CN102575235B

CN102575235B - 用于通过发酵生产生物化学品的突变甲基乙二醛合酶(mgs)

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Publication number: CN102575235B
Application number: CN201080043839.3A
Authority: CN
Inventors: F.沃尔克; L.杜蒙-西格诺弗特; P.索凯勒
Original assignee: Metabolic Explorer SA
Current assignee: Metabolic Explorer SA
Priority date: 2009-07-30
Filing date: 2010-07-30
Publication date: 2015-05-20
Anticipated expiration: 2030-07-30
Also published as: WO2011012693A1; JP5913099B2; US8497102B2; CA2767962A1; KR20120047276A; CN102575235A; EP2459710B1; CA2767962C; JP2013500032A; IN2012DN00302A; BR112012002153A2; EP2459710A1; US20120122166A1; KR101771266B1

Abstract

本发明涉及用于产生生物化学品的方法，所述生物化学品选自乳酸、丙酮醇和1，2-丙二醇，所述方法包括在适当的培养基中培养经过修饰以改进生物化学品生产的微生物，所述生物化学品选自乳酸、丙酮醇和1，2-丙二醇，并回收所需的生物化学品，所述产品可以进一步纯化，其中所述微生物表达甲基乙二醛合酶(MGS)，其酶活性不受正磷酸盐的抑制。本发明涉及突变的甲基乙二醛合酶(MGS)，所述酶在亲本酶的蛋白序列中至少一个氨基酸残基由相同位置的不同氨基酸残基替代，其中-突变酶保留亲本酶的甲基乙二醛合酶活性的多于50％和-与亲本酶相比，突变MGS的甲基乙二醛合酶活性不受正磷酸盐的抑制。

Description

用于通过发酵生产生物化学品的突变甲基乙二醛合酶(MGS)

发明领域

本发明涉及产生选自乳酸、丙酮醇和1，2-丙二醇的生物化学品的方法，所述方法包括在合适的培养基中培养微生物，所述微生物经过修饰而改进选自乳酸、丙酮醇和1，2-丙二醇的生物化学品的产生，和回收所需的生物化学品，其可进一步纯化，其中微生物表达甲基乙二醛合酶(MGS)酶，所述酶的活性不受正磷酸盐的抑制。

本发明还涉及突变的甲基乙二醛合酶(MGS)，其在亲本酶的蛋白序列中包含至少一个由相同位置的不同氨基酸残基替代的氨基酸残基，其中

-突变酶保留亲本酶的甲基乙二醛合酶活性的多于50％和

-与亲本酶相比，突变MGS的甲基乙二醛合酶活性不受正磷酸盐抑制。

发明背景

甲基乙二醛合酶(MGS)被发现和鉴定为大肠杆菌中甲基乙二醛旁路中的第一个酶。之后在多种生物体中发现MGS，包括革兰氏阴性以及革兰氏阳性细菌和酵母(Cooper(1984))。甲基乙二醛旁路可以作为葡萄糖分解代谢过程中将磷酸丙糖转化为丙酮酸的替代途径(Cooper和Anderson(1970)，Cooper(1984))。Embden-Meyerhoff-Parnas(EMP)途径或糖酵解包括磷酸丙糖3-磷酸甘油醛(G3P)到丙酮酸的转化，而甲基乙二醛旁路由第二个磷酸丙糖，磷酸二羟基丙酮(DHAP)开始，将其通过中间体甲基乙二醛(MG)和乳酸转化为丙酮酸。

MGS，首先在大肠杆菌中纯化并表征(Hopper和Cooper(1971和1972))，可催化1摩尔DHAP转化为1摩尔MG和1摩尔正磷酸(Pi)。MGS对DHAP是非常特异性的，DHAP似乎是该酶以良好亲和力接受的唯一底物(亲和力常数Km在0.2-0.47mM变化)。鉴定了该酶的几种抑制剂：磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)、3-磷酸甘油酸、Pi和焦磷酸(PPi)。

近来在大肠杆菌中编码MGS的基因(yccG，后来重命名为mgsA)的鉴定使克隆和过表达mgsA基因之后重组MGS的生产和表征更容易(等(1998))。提出了酶的精细表征(Saadat和Harrison(1998))，并且进一步研究了最有力的抑制剂Pi的抑制：Pi作为酶的变构抑制剂，表示存在磷酸盐的情况下，进行酶反应需要更大量的DHAP(也可参见实施例2中给出的来自大肠杆菌的天然MGS的表征)。表征了几种MGS突变体(在位置D20、D71、D91、D10和H98上)，所述突变通常会降低酶的催化速率，并提出了催化机制(Saadat和Harrison(1998)，Marks等(2004))。在酶结晶后确定来自大肠杆菌的MGS的三维结构(Saadat和Harrison(1999和2000))。MGS是具有6个相同17kDa单元的均六聚体。磷酸盐能结合MGS的活性位点，并且提出了通过单体之间盐桥传送变构信息的假设，尽管没有给出明确的证据。

几种目的产物，乳酸、丙酮醇和1，2-丙二醇的产生，可以由不同碳底物(葡萄糖、果糖、蔗糖、甘油)经由甲基乙二醛旁路，特别是通过MGS的分解代谢而进行。

已经研究了细菌中甲基乙二醛分解代谢的途径(Ferguson等，1998)，以理解这个化合物的解毒，还用于1，2-丙二醇的产生。已在大肠杆菌中鉴定了三个能导致从甲基乙二醛产生乳酸的途径：

-第一个是依赖谷胱甘肽的乙二醛酶I-II系统(由gloA和gloB基因编码)，所述系统可以将甲基乙二醛在两个步骤中转化为D-乳酸(Cooper，1984)。

-第二个是不依赖谷胱甘肽的乙二醛酶III酶，其催化将甲基乙二醛在一个步骤中转化为D-乳酸(Misra等，1995)。

-第三个系统是通过甲基乙二醛还原酶降解甲基乙二醛，得到丙酮醇或者D-或L-乳醛(Cameron等，1998，Bennett和San，2001)。L-乳醛可进一步通过醛脱氢酶的作用，例如通过由aldA或aldB基因编码的酶的作用转化成L-乳酸(Grabar等，2006)。

由三个系统之一产生的乳酸可进一步通过D-或L-乳酸脱氢酶转化成丙酮酸。这些酶，与发酵的乳酸脱氢酶相反，是连接黄素的膜结合蛋白，其只在需氧条件下活化(Garvie，1980)。D-和L-乳酸脱氢酶在大肠杆菌中分别由dld和lldD(或lctD)基因编码(Rule等，1985，Dong等，1993)。

第三个系统产生的丙酮醇或乳醛可以通过几种酶活性，特别是大肠杆菌中的甘油脱氢酶(由gldA基因编码)或1，2-丙二醇氧化还原酶(由fucO基因编码)转化为1，2-丙二醇(Altaras和Cameron，2000)。

1，2-丙二醇或丙二醇，一种C3二醇，是广泛使用的化学品。它是不饱和聚酯树脂、液体清洁剂、冷却剂、防冻剂和航空器除冰流体的组分。自1993-1994年以来，由于用作乙烯衍生物的替代物，丙二醇的使用日益增加，因为认识到乙烯衍生物比丙烯衍生物的毒性更大。

1，2-丙二醇目前通过化学途径使用氧化丙烯水合过程产生，该过程消耗大量水。氧化丙烯可通过两个过程的任一产生，一个使用表氯醇，另一个使用氢过氧化物。两个途径都使用高毒性物质，此外，氢过氧化物途径生成副产物如叔丁醇和1-苯基乙醇。为了经济地产生丙烯，必须为这些副产物找到用途。化学途径通常产生外消旋1，2-丙二醇，而两个立体异构体(R)1，2-丙二醇和(S)1，2-丙二醇各自是某些应用(例如专用化学品和药物产品的手性起始材料)中感兴趣的。

丙酮醇或羟基丙酮(1-羟基-2-丙酮)是C3酮醇。这个产物在纺织业的瓮染过程中用作还原剂。它能有利地替代传统的含硫还原剂，从而降低危害环境的废水中的硫含量。丙酮醇也是化学工业的起始材料，例如用于产生多元醇或杂环分子。它还具备引人关注的螯合和溶剂性质。

丙酮醇目前主要通过1，2-丙二醇的催化氧化或脱氢而产生。现在提出了由可再生物料开始的新过程(参见DE4128692和WO 2005/095536)。目前，化学过程产生丙酮醇的成本削弱了其工业应用和市场。

用于产生1，2-丙二醇和丙酮醇的化学过程的劣势使生物合成成为具备吸引力的替代方法。MGS是从中央代谢开始产生这两个化合物所必经的第一步。已披露了使用不同的微生物，楔形梭菌(Clostridium sphenoides)(DE3336051)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)(WO 2004/087936)、重组酵母(WO99/28481)或重组大肠杆菌(E.coli)(WO 98/37204)产生1，2-丙二醇或丙酮醇的过程。也已经披露了产生1，2-丙二醇或丙酮醇的替代方法(WO 2005/073364、WO2008/116852、WO 2008/116848、WO 2008/116849、WO 2008/116851)。

乳酸或乳酸盐及其衍生物在食品、药物、皮革和纺织业中有广泛的应用。近来，聚乳酸(PLA)已经开发为可再生、生物可降解和环境友好的塑料，因此，预期对乳酸盐的需求将增加。可以通过化学合成或生物过程产生乳酸盐。然而，只有生物过程能产生所需的立体异构体，具有高光学纯度的D-或L-乳酸盐，这是对于其很多终端用途而言很重要的特性。PLA的物理性质和生物降解速率可以通过操纵手性底物，D-和L-乳酸盐的比例而控制。因此，生产光学纯D-和L-乳酸盐的生物过程的可用性是高质量聚合物合成的先决条件。

乳酸细菌是乳酸的天然生产者，并且发现其中对D-或L-形式是特异性的。这些细菌传统上已用于产生乳酸作为专用化学品(例如在US2004/0005677中)。然而，随着乳酸开始作为PLA合成的日用化学品，需要更有效和更经济的过程。研究了能在矿物盐培养基上生长和使用多种不同糖底物的替代生物催化剂。酵母和大肠杆菌将这些特性与多种遗传工具对于代谢工程的可用性组合。已经在WO 03102201、WO 03102152和US2005/0112737(酵母菌株)和EP 1760156和WO 2005/033324(大肠杆菌菌株)中描述了这些催化剂用于产生乳酸的用途。微生物中这些D-或L-乳酸的生产过程依赖于由NADH-依赖性乳酸脱氢酶通过糖的分解作用将丙酮酸还原(通常在厌氧条件下)。具有上述MG降解的三个途径的甲基乙二醛旁路能作为乳酸生产的可替代的非发酵途径，如PCT/EP2009/053093所述。

根据Pi对MGS的变构抑制，酶有活性所需的条件是高浓度的底物DHAP或低浓度Pi。当环境中Pi有限时，缺少其底物之一，G3P脱氢酶不能继续作用，因此将积累G3P以至于DHAP，满足MGS有效作用的两个条件。在这些条件下，甲基乙二醛旁路将替代磷酸丙糖分解代谢的糖酵解。当Pi丰富时，因为Pi的浓度过高而DHAP的浓度过低以使MGS不能成为有活性的，所以糖酵解将运行(Cooper(1984)，Fergusson等(1998))。这个机制使微生物可应对关于Pi的不同状况。然而，考虑到甲基乙二醛旁路中代谢物的产生，当这些分子是代谢的终产物时，两条平行途径，糖酵解和甲基乙二醛旁路将一起作用；糖酵解确保为生长供应前体和能量，而甲基乙二醛旁路用于合成所需的产物。在这种情况下，不受磷酸盐抑制的MGS酶会是明显的优势。

本发明人鉴定了不受磷酸盐的变构抑制的新突变MGS，同时保持其将DHAP转化为MG的大部分特异活性，如实施例2中通过表征纯化的酶所证明的。这些突变体的用途是设计用于产生甲基乙二醛旁路的产物，特别是丙酮醇、1，2-丙二醇和乳酸的更有效的过程中的关键要素。

发明简述

本发明涉及产生选自乳酸、丙酮醇和1，2-丙二醇的生物化学品的方法，所述方法包括在合适的培养基中培养微生物，所述微生物经过修饰而改进选自乳酸、丙酮醇和1，2-丙二醇的生物化学品的产生，和回收所需的生物化学品，其可进一步纯化，其中所述微生物表达活性不受正磷酸盐抑制的甲基乙二醛合酶(MGS)酶。

本发明涉及突变甲基乙二醛合酶(MGS)，所述酶在亲本酶的蛋白序列中包含至少一个由相同位置的不同氨基酸残基取代的氨基酸残基，其中

-突变酶保留亲本酶的甲基乙二醛合酶活性的多于50％和

本发明还涉及包含编码本发明的突变MGS的序列的DNA序列，和表达这种活性不受正磷酸盐抑制的MGS的微生物，特别是包含编码本发明突变MGS的基因的微生物。

发明详述

在本申请中，除非特别指出，否则使用的术语均具有它们通常的意义。

微生物

“微生物”指所有种类的单细胞生物，包括原核生物如细菌，和真核生物如酵母。优先地，微生物选自下组：细菌、酵母和真菌，更优先地选自肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、芽孢杆菌科(Bacillaceae)、链霉菌科(Streptomycetaceae)、梭菌科(Clostridiaceae)和棒状杆菌科(Corynebacteriaceae)。更优先地，微生物是埃希氏菌属(Escherichia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、泛菌属(Pantoea)、沙门氏菌属(Salmonela)、芽孢杆菌属(Bacillus)、链霉菌属(Streptomyces)、梭菌属(Clostridium)或棒状杆菌属(Corynebacterium)的菌种。甚至更优先地，微生物选自下组：大肠杆菌(Escherichia coli)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、热解糖热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum)、楔形梭菌(Clostridium sphenoides)或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。

如本文所使用的，术语“修饰的微生物”或“修饰的”或“重组的”指具有其基因组的修饰的宿主细胞，例如，通过添加不天然存在于生物体中的核酸，或者通过对天然存在于宿主细胞中的核酸进行修饰来进行。

“经过修饰而改进选自乳酸、丙酮醇和1，2-丙二醇的生物化学品的产生的微生物”是其中通过转化简单碳源而将有利于生产所需的生物化学品的途径已经过修饰的微生物。经过修饰而改进生产的微生物产生的所需的生物化学品比天然的、未修饰的微生物多。

图2表示用本发明的微生物生产乳酸、丙酮醇和丙二醇的优选生物合成途径。本领域的技术人员可以鉴定与待促进的途径相关的酶活性和待削弱的其它酶活性。

在Cameron等，1998，Bennett和San，2001，Ko等，2005和WO 99/28481，WO 98/37204，WO 2005/073364，WO 2008/116852，WO 2008/116848，WO2008/116849，WO 2008/116851，PCT/EP2009/053093(其内容通过提述并入本文)中也披露了经过修饰而改进通过转化甲基乙二醇生产乳酸、丙酮醇和1，2-丙二醇的微生物。

在酵母的情况中，宿主生物体的下述修饰是优选的：

●削弱下述基因中至少一个的表达：TPI1、NDE1、NDE2、GUT2、GPD1、GPD2、PDC1、PDC2、PDC5、PDC6、GLO1

●增强GRE3基因的表达。

在本发明的微生物中，编码本发明突变MGS的DNA序列可以引入载体，用于突变MGS的表达和翻译。也可以将其整合入所述微生物的染色体。

DNA序列的整合可以完整地，或者简单地通过在微生物的天然基因中引入编码序列中的突变而进行，即，由编码突变蛋白的氨基酸的核苷酸取代编码待改变的氨基酸的核苷酸。

微生物基因中的全部、部分或特定核苷酸取代是遗传工程领域中熟知的，包括Sambrook J等，Molecular cloning：a laboratory manual，Cold SpringHarbour Press，New York(2001)，Ausubel FM等，Current protocols in molecularbiology，John Wiley和sons，New York(1999)，Adams A等，Methods in yeastgenetics，Cold Spring Harbour Press，New York(1997)。

本发明的微生物可以额外地包含编码YqhD酶的基因，所述酶可增加对于NADPH的催化效率。

“可增加对于NADPH的催化效率”的YqhD酶指微生物中表达的YqhD酶对于NADPH的催化效率高于相同微生物的天然YqhD酶的对于NADPH的催化效率。催化效率定义为催化常数(Kcat)和米氏常数(Michaelis constant)(Km)之间的比例。YqhD酶催化效率的增加表示酶的Kcat增加或酶的Km减少。在一个优选的实施方案中，YqhD酶的Kcat增加而且YqhD酶的Km减少。

优选地，YqhD酶的对于NADPH的催化效率高于大肠杆菌的天然YqhD酶的效率。

这种酶优选地具有大肠杆菌的YqhD活性的至少50％，更优选大肠杆菌YqhD活性的至少60％的酶活性。

特别地，YqhD酶是突变YqhDS酶，其中

-突变酶保留亲本酶YqhD活性的多于50％和

-与亲本酶对于NADPH的催化效率相比，突变YqhD对于NADPH的催化效率增加。

优选地，突变YqhD包含选自下组的至少一个突变：G149E、G149S和A286T，和它们的组合。参照大肠杆菌的YqhD序列给出氨基酸位置。本领域的技术人员通过序列比对的标准技术可以在来自其它生物体的序列中找到相应的氨基酸。

本发明的微生物可以额外地包含编码甘油脱氢酶(GlyDH)酶的基因，所述酶具有NAD+和/或其底物和/或其产物对其活性的抑制下降。

“NAD+和/或其底物和/或其产物对其活性的抑制下降”指微生物中表达的GlyDH酶活性的抑制低于相同微生物的天然GlyDH酶活性的抑制。GlyDH酶活性的抑制可以通过抑制浓度50(IC50)或抑制常数(Ki)或技术人员已知的任何其它技术定义。GlyDH酶活性抑制下降指本发明的GlyDH酶的IC50或Ki高于天然GlyDH酶的IC50或Ki。技术人员知晓IC50和Ki之间的关系，以及它们在传统的Michaelis-Menten动力学中对于酶活性的意义。

优选地，GlyDH酶活性的抑制低于大肠杆菌的天然GlyDH酶活性的抑制。在一个优选的实施方案中，由NAD+、酶底物和酶产物组成的组中至少两个成员对于酶活性的抑制下降。更优选地，NAD+、其底物和其产物三者对酶活性的抑制下降。

酶“底物”是二羟基丙酮、羟基丙酮、甲基乙二醛、乳醛、甘油醛、乙二醇醛(glycolaldehyde)和它们的衍生物。

酶“产物”是由所选底物通过羰官能还原而获得的分子。

对于1，2-丙二醇的产生，底物是羟基丙酮，而产物是1，2-丙二醇。

特别地，GlyDH酶是突变酶，其中

-突变酶保留亲本酶活性的多于50％和

-与亲本酶相比，NAD+和/或其底物和/或其产物对突变GlyDH的甘油脱氢酶活性的抑制下降。

优选地，突变GlyDH优选包含选自下组的至少一个突变：A160T，T120N和它们的组合。参照大肠杆菌的GldA序列给出氨基酸位置。本领域技术人员可以通过序列比对的标准技术在来自其它生物体的序列中找到相应的氨基酸。

甲基乙二醛合酶(MGS)酶

本发明涉及其活性不受正磷酸盐抑制的甲基乙二醛合酶(MGS)，包含所述酶的微生物和用于通过在含简单碳源的培养基上发酵所述微生物而产生所需的生物化学品的方法。

“不受正磷酸盐抑制”或“无正磷酸盐的抑制”指在存在正磷酸盐的情况下研究酶活性时，在活性测定法中鉴定无正磷酸盐的抑制。这种活性测定法是本领域中熟知的并且能如实施例2所披露的进行。

此外，无论是否存在正磷酸盐，本发明MGS酶的动力学都遵从Michaelis-Menten动力学。天然酶的动力学仅在不存在正磷酸盐的情况下遵循Michaelis-Menten模型。正磷酸盐的存在使天然酶的动力学曲线(比活性对底物浓度)成S形(sigmoidal)，表明正磷酸盐的变构抑制。

这种酶优选地具有大肠杆菌甲基乙二醛合酶活性的至少50％的甲基乙二醛合酶活性。

可通过本领域技术人员已知的多种方法获得酶。

第一种方法包括筛选各种生物体不受正磷酸盐抑制的天然酶。

第二种方法包括诱导已知生物体的酶中的突变并选择不受正磷酸盐抑制的酶。可以通过本领域已知的方法诱导突变，如对微生物进行诱变剂处理。另一种诱导突变的方法是在选择压力下(以高水平正磷酸盐)生长微生物，鉴定在这种条件下生长的微生物，并选择获得的不受正磷酸盐抑制的酶。

本领域还已知其它方法以通过将各种来源的DNA重排并基于它们的甲基乙二醛合酶活性和它们不受正磷酸盐抑制的酶选择由如此获得重排的DNA编码的蛋白。

在本发明一个特定的实施方案中，本发明人通过如WO 2005/073364披露的和实施例1中所示，选择在选择压力下培养的经过修饰而改进乳酸、丙酮醇和/或1，2-丙二醇产生的菌株，从而获得保留其甲基乙二醛合酶活性且不受正磷酸盐抑制的几种突变体MGS。

本发明特别涉及突变甲基乙二醛合酶(MGS)，所述酶在亲本酶蛋白序列中包含至少一个在相同位置用不同氨基酸残基取代的氨基酸残基，其中

-突变酶保留亲本酶活性的多于50％和

-与亲本酶相比，突变MGS的甲基乙二醛合酶活性不受正磷酸盐的抑制。

“突变(体)”指人为将突变引入蛋白序列。根据本发明，突变酶是与亲本酶相比包含至少一个氨基酸差异的酶。在本发明的突变酶中，可以通过直接诱变或随机诱变在氨基酸中引入任何变化，也可以使用嵌合酶，其包含替代了亲本酶的相应部分另一个酶的部分。

“亲本酶”是突变之前的酶。亲本酶可以是任何来源的，天然的、自另一种生物体分离的或合成的。

用于确定突变MGS保留“多于50％”的方法是本领域中公知的并且在实施例2中披露。

事实上，技术人员可以根据突变MGS的最终用途选择所需活性的水平。事实上，当需要高活性时，技术人员可选择与未突变亲本酶相比具有多于80％活性，更优选多于90％活性的突变体。在其它情况下，选择与亲本酶相比具有大约50％和多于50％的突变MGS可防止微生物中的额外修饰，像修饰启动子以降低酶的表达水平。

本发明人发现在包含多至3mM正磷酸盐的培养基中，在相应亲本酶受到抑制时，突变酶的酶活性不受正磷酸盐的抑制。选择正磷酸盐的量，只要酶反应通常在微生物中发生即可。

根据本发明，“与亲本MGS相比不受正磷酸盐的抑制”应理解为在与在培养基上生长的微生物中正磷酸盐浓度相容的正磷酸盐浓度，所述培养基以与微生物生长相容的浓度包含正磷酸盐。

在一个优选的实施方案中，本发明的突变MGS在天然亲本MGS中包含鉴定区的至少一个在相同位置由不同氨基酸残基取代的氨基酸残基。

本发明人已经鉴定了突变体，其中天然亲本MGS中下述保守区(CR)之一的至少一个氨基酸残基在相同位置由不同氨基酸残基取代，三个保守区CR1、CR2和CR3鉴定如下：

-Xa1-Leu-Xa2-Xa3-His-Asp-Xa4-Xa5-Lys-(CR1)

其中

Xa1代表Ala和Val，优选Ala，

Xa2代表Val和Ile，

Xa3代表Ala和Ser，优选Ala，

Xa4代表Ala、Arg、Asn、Gin、Glu、His、Lys、Met和Ser，优选His和Lys，和

Xa5代表Arg、Cys、Gin、Lys、Met和Tyr，优选Cys和Lys

-Asp-Xa6-Xa7-Xa8-Xa9-X10-X11-His-X12-X13-Asp-X14-(CR2)

其中

Xa6代表Asp和Pro，优选Pro，

Xa7代表Leu和Met，优选Leu，

Xa8代表Asn、Glu、Ser和Thr，优选Asn和Thr，

Xa9代表Ala、Asn、Pro、Ser和Val，优选Ala，

X10代表Ala、Leu、Gln、Lys、Met和Val，优选Gln和Val，

X11代表Ala和Pro，优选Pro，

X12代表Asp和Glu，

X13代表Ala、Pro和Val，优选Pro，和

X14代表Ile和Val，优选Val

-X15-X16-X17-X18-Pro-X19-X20-X21-X22-(CR3)

其中

X15代表Ile、Leu和Val，优选Val，

X16代表Arg、Gln、His、Trp和Tyr，优选Trp和Tyr，

X17代表Ala、Asn、Arg、Asp、Gln、Glu、Gly、Lys和Ser，优选Asn，

X18代表Ile、Leu和Val，优选Ile，

X19代表Cys、His、Ile、Leu、Met和Val，优选Leu和Val，

X20代表Ala和Val，优选Ala，

X21代表Cys、Ile、Leu、Met和Thr，优选Thr，和

X22代表Asn和Thr，优选Asn。

使用标准序列比对工具如ClustalW2、Kalign、MAFFT、MUSCLE或T-coffee(全部可在网站http://www.ebi.ac.uk/上获得)通过简单的序列比对可在不同MGS酶中鉴定这些保守区。图1中给出了不同种的几个MGS的序列比对。

参照大肠杆菌的蛋白给出本申请中的氨基酸编号。

在图1中可以发现CR1对应于大肠杆菌MGS的氨基酸15-23，CR2对应于大肠杆菌MGS的氨基酸91-102，而CR3对应于大肠杆菌MGS的氨基酸111-119。

根据本发明，突变MGS在CR1、CR2或CR3之一中具有至少一个突变。它可以在CR1和CR2中，CR1和CR3中，或CR2和CR3中具有至少两个突变。它也可以在CR1、CR2和CR3中具有至少三个突变。

在上下文中，“至少”表示突变的酶可以有其它突变，但不与鉴定的保守区CR1、CR2和CR3相关。这些其它非鉴定的突变对本发明的突变酶没有实质影响，只要：

-突变酶保留亲本酶的甲基乙二醛合酶活性的多于50％和

在优选的实施方案中，由突变MGS中相同位置的不同氨基酸残基取代的亲本MGS中保守区CR1至CR3中的氨基酸残基选自下组：CR1中的氨基酸Xa4、CR2中的氨基酸Xa9和CR3中的氨基酸X19和它们的组合(CR1&CR2、CR1&CR3、CR2&CR3和CR1&CR2&CR3)。

Xa4对应于大肠杆菌MGS序列中的氨基酸21。Xa9对应于大肠杆菌MGS序列中的氨基酸95。X19对应于大肠杆菌序列中的氨基酸116。

特别地，本发明的突变MGS包含选自下组的至少一个突变：H21Q、A95V、V116L，和它们的组合，参照大肠杆菌的MGS序列给出氨基酸位置。

更优选地，本发明的突变MGS在保守区CR1至CR3中包含下述氨基酸序列中的至少一个

-CR1：Ala Leu Val Ala His AspCys Lys

-CR2：Asp Pro Leu AsnVal Pro His Asp Pro Asp Val

-CR3：Val Trp Asn Ile ProAla Thr Asn

用粗体和下划线标出的氨基酸残基对应于突变MGS中不同于亲本MGS的氨基酸的氨基酸。

特别地，本发明的突变MGS与大肠杆菌MGS序列相比具有至少50％的序列同一性，只要其在CR1和/或CR2中包含至少一个下述突变：

-CR1：Ala Leu Val Ala His AspCys Lys

-CR2：Asp Pro Leu AsnVal Pro His Asp Pro Asp Val

-CR3：Val Trp Asn Ile ProAla Thr Asn。

使用EBI网站(见上文)可得到的CLUSTALW2，将大肠杆菌的MGS序列与待比较的蛋白序列以默认参数进行序列比对，然后定义序列同一性。然后通过在相同位置同样氨基酸的数目与参照序列(大肠杆菌)中氨基酸的总数的比值，以序列比对计算序列同一性。

优选地，突变MGS具有至少70％的序列同一性。

在最优选的实施方案中，本发明的突变MGS包含选自下组的序列：SEQID NO 1、SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3中鉴定的MGS。

DNA、载体、基因

本发明还涉及包含编码本发明的突变MGS的序列的DNA序列。编码本发明的突变MGS的序列本身不是限定因素。技术人员能够轻易地从微生物获得天然MGS的序列，并通过改变一个或多个合适的核苷酸而在编码序列引入待引入蛋白质中的突变。

技术人员还能在微生物序列中进行诱变，并通过标准方法分离突变的DNA序列。

通过常用的方法如聚合酶链式反应(PCR，参见Sambrook J等，Molecularcloning：a laboratory manual，Cold Spring Harbour Press，New York(2001)，Ausubel FM等，Current protocols in molecular biology，John Wiley和sons，NewYork(1999)，Adams A等，Methods in yeast genetics，Cold Spring Harbour Press，New York(1997))，或通过随机突变技术，如使用诱变剂(紫外线或化学试剂如亚硝基胍(NTG)或甲烷磺酸乙酯(EMS))或使用PCR技术(DNA重排或易错PCR)，用定点诱变引入突变。

本领域的技术人员还能制备合成基因，其具有选择的优选密码子用于在特定生物体中改进的表达。多种生物体的密码子选择是本领域中公知的并且几家公司正在生产密码子优化的合成基因。

本发明的序列可以是分离的，由上述编码序列组成，或者在包含编码序列的上游和下游用于其在特定生物体中表达的调节元件的基因中。

序列还可存在于载体中，用于其在微生物中复制(复制载体)或用于本发明突变的蛋白质在微生物中的表达和翻译(表达载体)。这种载体是本领域中公知的，并且不是本发明定义的限定因素。

所述基因和载体也是本发明的一部分。

优选地，本发明的DNA序列在具有允许本发明的突变MGS的表达和翻译的调节元件的微生物中。

乳酸、丙酮醇或1，2-丙二醇的产生

本发明还涉及通过发酵生产选自乳酸、丙酮醇和1，2-丙二醇的生物化学品的方法，所述方法包括培养本发明的微生物，所述微生物经过修饰而改进乳酸、丙酮醇和/或1，2-丙二醇的产生，和回收所述生物化学品。

在一个特定的实施方案中，纯化回收的乳酸和/或丙酮醇和/或1，2-丙二醇。

纯化乳酸、丙酮醇和1，2-丙二醇的方法是本领域中公知的，并在Datta和Henry，2006，Wasewar，2005，US5076896和WO 2007/074066中描述。

有利地，根据微生物发酵领域的技术人员已知过程，产生可以通过在分批、补料分批或连续过程中通过发酵进行。优选地，产生通过在补料分批过程中通过发酵而进行。

培养基和碳源

在本发明的生产方法中，在合适的培养基上培养微生物。

“合适的培养基”指适合于微生物生长的已知分子组成的培养基。特别地，所述培养基至少包含磷源和氮源。所述合适的培养基是例如适合于所用细菌的已知设定组成的矿物质培养基，其包含至少一种碳源。所述合适的培养基还可以是包含氮源和/或磷源的任何液体，所述液体加入和/或混合至蔗糖源中。特别地，用于肠杆菌科的矿物质生长培养基的组成因而可与M9培养基(Anderson，1946)、M63培养基(Miller，1992)或如Schaefer等(1999)所定义的培养基相同或相似。

在这个培养基中，碳源“葡萄糖”可以由任何其它碳源代替，特别是由蔗糖或任何含蔗糖碳源如甘蔗汁或糖甜菜汁代替。

“碳源”或“碳底物”指任何能由微生物代谢的碳源，其中所述底物包含至少一个碳原子。

优选地，碳源选自下组：葡萄糖、蔗糖、单糖或寡糖、淀粉或其衍生物或甘油和它们的混合物。

事实上本发明方法中使用的微生物可进行修饰以使其能在特定碳源上生长，而未修饰微生物不能在相同的碳源上生长，或以低速率生长。当碳源是生物质降解的副产物如甘蔗副产物(包括来自原汁澄清的滤饼和不同种类的糖蜜)时，这些修饰可为必需的。

附图简述

图1代表多种来源MGS的36个蛋白序列的比对。序列获得自UniProtKnowledge Base(The UniProt consortium(2008))，并且使用MUSCLE，用默认参数进行比对。

图2代表在本发明的微生物中生产乳酸、丙酮醇和1，2-丙二醇的代谢途径。

图3代表在SDS 4-15％梯度聚丙烯酰胺凝胶上对蛋白mgsA*V116L的不同纯化步骤的分析。泳道1：分子量标志物，泳道2：粗提物，泳道3，第一硫酸铵沉淀的上清，泳道4，第二硫酸铵沉淀的沉淀，泳道5，Resource Q汇集物，泳道6，MonoQ汇集物，泳道7，superdwx 200汇集物，泳道8，用BSA的最终汇集物。

实施例

实施例1：3株修饰的大肠杆菌MG1655菌株在恒化培养中的进化和进化克隆中3个突变MGS酶的鉴定：

菌株大肠杆菌MG1655 lpd*ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::Km，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，Δedd(菌株1)，大肠杆菌MG1655 lpd* ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ΔldhA::Cm，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，Δedd(菌株2)和大肠杆菌MG1655 lpd* ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ΔldhA，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，Δedd，ΔarcA，Δndh::Km(菌株3)的构建，对于菌株1先前在专利申请WO 2005/073364中描述，对于菌株2和3在专利申请WO 2008/116852中描述。

为了向改进1，2丙二醇生产的方向进化，在连续培养中，或者在厌氧条件下，或者在微氧条件下(1％氧)，在含0.42或0.84g/l硝酸钠，及过量葡萄糖(如果葡萄糖耗尽则起初添加20g/l)的培养基MPG(在专利申请WO2008/116852中给出)中培养这3株菌株。温度设为37℃，通过加入碱将pH调为6.5，并将恒化器的稀释率设为0.04-0.08h^-1。在恒化器中进化菌株后，在几周中，生物质浓度增加，其与产物1，2-丙二醇和副产物乙酸的增加偶联。这表示菌株性能的改进。当培养到达稳态，而在这些条件下浓度不再进一步增加时，进化完成。

评价进化前后的菌株特性。在培养皿上分离代表个体克隆的单菌落。使用初始菌株作为对照，使用与恒化培养所用相同的培养基MPG但用MOPS缓冲，在锥形瓶试验中评价这些克隆。在这些克隆中，与对照相比，几株表现出更好的1，2-丙二醇比生产速率(specific production rate)。在每种进化条件下对最佳克隆获得的结果报道于下面的表1-3中。

表1：在厌氧条件下进化81天后最佳进化克隆与初始菌株的比较

表2：在厌氧条件下进化66天后最佳进化克隆与初始菌株的比较

表3：在微氧条件下进化132天后最佳进化克隆与初始菌株的比较

在菌株1、菌株2和菌株3的3个最佳进化克隆中对终端1，2-丙二醇生物合成途径的涉及的特定基因测序。对于每个克隆，鉴定了一个突变mgsA基因，其导致突变MGS蛋白的表达：菌株1进化克隆的MgsA*(A95V)(SEQ IDNO 1)，菌株2进化克隆的MgsA*(H21Q)(SEQ ID NO 2)和菌株3进化克隆的MgsA*(V116L)(SEQ ID NO 3)。

实施例2：天然MGS和3个突变MGS(H21Q，A95V&V116L)的产生、纯化和表征

1.产生MGS蛋白的菌株的构建

1.1过量表达mgsA：pETTOPO-mgsA的质粒的构建

建立质粒以获得天然蛋白(无His-tag)的过量表达。使用下述寡核苷酸从大肠杆菌MG1655的基因组DNAPCR扩增基因mgsA(序列1025780-1026238)：

●pETTOPO mgsAF(由24pb组成)：

atggaactgacgactcgca，(SEQ ID NO 4)

具有-与基因mgsA的序列(1026238-1026220)同源的区(带下划线的字母)。

-用于定向克隆质粒pET101中的片段的区(粗体)。和

●pETTOPO-N mgsAR(由23pb组成)：

Ttacttcagacggtccgcgagat (SEQ ID NO 5)

具有与基因mgsA序列(1025780-1025802)同源的区(带下划线的字母)。

将扩增的片段由“Champion pET Directional TOPO Expression Kit”直接克隆入pET101中。将构建的质粒命名为pETTOPO-mgsA。

1.2过量表达mgsA＊的质粒的构建

三个突变MGS携带突变H21Q、A95V或V116L。使用来自的Quickchange定点诱变试剂盒，用表4给出的寡核苷酸，通过在质粒pETTOPO-mgsA中定向突变而建立用于过量表达这三个变体蛋白的质粒。

表4：用于mgsA定点诱变的寡核苷酸

获得的这3个质粒命名为pETTOPO-mgsA*(A95V)、pETTOPO-mgsA*(V116L)和pETTOPO-mgsA*(H21Q)。

1.3BL21star(DE3)ΔmgsA::Cm的构建

为了避免质粒表达的变体蛋白和染色体表达的野生型蛋白之间的混合，缺失了用来进行过量表达的菌株中的mgsA基因。

1.3.1菌株MG1655ΔmgsA::Cm的构建

通过插入氯霉素抗生素抗性盒并根据方案1缺失大多数相关基因而在菌株大肠杆菌MG1655中失活基因mgsA。

方案1：引入PCR产物用于重组和重组子的选择(FRT系统)。

使用表5中选择和给出的用于替代基因或基因间区的寡核苷酸，从质粒pKD3扩增氯霉素抗性盒或从质粒pKD4扩增卡那霉素抗性盒(Datsenko，K.A.和Wanner，B.L.(2000))。然后通过电穿孔将获得的PCR产物引入携带质粒pKD46的受体菌株中，其中表达的系统λRed(γ，β，exo)极利于同源重组。然后选择抗生素抗性的转化子，并通过PCR分析以表6中给出的合适的寡核苷酸检查抗性盒的插入。

如果在菌株中有其它修饰，用表6中给出的寡核苷酸检查。

将得到的菌株命名为大肠杆菌MG1655ΔmgsA::Cm。

表5：用于通过与PCR产物重组而替代染色体区的寡核苷酸

表6：用于检查抗性盒插入或抗性盒丢失的寡核苷酸

1.3.2.菌株BL21star(DE3)ΔmgsA::Cm的构建

通过噬菌体P1转导技术，由菌株大肠杆菌BL21star(DE3)中的氯霉素抗性盒替代基因mgsA而进行该基因的缺失。

方案2：用噬菌体P1转导以缺失基因

通过用噬菌体P1转导的技术，在受体大肠杆菌菌株中由抗性盒(卡那霉素或氯霉素)替代所选择的基因而缺失该基因。方案有两个步骤，(i)在缺失单个基因的菌株MG1655上制备噬菌体裂解物和(ii)通过这个噬菌体裂解物转导受体菌株。

噬菌体裂解物的制备

-接种100μl缺失单个基因的菌株MG1655的过夜培养物于10mlLB+Cm 30μg/ml+葡萄糖0.2％+CaCl₂5mM。

-在37℃振荡温育30分钟。

-向野生型菌株MG1655加入制备的100μl噬菌体裂解物P1(约1x10⁹个噬菌体/ml)。

-在37℃振荡3小时直至所有细胞裂解。

-加入200μl氯仿，并漩涡振荡。

-以4500g离心10分钟以消除细胞碎片。

-将上清转移至无菌管中并加入200μl氯仿。

-在4℃保存裂解物。

转导

-将LB培养基中大肠杆菌受体菌株的5ml过夜培养物以1500g离心10分钟。

-在2.5ml MgSO₄ 10mM，CaCl₂ 5mM中悬浮细胞沉淀。

-对照管：100μl细胞

缺失单个基因的菌株MG1655的100μl噬菌体P1。

-测试管：100μl细胞+缺失单个基因的菌株MG1655的100μl噬菌体P1。

-在30℃无振荡温育30分钟。

-每管加入100μl 1M柠檬酸钠，并漩涡振荡。

-加入1ml LB。

-在37℃振荡温育1小时

-在以7000rpm将管离心3分钟后涂布于LB板+Cm 30μg/ml上。

-在37℃过夜温育。

然后选择抗生素抗性的转化子，并用表6给出的合适的寡核苷酸通过PCR分析检查缺失的插入。

将得到的菌株命名为大肠杆菌BL21 star(DE3)ΔmgsA::Cm。

1.4.在菌株BL21star(DE3)ΔmgsA::Cm中引入质粒

通过电穿孔将质粒pETTOPO-mgsA、pETTOPO-mgsA*(A95V)、pETTOPO-mgsA*(V116L)、pETTOPO-mgsA*(H21Q)转化入菌株大肠杆菌BL21star(DE3)ΔmgsA::Cm中，并将获得的菌株分别命名为：

-BL21star(DE3)ΔmgsA::Cm pETTOPO-mgsA

-BL21star(DE3)ΔmgsA::Cm pETTOPO-mgsA*(A95V)

-BL21star(DE3)ΔmgsA::Cm pETTOPO-mgsA*(V116L)

-BL21star(DE3)ΔmgsA::Cm pETTOPO-mgsA*(H21Q)

2.MGS蛋白的产生

在37℃和需氧条件下在包含500ml含2.5g/l葡萄糖的LB培养基的21带挡板锥形瓶中培养四株菌株BL21star(DE3)ΔmgsA::Cm pETTOPO-mgsA、BL21star(DE3)ΔmgsA::Cm pETTOPO-mgsA*(A95V)、BL21star(DE3)ΔmgsA::CmpETTOPO-mgsA*(V116L)和BL21 star(DE3)ΔmgsA::CmpETTOPO-mgsA*(H21Q)。摇瓶在定轨摇床上以200rpm振荡。当在550nm测量的光密度达到0.5单位时，在25℃温育摇瓶。当光密度达到1.2单位时，通过在培养物中加入500μMIPTG而诱导MGS蛋白的产生。当培养物达到3.5单位以上的光密度时通过离心收获生物质。弃去上清并将沉淀在使用前保存在-20℃。

3.MGS的活性试验

使用根据Hopper和Cooper (1972)改写的偶联活性试验确定酶活性。通过MGS将磷酸二羟基丙酮(DHAP)转化成甲基乙二醛(MG)。MG的形成与S-D-乳酰谷胱甘肽的形成相偶联，所述形成通过与谷胱甘肽非酶促形成硫代半乙缩醛和之后通过乙二醛酶I将复合物异构化而进行。在30℃在分光光度计上测量240nm处吸光度的增加速率，其对应于S-D-乳酰谷胱甘肽的形成并因此对应于MG的形成。标准试验混合物由1.5mM DHAP、1.5mM谷胱甘肽、50mM咪唑(pH7.0)、2单位酵母乙二醛酶I和30μl MGS样品(以1000μL的总体积)组成。平行进行缺少MGS样品的对照试验，并从试验减去对照的测量值，从而考虑MG或S-D-乳酰谷胱甘肽的非特异性形成。加入MGS样品后，通过跟踪240nm处的吸光度随时间增加而测量初始速率。一单位MGS活性定义为在试验条件下形成1μmol MG/min。比酶活性用单位每mg蛋白表示。

4.MGS酶的纯化

使用相同的方案纯化四种蛋白MgsA、MgsA*(V116L)、MgsA*(H21Q)、MgsA*(A95V)。本方案根据Hooper和Cooper(1972)改写。

所有层析柱在室温下运行。纯化步骤之间的级分保存于4℃。

4.1.步骤1：无细胞提取物的制备

将350-400mg的大肠杆菌生物质重悬于70ml的50mM咪唑、1mM磷酸钾pH 7和蛋白酶抑制剂混合物中。在Rosett Cell RZ3中于冰上对细胞声处理(Branson sonifier，70W)，共六个循环，每个循环30秒及间隔30秒。然后通过在4℃以12000g离心30min而去除细胞碎片。将上清液保留为粗提物。

4.2.步骤2：硫酸铵沉淀

在冰上向粗提物加入固体硫酸铵(209g/l)。4℃温育15分钟后，通过在4℃于12000g离心15分钟而去除沉淀并弃去。在0℃向上清溶液加入更多硫酸铵(111g/l)。4℃离心15分钟后，将混合物在4℃于12000g离心15分钟。弃去上清并将沉淀溶于200ml的50mM咪唑，1mM磷酸钾pH 7中。

4.3.步骤3：阴离子层析pH 7

使用Akta Purifier(GE Healthcare)，将重悬于50mM咪唑，1mM磷酸钾pH 7的一半硫酸铵沉淀(100ml)加载于用相同的缓冲液平衡的6ml ResourceQ柱(GE Healthcare)。实现两次运行。对于每次运行，用10倍柱体积的相同缓冲液洗涤柱。用20倍柱体积的0M-0.5M氯化钠梯度洗脱蛋白。洗脱后，用1倍柱体积的梯度0.5M-1M氯化钠和5倍柱体积的1M氯化钠洗涤柱。柱的流速为2ml/分钟，并收集5ml组分。

用150mM氯化钠洗脱MGS蛋白。

汇集包含MGS蛋白的级分，并对于50mM咪唑，1mM磷酸钾，100mMNaCl pH 8过夜透析。

4.4.步骤4：阴离子层析pH 8

将透析汇集物施于用50mM咪唑，1mM磷酸钾，100mM NaCl pH8平衡的1.7ml Mono Q柱(GE Healthcare)。为了避免柱过载，运行4次。对于每次运行，用10倍柱体积的50mM咪唑，1mM磷酸钾，100mM NaCl pH 8洗涤柱。用20倍柱体积的0.1M-0.5M氯化钠梯度洗脱蛋白。洗脱后，用1倍柱体积的0.5M-1M氯化钠梯度和5倍柱体积的1M氯化钠洗涤柱。柱的流速为1.5ml/分钟，并收集2ml级分。

用约200mM氯化钠洗脱MGS蛋白。汇集并浓缩包含MGS蛋白的级分以加载于凝胶过滤柱上。

4.5.步骤5：凝胶过滤

将来自Mono Q柱的浓缩级分加载于用50mM咪唑，1mM磷酸钾，350mM NaCl pH 7平衡的Superdex 20010/300GL柱(GE Healthcare)。实现四次运行。柱的流速为0.5ml/分钟并收集0.5ml组分。用约13.5ml缓冲液洗脱MGS蛋白。突变MGS的表达和纯化与野生型酶非常相似。天然mgsA和突变mgsA*之间的寡聚化没有差别。

所有蛋白在存在0.1mg/ml BSA的情况下储存于4℃以稳定蛋白。

在SDS 4-15％梯度聚丙烯酰胺凝胶上分析每个纯化步骤的汇集物(图3)。此凝胶显示纯度随着纯化步骤而增加。在Superdex 200柱后，蛋白为几乎90％纯。最后的汇集物显示在约17kDa对应于蛋白MgsA和在约70kDa对应于用于稳定酶的BSA的两个主要条带。

5.不存在正磷酸盐的情况下对MGS酶的表征

使用前述活性试验确定四个纯化酶(MgsA、MgsA*(V116L)、MgsA*(H21Q)和MgsA*(A95V))的动力学常数(Km、kcat和kcat/Km)。对于每个酶分析0.08mM-1.5mM的至少六个DHAP浓度。对于所有动力学，在所有DHAP浓度一式三份测定初始速度。

在活性试验前，将在50mM咪唑，1mM磷酸钾，350mM NaCl，0.1mg/mlBSApH 7中于4℃储存的纯化蛋白在50mM咪唑，10％甘油，0.1mg/ml BSApH 7中稀释。

用来自软件Sigma Plot(Systat Software Inc，San Jose CA)的模块酶动力学计算每个蛋白的动力学常数。显示Michaelis-Menten的数据组符合Michaelis-Menten方程。下表汇编了四个MGS的不同动力学参数。

表7：无Pi时MGS酶的动力学参数

不存在正磷酸盐的情况下四个酶(天然MGS和3个突变MGS)的动力学参数非常相似。Km值良好地符合先前报道的天然酶的0.20±0.03mM的数值(Saadat和Harrison，1998)。

由kcat值直接计算每个MGS的比活性。MgsA和MgsA*(H21Q)的比活性相似。MgsA*(A95V)的比活性代表MgsA比活性的75％。MgsA*(V116L)的比活性代表MgsA比活性的50％。突变并未不利于酶的活性。

6.存在正磷酸盐的情况下MGS酶的表征

在活性试验中存在不同浓度磷酸钾(0.2mM、0.3mM、1mM正磷酸盐(Pi))的情况下，确定在50mM咪唑，1mM磷酸钾，350mM NaCl，0.1mg/ml BSApH 7中于4℃储存的四个纯化酶(MgsA、MgsA*(V116L)、MgsA*(H21Q)和MgsA*(A95V))的动力学常数(Km、kcat和kcat/Km)。在活性试验前，将蛋白用50mM咪唑，10％甘油，0.1mg/ml BSA pH 7稀释。为了精确确定这些动力学参数，对于0.08mM-1.5mM的至少六个底物(DHAP)浓度，所有初始速度的测量一式三份进行。

用来自软件Sigma Plot的模块酶动力学确定在每种磷酸钾浓度(0.2mM、0.3mM、1mM Pi)下每个蛋白的动力学常数。表8中汇编了MGS酶的不同动力学参数。

表8：存在各种浓度Pi时MGS酶的动力学参数

对于天然MgsA，在不存在磷酸盐的情况测量在多个DHAP浓度的活性时，酶显示标准的Michaelis-Menten动力学。然而，0.2-0.3mM浓度的Pi的存在使DHAP的响应成为S形，并且提高Pi浓度会使S形响应更明显。因此，酶的Km迅速增加。这表明正磷酸盐对MGS酶的变构抑制，如文献(Saadat和Harrison，1998)中已经描述的。

对于三个突变MGSA*(V116L)、MgsA*(H21Q)和MgsA*(A95V)，在全部Pi浓度，动力学符合Michaelis-Menten方程，并且没有发现Pi的变构抑制。不存在和存在正磷酸盐的情况下，Michaelis-Menten曲线非常相似。

总之，3个突变MGS的性质非常相似：突变MGS没有天然MGS酶所显示的受正磷酸盐的变构抑制。

实施例3：表达野生型或修饰的MGS的两个大肠杆菌1，2-丙二醇生产菌株的构建和1，2-丙二醇生产的评价

1.修饰菌株大肠杆菌MG1655，mgsA＊(H21Q)::Km，Δedd-eda，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，ΔarcA，Δndh(pME101-VB01-yqhD＊(G149E)-gldA＊(160T)的构建。

1.1.修饰菌株大肠杆菌ΔgloA::Cm的构建

使用方案1中所述技术，用表5中给出的寡核苷酸，通过插入氯霉素抗生素盒并缺失相关基因的大部分而失活菌株大肠杆菌MG1655中的基因gloA。用表6中给出的合适的寡核苷酸，通过PCR分析检查缺失。将得到的菌株命名为大肠杆菌MG1655ΔgloA::Cm。

1.2.修饰菌株大肠杆菌ΔgloA::Cm Δedd-eda::Km的构建

1.2.1.修饰菌株大肠杆菌Δedd-eda::Km的构建

使用方案1中所述技术，用表5中给出的寡核苷酸，通过插入卡那霉素抗生素盒并缺失相关基因的大部分而失活菌株大肠杆菌MG1655中的基因edd-eda。用表6中给出的合适的寡核苷酸，通过PCR分析检查缺失。将得到的菌株命名为大肠杆菌MG1655Δedd-eda::Km。

1.2.2.修饰菌株大肠杆菌ΔgloA::Cm，Δedd-eda::Km的构建

根据方案2，通过用噬菌体P1转导的技术由卡那霉素抗性盒替代基因edd-eda而进行菌株大肠杆菌ΔgloA::Cm中所述基因的缺失。

方案2：用噬菌体P1转导缺失基因

通过用噬菌体P1转导的技术，由抗性盒(卡那霉素或氯霉素)替代所选的基因而进行受体大肠杆菌菌株中该基因的缺失。方案为两个步骤，(i)制备缺失单个基因的菌株MG1655的噬菌体裂解液和(ii)通过此噬菌体裂解液转导受体菌株。

噬菌体裂解液的制备

-用缺失单个基因的菌株MG1655的100μl过夜培养物接种10ml LB+Cm 30μg/ml+葡萄糖0.2％+CaCl₂5mM。

-37℃振荡温育30分钟。

-向野生型菌株MG1655添加制备的100μl噬菌体裂解液P1(约1x10⁹噬菌体/ml)。

-37℃振荡3小时直至所有细胞裂解。

-加入200μl氯仿，并漩涡振荡。

-4500g离心10分钟以消除细胞碎片。

-将上清转移至无菌管中并加入200μl氯仿。

-在4℃保存裂解液。

转导

-将细胞沉淀悬浮于2.5ml的MgSO₄ 10mM，CaCl₂ 5mM中。

-对照管：100μl细胞

100μl单个基因缺失的菌株MG1655的噬菌体P1

-管测试：100μl细胞+100μl单个基因缺失的菌株MG1655的噬菌体P1。

-30℃无振荡温育30分钟。

-每个管加入100μl 1M柠檬酸钠，并漩涡振荡。

-加入1ml LB。

-37℃振荡温育1小时。

-7000rpm将管离心3分钟后涂布在板LB+Cm 30μg/ml上。

-37℃过夜温育。

然后选择抗生素抗性的转化子，并用表6中给出的合适的寡核苷酸，通过PCR分析检查缺失的插入。

用表6中给出的合适的寡核苷酸，通过PCR分析检查缺失，以及菌株中已经存在的其它缺失。

将得到的菌株命名为大肠杆菌ΔgloA::Cm，Δedd-eda::Km。

1.3.修饰菌株大肠杆菌MG1655ΔgloA，Δedd-eda的构建

根据方案3消除菌株大肠杆菌ΔgloA::CmΔedd-eda::Km中的抗生素抗性盒。

方案3：抗性盒的消除(FRT系统)

根据下述技术消除氯霉素和/或卡那霉素抗性盒。将携带FLP重组酶的质粒pCP20通过电穿孔引入菌株，所述重组酶在氯霉素和/或卡那霉素盒的FRT位点作用。在42℃系列培养后，用表5中给出的寡核苷酸，通过PCR分析检查抗生素抗性盒的丢失。

使用表6中给出的寡核苷酸检查菌株中先前建立的修饰的存在。

将获得的菌株命名为大肠杆菌MG1655ΔgloAΔedd-eda。

1.4.修饰菌株大肠杆菌MG1655Δedd-eda ΔgloA，ΔaldA::Cm的构建

1.4.1.修饰菌株大肠杆菌MG1655ΔaldA::Cm的构建

使用方案1中所述技术，用表5中给出的寡核苷酸，通过插入氯霉素抗生素盒并缺失相关基因的大部分而失活菌株大肠杆菌MG1655中的基因aldA。用表6中给出的合适的寡核苷酸，通过PCR分析检查缺失。

将得到的菌株命名为大肠杆菌MG1655ΔaldA::Cm。

1.4.2.修饰菌株大肠杆菌MG1655Δedd-eda ΔgloA，ΔaldA::Cm的构建

通过用噬菌体P1转导的技术(方案2)，由氯霉素抗性盒替代基因aldA而进行菌株大肠杆菌MG1655Δedd-edaΔgloA中该基因的缺失。

用表6中给出的合适的寡核苷酸检查缺失ΔaldA::Cm和其它修饰。

将得到的菌株命名为大肠杆菌MG1655Δedd-edaΔgloA，ΔaldA::Cm。

1.5.修饰菌株大肠杆菌MG1655Δedd-eda，ΔgloA，ΔaldA::Cm，ΔaldB::Km的构建

1.5.1.修饰菌株大肠杆菌MG1655ΔaldB::Km的构建

使用方案1中所述技术，用表5中给出的寡核苷酸，通过插入卡那霉素抗生素盒并缺失相关基因的大部分而失活菌株大肠杆菌MG1655中的基因aldB。用表6中给出的合适的寡核苷酸，通过PCR分析检查缺失。

将得到的菌株命名为大肠杆菌MG1655ΔaldB::Km。

1.5.2.修饰菌株大肠杆菌MG1655Δedd-eda ΔgloA，ΔaldA::Cm，ΔaldB::Km的构建

通过用噬菌体P1转导的技术(方案2)，由卡那霉素抗性盒替代基因aldA而进行菌株大肠杆菌MG1655Δedd-edaΔgloA ΔaldA::Cm中该基因的缺失。

用表6中给出的合适的寡核苷酸检查缺失ΔaldB::Km和其它修饰。

将得到的菌株命名为大肠杆菌MG1655Δedd-eda ΔgloA，ΔaldA::Cm，ΔaldB::Km。

1.6.修饰菌株大肠杆菌MG1655Δedd-eda ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB的构建

根据方案3消除菌株大肠杆菌MG1655Δedd-edaΔgloA，ΔaldA::Cm，ΔaldB::Km中的抗生素抗性盒。

用表6中给出的寡核苷酸，通过PCR分析检查抗生素抗性盒的丢失。还使用表6中给出的寡核苷酸检查菌株中先前建立的修饰的存在。

将获得的菌株命名为大肠杆菌MG1655Δedd-edaΔgloA，ΔaldA，ΔaldB。

1.7.修饰菌株大肠杆菌MG1655Δedd-eda ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，ΔarcA::Km的构建

1.7.1.修饰菌株大肠杆菌MG1655ΔarcA::Km的构建

使用方案1中所述技术，用表5中给出的寡核苷酸，通过插入卡那霉素抗生素盒并缺失相关基因的大部分而失活菌株大肠杆菌MG1655中的基因arcA。用表6中给出的合适的寡核苷酸，通过PCR分析检查缺失。

将得到的菌株命名为大肠杆菌MG1655ΔarcA::Km。

1.7.2.修饰菌株大肠杆菌MG1655Δedd-eda ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，ΔarcA::Km的构建

通过用噬菌体P1转导的技术(方案2)，由卡那霉素抗性盒替代基因arcA而进行菌株大肠杆菌Δedd-eda ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB中该基因的缺失。

用表6中给出的合适的寡核苷酸检查缺失ΔarcA::Km和其它修饰。

将得到的菌株命名为大肠杆菌MG1655Δedd-eda ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，ΔarcA::Km。

1.8.修饰菌株大肠杆菌MG1655Δedd-eda ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，ΔarcA::Km，Δndh::Cm的构建

1.8.1.修饰菌株大肠杆菌MG1655Δndh::Cm的构建

使用方案1中所述技术，用表5中给出的寡核苷酸，通过插入氯霉素抗生素盒并缺失相关基因的大部分而失活菌株大肠杆菌MG1655中的基因ndh。用表6中给出的合适的寡核苷酸，通过PCR分析检查缺失。

将得到的菌株命名为大肠杆菌MG1655Δndh::Cm。

1.8.2.修饰菌株大肠杆菌MG1655Δedd-eda ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，ΔarcA::Km，Δndh::Cm的构建

通过用噬菌体P1转导的技术(方案2)，由氯霉素抗性盒替代基因ndh而进行菌株大肠杆菌Δedd-eda ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，ΔarcA::Km中该基因的缺失。

用表6中所述的寡核苷酸检查缺失Δndh::Km和其它修饰。

将得到的菌株命名为大肠杆菌MG1655Δedd-eda ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，ΔarcA::Km，Δndh::Cm。

1.9.修饰菌株大肠杆菌MG1655Δedd-eda，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，ΔarcA，Δndh的构建

根据方案3消除菌株大肠杆菌MG1655Δedd-eda ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，ΔarcA::Km，Δndh::Cm中的抗生素抗性盒。

将获得的菌株命名为大肠杆菌MG1655Δedd-eda ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，ΔarcA，Δndh。

1.10.修饰菌株大肠杆菌MG1655ΔgloA，Δedd-eda，ΔaldA，ΔaldB，ΔarcA，Δndh(pME101VB01-yqhD＊(G149E)-gldA＊(A160T))的构建

1.10.1.质粒pME101-VB01-yqhD＊(G149E)-gldA＊(A160T)的构建

1.10.1.1.质粒pME101-VB01的构建

质粒pME101VB01来自质粒pME101，并且携带多克隆位点，其中包含对罕见限制性内切酶NheI，SnaBI，PacI，BglII，AvrII，SacII和AgeI特异性的识别位点序列，其后为丙酮丁醇梭菌ATCC824的adc转录终止子。

为了由低拷贝载体表达，如下构建质粒pME101。使用寡核苷酸PME101F和PME101R PCR扩增质粒pCL1920(Lemer和Inouye，1990，NAR 18，15p4631-GenBank AX085428)，并将来自载体pTrc99A(Amersham PharmaciaBiotech，Piscataway，N.J)的携带lacI基因和trc启动子的BstZ17I-XmnI片段插入扩增的载体中。

PME101F(SEQ ID NO 12)：ccgacagtaagacgggtaagcctg

PME101R(SEQ ID NO 13)：agcttagtaaagccctcgctag

使用合成的包含多克隆位点和adc转录终止子的双链核酸接头生成pME101VB01。将两个100碱基的寡核苷酸退火，所述寡核苷酸由NcoI或HindIII消化的限制位点互补形成侧翼。将100-碱基对产物亚克隆入NcoI/HindIII消化的质粒pME101以生成pME101VB01。

pME101VB011，由100个碱基(SEQ ID NO 14)组成：

catgggctagctacgtattaattaaagatctcctagggagctcaccggtTAAAAATAAGAGTTACCTTAAATGGTAACTCTTATTTTTTTAggcgcgcca

pME101VB012，由100个碱基(SEQ ID NO 15)组成：

agcttggcgcgccTAAAAAAATAAGAGTTACCATTTAAGGTAACTCTTATTTTTAaccggtgagctccctaggagatctttaattaatacgtagctagcc

具有：

-对应于多克隆位点的区(带下划线的小写字母)

-对应于丙酮丁醇梭菌ATCC824pSOL1(NC 001988)的adc转录终止子(序列179847-179814)的区(大写字母)。

1.10.1.2.质粒pME101-VB01-yqhD＊(G149E)-gldA＊(A160T)的构建

1.10.1.2.1.质粒pSCB-yqhD*(G149E)的构建

使用下述寡核苷酸从大肠杆菌MG1655的基因组DNAPCR扩增基因yqhD。

yqhD F，由43个bp组成，(SEQ ID NO 16)

cgatgcacg acaactttaatctgcacaccccaaccc

具有：

-与基因yqhD的序列(3153377-3153408)同源的区(带下划线的字母)

-限制位点BspHI(粗体字母)

yqhD R，由29个bp组成，(SEQ ID NO 17)

Cta ttagcgggcggcttcgtata

具有：

-与基因yqhD序列(3154540-3154521)同源的区(带下划线的字母)

-限制位点NheI(粗体字母)

将PCR扩增的片段克隆在pSCB中。将得到的质粒命名为pSCB-yqhD。用下述寡核苷酸在这个质粒上进行定向突变：yqhD*G149EmutDirF(由45pb组成，ggttcagaatccaacgcaggcggtgattcccgtaaaaccacaggc，(SEQ ID NO 18)和yqhD*G149EmutDirR(由45pb组成)gcctgtggttttacgggaataccgcctgcgttggattctgaacc，(SEQ ID NO 19)。两个寡核苷酸与区3153803-3153850同源。在粗体字母中，经变化以产生突变G149E的碱基，而大写字母中，经变化以产生EcoRV限制位点的碱基。将得到的质粒命名为pSCB-yqhD*(G149E)。

1.10.1.2.2.质粒pSCB-gldA*(A160T)的构建

将使用寡核苷酸gldAF和gldAR从大肠杆菌MG1655的基因组DNAPCR扩增的基因gldA克隆入pSCB将得到的质粒命名为pSCB-gldA。

用下述寡核苷酸在这个质粒上进行定向突变：gldA*A160TmutDirF(由45pb组成，gacaccaaaatcgtcgctggccacctgcacgtctgCtagcggcg，(SEQ ID NO 20)和gldA*A160TmutDirR(由45pb组成)cgccgctaGcagacgtgcaggtggccagcgacgattttggtgtc，(SEQ ID NO 21)。两个寡核苷酸与区4136602-4136558同源。在粗体字母中，经变化以产生突变A160T的碱基，而大写字母中，经变化以产生EcoRV限制位点的碱基。将得到的质粒命名为pSCB-gldA*(A160T)。

1.10.1.3.pME101VB01-yqhD*(G149E)-gldA*(A160T)的构建

用限制酶BspHI和NheI剪切pSCB-yqhD*(G149E)，将包含yqhD*(G149E)的片段克隆入载体pME101VB01的NcoI/NheI位点。将得到的质粒命名为pME101VB01-yqhD*(G149E)。用限制酶avrII和SacI剪切pSCB-gldA*(A160T)，将包含gldA*(A160T)的片段克隆入载体pME101VB01-yqhD*(G149E)的avrII/SacI位点。将得到的质粒命名为pME101VB01-yqhD*(G149S)-gldA*(A160T)。

1.10.2.修饰菌株大肠杆菌MG1655ΔgloA，Δedd-eda，ΔaldA，ΔaldB，ΔarcA，Δndh(pME101VB01-yqhD＊(G149E)-gldA＊(A160T))的构建

通过电穿孔将质粒pME101VB01-yqhD-gldA*(A160T)导入菌株大肠杆菌MG1655ΔgloA，Δedd-eda，ΔaldA，ΔaldB，ΔarcA，Δndh中。

将获得的菌株命名为大肠杆菌MG1655ΔgloA，Δedd-eda，ΔaldA，ΔaldB，ΔarcA，Δndh(pME101VB01-yqhD*(G149E)-gldA*(A160T)。

1.11.修饰菌株大肠杆菌MG1655mgsA＊(H21Q)::KmΔedd-eda，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，ΔarcA，Δndh(pME101VB01-yqhD＊(G149E)-gldA＊(A160T))的构建

1.11.1.修饰菌株大肠杆菌MG1655mgsA*(H21Q)::Km的构建

1.11.1.1.修饰菌株大肠杆菌MG1655mgsA*(H21Q)的构建

将突变引入mgsA基因以获得突变蛋白MgsA*(H21Q)。用于建立这种修饰的技术如Heermann等(2008)，Microbial Cell Factories.7(14)：1-8所述。

使用下述寡核苷酸扩增rpsL-Neo盒：

1.mgsA*(H21Q)::rpsL-Neo F，由105bp组成，(SEQ ID NO 22)

gttaactacggatgtacattatggaactgacgactcgcactttacctgcgcggaaacatattgcgctggtggcac acgatca

具有，

-与基因mgsA的序列同源的区(带下划线的字母)。

-扩增rpsL-Neo盒的区(粗体字母)。

2.mgsA*(H21Q)::rpsL-Neo R(SEQ ID NO 23)

gggaaattaagttaccggtagtgcctgttgcatacagtacgtgttgttccagtaacggttgatgccgttccaccc agctcatcagcatctgtttgcat

具有，

-与基因mgsA的序列同源的区(带下划线的字母)，具有两个突变，第一个(红色)生成突变H21Q，而第二个(黄色)生成限制位点AlwN1。

-扩增rpsL-Neo盒的区(粗体字母)。

将获得的片段根据方案1导入菌株MG1655rpsL*(如Heermann等所述)。通过PCR和序列分析检查获得的菌株。将获得的菌株命名为大肠杆菌mgsA*(H21Q)::rpsL-Neo。

根据方案1进行盒rpsL-Neo的缺失。通过质粒pETTOPO-mgsA*(H21Q)的NcoI和SacI的限制消化而获得转化的片段。

使用表6中所述的寡核苷酸通过PCR检查修饰。

将获得的菌株命名为菌株大肠杆菌MG1655mgsA*(H21Q)。

1.11.1.2.修饰菌株大肠杆菌MG1655mgsA*(H21Q)::Km的构建使用下述引物将卡那霉素抗性盒导入mgsA*(H21Q)开读框(ORF)的3’中：mgsA::Km F，由100bp组成：(SEQ ID NO 24)

tccagtcgccgcatttcaacgacgcggtcgatattctgatccccgattatcagcgttatctcgcggaccgtctga agtaa

具有：

-与mgsA*(H21Q)ORF末端同源的区(带下划线的字母)，

-扩增卡那霉素盒的区(粗体字母)。

mgsA::Km R，由100bp组成：(SEQ ID NO 25)

tgtggaaatactgaaaaatctggatgtgccggtggcgagaaaaccgtaagaaacaggtggcgtttgccacctg tgcaata

-与helD ORF末端同源的区(带下划线的字母)，

-扩增卡那霉素盒的区(粗体字母)。

将获得的片段根据方案1导入菌株MG1655mgsA*(H21Q)。通过PCR检查获得的菌株。将获得的菌株命名为大肠杆菌mgsA*(H21Q)::Km。

1.11.2.修饰菌株大肠杆菌MG1655mgsA＊(H21Q)::Km ΔgloA，Δedd-eda，ΔaldA，ΔaldB，ΔarcA，Δndh(pME101VB01-yqhD＊(G149E)-gldA＊(A160T))的构建

通过噬菌体P1的转导技术进行由mgsA*(H21Q)::Km替代菌株大肠杆菌ΔgloA，Δedd-eda，ΔaldA，ΔaldB，ΔarcA，Δndh(pME101VB01-yqhD*(G149E)-gldA*(A160T))中的mgsA。向培养物加入IPTG以促进质粒上携带的基因的表达。

使用表6中所述寡核苷酸检查修饰mgsA*(H21Q)::Km和其它缺失。

2.修饰菌株大肠杆菌MG1655mgsA::Km，Δedd-eda，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，ΔarcA，Δndh(pME101-VB01-yqhD＊(G149E)-gldA＊(160T)的构建

2.1.修饰菌株大肠杆菌MG1655ΔgloA，Δedd-eda，ΔaldA，ΔaldB，ΔarcA，Δndh(pME101VB01-yqhD＊(G149E)-gldA＊(A160T))的构建

如上所述构建菌株。

2.2.修饰菌株大肠杆菌MG1655mgsA::Km Δedd-eda，ΔaldA，ΔaldB，ΔarcA，Δndh(pME101VB01-yqhD＊(G149E)-gldA＊(A160T))的构建

2.2.1.修饰菌株大肠杆菌MG1655mgsA::Km的构建

使用下述引物将卡那霉素抗性盒导入mgsA开读框的3’中：如SEQ ID NO24和SEQ ID NO 25所示。

根据方案1将获得的片段导入菌株MG1655中。通过PCR检查获得的菌株。将获得的菌株命名为大肠杆菌mgsA::Kn。

2.2.2修饰菌株大肠杆菌MG1655mgsA::Km，ΔgloA，Δedd-eda，ΔaldA，ΔaldB，ΔarcA，Δndh(pME101VB01-yqhD＊(G149E)-gldA＊(A160T))的构建

通过噬菌体P1转导的技术，进行用mgsA::Km替代菌株大肠杆菌Δedd-edaΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，ΔarcA，Δndh(pME101VB01-yqhD*(C149E)-gldA*(A160T))中的mgsA。使用表6中所述寡核苷酸检查修饰mgsA::Km和其它缺失。

将获得的菌株命名为大肠杆菌MG1655mgsA::Km，ΔgloA，Δedd-eda，ΔaldA，ΔaldB，ΔarcA，Δndh(pME101VB01-yqhD*(C149E)-gldA*(A160T))。

3.两株仅在mgsA等位基因中不同的大肠杆菌等基因菌株的1，2-丙二醇产生的评价

在需氧条件下，在含20g/l葡萄糖作为唯一碳源的基本培养基MML11PG1_100(组成参见表9)中，在摇瓶试验(500ml摇瓶，含50ml培养基)中培养上述两株菌株。以50mg/l的浓度加入壮观霉素。

表9：基本培养基MML11PG1_100的组成

成分	浓度(g/l)
		EDTA	0.0084
CoCl₂6H₂O	0.0025
		MnCl₂4H₂O	0.0150
CuCl₂2H₂O	0.0015
		H₃BO₃	0.0030
Na₂MoO₄2H₂O	0.0025
		Zn(CH₃COO)₂2H₂O	0.0130
柠檬酸铁(III)H₂O	0.1064
		柠檬酸	1.70
KH₂PO₄	1.65
		K₂HPO₄3H₂O	0.92
(NH₄)₂HPO₄	0.40
		(NH₄)₂SO₄	4.88
MgS0₄7H₂O	1.00
		CaCl₂2H₂O	0.08
硫胺素	0.01
		葡萄糖或蔗糖	20.00
MOPS缓冲液	40.00

用氢氧化钠将培养基的pH调至6.8。

在37℃进行培养，并通过用MOPS缓冲培养基而维持pH。

在培养末期，使用用于分离的Biorad HPX 97H柱和用于检测的折射计，通过HPLC分析发酵液中的1，2-丙二醇和残余葡萄糖。然后计算1，2-丙二醇对葡萄糖的得率(yield)。

表10：以葡萄糖为碳源的基本培养基中1，2-丙二醇的产生

ND表示“未检测”-n是相同实验的重复次数-给出的数字是n次重复获得的数字的平均值和标准偏差。

由于受到无机磷酸盐的抑制，含野生型MGS的菌株不产生任何1，2-丙二醇。

含突变MGS的大肠杆菌明显产生1，2-丙二醇，连同上述发现一起证实具有对无机磷酸盐的抑制不敏感的突变MGS的菌株能够在存在无机磷酸盐的情况下产生1，2-丙二醇。

实施例4：含突变MGS、突变YqhD和突变GlyDH的大肠杆菌以葡萄糖和蔗糖产生1，2-丙二醇

1.修饰菌株大肠杆菌MG1655mgsA＊(H21Q)::Km ΔgloA，Δedd-eda，ΔaldA，ΔaldB，ΔarcA，Δndh(pME101-VB01-yqhD＊(G149E)-gldA＊(A160T)))的构建

该菌株的构建先前描述。

2.修饰菌株大肠杆菌MG1655mgsA＊(H21Q)ΔgloA，Δedd-eda，ΔaldA，ΔaldB，ΔarcA，Δndh(pME101-VB01-yqhD＊(G149E)-gldA＊(A160T))(pBBR1MCS5-cscBKAR)的构建

2.1.质粒pBBR1MCS5-cscBKAR的构建

用EcoRI消化质粒pKJL101.1(Jahreis等(2002)，J.Bacteriol.184：5307-5316)。将包含cscBKAR基因的片段克隆入也用EcoRI消化的pBBR1MCS5(Kovach等(1995)，Gene，166175-176)。

将得到的质粒命名为pBBR1MCS5-cscBKAR。

2.2.修饰菌株大肠杆菌MG1655mgsA＊(H21Q)::Km，ΔgloA，Δedd-eda，ΔaldA，ΔaldB，ΔarcA，Δndh(pME101-VB01-yqhD＊(G149E)-gldA＊(A160T))(pBBR1MCS5-cscBKAR)的构建

将质粒pME101-VB01-yqhD*(G149E)-gldA*(A160T)和pBBR1MCS5-cscBKAR通过电穿孔引入菌株大肠杆菌MG1655mgsA*(H21Q)，Δedd-eda，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，ΔarcA，Δndh中。

将获得的菌株命名为菌株大肠杆菌MG1655mgsA*(H21Q)::Kn，ΔgloA，Δedd-eda，ΔaldA，ΔaldB，ΔarcA，Δndh(pME101-VB01-yqhD*(G149E)-gldA*(A160T))(pBBR1MCS5-cscBKAR)。

3.两株包含突变MGS、突变YqhD和突变GlyDH的大肠杆菌以葡萄糖和蔗糖产生1，2-丙二醇的评价

在需氧条件下，在以20g/l葡萄糖或蔗糖为唯一碳源的基本培养基MML11PG1_100(组成参见表9)中，通过摇瓶试验(500ml摇瓶，含50ml培养基)培养上述两株菌株。以50mg/l的浓度加入壮观霉素。

在37℃进行培养，并通过用MOPS缓冲培养基而维持pH。

在培养末期，使用用于分离的Biorad HPX 97H柱和用于检测的折射计，通过HPLC分析发酵液中的1，2-丙二醇和残余葡萄糖或蔗糖。然后计算1，2-丙二醇对葡萄糖或蔗糖的得率。

表11：以葡萄糖或蔗糖为碳源的基本培养基中1，2-丙二醇的生产

n是相同实验的重复次数-给出的数字是n次重复获得的数字的平均值和标准偏差。

与葡萄糖相比，在含突变MGS的大肠杆菌菌株中以蔗糖作为唯一碳源的1，2-丙二醇产生得到改进。

实施例5：表达野生型或修饰MGS的两株大肠杆菌丙酮醇产生菌株的构建和丙酮醇生产的评价

1.修饰菌株大肠杆菌MG1655mgsA＊(H21Q)::Km Ptrc01-gapA::cm，Δedd-eda，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，ΔgldA，(pME101-VB01-yqhD)的构建

1.1.修饰菌株大肠杆菌MG1655ΔgloA，Δedd-eda ΔaldA，ΔaldB，ΔgldA的构建

1.1.1.修饰菌株ΔgldA::Km的构建

使用方案1中所述技术，用表5中给出的寡核苷酸，通过插入卡那霉素抗生素盒并缺失相关基因的大部分而失活菌株大肠杆菌MG1655中的基因gldA。用表6中给出的合适的寡核苷酸，通过PCR分析检查缺失。

将得到的菌株命名为大肠杆菌MG1655ΔgldA::Cm。

1.1.2.修饰菌株大肠杆菌MG1655Δedd-eda ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，ΔgldA::Km的构建

通过用噬菌体P1转导的技术(方案2)，由卡那霉素抗性盒替代基因gldA而进行菌株大肠杆菌MG1655Δedd-edaΔgloA，ΔaldA，ΔaldB中该基因的缺失。

用表6中给出的合适的寡核苷酸通过PCR分析检查所述缺失和菌株中已存在的其它缺失。

将得到的菌株命名为大肠杆菌MG1655Δedd-eda ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，ΔgldA::Km。

1.1.3.修饰菌株大肠杆菌MG1655Δedd-eda ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，ΔgldA的构建

根据方案3消除菌株大肠杆菌MG1655Δedd-eda ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，ΔgldA::Km中的抗生素抗性盒。

将获得的菌株命名为大肠杆菌MG1655Δedd-eda ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，ΔgldA。

1.2.修饰菌株大肠杆菌MG1655Ptrc01-gapA::cm ΔgloA，Δedd-eda，ΔaldA，ΔaldB，ΔgldA的构建

1.2.1.修饰菌株MG1655Ptrc01-gapA::Cm的构建

使用方案2中所述技术，用表5中给出的寡核苷酸，通过用FRT-CmR-FRT和工程改造的启动子取代225bp的上游gapA序列进行用合成的短Ptrc01启动子(SEQ ID NO 26：gagctgattaatcatccggctcggtgtgg)取代菌株大肠杆菌MG1655中的天然gapA启动子的替代。

用表6中所述的合适的寡核苷酸，通过PCR分析检查修饰。将得到的菌株命名为大肠杆菌MG1655Ptrc01-gapA::Cm。

1.2.2.修饰菌株大肠杆菌MG1655 Ptrc01-gapA::cm Δedd-eda ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，ΔgldA的构建

通过用噬菌体P1转导的技术进行用合成的短Ptrc01启动子取代菌株大肠杆菌MG1655Δedd-eda ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，ΔgldA中的天然gapA启动子的替代。

使用表6中所述寡核苷酸检查修饰Ptrc01-gapA::cm和其它缺失。

将获得的菌株命名为大肠杆菌MG1655 Ptrc01-gapA::cmΔedd-eda ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，ΔgldA。

1.3.修饰菌株大肠杆菌MG1655 Ptrc01-gapA::cm Δedd-eda ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，ΔgldA pME101-VB01-yqhD＊(G149E)的构建

将质粒pME101VB01-yqhD*(G149E)通过电穿孔导入菌株大肠杆菌MG1655 Ptrc01-gapA::cmΔedd-edaΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，ΔgldA中。

将获得的菌株命名为大肠杆菌MG1655Ptrc01-gapA::cm，ΔgloA，Δedd-eda，ΔaldA，ΔaldB，ΔgldA(pME 101-VB01-yqhD*(G149E)。

1.4.修饰菌株大肠杆菌MG1655 mgsA＊(H21Q)::Km Ptrc01-gapA::cmΔedd-eda ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，ΔgldA pME101-VB01-yqhD＊(G149E)的构建

通过用噬菌体P1转导的技术进行用mgsA*(H21Q)::Km取代菌株大肠杆菌Δedd-edaΔgloA，ΔaldA，ΔgldA(pME101VB01-yqhD*(G149E))中的mgsA的替代。向培养基中加入IPTG以促进质粒上携带的基因的表达。

使用表6中所述寡核苷酸检查修饰mgsA*(H21Q)::Km和其它缺失。

将得到的菌株命名为大肠杆菌MG1655mgsA*(H21Q)::Km Ptrc01-gapA::cmΔedd-edaΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，ΔgldA pME101-VB01-yqhD*(G149E)。

2.修饰菌株大肠杆菌MG1655 Ptrc01-gapA::cm，mgsA::Km Δedd-eda，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，ΔgldA，(pME101-VB01-yqhD＊(G149E))的构建

2.1.修饰菌株大肠杆菌MG1655Ptrc01-gapA::cm，mgsA::Km Δedd-eda，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，ΔgldA(pME101-VB01-yqhD＊(G149E))的构建

如前所述在菌株大肠杆菌MG1655Ptrc01-gapA::cmΔedd-eda，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，ΔgldA(pME101-VB01-yqhD*(G149E))中构建mgsA::Km。

将获得的菌株命名为大肠杆菌MG1655 Ptrc01-gapA::cm，mgsA::Km，Δedd-eda，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，ΔgldA.(pME 101-VB01-yqhD*(G149E))。

3.仅在mgsA等位基因上有差别的两株大肠杆菌同基因菌株中丙酮醇产生的评价

在需氧条件下，在以20g/l葡萄糖为唯一碳源的基本培养基MML11PG1_100(组成参见表9)中，通过摇瓶试验(500ml摇瓶，含50ml培养基)培养上述两株菌株。以50mg/l的浓度加入壮观霉素。

在37℃进行培养，并通过用MOPS缓冲培养基而维持pH。

在培养末期，使用用于分离的Biorad HPX 97H柱和用于检测的折射计，通过HPLC分析发酵液中的丙酮醇和残余葡萄糖。然后计算丙酮醇对葡萄糖的得率。

表11：以葡萄糖为碳源的基本培养基中丙酮醇的产生

n是相同实验的重复次数-给出的数字是n次培养获得的数字的平均值和标准偏差。

与包含天然MGS的同基因菌株相比，包含突变MGS的大肠杆菌菌株中的丙酮醇产生得到明显的改进。

实施例6：包含突变MGS和突变YqhD的大肠杆菌以葡萄糖和蔗糖产生丙酮醇

1.修饰菌株大肠杆菌MG1655 Ptrc01-gapA::cm，mgsA＊(H21Q::Km)，Δedd-eda ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，ΔgldA，pME101-VB01-yqhD＊(G149E)的构建

如前所述构建该菌株。

2.修饰菌株大肠杆菌MG1655Ptrc01-gapA::cm，mgsA＊(H21Q)，Δedd-eda ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，ΔgldA pME101-VB01-yqhD＊(G149E)pBBR1MCS5-cscBKAR的构建

通过电穿孔将质粒pBBR1MCS5-cscBKA引入菌株大肠杆菌MG1655Ptrc01-gapA::cm，mgsA*(H21Q::Kn)，Δedd-edaΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，ΔgldApME101-VB01-yqhD＊(G149E)。

将得到的菌株命名为大肠杆菌MG1655 Ptrc01-gapA::cm，mgsA*(H21Q)::Kn，Δedd-eda ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，ΔgldapME101-VB01-yqhD*(G149E)pBBR1MCS5-cscBKAR。

实施例7：表达野生型或修饰MGS的两株大肠杆菌乳酸产生菌株的构建和乳酸产生的评价

1-修饰菌株大肠杆菌MG1655Ptrc01-gapA，Δedd-eda，ΔyqhD，Δdld，ΔlldD(pJB137-PgapA-ppsA)(pME101-VB01-yedU)的构建

1.1.修饰菌株大肠杆菌MG1655 Ptrc01-gapA，Δedd-eda的构建

1.1.1.菌株大肠杆菌MG1655 Ptrc01-gapA::cm，Δedd-eda::Km的构建

通过用噬菌体P1转导的技术(方案2)通过用卡那霉素抗性盒取代菌株大肠杆菌MG1655Ptrc01-gapA::em(见实施例3)中的基因edd-eda而进行所述基因的缺失。

使用表6中给出的合适的寡核苷酸通过PCR分析而检查所述缺失和该菌株中存在的其他缺失。

将得到的菌株命名为大肠杆菌MG1655 Ptrc01-gapA::cm，Δedd-eda::Kn。

1.1.2.菌株大肠杆菌MG1655 Ptrc01-gapA，Δedd-eda的构建

根据方案3消除菌株大肠杆菌MG1655ΔPtrc01-gapA::cm，Δedd-eda::Kn中的抗生素抗性盒。

用表6中给出的寡核苷酸通过PCR分析检查抗生素抗性盒的丢失。还使用表6中给出的寡核苷酸检查先前建立的修饰的存在。

将获得的菌株命名为大肠杆菌MG1655 Ptrc01-gapA，Δedd-eda。

1.2.大肠杆菌MG1655 Ptrc01-gapA，Δedd-eda，ΔyqhD的构建

1.2.1.修饰菌株大肠杆菌MG1655ΔyqhD::Km的构建

使用方案1中所述的技术，用表5中给出的寡核苷酸，通过插入卡那霉素抗生素盒并缺失相关基因的大部分而失活基因yqhD。用表6中给出的合适的寡核苷酸，通过PCR分析检查缺失。

将得到的菌株命名为大肠杆菌MG1655ΔyqhD::Km。

1.2.2.修饰菌株大肠杆菌Ptrc01-gapA，Δedd-eda，ΔyqhD的构建

通过方案2中所述的用噬菌体P1转导的技术进行通过用卡那霉素抗性盒取代菌株大肠杆菌MG1655 Ptrc01-gapAΔedd-eda中的基因yqhD而进行该基因的缺失。使用表6中给出的合适的寡核苷酸通过PCR分析而检查缺失。

将获得的菌株命名为大肠杆菌Ptrc01-gapA，Δedd-eda，ΔyqhD::Km。

1.3.修饰菌株大肠杆菌Ptrc01-gapA，Δedd-eda，ΔyqhD，Δdld的构建

1.3.1.修饰菌株大肠杆菌MG1655Δdd::Cm的构建

使用方案2中所述技术，用表5中给出的寡核苷酸，通过插入氯霉素抗生素抗性盒并缺失相关基因的大部分而失活基因dld。用表6中给出的合适的寡核苷酸通过PCR分析检查缺失。

将获得的菌株命名为大肠杆菌MG1655Δdld::Cm。

1.3.2.修饰菌株大肠杆菌MG1655 Ptrc01-gapA，Δedd-eda，ΔyqhD，Δdld的构建

通过方案2中所述的用噬菌体P1转导的技术进行菌株大肠杆菌MG1655Ptrc01-gapA，Δedd-eda，ΔyqhD::Kn中的基因dld的缺失。

将得到的菌株命名为大肠杆菌MG1655 Ptrc01-gapA，Δedd-eda，ΔyqhD::Km，Δdld::Cm。

然后根据方案3消除氯霉素和卡那霉素抗性盒。

将获得的菌株命名为大肠杆菌MG1655 Ptrc01-gapA，Δedd-eda，ΔyqhD，Δdld。

1.4.修饰菌株大肠杆菌Ptrc01-gapA，Δedd-eda，ΔyqhD，Δdld，ΔlldD的构建

1.4.1.大肠杆菌MG1655ΔlldD::Cm

使用方案2中所述技术，用表5中给出的寡核苷酸，通过插入氯霉素抗生素抗性盒并缺失相关基因的大部分而失活基因lldD。用表6中给出的合适的寡核苷酸，通过PCR分析检查缺失。

将获得的菌株命名为大肠杆菌MG1655ΔlldD::Cm。

1.4.2.大肠杆菌MG1655 Ptrc01-gapA，Δedd-eda，ΔyqhD，Δdld，ΔlldD

根据方案3中所述用噬菌体P1转导的技术进行菌株大肠杆菌MG1655Ptrc01-gapA，Δedd-eda，ΔyqhD，Δdld中的基因lldD缺失。

将得到的菌株命名为大肠杆菌MG1655Ptrc01-gapA，Δedd-eda，ΔyqhD，Δdld，ΔlldD::Cm。

然后根据方案3消除氯霉素抗性盒。将获得的菌株命名为大肠杆菌MG1655Ptrc01-gapA，Δedd-eda，ΔyqhD，Δdld，ΔlldD。

1.5.修饰菌株大肠杆菌MG1655 Ptrc01-gapA，Δedd-eda，ΔyqhD，Δdld，ΔlldD(pJB137-PgapA-ppsA)(pME101-VB01-yedU)的构建

将质粒pJB137-PgapA-ppsA和pME101-VB01-yedU(如专利申请PCT/EP2009/053093中所述)通过电穿孔引入菌株大肠杆菌MG1655Ptrc01-gapA，Δedd-eda，ΔyqhD，Δdld，ΔlldD中。

将得到的菌株命名为大肠杆菌MG1655Ptrc01-gapA，Δedd-eda，ΔyqhD，Δdld，ΔlldD.(pJB137-PgapA-ppsA)(pME101-VB01-yedU)。

2.修饰菌株大肠杆菌MG1655Ptrc01-gapA，mgsA＊(H21Q)，Δedd-eda，ΔyqhD，Δdld，ΔlldD(pJB137-PgapA-ppsA)(pME101-VB01-yedU)的构建

2.1.修饰菌株大肠杆菌MG1655Ptrc01-gapA，mgsA＊(H21Q)，Δedd-eda，ΔyqhD，Δdld，ΔlldD的构建

如先前在实施例3中所述在菌株大肠杆菌MG1655 Ptrc01-gapA，Δedd-eda，ΔyqhD，Δdld，ΔlldD中构建突变mgsA*(H21Q)。

将获得的菌株命名为菌株大肠杆菌MG1655 Ptrc01-gapA，mgsA*(H21Q)，Δedd-eda，ΔyqhD，Δdld，ΔlldD。

2.2.修饰菌株大肠杆菌MG1655Ptrc01-gapA，mgsA＊(H21Q)，Δedd-eda，ΔyqhD，Δdld，ΔlldD(pJB137-PgapA-ppsA)(pME101-VB01-yedU)的构建

将质粒pJB137-PgapA-ppsA和pME101-VB01-yedU通过电穿孔引入菌株大肠杆菌MG1655Ptrc01-gapA，mgsA*(H21Q)，Δedd-eda，ΔyqhD，Δdld，ΔlldD中。

将得到的菌株命名为大肠杆菌MG1655Ptrc01-gapA，mgsA*(H21Q)，Δedd-eda，ΔyqhD，Δdld，ΔlldD(pJB137-PgapA-ppsA)(pME101-VB01-yedU)。

实施例8：两株酿酒酵母1，2-丙二醇生产菌株的构建和1，2-丙二醇生产的评价

1-两株酿酒酵母菌株CENPK Δgpd2，Δtpi1，gldA＊(A160T)，yqhD，mgsA＊(H21Q)和CENPK Δgpd2，Δtpi1，gldA＊(A160T)，yqhD＊(G149E)，mgsA＊(H21Q)的构建

1-1.酿酒酵母菌株CENPK Δgpd2，gldA＊(A160T)的构建

使用的酿酒酵母菌株为来自Euroscarf的CEN.PK2-1C(MATa；ura3-52；trp1-289；leu2-3，112；his3Δ1；MAL2-8C；SUC2)。

使用Guldener等(1996)所述的“短侧翼同源性”(SFH)方法，通过用对应于pTDH3-gldA*(A160T)-CYCt-pTEF1-ble-TEF1t盒的PCR片段转化菌株CEN.PK2-1C而失活基因GPD2。

使用Shevchuk等(2004)所述几个片段基于长片段PCR的融合而构建pTDH3-gldA*(A160T)-CYCt-pTEF1-ble-TEF1t盒。

分别使用pTDH3/GPD2F和pTDH3R引物和CYCt/gldA F和CYCt/Zeo R引物，从质粒p406TDH3(Addgene)扩增pTDH3和CYCt。

使用引物gldA/TDH3F和gldA/CYCtR从pSCB gldA*(A160T)扩增gldA*(A160T)。

使用Zeo/CYCt F和ZEO/GPD2作为引物从来自Euroscarf的质粒pUG66扩增pTEF1-ble-TEF1t。

使用表13中所述具有重叠末端的引物扩增所有片段。然后纯化每个片段。

不加引物的PCR实验中使用100ng各个片段，使用低退火条件允许它们同时融合。

使用这步获得的未纯化产物作为高Tm的PCR实验中的基质，使用pTDH3/GPD2F和ZEO/GPD2R引物，所述引物具有延伸的40bp，其与GPD2基因座(表13)的前40和后40bp同源。

将这个片段整合入GPD2基因座，替代GPD2开读框。

使用的转化方法是Schiestl和Gietz(1989)所述的醋酸锂方法。在补充75μg/ml腐草霉素(Cayla，法国)的YEPD丰富培养基(1％细菌用酵母提取物，2％细菌用蛋白胨，2％葡萄糖)上选择菌株CENPK，Δgpd2，gldA*(A160T)。使用GPD2ver F和GPD2ver R引物(表13)，通过在提取的基因组DNA上的PCR确认GPD2基因的缺失。

这导致gldA*(A160T)的异源表达和GPD2的缺失。将得到的菌株命名为CENPK Δgpd2，gldA*(A160T)。

表13

1-2.两株酿酒酵母菌株CENPKΔgpd2，gldA＊(A160T)，yqhD和CENPKΔgpd2，gldA＊(A160T)，yqhD＊(G149E)的构建

使用的菌株为之前建立的CENPK，Δgpd2，gldA*(A160T)。使用“短侧翼同源性”(SFH)方法，通过用对应于pTEF1-yqhD-CYCt-pTEF1-nat1-TEF1t盒或pTEF1-yqhD*(G149E)-CYCt-pTEF1-nat1-TEF1t盒的PCR片段转化所述菌株而实现yqhD或yqhD*(G149E)的表达。

使用几个片段的基于长片段PCR的融合而构建pTEF1-yqhD-CYCt-pTEF1-nat1-TEF1t盒或pTEF1-yqhD*(G149E)-CYCt-pTEF1-nat1-TEF1t盒。

分别使用pTEF1/URA3F和pTEF R引物和CYCt/yqhD F和CYCt/Nat1R引物从质粒p405TEF1(Addgene)扩增pTEF1和CYCt。

使用引物yqhD/TEF-F和yqhD/CYCtR分别从pSCB-yqhD和pSCByqhD*(G149E)扩增yqhD和yqhD*。

使用Nat1/CYCt F和Nat1/Leu2作为引物从来自Euroscarf的质粒pAG35扩增pTEF1-nat1-TEF1t。

使用表14中所述具有重叠末端的引物扩增所有片段。然后纯化每个片段。

使用这步获得的未纯化产物作为高Tm的PCR实验中的基质，使用pTEF1/LEU2F和Nat1/Leu2引物，所述引物具有延伸的40bp，其与LEU2基因座(表14)的前40和后40bp同源。

将这些片段整合入LEU2基因座，替代LEU2开读框。

使用的转化方法是醋酸锂方法。通过pTEF1-yqhD-CYCt-pTEF1-nat1-TEF1t盒或通过pTEF1-yqhD*(G149E)-CYCt-pTEF1-nat1-TEF1t转化菌株CENPK，Δgpd2，gldA*(A160T)以获得CENPK，Δgpd2，gldA*(A160T)，yqhD和CENPK，Δgpd2，gldA*(A160T)，yqhD*(G149E)。在补充50μg/ml诺尔丝菌素(nourseothricine)(Weberbioagents，德国)的YEPD丰富培养基(1％细菌用酵母提取物，2％细菌用蛋白胨，2％葡萄糖)上选择转化子。使用YQHD ver F和YQHD ver R引物(表14)，通过在提取的基因组DNA上PCR而确认yqhD或yqhD*(G149E)的整合。

这导致yqhD和yqhD*(G149E)的异源表达。将得到的菌株命名为CENPKΔgpd2，gldA*(A160T)，yqhD和CENPK Δgpd2，gldA*(A160T)，yqhD*(G149E)。

表14

1-3.两株酿酒酵母菌株CENPK Δgpd2，Δtpi1，gldA＊(A160T)，yqhD，mgsA＊(H21Q)和CENPK Δgpd2，Δtpi1，gldA＊(A160T)，yqhD＊(G149E)，mgsA＊(H21Q)的构建

使用的两株菌株为之前建立的CENPK，Δgpd2，gldA*(A160T)，yqhD或CENPK，Δgpd2，gldA*(A160T)，yqhD*。

使用“短侧翼同源性”(SFH)方法，通过用对应于pTEF1-hph-TEF1t-pPGK1-msgA*(H21Q)盒的PCR片段转化所述菌株而失活基因TPI1。

使用几个片段的基于长片段PCR 的融合而构建pTEF1-hph-TEF1t-pPGK1-msgA*(H21Q)盒。

使用PGK1/TPI1F和PGK1/mgsAR从由pAG35(Euroscarf)构建的质粒pAG35pPGK1扩增pTEF1-hph-TEF1t-pPGK1。

使用引物mgsA/PGK1F和mgsA/TPI R为引物从pETTOPO mgsA*(H21Q)扩增mgsA*(H21Q)。

使用表15中所述具有重叠末端的引物扩增所有片段。然后纯化每个片段。

使用这步获得的未纯化产物作为高Tm的PCR实验中的基质，使用PGK1/TPI1F和mgsA/TPI R引物，所述引物具有延伸的40bp，其与TPI1基因座(表15)的前40和后40bp同源。

将这个片段整合入TPI1基因座，替代TPI1开读框。

使用的转化方法是醋酸锂方法。通过pTEF1-hph-TEF1t-pPGK1-msgA*(H21Q)盒转化菌株CENPK，Δgpd2，gldA*(A160T)，yqhD和菌株CENPK，Δgpd2，gldA*(A160T)，yqhD*(G149E)以获得CENPK，Δgpd2，Δtpi1，gldA*(A160T)，yqhD*(G419E)，msgA*(H21Q)；CENPK，Δgpd2，Δtpi1，gldA*(A160T)。在补充250μg/ml潮霉素(Sigma-Aldrich)的YEPD丰富培养基(1％细菌用酵母提取物，2％细菌用蛋白胨，2％葡萄糖)上选择转化子。

使用mgsA ver F和mgsA ver R引物(表15)，通过在提取的基因组DNA上PCR而确认msgA*(H21Q)的整合。

这导致msgA*(H21Q)的异源表达和TPI1的缺失。将得到的菌株命名为CENPKΔgpd2，Δtpi1，gldA*(A160T)，yqhD，mgsA*(H21Q)和CENPKΔgpd2，Δtpi1，gldA*(A160T)，yqhD*(G149E)，mgsA*(H21Q)。

表15

2-酿酒酵母CENPKΔgpd2，Δtpi1，gldA＊(A160T)，yqhD，mgsA＊(H21Q)中1，2-丙二醇生产的评价

在厌氧或需氧条件下，在包含5％葡萄糖或5％蔗糖作为唯一碳源的基本培养基(SD培养基，0.67％酵母氮基无氨基酸(DIFCO))中以分批方式培养上述CENPK，Δgpd2，Δtpi1，gldA*(A160T)，yqhD，msgA*(H21Q)菌株和对照菌株CEN.PK2-1C。基本培养基补加50mg/l脲，250mg/l亮氨酸，50mg/L组氨酸和50mg/L色氨酸。在225rpm搅拌转速下于28℃进行培养。

在包含50ml培养基的250ml摇瓶中进行需氧培养。在包含90ml培养基的100ml青霉素瓶中进行厌氧培养。

在培养末期，用偶联Agilent 5975C系列质量选择性检测器(EI)的Agilent7890A系列气相层析和HP INNOWax柱，通过气相层析/质谱(GC/MS)分析发酵液中的1，2-丙二醇。将生成的1，2-丙二醇的保留时间和质谱与真正的1，2-丙二醇比较。使用用于分离的Biorad HPX 97H柱和用于检测的折射计，通过HPLC分析发酵液中残余的葡萄糖或蔗糖。然后计算1，2-丙二醇相对于葡萄糖或蔗糖的得率。

表16：以葡萄糖或蔗糖为碳源，在需氧或厌氧条件下，在基本培养基中1，2-丙二醇的生产

与未修饰的对照菌株相比，包含突变MGS的酿酒酵母菌株中以葡萄糖或蔗糖的1，2-丙二醇产生在厌氧或需氧状态下得到了改进。

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-Shevehuk，N.A.等，(2004)，Nucleic AcidsRes.32：e19

Claims

1.用于产生选自乳酸、丙酮醇和1,2-丙二醇的生物化学品的方法，所述方法包括

-在合适的培养基中培养大肠杆菌，所述大肠杆菌经过修饰而改进所述选自乳酸、丙酮醇和1,2-丙二醇的生物化学品的产生，和

-回收所需的生物化学品

其中所述大肠杆菌表达选自下组的突变甲基乙二醛合酶(MGS)：SEQ IDNO 1、SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3中所示的MGS，其活性不受正磷酸盐抑制且其保留多于50％的大肠杆菌MgsA酶的甲基乙二醛合酶(MGS)活性。

2.根据权利要求1的用于产生选自乳酸、丙酮醇和1,2-丙二醇的生物化学品的方法，其中所述大肠杆菌另外包含编码突变YqhD的基因，所述突变YqhD包含突变G149E。

3.根据权利要求1的用于产生选自乳酸、丙酮醇和1,2-丙二醇的生物化学品的方法，其中所述大肠杆菌另外包含编码突变YqhD的基因和/或编码突变甘油脱氢酶的基因，所述突变YqhD包含突变G149E，所述突变甘油脱氢酶包含突变A160T。

4.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中回收的生物化学品是经纯化的。

5.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中所述合适的培养基包括选自以下的碳源：单糖或二糖、淀粉及其衍生物，和它们的混合物。

6.根据权利要求5的方法，其中所述碳源选自葡萄糖和蔗糖。

7.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中所述产生在分批、补料分批或连续过程中进行。

8.选自下组的突变甲基乙二醛合酶(MGS)：SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3中所示的大肠杆菌MGS，其活性不受正磷酸盐抑制且其保留多于50％的大肠杆菌MgsA酶的甲基乙二醛合酶(MGS)活性。

9.DNA，其序列包含编码权利要求8的突变MGS的序列。

10.修饰的大肠杆菌，其中所述大肠杆菌表达权利要求8的突变甲基乙二醛合酶(MGS)。

11.根据权利要求10的修饰的大肠杆菌，其中所述大肠杆菌另外包含编码突变YqhD的基因，所述突变YqhD包含突变G149E。

12.根据权利要求10的修饰的大肠杆菌，其中所述大肠杆菌另外包含编码突变YqhD的基因和/或编码突变甘油脱氢酶的基因，所述突变YqhD包含突变G149E，所述突变甘油脱氢酶包含突变A160T。