所述MRI对比剂的肿瘤细胞的信号明显降低，信号强度为172特斯拉(图5A)；而注射菲立磁的肿瘤细胞的信号无明显变化，信号强度为1900特斯拉(图5B)。

注射后6小时MRI扫描，结果见图6，由图6可以看出，随着对比剂以及完成生物学功能的VEGF165在小鼠体内的降解，注射本发明所述MRI对比剂的肿瘤细胞的信号开始回升，信号强度为2076特斯拉(图6A)；而注射菲立磁的肿瘤细胞的信号仍无明显变化，信号强度为1900特斯拉(图6B)。

上述试验结果表明本发明所述MRI对比剂在荷瘤鼠活体内能以肿瘤区VEGF165为靶点靶向MRI成像，而注射等量的菲立磁各时间点信号降低不明显。

实施例5：制备本发明所述MRI对比剂

将10g葡聚糖T-40溶解在50ml水中，加热至70℃，搅拌，同时加入5ml的10mol/L的NaOH反应5h，再加入3ml的5mol/L氯乙酸，70℃恒温20min，待反应体系冷却后，用稀盐酸调节pH＝8；用甲醇沉淀反应物，在苯乙烯型阴阳离子型树脂(阴与阳离子型树脂的比例为1.5∶1)中纯化，在旋转蒸发器上50℃真空浓缩，然后将产物冻干，即得到带有羧基的葡聚糖T-40，备用。

制备5ml 1mol/L的FeCl₃·6H₂O，并加入660mg FeCl₂·4H₂O，N₂保护待用。称取上述带有羧基的葡聚糖T-405.0g溶解在15mL一次蒸馏水中，N₂保护下加热到75℃，加入配制好的FeCl₃·6H₂O-FeCl₂·4H₂O混合液，同时匀速滴加NH₄OH，充分搅拌，调节PH＝7，得到黑色的悬浮液，1500r/min离心10min，取上层清液。用凝胶色谱柱Sephacryl S-300HR(2.6cm×40cm)分离并收集首峰溶液，洗脱液为10mol/L的醋酸钠(pH＝6.5)，所得溶液在去离子水中透析24h，然后超滤浓缩为10mg/mL，制得由羧基葡聚糖T-40包被的超顺磁性氧化铁微粒的浓缩液，4℃存储备用。

取150μL上述浓缩液到2mL离心管，用500μL PBS(pH5.0～6.0)洗涤两次，磁分离后去上清；加入250μL EDC(5mg/mL)和250μLsuflo-NHS(10mg/mL)，涡旋混匀，37℃摇床内活化20-30分钟，转速150-200转/分；离心管放入磁分离器内磁分离去上清，加入500μl PBS(pH8.0-9.0)，混匀后磁分离器内磁分离去上清，PBS反复洗涤3-4次；加入500μg 5′端带有氨基的VEGF165-aptamer(本发明所述RNA)，用PBS将溶液调制500μL，充分混匀；37℃摇床内偶联4小时；离心管放入磁分离器磁分离去上清，加入1％BSA 0.5-1mL，37℃摇床内1小时封闭磁株；离心管放入磁分离器磁分离去上清，用PBS洗涤5次即得，4℃保存。

参照实施例2-4的方法，对本实施例制备的MRI对比剂进行检测，其中，在荷瘤小鼠中的试验采用肠癌小鼠模型。结果显示，本实施例制备的MRI对比剂能够以肿瘤区VEGF165为靶点，与VEGF165特异性结合并MRI成像，且避免了免疫源性问题。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种靶向性MRI对比剂的制备方法，其特征在于，将外层包被有羧基葡聚糖的超顺磁性氧化铁微粒用N-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺活化后，与SEQ ID NO:1所示序列5＇端修饰有氨基的RNA在37℃、200r/min下共价偶联4h，所述外层包被有羧基葡聚糖的超顺磁性氧化铁微粒、N-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺的质量比为3-4:2.5:5，所述外层包被有羧基葡聚糖的超顺磁性氧化铁微粒与所述RNA的质量比为3-4:1-1.2；

其中，所述RNA除从5＇端起第4、5位碱基未修饰外，其余碱基均人工修饰，所有嘧啶为核糖环2’位被氟修饰，所有嘌呤为核糖环2’位被甲基修饰，所述共价偶联为RNA5＇端氨基与葡聚糖上的羧基共价偶联。

2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述外层包被有羧基葡聚糖的超顺磁性氧化铁微粒通过以下方法获得：

氧化葡聚糖上羟基为羧基获得羧基葡聚糖，然后用共沉淀一步法与FeCl₃·6H₂O、FeCl₂·4H₂O制备即得外层包被有羧基葡聚糖的超顺磁性氧化铁微粒。

3.权利要求1-2任意一项所述制备方法制备的MRI对比剂。

4.根据权利要求3所述MRI对比剂，其特征在于，偶联量为每1mg外层包被有羧基葡聚糖的超顺磁性氧化铁微粒偶联1221pmol的所述RNA。

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