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CN102574907B - 修饰的人肿瘤坏死因子受体i多肽或其片段以及制备它们的方法 - Google Patents

修饰的人肿瘤坏死因子受体i多肽或其片段以及制备它们的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及将与肿瘤坏死因子在体内或离体偶联的修饰的人肿瘤坏死因子受体1多肽、或其片段。本发明所述的修饰的人肿瘤坏死因子受体1多肽或其片段表现出提高的针对体内蛋白酶活性的耐受性，并且由此表现出提高的生物利用度和提高的吸收率。

Description

修饰的人肿瘤坏死因子受体I多肽或其片段以及制备它们的方法
技术领域
本发明涉及修饰的人肿瘤坏死因子受体I多肽或其片段以及制备它们的方法，所述修饰的人肿瘤坏死因子受体I多肽或其片段能够在体内(invivo)或离体(ex vivo)结合肿瘤坏死因子。
背景技术
炎症是由抗原性刺激诱发的机体防御反应。当甚至在去除感染性抗原性物质后仍然发生炎症或者炎性反应是由不适当的刺激(如自身抗原)诱发的时，炎性反应可能病理性恶化。这样的炎性反应涉及多种细胞因子。具体地，肿瘤坏死因子(以下称为“TNF”)鉴定为起控制炎症作用的细胞因子。
最初发现TNF为一种消除肿瘤细胞的蛋白(Carswell等，PNAS72：3666-3670，1975；Old等，Science(科学)230：630-632，1985；和Beutler等，Nature(自然)316：552-554，1985)。TNF是一类由多种细胞类型(包括单核细胞和巨噬细胞)产生的细胞因子，并且直接参与炎性反应。先前已经描述了至少两种TNFs(TNF-α和TNF-β)，每一种作为三聚体分子有活性，并且据信通过交联受体起始细胞内信号传导(Engelmann等，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)，265：14497-14504)。TNFs在体内诱导炎性反应来调节细胞介导的免疫应答和防御机制，并且对多种不同的靶细胞具有重要的生理作用(Selby等，Lancep 1：483，1988；Starnes等，J.Clin.Invest(临床研究杂志)82：1321，1988；Oliff等，Cell(细胞)50；555，1987；Waage等，Lancept1：355，1987；和Aggarwal等，Nat.Rev.Immunol.(自然免疫学综述)3：745-756，2003)。然而，证明过量的TNFs导致病理性病症，如类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)，变性关节炎(degenerative arthritis)，银屑病(psoriasis)或局限性回肠炎(Crohn′s disease)，并且抑制TNFs表现出对疾病的治疗作用(Feldmann等，Nat.Med.(自然医学)9：1245-1250，2003；Kooloos等，Drug Discov.Today(今日药物发现)12：125-131，2007；Rutgeerts等，Gastroenterology(胃肠病学)126：1593-1610，2004；Rothe等，Nature(自然)364：798-802，1993；Kafrouni等，J.Leukocyte Biol.(白细胞生物学杂志)74：564-571，2003；Rahman等，Plos Pathog.(Plos病理学)2：e4，2006；Chan等，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)278：51613-61621，2003；和Wajant等，Cell Death Differ.(细胞死亡分化)10：45-65，2003)。
肿瘤坏死因子受体(以下称为“TNFR”)是一种与TNF结合的细胞因子受体。
目前已经发现了两种类型的TNFRs，称为p55-TNFRI和p75-TNFRII。可以证明TNFRI表达几乎存在于每种哺乳动物细胞中，而TNFRII表达主要限于免疫系统细胞和内皮细胞。
两种TNF受体之间表现出28％的氨基酸序列相似性。两种受体都具有细胞外结构域，并且具有4个富含半胱氨酸的结构域。
TNFRI的细胞质部分包含起始凋亡信号传导的“死亡结构域”。TNFRII没有死亡结构域，并且其功能尚未清楚确定。另外TNFRI和TNFRII在关于配体TNF-α的亲和性方面表现出差异。已知TNFRI表现出的亲和力是TNFRII的亲和力的30倍或更高(Tartaglia等，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)268：18542-18548，1993；和Bernard等，Cytokine(细胞因子)7：759-770，1995)。由于这种亲和性差异，已经进行了多种尝试来开发关于TNFRI的药物。
粘附在细胞表面上的TNFR被蛋白酶切下，从而产生可溶的TNFR。所述可溶的TNFR中和过量的TNF，从而控制TNF的水平。在诸如自身免疫疾病和慢性炎症的情形中，过高水平的TNF完全超过自我调节的能力。
为了人工控制TNF信号传导，已经尝试了多种阻断TNF的策略，包括抑制TNF合成，抑制TNF分泌或释放，以及抑制TNF信号传导。在TNF阻断方法中，已经应用通过防止TNFR与TNF结合的阻断TNF信号传导的方法来开发药物。例如，通过将TNFRII细胞外区域与抗体的Fc区域融合而制备的伊那西普(etanercept)，以及能够结合TNF的抗体阿达木单抗(adalimumab)和英利昔单抗(infliximab)已经全球性用作治疗类风湿性关节炎、银屑病、强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis)等的治疗剂。
通过应用如抗类风湿性关节炎药物伊那西普中相同的技术制备的来那西普(lenercept)，是一种抗体Fc与TNFRI细胞外结构域的融合蛋白，其在欧洲和美国已经完成了II期临床试验(Furst等，J.Rheumatol.(风湿病学杂志)30：2123-2126，2003；和Rau等，J Rheumatol.(风湿病学杂志)30：680-690，2003 Arbraham等，Crit Care Med.29：503-510，2001)。另外，已经进行了关于TNFRI二聚体和聚乙二醇化可溶TNFRI分子的研究(Carl等，Ann.Rheum.Dis.(年度风湿病)58：173-181，1999；Solorzano等，J.Appl.Physiol.(应用生理学杂志)84：1119-1130，1998；Carl等，Advanced DrugDelivery Reviews(高级药物递送综述)55：1315-1336，2003；Honghui等，J.Clin.Pharmacol.(临床药理学杂志)45：490-497，2005；和Yugal等，TheAmerican Journal of Pathology(美国病理学杂志)172：1411-1418，2008)。
此外，已经研究了氨基酸序列的修饰作为一种减少TNFRI的免疫原性并且增加TNFRI与TNF结合的能力的途径。具体地，已知通过部分置换TNFRI的氨基酸序列而减少针对其的抗体存在的TNFRI突变体，和具有增加的TNFRI与TNF结合的能力的TNFRI突变体(美国专利号7,144,987)。
已经积极地进行研究来发现负责TNFR与TNF结合的活性位点，并且已知TNFR的第四结构域不是与TNF结合所必需的，并且当第二和第三结构域缺失时导致TNF结合活性的丧失(Corcoran等，Eur.J.Biochem.(欧洲生物化学杂志)233：831-840，1994；Chin-Hsueh等，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)270：2874-2878，1995；和Scallon等，Cytokine(细胞因子)7：759-770，1995)。此外，第三结构域用于TNFRI与TNF结合的特定区域可以被制成缺陷型的，并且已知由人TNFRI多肽(SEQ ID NO：1)的氨基酸残基59-143组成的氨基酸序列是表现出TNFRI生物学活性的区域(美国专利号6,989,147)。
因此，由于TNFRI与TNF的结合是在这一区域中，其他区域可以包括相当多的添加基团、消除的基团或置换的基团。
同时，为了增强生物利用度，TFNRI以TNFRI多肽片段的形式而不是以全长TNFRI的形式使用。为了制备能够最小化蛋白酶切割性并且增强细胞渗透性的有效的注射剂和口服制剂的目的，TFNRI需要以尽可能小的尺寸制备。
另外，由于蛋白治疗剂通过一般的过程(如在体内循环过程中的代谢、肾小球滤过以及胃肠道、组织和血液中的蛋白酶作用)清除，难以将蛋白治疗剂递送至靶位点同时在体内保留蛋白的固有活性。特别地，蛋白酶对药物的清除在通过口服施用、血管注射、肌内注射等施用蛋白治疗剂时对蛋白治疗剂的半衰期有显著的影响。
人肿瘤坏死因子抑制剂是一种蛋白治疗性药物并且在体内控制TNF，其已经以注射剂的形式开发出来，但是注射剂的施用具有与疼痛和感染风险相关的问题。因此，需要另一种途径，如减少注射频率或口服施用。对于该目的，增强人肿瘤坏死因子抑制剂的稳定性是必需的，然而，蛋白酶诱导的降解对其构成巨大的障碍。
因此，开发可口服施用的蛋白治疗剂的重要目标是开发表现出蛋白酶耐受性同时具有生物学活性的蛋白治疗剂。
发明的公开内容
技术问题
因此，本发明意欲提供修饰的人肿瘤坏死因子受体I(TNFRI)多肽或其片段，所述修饰的人肿瘤坏死因子受体I(TNFRI)多肽或其片段在体内或离体具有TNF抑制活性，并且表现出对胃肠道、细胞质和血液中存在的蛋白酶的提高的耐受性。
技术方案
除非另外指明，本说明书、实施例和后附权利要求书中所用的所有技术和科学术语具有下述定义的意思。
当用在本文中时，术语″人肿瘤坏死因子受体I″或″人肿瘤坏死因子受体I多肽″(以下称为“TNFRI”或“TNFRI多肽”)是指由来源于人的455个氨基酸组成且能够结合TNF的多肽。
当用在本文中时，术语″人肿瘤坏死因子受体I片段″或″人肿瘤坏死因子受体I多肽片段″(以下称为“TNFRI片段”或“TNFRI多肽片段”)是指具有与相对应的TNFRI氨基酸序列100％相同的氨基酸序列并且表现出至少一个TNFRI氨基酸残基缺失的TNFRI片段。所述缺失的氨基酸残基可以位于多肽的任意位置，诸如N端、C端、或在N端和C端之间。所述片段与全长TNFRI共有至少一种生物学特性。代表性的是由TNFRI的N端氨基酸残基41延伸的108个或126个氨基酸序列组成的片段，本文中分别命名为TNFRI108或TNFRI126。
当用在本文中时，术语″TNFRI变体″或″TNFRI突变体″或″TNFRI片段变体″，″TNFRI片段突变体″或″修饰的TNFRI多肽″，或″修饰的TNFRI多肽片段″是指与由下文定义的天然或重组细胞中分离的TNFRI多肽或其片段共有小于100％的序列同一性的TNFRI多肽或其片段。典型地，所述TNFRI变体与野生型或天然TNFRI或TNFRI片段具有约70％以上的氨基酸序列同一性。所述序列同一性优选至少约75％，更优选至少约80％，更优选至少约85％，甚至更优选至少约90％，并且最优选至少约95％。
当用在本文中时，术语“单一变体”是指在人肿瘤坏死因子受体I或人肿瘤坏死因子受体I片段的氨基酸序列中的一个位置具有突变的变体。
当用在本文中时，术语“双重变体”是指在人肿瘤坏死因子受体I或人肿瘤坏死因子受体I片段的氨基酸序列中的两个位置具有突变的变体。
当用在本文中时，术语“三重变体”是指在人肿瘤坏死因子受体I或人肿瘤坏死因子受体I片段的氨基酸序列中的三个位置具有突变的变体。
当用在本文中时，术语″TNFRIm″是指具有由TNFRI氨基酸序列N端的氨基酸残基41延伸的m个氨基酸组成的氨基酸序列的TNFRI片段。例如，TNFRI108片段是指具有由TNFRI N-端的氨基酸残基41延伸的108个氨基酸的序列的TNFRI片段。另一个实例是TNFRI126，其具有从TNFRI N-端的氨基酸残基41延伸的126个氨基酸的序列。
当用在本文中时，术语″Met-TNFRIm″具有由TNFRI N-端的氨基酸残基41延伸的m个氨基酸组成的氨基酸序列的TNFRI片段，其中为在大肠杆菌(E.coli)中表达的目的，在N端添加在TNFRI氨基酸序列中初始不存在的甲硫氨酸。
符号“xAz”用在本文中是指在氨基酸序列中用氨基酸z置换在位置A的氨基酸x。例如，K48Q是指用谷氨酰胺(Gln)残基置换在位置48的赖氨酸(Lys)残基。
本发明涉及在体内和/或离体具有TNF抑制活性并且提高的蛋白酶耐受性的修饰的TNFRI多肽或其片段，制备其的方法及其应用。
作为开发具有增加的体内和/或离体稳定性的TNFRI变体的广泛且透彻的研究的结果，本申请的发明人已经通过用既不被蛋白酶识别也不被蛋白酶切割且不显著改变生理化学特性的一个或多个氨基酸残基置换天然TNFRI片段的氨基酸序列中预计被蛋白酶识别且切割的一个或多个氨基酸残基而构建了具有增加的蛋白酶耐受性的TNFRI变体。
因此，本发明提供一种通过在天然TNFRI多肽或其片段的氨基酸序列的一个或多个特定位置进行氨基酸修饰而具有提高的蛋白酶耐受性的修饰的TNFRI多肽或其片段。
本发明所述的修饰的TNFRI多肽或其片段具有极佳的药物生物利用度并且甚至在不包含糖链时表现出活性，并且因此可以容易地在微生物细胞以及动物细胞中生产。
更具体地，本发明将在下文中综述。
本发明提供修饰的TNFRI多肽或其片段，其在选自由SEQ ID NO：1所示的天然人TNFRI多肽或其片段的氨基酸序列中位置61，68，78，85，106，107，109，121，128，133，135，136，138，141，150，156，161，200，203，206和207组成的组的一个或多个位置处包含氨基酸修饰；更优选地，在选自由位置68，85，109，128，133，135，136，141和161组成的组的一个或多个位置处包含氨基酸修饰；并且最优选地，在选自由位置68，109，133，135，136，141和161组成的组的一个或多个位置处包含氨基酸修饰。
在上述特定位置的氨基酸修饰是与未修饰的TNFRI多肽或其片段相比具有增加的蛋白酶耐受性的修饰，并且不仅包括在上述特定位置的氨基酸置换还包括另外的氨基酸化学修饰，如蛋白的翻译后修饰，例如，通过碳水化合物结构部分的糖基化，酰化(例如，乙酰化或琥珀酰化)，甲基化，磷酸化，hesylation，氨甲酰化，硫酸化，异戊二烯化，氧化，胍基化(guanidination)，脒基化，氨甲酰化(例如，甲氨酰化)，三硝基苯基化，硝化，和PEG化。本发明所述的修饰的TNFRI多肽或其片段通过在上述特定位置的氨基酸修饰表现出增加的对体内蛋白酶的耐受性。所述化学修饰可以通过按照本领域已知的常规方法操作氨基酸而进行。
本发明提供一种修饰的TNFRI多肽或其片段，所述修饰的TNFRI多肽或其片段在选自由SEQ ID NO：1所示的天然人TNFRI多肽或其片段的氨基酸序列中位置61，68，78，85，106，107，109，121，128，133，135，136，138，141，150，156，161，200，203，206和207组成的组的一个或多个位置处包含氨基酸置换。
优选地，本发明提供一种修饰的TNFRI多肽或其片段，所述修饰的TNFRI多肽或其片段在选自由SEQ ID NO：1所示的天然人TNFRI多肽或其片段的氨基酸序列中位置68，85，109，128，133，135，136，141和161组成的组的一个或多个位置处包含氨基酸置换，更优选地，在选自由位置68，109，133，135，136，141和161组成的组的一个或多个位置处包含氨基酸置换。
在由SEQ ID NO：1所示的天然人TNFRI多肽或其片段的氨基酸序列中位置61，68，78，85，106，107，109，121，128，133，135，136，138，141，150，156，161，200，203，206和207处的氨基酸置换是用既不被蛋白酶识别也不被蛋白酶切割且不显著改变生理化学特性的氨基酸残基对初始氨基酸残基的置换，并且优选包括用Q(Gln)或H(His)置换R(Arg)；用Q(Gln)或N(Asn)置换E(Glu)；用Q(Gln)或N(Asn)置换K(Lys)；用N(Asn)或Q(Gln)置换D(Asp)；用I(Ile)或V(Val)置换M(Met)；用A(Ala)或S(Ser)置换P(Pro)；用I(Ile)或H(His)置换Y(Tyr)；用I(Ile)或V(Val)置换F(Phe)；用H(His)或S(Ser)置换W(Trp)；以及用I(Ile)或V(Val)置换L(Lue)。
此外，本发明提供一种修饰的TNFRI多肽或其片段，其包含选自由SEQ ID NO：1所示的天然人TNFRI多肽或其片段的氨基酸序列中K61Q，K61N，L68I，L68V，D78Q，E85N，R106H，R106Q，K107Q，M109I，R121H，R121Q，R128H，R128Q，R133Q，Y135I，Y135H，W136H，W136S，E138Q，E138N，F141I，F141V，L150I，L156I，K161Q，K161N，E200Q，K203Q，E206Q，D207Q和D207N组成的组的一个或多个氨基酸置换。
优选地，本发明提供一种修饰的TNFRI多肽或其片段，其包含选自由SEQ ID NO：1所示的天然人TNFRI多肽或其片段的氨基酸序列中L68I，L68V，E85N，M109I，R128H，R133Q，Y135I，W136S，F141I，F141V，K161Q和K161N组成的组的一个或多个氨基酸置换，更优选地包含选自由L68I，L68V，M109I，R133Q，Y135I，W136S，F141I，F141V，K161Q和K161N组成的组的一个或多个氨基酸置换，进一步优选地包含选自由L68I，L68V，R133Q，Y135I，F141I，K161Q和K161N组成的组的一个或多个氨基酸置换。
优选地，本发明提供包含一个或两个上述氨基酸修饰的修饰的TNFRI多肽或其片段。
即，本发明提供一种修饰的TNFRI多肽或其片段，其包含选自由SEQID NO：1所示的天然人TNFRI多肽或其片段的氨基酸序列中K61Q，K61N，L68I，L68V，D78Q，E85N，R106H，R106Q，K107Q，M109I，R121H，R121Q，R128H，R128Q，R133Q，Y135I，Y135H，W136H，W136S，E138Q，E138N，F141I，F141V，L150I，L156I，K161Q，K161N，E200Q，K203Q，E206Q，D207Q和D207N组成的组的一个或两个氨基酸置换；优选地，提供这样的修饰的TNFRI多肽或其片段，其包含选自由SEQ ID NO：1所示的天然人TNFRI多肽或其片段的氨基酸序列中L68I，L68V，E85N，M109I，R128H，R133Q，Y135I，W136S，F141I，F141V，K161Q和K161N组成的组的一个或两个氨基酸置换；并且进一步优选地提供这样的修饰的TNFRI多肽或其片段，其包含选自由SEQ ID NO：1所示的天然人TNFRI多肽或其片段的氨基酸序列中L68I，L68V，R133Q，Y135I，F141I，K161Q和K161N组成的组的一个或两个氨基酸置换。
作为包含两个氨基酸置换的修饰的TNFRI多肽或其片段的优选实施方案，本发明提供这样的修饰的TNFRI多肽或其片段，其包含选自由SEQID NO：1所示的天然人TNFRI多肽或其片段的氨基酸序列中L68V，R133Q，F141V，K161Q，K161N，E200Q和D207N组成的组的两个氨基酸置换。更优选地，本发明提供包含两个氨基酸置换的修饰的TNFRI多肽或其片段，所述两个氨基酸置换为L68V和选自由SEQ ID NO：1所示的天然人TNFRI多肽或其片段的氨基酸序列中R133Q，F141V，K161Q，K161N，E200Q或D207N的一个氨基酸置换。进一步优选地，本发明提供这样的修饰的TNFRI多肽或其片段，其包含选自SEQ ID NO：1所示的天然人TNFRI多肽或其片段的氨基酸序列中L68V/K161Q，L68V/K161N或L68V/D207N的氨基酸置换。
SEQ ID NO：1所示的天然人TNFRI多肽的片段是指具有基本上等价于天然人TNFRI多肽的作用的天然人TNFRI多肽的一部分。具体地，本发明利用由SEQ ID NO：1所示的天然人TNFRI氨基酸序列的氨基酸残基41-211(SEQ ID NO：2；TNFRI171)组成的氨基酸序列；由SEQ ID NO：1所示的天然人TNFRI氨基酸序列的氨基酸残基41-166(SEQ ID NO：3；TNFRI126)组成的氨基酸序列；以及由SEQ ID NO：1所示的天然人TNFRI氨基酸序列的氨基酸残基41-148(SEQ ID NO：4；TNFRI108)组成的氨基酸序列。然而，本发明所述的SEQ ID NO：1所示天然人TNFRI多肽的片段并不限于上述TNFRI171，TNFRI126和TNFRI108，只要其表现出与天然人TNFRI多肽基本上等价的作用即可。
术语修饰的TNFRI多肽的“片段”是指表现出与所述修饰的TNFRI多肽基本上等价作用的修饰的TNFRI多肽的一部分，其可以由本领域技术人员容易的制备。
因此，本发明所述的具有提高的蛋白酶耐受性的修饰的TNFRI多肽或其片段包括下文示例的那些。
本发明提供修饰的人肿瘤坏死因子受体I多肽或其片段(TNFRI171变体或其片段)，其包含在由SEQ ID NO：1所示的天然人肿瘤坏死因子受体I氨基酸序列的氨基酸残基41-211组成的氨基酸序列的位置61，68，78，85，106，107，109，121，128，133，135，136，138，141，150，156，161，200，203，206和207组成的组的一个或多个位置处的氨基酸修饰；优选包含在选自由位置68，85，109，128，133，135，136，141和161组成的组的一个或多个位置处的氨基酸修饰；更优选地包含在选自由位置68，109，133，135，136，141和161组成的组的一个或多个位置处的氨基酸修饰。此处，关于氨基酸修饰，与上述具体修饰和优选修饰相同的修饰应该应用于上述特定位置处的氨基酸修饰。
本发明提供修饰的人肿瘤坏死因子受体I多肽或其片段(TNFRI126变体或其片段)，其包含在由SEQ ID NO：1所示的天然人肿瘤坏死因子受体I氨基酸序列的氨基酸残基41-166组成的氨基酸序列的位置61，68，78，85，106，107，109，121，128，133，135，136，138，141，150，156和161组成的组的一个或多个位置处的氨基酸修饰；优选包含在选自由位置68，85，109，128，133，135，136，141和161组成的组的一个或多个位置处的氨基酸修饰；更优选地包含在选自由位置68，109，133，135，136，141和161组成的组的一个或多个位置处的氨基酸修饰。此处，关于氨基酸修饰，与上述具体修饰和优选修饰相同的修饰应该应用于上述特定位置处的氨基酸修饰。
本发明提供修饰的人肿瘤坏死因子受体I多肽或其片段(TNFRI108变体或其片段)，其包含在由SEQ ID NO：1所示的天然人肿瘤坏死因子受体I氨基酸序列的氨基酸残基41-148组成的氨基酸序列的位置61，68，78，85，106，107，109，121，128，133，135，136，138和141组成的组的一个或多个位置处的氨基酸修饰；优选包含在选自由位置68，85，109，128，133，135，136和141组成的组的一个或多个位置处的氨基酸修饰；更优选地包含在选自由位置68，109，133，135，136和141组成的组的一个或多个位置处的氨基酸修饰。此处，关于氨基酸修饰，与上述具体修饰和优选修饰相同的修饰应该应用于上述特定位置处的氨基酸修饰。
此外，本发明提供这样的修饰的TNFRI多肽或其片段，其在与具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的TNFRI多肽基本上相同的多肽中包含上述指定的氨基酸修饰或相对应的修饰。术语“与具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的TNFRI多肽基本上相同的多肽”是指包含对TNFRI的固有活性无害的氨基酸修饰数目和种类的多肽，所述氨基酸修饰即氨基酸置换、缺失、添加或其他修饰。具体地，本发明提供这样的修饰的TNFRI多肽或其片段，其在与具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的多肽的同源性大于90％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％或大于99％的变体中包含与上述具体氨基酸修饰相对应的修饰。
除了本发明用于提高对蛋白酶的耐受性的氨基酸修饰外，上述变体与具有SEQ ID NO：1所示的序列的多肽的序列同源性大于90％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％或大于99％，并且所述变体包括人TNFRI多肽的等位基因变体同种型，组织特异性同种型和其等位基因变体，具有一个或多个氨基酸突变、替换、缺失、插入或添加的合成的变体，通过核酸翻译制备的合成分子，从人以及非人组织和细胞分离的蛋白，嵌合TNFRI多肽及其修饰形式。
当用在本文中时，术语“相对应的修饰”是指在作为其他同种型的多肽之中或之间可比较的残基的修饰。即，“相对应的修饰”意指与本发明在具有这样的残基的位置处用于提高对蛋白酶耐受性的氨基酸修饰相对应的修饰，所述残基在与SEQ ID NO：1所示的天然人TNFRI多肽的氨基酸序列进行序列比对时鉴定为不改变功能的。本领域技术人员可以容易地鉴定所述多肽之间或之中相对应的残基的修饰。例如，通过比对TNFRI多肽的序列，利用保守的和相同的氨基酸残基作为指导，本领域技术人员可以鉴定相对应的残基。
此外，本发明提供包含SEQ ID NO：6至SEQ ID NO：266中任一项所示的氨基酸序列的TNFRI多肽或其片段，优选包含SEQ ID NOS：18，19，33，52，62，69，70，73，78，79，94，95，109，128，138，145，146，149，154，155，164，165，178，179，193，212，222，229，230，233，238，239，248，249，或258至266中任一项所示的氨基酸序列的TNFRI多肽或其片段，更优选包含SEQ ID NOS：18，19，69，70，78，94，95，145，146，154，164，165，178，179，229，230，238，248，249，或261至263中任一项所示的氨基酸序列的TNFRI多肽或其片段。
为了增加蛋白酶耐受性、减少免疫原性、或保持或增强生物学活性的目的，除了上述氨基酸修饰之外，本发明所述的修饰的TNFRI多肽或其片段可以进一步包含其他化学修饰，如蛋白的翻译后修饰，例如，通过碳水化合物结构部分的糖基化，酰化(例如，乙酰化或琥珀酰化)，甲基化，磷酸化，hesylation，氨甲酰化，硫酸化，异戊二烯化，氧化，胍基化(guanidination)，脒基化，氨甲酰化(例如，甲氨酰化)，三硝基苯基化，硝化，和PEG化。
此外，本发明提供编码前述TNFRI多肽或其片段的基因。
本发明所述的编码TNFRI多肽或其片段的基因包括关于在大肠杆菌中表达最优化而改造的基因。由于人和大肠杆菌之间基因密码子的不同，当在大肠杆菌中表达人基因时，基因的表达产率低。由于这一原因，本发明可以使用基于人TNFRI基因经过改造适于在大肠杆菌中表达的基因，例如，SEQ ID NO：5的TNFRI基因。当将该基因插入到大肠杆菌表达载体(例如pET44a(Cat.No：71122-3，Novagen))中，然后在不添加密码子的条件下在大肠杆菌细胞(例如：BL21(DE3))中表达时，该基因表现出比人TNFRI基因更高的表达水平。因此，使用上述基因，可以在大肠杆菌中有效地生产TNFRI片段和TNFRI变体。
此外，本发明提供包含该基因的载体。在本发明中可以用来引入基因的载体可以是本领域已知的载体，优选具有图1至图5的切割图谱的载体。
此外，本发明提供用该载体转化的微生物细胞或动物细胞。在本发明中可以用于转化载体的微生物细胞或动物细胞可以是本领域已知的用于转化的微生物细胞或动物细胞，优选大肠杆菌细胞、CHO细胞、或HEK293细胞，更优选大肠杆菌细胞(例如，大肠杆菌BL21(DE3))。
本发明提供一种利用大肠杆菌生产TNFRI的方法。
TNFRI可以使用动物细胞生产(Bernie等，The Journal of Pharmacologyand Experimental Therapeutics(药理学和实验治疗剂杂志).301：418-426，2002；和Scallon等，Cytokine(细胞因子).7：759-770，1995)。
由于当在大肠杆菌中表达TNFRI时，TNFRI以不是构象活性的包涵体形式表达，所以需要重折叠成为活性蛋白的过程(Silvia等，AnalyticalBiochemistry(分析生物化学)230：85-90，1995；和Karin等，Cytokine(细胞因子).7：26-38，1995)。因此，本发明所述的修饰的TNFRI多肽或其片段可以通过在大肠杆菌中以包涵体形式表达TNFRI，将所表达的TNFRI重折叠为活性TNFRI，并且使用凝胶过滤层析等纯化活性TNFRI而生成。备选地，使用涉及连接亲水性融合蛋白的表达方法、低温培养方法等，本发明所述的修饰的TNFRI多肽或其片段可以在大肠杆菌中以可溶蛋白的形式而不是包涵体颗粒形式生产。在本发明的实施例中，通过在TNFRI蛋白的N端连接亲水性NusA蛋白，在大肠杆菌中生产作为可溶蛋白的TNFRI。
此外，本发明提供用于生产TNFRI多肽或其片段的方法，所述方法包括将基因引入到适当的载体中，将所述载体转化到宿主细胞中产生转化体，并且在培养基中培养所述转化体，从而表达所述TNFRI多肽或其片段。
此外，本发明提供用于治疗TNF-介导的疾病或内部症状(以下称为“TNF-介导的疾病”)的方法。所述TNF-介导的疾病、相关的后遗症以及与其相关的症状的实例包括：成人呼吸窘迫综合征(adult respiratory distresssyndrome)；厌食症(anorexia)；癌症(例如白血病(leukemia))；慢性疲劳综合征(chronic fatigue syndrome)；移植物抗宿主排斥(graft-versus-hostrejection)；痛觉过敏(hyperalgesia)；炎性肠病(inflammatory boweldisease)；神经炎性病(neuroinflammatory disease)；缺血性/再灌注损伤(ischemic/reperfusion injury)，包括脑缺血(cerebral ischemia)(由外伤(trauma)、癫痫(epilepsy)、出血(hemorrhage)或中风(stroke)导致的脑损伤，它们中的每一种可以导致神经变性)；糖尿病(diabetes)(例如，青少年发作的1型糖尿病(juvenile onset Type 1 diabetes mellitus))；多发性硬化(multiple sclerosis)；眼病(ocular diseases)；疼痛；胰腺炎(pancreatitis)；肺纤维化(pulmonary fibrosis)；风湿性疾病(rheumaticdiseases)(例如，类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)，骨关节炎(osteoarthritis)，青少年(类风湿性)关节炎(juvenile(rheumatoid)arthritis)，血清阴性多关节炎(seronegative polyarthritis)，强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis)，莱特尔综合征(Reiter′s syndrome)和反应性关节炎(reactive arthritis)，银屑病关节炎(psoriatic arthritis)，肠病性关节炎(enteropathic arthritis)，多肌炎(polymyositis)，皮肌炎(dermatomyositis)，硬皮病(scleroderma)，系统性硬化病(systemicsclerosis)，血管炎(vasculitis)，脑血管炎(cerebral vasculitis)，舍格伦综合征(Sjogren′s syndrome)，风湿热(rheumatic fever)，多软骨炎(polychondritis)和风湿性多肌痛(polymyalgia rheumatica)和巨大细胞动脉炎(giant cell arteritis)；感染性休克(septic shock)；放射性治疗诱发的副作用(radiotherapy-induced side effects)；系统性红斑狼疮(systemiclupus erythematous)；颞下颌关节病(temporomandibular joint disease)；甲状腺炎(thyroiditis)和组织移植(tissue transplantation)。
此外，本发明提供用于预防或治疗类风湿性关节炎或TNF-介导的疾病的组合物，所述组合物包含所述修饰的TNFRI多肽或其片段。
此外，本发明提供用于预防或治疗类风湿性关节炎或TNF-介导的疾病的组合物，所述组合物包含编码所述修饰的TNFRI多肽或其片段的基因，包含所述基因的载体或用所述载体转化的微生物细胞或动物细胞。
除了口服途径或通过吸入之外，本发明的药物组合物还可以通过静脉内或皮下途径施用。所述药物组合物可以通过将具有所需要纯度的TNFRI变体与药用载体(carriers)、赋形剂或稳定剂混合而制备用于储存或施用。可接受的载体(carriers)、赋形剂或稳定剂以所用的剂量和浓度对接受者无毒，并且包括缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐和其他有机酸盐；抗氧化剂，如抗坏血酸；低分子量(长度小于约10个残基)肽，包括聚精氨酸，和蛋白，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或精氨酸；和其他糖类，包括单糖、二糖、纤维素及其衍生物、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖醇，如甘露醇或山梨醇；平衡离子，如钠；和/或非离子型表面活性剂，如吐温、Pluronics或聚乙二醇(PEG)。
本发明的药物组合物可以按照本领域已知的常规方法配制为用于注射的无菌组合物的形式。所述用于注射的无菌组合物可以包含活性化合物在赋形剂(vehicle)中的溶液或混悬液，所述赋形剂如水或天然纯在的植物油，如芝麻油、花生油或棉籽油，或合成的脂肪赋形剂，如油酸乙酯。按照接受的制药实践，所述用于注射的无菌组合物可以结合在缓冲剂、防腐剂、抗氧化剂等中。
本发明所述的修饰的TNFRI多肽或其片段、编码其的基因、或包含所述基因的载体、或用所述载体转化的微生物细胞或动物细胞以对于TNF-介导的疾病治疗有效的量结合在药物组合物中。
当用在本文中时，术语“治疗有效量”是指当施用给受试者时足以引发有效的反应(即，研究者、兽医、医生或其他临床医师寻找的动物或人的生物学或医学反应)的活性成分或药物组合物的量/剂量。治疗有效量意欲包括引起被治疗的疾病或病症的症状减轻的量。本领域技术人员明白本发明的活性成分的治疗有效量和给药频率取决于所需要的作用而变化。因此，本领域技术人员可以容易地确定最佳剂量，并且可以按照多种因素(如疾病的类型和严重性，组合物中活性成分和其他成分的含量，剂型，以及受试者的年龄、体重、身体状况和性别，以及饮食，组合物的施用时间和途径以及排泄率，治疗的持续时间，和同时给药的药物)进行调整。例如，对于成人，本发明的TNFRI变体优选以0.01至1,000mg/kg的剂量每天一次施用，更优选以0.1至100mg/kg每天一次施用。
本发明所述的TNFRI多肽或其片段可以作为其他治疗法的添加而施用并且可以与其他适用于被治疗的适应证的药物组合物一起施用。本发明所述的TNFRI多肽或其片段可与任何一种或多种已知的或新型的抗炎药物分开或组合施用。关于与所述药物相对应的化合物的信息可见于″TheMerck Manual of Diagnosis and Therapy(默克诊断和治疗手册)″，第16版，Merck，Sharp&Dohme Research Laboratories(Sharp&Dohme研究实验室)，Merck&Co.，Rahway，N.J.(1992)和″Pharmaprojects″，PJBPublications Ltd.(PJB出版有限公司)。
作为组合使用的实例，本发明所述的TNFRI多肽或其片段可以与用于控制炎症的分类为非类固醇抗炎药(NSAIDs)的一线药物组合用于治疗TNF-介导的疾病，所述疾病包括急性和慢性炎症，如风湿病(例如，莱姆病(lyme disease)，青少年(类风湿性)关节炎(juvenile(rheumatoid)arthritis)，骨关节炎(osteoarthritis)，银屑病关节炎(psoriatic arthritis)，类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)和葡萄糖球菌属诱发的(感染性)关节炎(staphylococcal-induced(“septic”)arthritis))。
作为组合使用的另一个实例，本发明所述的TNFRI多肽或其片段可以与任何一种或多种长效抗风湿药(slow-acting antirheumatic drugs，SAARDs)或缓解疾病的抗风湿药(disease modifying antirheumatic drugs，DMARDS)、其药物前体酯类或药用盐组合使用，用于治疗上文定义的TNF-介导的疾病和多发性硬化。
作为组合使用的另一个实例，本发明所述的TNFRI多肽或其片段可以与任何一种或多种COX2抑制剂、其药物前体酯类或药用盐组合使用，用于治疗上文定义的TNF-介导的疾病。
此外，本发明所述的TNFRI多肽或其片段可以与任何一种或多种抗细菌药物、其药物前体酯类或药用盐组合使用，用于治疗上文定义的TNF-介导的疾病。
本发明所述的TNFRI多肽或其片段可以与下述任何一种或多种化合物组合使用，用于治疗上文定义的TNF-介导的疾病：粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor)；沙利度胺(thalidomide)；替尼达普(tenidap)；tiapafant；尼美舒利(nimesulide)；panavir；咯利普兰(rolipram)；柳氮磺吡啶(sulfasalazine)；巴柳氮(balsalazide)；奥沙拉秦(olsalazine)；美沙拉秦(mesalazine)；泼尼松龙(prednisolone)；布地奈德(budesonide)；甲泼尼龙(methylprednisolone)；羟化可的松(hydrocortisone)；甲氨喋呤(methotrexate)；环孢素(cyclosporin)；肽T(peptide T)；(1R，3S)-顺式-1-[9-(2，6-二氨基嘌呤基)]-3-羟基-4-环戊烯盐酸化物；(1R，3R)-反式-1-[9-(2，6-二氨基)嘌呤]-3-乙酸基环戊烷；(1R，3R)-反式-1-[9-腺嘌呤基)-3-叠氮基环戊烷盐酸化物和(1R，3R)-反式-1-[6-羟基-嘌呤-9-基)-3-叠氮基环戊烷。
本发明所述的TNFRI多肽或其片段可以与一种或多种另外的TNF抑制剂组合使用，用于治疗上文定义的TNF-介导的疾病。所述TNF抑制剂包括阻断TNF的体内合成或细胞外释放的化合物和蛋白：例如，抗TNF抗体，包括MAK 195F Fab抗体(Holler等(1993)，1st InternationalSymposium on Cytokines in Bone Marrow Transplantation(关于骨髓移植中的细胞因子的第一次国际研讨会)，147)；CDP 571抗TNF单克隆抗体(Rankin等(1995)，British Journal of Rheumatology(英国风湿病学杂志)，34：334-342)；BAY X 1351鼠抗肿瘤坏死因子单克隆抗体(Kieft等(1995)，7th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases(第7次欧洲临床微生物学和传染病会议)，9)；CenTNF cA2抗TNF单克隆抗体(Elliott等(1994)，Lancet，344：1125-1127和Elliott等(1994)，Lancet(柳叶刀)，344：1105-1110)。
此外，本发明提供包含TNFRI多肽或其片段的药物制剂。优选地，本发明的药物制剂还包含药用赋形剂。本发明的药物制剂可以以选自由下列各项组成的组的药物配方形式存在：口服配方、吸入剂、注射剂、透黏膜配方、和外用剂。
本发明的药物制剂包含治疗有效量的药用稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、辅剂或载体。
另外，本发明的药物制剂包含本领域中常用的添加剂，所述添加剂包括缓冲剂(例如Tris缓冲剂，乙酸盐缓冲剂，或磷酸盐缓冲剂)，去污剂(例如吐温80)，抗氧化剂(例如抗坏血酸，偏亚硫酸氢钠)，防腐剂(例如乙基汞硫代水杨酸钠，苯甲醇)和填充物质(例如乳糖，甘露醇)。所述添加剂可以结合在聚合化合物(如聚乳酸或聚乙醇酸)的颗粒制剂中或结合在脂质体中。本发明的药物制剂可以包含透明质酸，以用于促进在循环中的持续存在时间的目的。本发明的药物制剂可以任选地包含作为药用媒介物(vehicles)、赋形剂或介质的药用液体、半固体、或固体稀释剂，其包括但不限于，聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯，淀粉，蔗糖，葡萄糖，阿拉伯树胶，磷酸钙，矿物油，可可脂，和可可油。
本发明的药物制剂还包含惰性添加剂，所述惰性添加剂提供对抗胃环境的保护，并且提供生物学活性物质在肠中的释放。
本发明的药物制剂使用已知的技术制备，所述已知的技术包括混合、溶解、粒化、制备糖衣片、磨碎、乳化、包封、截留或压片过程。
本发明的药物制剂可以以液体(例如，混悬液、酏剂和/或溶液)或固体(例如，粉剂、片剂和/或胶囊)形式存在，或者可以配制成长效制剂的形式。所述长效制剂典型地比非长效制剂作用更久。所述长效制剂使用适当的聚合物或疏水性物质(例如，在适当的油中的乳剂)或离子交换树脂制备，或者作为略溶的衍生物，例如，作为略溶的盐。此外，本发明的药物制剂包含递送系统，如脂质体或乳剂。某些递送系统可用于制备特定的药物制剂，包括包含疏水性化合物的那些。在某些实施方案中，使用有机溶剂，如二甲亚砜。在本发明的另一个方面中，本发明的药物组合物包含一种或多种组织特异性递送分子，所述组织特异性递送分子设计为将药剂递送至特定的组织或细胞类型。例如，在某些实施方案中，所述药物制剂包含由组织特异性抗体包被的脂质体。
优选地，本发明的药物制剂可以配制成口服固体剂型。固体剂型包括片剂、胶囊、药丸、药片或小丸。
此外，可以利用脂质体包封或类蛋白质包封来配制本发明的组合物。脂质体可以由磷脂和亲水性聚合物制备，所述磷脂如磷脂酰胆碱(PC)，磷脂酰乙醇胺(PE)，磷脂酸(PA)，磷脂酰肌醇(PI)和鞘磷脂(SM)；所述亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮，聚乙烯甲基醚，聚甲基唑啉，聚乙基唑啉，聚羟丙基唑啉，聚羟丙基甲基丙烯酰胺，聚甲基丙烯酰胺，聚二甲基丙烯酰胺，聚甲基丙稀酸羟基丙基酯，聚丙稀酸羟基乙基酯，羟甲基纤维素，羟乙基纤维素，聚乙二醇和聚天冬酰胺(polyaspartamide)。
如果需要，包含在本发明的药物制剂中的TNFRI多肽或其片段可以进行化学修饰，以使口服递送有效。通常，所考虑的化学修饰是将至少一种结构部分(moiety)连接到TNFRI变体多肽上，其中所述结构部分可以是赋予蛋白酶耐受性或帮助从胃或肠吸收到血流中的物质。优选地，用于化学修饰的结构部分可以是用于提高本发明的药物制剂的整体稳定性并且因此增加其在体内的循环时间的化学修饰的结构部分。结构部分的实例包括聚乙二醇，乙二醇和丙二醇的共聚物，羧甲基纤维素，葡聚糖，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮和聚脯氨酸。可以使用的其他聚合物为聚-1，3-二烷和聚-1，3，6-三烷。最优选的是聚乙二醇结构部分(PEG化)。
修饰的脂肪族氨基酸的盐，如N-(8-[2-羟基苯甲酰基]氨基)辛酸钠(SNAC)可以用作增强口服剂型的本发明制剂的吸收的载体。
本发明的药物制剂可以配制为粒径约为1mm的颗粒或小丸形式的细碎的多颗粒。在这种情形中，药剂可以以胶囊形式存在。所述多颗粒制剂可以以粉剂、略微压缩的栓剂(plug)或片剂形式存在。所述制剂可以通过压缩制备。
本发明的药物制剂还可以，例如，通过进一步结合着色剂和调味剂包封的脂质体或微球体的形式配制。
此外，为了增强作为本发明的药物制剂中的活性成分的TNFRI多肽或其片段的摄取，可以使用添加剂，其包括脂肪酸，如油酸或亚油酸。
本发明的药物制剂可以是控释制剂。作为所述制剂中的活性成分的TNFRI多肽或其片段可以结合在惰性载体中，所述惰性载体通过扩散或溶出机制允许控制性释放。此外，控释制剂可以包含缓慢崩解基质，例如，藻酸盐或多糖。另一种形式的控释制剂可以基于Osmotic Release Oraldelivery System(渗透释放口服递送系统，OROS，Alza Corp.)。在控释制剂中，作为本发明的活性成分的TNFRI变体被包裹在半透膜中，所述半透膜由于渗透作用允许水进入并且通过单个小开口排出活性成分。本发明的控释制剂可以具有肠衣，从而表现出药物的延迟释放作用。
本发明的药物制剂可以以膜包被的片剂形式存在。用于膜包被的物质分成两组。第一组是非肠溶物质，并且包括甲基纤维素，乙基纤维素，羟乙基纤维素，甲基羟乙基纤维素，羟丙基纤维素，羟丙基甲基纤维素，羧甲基纤维素钠，聚乙烯吡咯烷酮(povidone)和聚乙二醇。第二组由肠溶物质如苯二甲酸的酯类组成。详细地，作为肠溶物质的肠溶聚合物选自由下列各项组成的组：肠溶纤维素衍生物，肠溶丙烯酸共聚物，肠溶马来酸共聚物，肠溶聚乙烯衍生物，和它们的组合。所述肠溶纤维素衍生物是选自由下列各项组成的组的至少一种：醋酸琥珀羟丙甲纤维素酯(hypromellose acetate succinate)，羟丙甲纤维素邻苯二甲酸酯，羟甲基乙基纤维素邻苯二甲酸酯，醋酸邻苯二甲酸纤维素，醋酸琥珀酸纤维素，醋酸马来酸纤维素，苯甲酸邻苯二甲酸纤维素，丙酸邻苯二甲酸纤维素，甲基纤维素邻苯二甲酸酯，羧甲基乙基纤维素和乙基羟乙基纤维素邻苯二甲酸酯。所述肠溶丙烯酸共聚物是选自由下列各项组成的组的至少一种：苯乙烯-丙烯酸共聚物，丙烯酸甲酯-丙烯酸共聚物，丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物，丙烯酸丁酯-苯乙烯-丙烯酸共聚物，甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物(例如，Eudragit L 100，Eudragit S，Degussa)，甲基丙烯酸-丙烯酸乙酯共聚物(例如，Eudragit L 100-55，Degussa)，和丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸-丙烯酸辛酯共聚物。所述肠溶马来酸共聚物是选自由下列各项组成的组的至少一种：乙烯乙酸酯-马来酸酐共聚物，苯乙烯-马来酸酐共聚物，苯乙烯-马来酸单酯共聚物，乙烯基甲醚-马来酸酐共聚物，乙烯-马来酸酐共聚物，乙烯基丁醚-马来酸酐共聚物，丙烯腈-丙烯酸甲酯-马来酸酐共聚物，和丙烯酸丁酯-苯乙烯-马来酸酐共聚物。所述肠溶聚乙烯衍生物是选自由下列各项组成的组的至少一种：聚乙烯醇邻苯二甲酸酯，聚乙烯醇缩乙醛邻苯二甲酸酯，聚乙烯基丁醛邻苯二甲酸酯(polyvinylbutyratephthalate)，和聚乙烯醇缩醛邻苯二甲酸酯(polyvinylacetacetal phthalate)。
上述包衣物质的混合物可以用来提供最佳的膜包被。膜包被可以在盘式涂层机中或在流态化床制粒机中或通过压缩涂层机进行。
为了缓释药物的目的，本发明的控释药物制剂可以在成形物品形式(例如，膜或微胶囊)的固体疏水性聚合物的半透性基质中包含本发明的TNFRI多肽或其片段。缓释基质的实例包括聚酯，水凝胶[例如，由Langer等，J.Biomed.Mater.Res.(生物医学材料研究杂志)，15：167-277，1981和Langer，Chem.Tech.(化学技术)，12：98-105，1982所述的聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇)]，聚乳酸(美国专利号3,773,919，EP 58,481)，L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物(Sidman等，Biopolymers(生物聚合物)22：547-556，1983)，非降解性乙烯醋酸乙烯酯(Langer等，同上)，降解性乳酸-乙醇酸共聚物(例如，Lupron DepotTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙立德组成的可注射微球体)，和聚-D-(-)-3-羟基丁酸(EP 133,988)。
当包封的蛋白在体内保持长时间时，由于暴露于在37℃的潮湿条件，它们可能变性或聚集，导致生物学活性的丧失和可能的免疫原性变化。依据所涉及的机制，可以设计用于蛋白稳定的合理策略。例如，如果发现聚集机制是通过二硫化物交换而形成分子间S-S键形成，可以通过修饰巯基残基、由酸性溶液冻干、控制含水量、使用适当的添加剂、和开发特定的聚合物基质组合物而实现稳定。
此外，本发明提供本发明的TNFRI变体，和包含其的药物制剂的应用。所述药物制剂可以通过注射、或通过口服、鼻、经皮或其他施用形式施用，所述其他施用形式包括，例如，通过静脉内、皮内、肌内、乳房内、腹膜内、鞘内、眼内、肺内或皮下注射；通过舌下、肛门、阴道或通过手术植入施用。治疗可以由单一剂量或一段时间的多次剂量组成。
此外，本发明的药物制剂可以通过肺递送方法递送。在吸入的同时将本发明的药物制剂递送至肺，并且穿过肺上皮层进行血流。
设计用于肺递送药物的宽泛的机械装置可以用于肺递送本发明的药物组合物。所述装置的实例包括喷雾器、计量吸入器、和粉剂吸入器，所有这些在本领域中是可商购的。
本发明的药物制剂可以适当地配制用于在上述装置中的最佳应用。典型地，每种制剂对于所用的装置是特异性的，并且除了治疗中可用的稀释剂、辅剂或载体之外，还可以包括使用适当的推进剂。
本发明用于肺递送的药物制剂优选地以平均粒径约为10μm以下、最优选约为0.5至5μm的颗粒形式提供，用以有效地递送至远端的肺部。
本发明用于肺递送的药物制剂还可以包含糖类作为载体，所述糖类如海藻糖、甘露醇、木糖醇、蔗糖、乳糖或山梨醇。所述药物制剂可以进一步包含二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)和二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)。所述药物制剂还可以包含天然的或合成的表面活性剂。所述药物制剂可以进一步包含聚乙二醇、葡聚糖如环糊精、胆酸和其他相关的衍生物、以及用于缓冲剂制剂中的氨基酸。
此外，对于本发明的药物制剂的肺递送，考虑使用脂质体、微胶囊或微球体、包裹体复合物(inclusion complexes)、或其他类型的载体。
本发明的药物制剂的肺递送可以使用带有喷嘴或超声方式的喷雾器进行。适用于喷雾器的的本发明的药物制剂包含溶解在水中的TNFRI变体，其浓度为每mL溶液约0.1-25mg生物学活性蛋白。喷雾剂制剂还可以包括缓冲剂和单糖，例如，其有助于蛋白稳定和渗透压调节。喷雾剂制剂还可以包含表面活性剂，从而在形成气雾剂时减少或防止由溶液的雾化引起的表面诱导的蛋白聚集。
本发明用于计量吸入器装置的药物制剂通常包含含有本发明的TNFRI变体的组合物的细碎分裂的粉末，所述粉末借助表面活性剂混悬在推进剂中。所述推进剂可以是含氯氟烃，氢化含氯氟烃，氢氟烃，或烃，包括三氯氟甲烷，二氯二氟甲烷，二氯四氟乙醇，和1，1，1，2-四氟乙烷，或它们的组合。可以用在本发明中的适当的表面活性剂的实例包括失水山梨糖醇三油酸酯和大豆卵磷脂(soya lecithin)。也可以使用油酸作为表面活性剂。
本发明用于从粉剂吸入器中分散的药物制剂由包含本发明的TNFRI变体的组合物的细碎分裂的干粉组成，并且还可以包含填充剂，如乳糖、山梨醇、蔗糖、甘露醇、海藻糖、或木糖醇。这些可以促进所述粉剂从装置中分散。
还考虑本发明的药物制剂的鼻递送。鼻递送允许蛋白治疗剂在将该蛋白治疗剂施用至鼻后直接进入血流，由此防止该治疗剂产物的肺沉积。本发明用于鼻递送的药物制剂包含葡聚糖或环糊精等。对于本发明的药物制剂，也考虑通过穿过其他黏膜转运的递送。
用于治疗上述疾病或病症的方法中所涉及的本发明的药物制剂的给药方案可以由主治医师根据改变药物作用的多种因素来确定，所述因素例如患者的年龄、状况、体重、性别和饮食，任何感染的严重性，施用的时间和其他临床因素。
本发明的药物制剂可以通过单次给药或连续给药施用，但是优选通过初始推注(bolus)然后连续输注来施用，从而保持药物在循环中的治疗水平。本领域已知的典型技术容易最优化有效剂量和施用方案。给药的频率取决于药剂的药物代谢动力学参数和施用途径。给药方案、施用方案和给药频率也可以根据所施用的药剂的物理状态、稳定性、体内释放率、和体内清除率而最优化。对于每种施用途径，可以根据体重、体表面积或器官尺寸计算适当的剂量。适当的剂量可以由已建立的用于确定血液水平剂量的测定法联合适当的剂量-响应数据来确定。最终给药方案由主治医师根据改变药物作用的各种因素来确定，所述因素例如药物的特异性活性，患者的严重性和反应，患者的年龄、状况、体重、性别和饮食以及其他临床因素。随着研究进行，将出现关于用于不同疾病和病症的适当的剂量水平和治疗的持续时间的进一步的信息。
有益效果
本发明所述的修饰的人肿瘤坏死因子受体I(TNFRI)多肽或其片段具有提高的蛋白酶耐受性，并且因此在注射或口服施用时表现出提高的生物利用度和吸收率。因此，所述TNFRI多肽或其片段可以有益地用作长时间作用的注射剂和口服蛋白药物。
附图描述
图1是显示能够表达TNFRI108的大肠杆菌表达载体的构建的示意图，对于TNFRI108，通过将TNFRI108基因插入到具有编码NusA蛋白的基因的pET44a载体中而融合NusA。
图2是在用pET44a-NusA-TNFRI108表达载体转化的大肠杆菌中表达NusA-融合的TNFRI108后通过固定的金属亲和层析和疏水性相互作用层析纯化的NusA-融合的TNFRI108的照片。
图3是验证关于TNFRI108片段(对照)和TNFRI108片段单一变体TNFRI108-68结合TNF-α的能力的BIAcore测定(3A)和ELISA(3B)的结果的图。
图4是验证TNFRI108片段单一变体TNFRI108-14、TNFRI108-64、和TNFRI108-68相对于TNFRI108片段的蛋白酶耐受性增加的图。
图5是显示能够表达Met-TNFRI126或Met-TNFRI171的大肠杆菌表达载体的构建的示意图，所述构建通过将Met-TNFRI126或Met-TNFRI171基因插入到pET44a载体中进行。
图6A是验证Met-TNFRI126和Met-TNFRI171蛋白通过凝胶过滤层析的洗脱(级分A4)的图，图6B是显示在还原状态下纯化的Met-TNFRI126和Met-TNFRI171的SDS-PAGE分析结果的照片。
图7是验证关于Met-TNFRI126片段(对照)、Met-TNFRI126片段变体Met-TNFRI126-14、Met-TNFRI126-64、Met-TNFRI126-65、和Met-TNFRI126-68结合TNF-α的能力的ELISA结果的图。
图8A是显示关于Met-TNFRI171片段(对照)、Met-TNFRI171片段变体Met-TNFRI171-83、Met-TNFRI171-84、和Met-TNFRI171-92结合TNF-α的能力的测定结果的图，图8B是验证Met-TNFRI171片段单一变体Met-TNFRI171-83、Met-TNFRI171-84、和Met-TNFRI171-92相对于Met-TNFRI171片段的蛋白酶耐受性增加的图。
图9是验证关于Met-TNFRI171片段(对照)、Met-TNFRI171片段双重变体Met-TNFRI171-204、Met-TNFRI171-205、和Met-TNFRI171-206结合TNF-α的能力的ELISA结果的图。
图10是验证Met-TNFRI171片段双重变体Met-TNFRI171-204(10A)、Met-TNFRI171-205(10B)、和Met-TNFRI171-206(10C)相对于Met-TNFRI171片段的蛋白酶耐受性增加的图。
发明模式
通过下述实施例将更清楚地明白本发明的上述和其他目的、特征和其他优点。然而，本发明并不限于下文公开的实施例。
利用人TNFRI基因组的信息来制备本发明所述的TNFRI多肽或其片段，所述基因组已经公共公开。
TNFRI片段基因通过聚合酶链式反应(以下称为“PCR”)合成，并且克隆到载体pGEM-T(Cat.No：A1380，Promega，)中，然后将其插入到pET44a(Cat.No：71122-3，Novagen)中用于在大肠杆菌中表达，由此构建微生物表达载体(图1)。将该表达载体转化到BL21Star(DE3)(Cat.No：C6010-03，Invitrogen)中，然后验证NusA-融合的TNFRI片段生产为细胞内可溶性蛋白。所表达的TNFRI使用96孔平板通过层析进行纯化。
另外，使用pET44a表达载体构建仅表达不含NusA的TNFRI片段的表达载体(图5)。在这时，TNFRI片段以包涵体形式表达。将以包涵体形式表达的TNFRI片段用变性溶液溶解，通过重折叠过程转换为活性蛋白，然后通过凝胶过滤层析纯化。
为了构建蛋白酶耐受性变体，推测TNFRI片段的蛋白酶切割位点。在这一点上，使用Expasy(Expert Protein Analysis System(专业蛋白分析系统))提供的肽切割程序(peptide cutter program)(http://www.expasy.org/tools/peptidecutter/)筛查TNFRI片段的氨基酸序列，寻找位于胃肠道、细胞和血液内的10种代表性不同蛋白酶的切割位点。
为了用不进行蛋白酶切割的氨基酸置换推断被蛋白酶切割的位点的氨基酸，并且没有显著的构象改变，使用PAM250矩阵(PAM250matrix)(W.A Pearson，Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP andFASTA(使用FASTP和FASTA的快速和灵敏性序列比较)，在Methodsin Enzymology(酶学方法)中，R.Doolittle编辑(ISBN 0-12-182084-X，Academic Press，San Diego)183：63-98(1990))。通过用选自通过PAM250矩阵分配为零或正值且不被蛋白酶识别的氨基酸的氨基酸置换推定位点的氨基酸来制备修饰的TNFRI多肽或其片段。
使用以NusA-融合的可溶性蛋白形式表达TNFRI变体编码基因的载体作为模板，按照定向诱变构建每种变体载体。将这样构建的每种变体载体转化到BL21Star(DE3)中，并且以细胞内可溶性蛋白产生NusA-融合的TNFRI片段，然后测定活性和蛋白酶耐受性。为了验证NusA融合体的作用，生产不含NusA的TNFRI突变体，并且分析和比较其活性和蛋白酶耐受性。
以下，将更详细地描述本发明所述的修饰的TNFRI多肽或其片段的制备和验证。
制备实施例：制备TNFRI基因片段：构建TNFRI171基因
据报道人TNFRI具有4个细胞外结构域，甚至仅有三个TNFRI结构域(TNFRI126)，TNFRI与TNF-α的结合也是可能的，并且细胞外结构域的更多缺陷对TNFRI与TNF-α的结合没有作用。基于这一事实，选择具有由SEQ ID NO：1所示的人TNFRI多肽的氨基酸残基41延伸的171个氨基酸残基的TNFRI171(SEQ ID NO：2)、具有由SEQ ID NO：1所示的人TNFRI多肽的氨基酸残基41延伸的126个氨基酸残基的TNFRI126(SEQID NO：3)、和具有由SEQ ID NO：1所示的人TNFRI多肽的氨基酸残基41延伸的108个氨基酸残基的TNFRI108(SEQ ID NO：4)作为候选肽来构建本发明的变体。为了生产这些变体，使用与大肠杆菌匹配的密码子(SEQID NO：5)来修饰TNFRI171的碱基序列，使其便利地在大肠杆菌中表达。该序列通过基于PCR的基因合成方法构建。
为了将用于在大肠杆菌中表达的合成的TNFRI171基因序列(SEQID NO：5)插入到pGEM-T(Cat.No：A1380，Promega)载体中，将3μl合成的基因添加到1μl pGEM-T载体中，并且向其中加入1μl连接酶(Cat.No：M2200S，NEB)和连接溶液(2x连接缓冲液)，然后在室温下反应5分钟。取出2μl反应溶液，并且加入到XL1-blue感受态细胞(Cat.No：RH119-J80，RBC)中，然后通过在47℃施加热击1分钟进行转化，然后在包含氨苄青霉素的LB固体培养基中静止培养，从而获得菌落。将菌落在包含氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，从其中分离质粒，并且使用PCR通过ddNTP的荧光标记(SolGent Inc.，南韩)验证基因序列。将该基因称为pGEM-TNFRI171。以下，使用上文获得的pGEM-TNFRI171基因作为模板，通过PCR获得除TNFRI171外的TNFRI126和TNFRI108。
实施例1：设计TNFRI单一变体
为了构建变体，首先设计具有蛋白酶耐受性的变体。为了确定突变位点，使用Expasy(Expert Protein Analysis System(专业蛋白分析系统))提供的肽切割程序(peptide cutter program)(http://www.expasy.org/tools/peptidecutter/)推测TNFRI171氨基酸序列的表1列出的并且位于胃肠道、细胞和血液内的10种代表性不同的蛋白酶的切割位点。用不进行蛋白酶切割的氨基酸置换推定的切割位点处的氨基酸而没有显著的构象改变。利用PAM250矩阵进行要被置换的氨基酸的确定。参考在PAM250矩阵中对于每个氨基酸具有正值、0或负值的19个相对应的氨基酸，将不进行蛋白酶切割且具有正值或0的氨基酸确定为要被置换的氨基酸。
[表1]蛋白酶特异性氨基酸和诱导耐受性的氨基酸
  蛋白酶   通过识别切割的氨基酸   诱导耐受性的置换氨基酸
  Arg-C蛋白酶   R   H或Q
  Asp-N内肽酶   -D   N或Q
  糜蛋白酶   [FYWML]，不在P前   S或I，H
  肠激酶   K   N或Q
  谷氨酰基内肽酶   E   N或Q
  Lys-C   K   N或Q
  Lys-N   K   N或Q
  脯氨酸内肽酶   H，K或R，-P   A或S
  凝血酶   R   N或Q
  胰蛋白酶   K   N或Q
表2提供按照前述方法设计的TNFRI变体的列表。
[表2]设计的TNFRI单一变体的列表
  变体号   突变   变体号   突变
  TNFRIx-1   K48Q   TNFRIx-47   M109I
  TNFRIx-2   K48N   TNFRIx-48   M109V
  TNFRIx-3   Y49I   TNFRIx-49   E113Q
  变体号   突变   变体号   突变
  TNFRIx-4   Y49H   TNFRIx-50   E113N
  TNFRIx-5   P52A   TNFRIx-51   D120N
  TNFRIx-6   P52S   TNFRIx-52   D120Q
  TNFRIx-7   K61Q   TNFRIx-53   R121H
  TNFRIx-8   K61N   TNFRIx-54   R121Q
  TNFRIx-9   K64Q   TNFRIx-55   D122N
  TNFRIx-10   K64N   TNFRIx-56   D122Q
  TNFRIx-11   Y67I   TNFRIx-57   R128H
  TNFRIx-12   Y67H   TNFRIx-58   R128Q
  TNFRIx-13   L68I   TNFRIx-59   K129Q
  TNFRIx-14   L68V   TNFRIx-60   K129N
  TNFRIx-15   Y69I   TNFRIx-61   Y132I
  TNFRIx-16   Y69H   TNFRIx-62   Y132H
  TNFRIx-17   D71N   TNFRIx-63   R133H
  TNFRIx-18   D71Q   TNFRIx-64   R133Q
  TNFRIx-19   D78N   TNFRIx-65   Y135I
  TNFRIx-20   D78Q   TNFRIx-66   Y135H
  TNFRIx-21   D80N   TNFRIx-67   W136H
  TNFRIx-22   D80Q   TNFRIx-68   W136S
  TNFRIx-23   R82H   TNFRIx-69   E138Q
  TNFRIx-24   R82Q   TNFRIx-70   E138N
  TNFRIx-25   E83Q   TNFRIx-71   L140I
  TNFRIx-26   E83N   TNFRIx-72   L140V
  TNFRIx-27   E85Q   TNFRIx-73   F141I
  TNFRIx-28   E85N   TNFRIx-74   F141V
  TNFRIx-29   F89I   TNFRIx-75   F144I
  TNFRIx-30   F89V   TNFRIx-76   F144V
  TNFRIx-31   E93Q   TNFRIx-77   L150I
  变体号   突变   变体号   突变
  TNFRIx-32   E93N   TNFRIx-78   L150V
  TNFRIx-33   L96I   TNFRIx-79   L156I
  TNFRIx-34   L96V   TNFRIx-80   L156V
  TNFRIx-35   R97H   TNFRIx-81   E160Q
  TNFRIx-36   R97Q   TNFRIx-82   E160N
  TNFRIx-37   L100I   TNFRIx-83   K161Q
  TNFRIx-38   L100V   TNFRIx-84   K161N
  TNFRIx-39   K104Q   TNFRIx-85   E200Q
  TNFRIx-40   K104N   TNFRIx-86   E200N
  TNFRIx-41   R106H   TNFRIx-87   K203Q
  TNFRIx-42   R106Q   TNFRIx-88   K203N
  TNFRIx-43   K107Q   TNFRIx-89   E206Q
  TNFRIx-44   K107N   TNFRIx-90   E206N
  TNFRIx-45   E108Q   TNFRIx-91   D207Q
  TNFRIx-46   E108N   TNFRIx-92   D207N
*关于下述实施例，在上表中的x表示变体1-76的108，126或171，变体77-84的126或171，以及变体85-92的171。
实施例2：构建TNFRI108变体
(1)构建TNFRI108基因和表达载体
为了在大肠杆菌中表达可溶性TNFRI108蛋白，使用商购的包含NusA基因的pET44a载体(Cat.No：71122-3，Novagen)构建表达载体。
具体地，是使用在上述制备实施例中构建的pGEM-TNFRI171质粒作为模板，通过PCR获得TNFRI108基因。为了将TNFRI108基因克隆到pET44a载体中，在该基因的5′端和3′端分别添加限制酶SmaI和HindIII识别位点。
正向引物：5′-ccccggggcgatgacgatgacaaagatagcgtgtgcccg-3′
反向引物：5′-taagcttattacagggagcaattaaaacactgg-3′
在下述条件下进行PCR：在95℃初级变性5分钟，25个循环的下述：在95℃第二次变性1分钟，在60℃引物退火40秒，在72℃延伸1分钟，然后在72℃最终酶反应10分钟。按照供应商的流程，将2μl所扩增的基因插入到pcDNA3.3TOPO TA载体(Cat.No：K8300-01，Invitrogen)中。取出2μl反应溶液，并且加入到XL1-blue感受态细胞(Cat.No：RH119-J80，RBC)中，然后通过在42℃施加热击1分钟进行转化，然后在包含氨苄青霉素的LB固体培养基中静止培养，从而获得菌落。将菌落在包含氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，从其中分离质粒，并且通过用荧光物质(SolGent Inc.，南韩)标记ddNTP验证基因序列。将该构建体称为pcDNA3.3-TNFRI108。
分别向构建的pcDNA3.3-TNFRI108载体和pET44a载体中加入限制酶(SmaI和HindIII)，然后在37℃反应3小时。在用限制酶处理后，将反应产物在1％凝胶上进行电泳，用刀片从琼脂糖凝胶上切下在相对应尺寸位置处的DNA条带，并且使用DNA分离试剂盒(Cat.No：102-102，GeneAll)提取。将提取的pET44a载体和TNFRI108基因DNA用连接酶(Cat.No：M2200S，NEB)进行连接。取出2μl反应溶液，并且加入到XL1-blue感受态细胞(Cat.No：RH119-J80，RBC)中，然后通过在47℃施加热击1分钟进行转化，然后在包含氨苄青霉素的LB固体培养基中静止培养，从而获得菌落。将菌落在包含氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，分离质粒，从而构建TNFRI108大肠杆菌表达载体(图1)。将这样构建的TNFRI108大肠杆菌表达载体称为pET44a-NusA-TNFRI108质粒。
(2)构建编码TNFRI108单一变体的DNA
对于位点特异性TNFRI108单一变体的构建，通过定点诱变构建TNFRI108单一变体。用于构建TNFRI108单一变体的引物提供在下表3中。
具体地，使用pET44a-NusA-TNFRI108质粒作为模板，将下表3中列出的对应于变体1-76的每对引物溶解在蒸馏水中到浓度为20pmol，然后用Pfu聚合酶进行PCR，从而构建每种定点变体。扩增反应中所用的溶液的组成如下。
添加1.0μl pET44a-NusA-TNFRI108质粒DNA，1.0μl每种20pmol正向引物，1.0μl每种20pmol反向引物，25.0μl 2X PrimeSTAR PCR缓冲液，4.0μl每种200μM dNTPs，0.5μl PrimeSTAR HS DNA聚合酶(Cat.No：R044A，Takara)和17.5μl蒸馏水，制成50μl反应溶液。
在下述条件下进行PCR：在98℃初级变性5分钟，17个循环的下述：在98℃第二次变性30秒，在55℃引物退火30秒，在72℃延伸9分钟，然后在72℃最终酶反应10分钟。
将PCR产物用DpnI酶在37℃处理2小时，以降解大肠杆菌来源的DNA并且获得PCR扩增的DNA。取出2μl DNA溶液，并且加入到XL1-blue感受态细胞(Cat.No：RH119-J80，RBC)中，然后通过在42℃施加热击1分钟进行转化，然后在包含氨苄青霉素的LB固体培养基中静止培养，从而获得菌落。将菌落在包含氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，分离质粒并且进行核苷酸测序分析，从而验证位点特异性突变的完成。
[表3]用于定点诱变的引物
(3)表达TNFRI108和TNFRI108变体
取出1μl上述制备的质粒溶液并且添加到BL21Star(DE3)(Cat.No：C6010-03，Invitrogen)感受态细胞中，然后通过在42℃施加热击1分钟进行转化，然后在包含氨苄青霉素的LB固体培养基中静止培养，从而获得包含pET44a-NusA-TNFRI108或TNFRI108变体载体的大肠杆菌(BL21Star(DE3))菌落，将其接种在5ml包含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基(Cat.No：244620，BD)中，然后在37℃通气培养16小时。将培养液接种到50ml包含100μg/ml氨苄青霉素的培养基，并且将细胞培养至600nm的吸光度为0.6-0.8。加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)(Cat.No：I9003，Sigma)至终浓度1.0mM，从而诱导表达。诱导表达后，在37℃继续通气培养3小时。将培养的细胞以5,000rpm离心20分钟来收集细胞。
(4)纯化TNFRI108和TNFRI108变体
在将收集的细胞进行细胞裂解后，回收上清，通过固定的金属亲和层析进行初级纯化，并且通过疏水性层析进行二级纯化，从而获得纯度超过90％的样品。
具体地，将收集的细胞重悬在混悬液(25mM Tris溶液，pH 8.5)中至600nm的吸光度为10。将重悬的样品用超声仪(Cat.No：VCX750，Sonics)进行细胞裂解并且以12,000rpm离心20分钟，以回收上清。将300μlHyperCel树脂(Pall，Cat No：20093-010)装载到96孔过滤板(Pall，Cat No：PN5065)上并且用4柱体积的蒸馏水洗涤，然后向其中加入2柱体积的0.1M NiCl2，由此使镍离子结合到树脂上。冲洗2柱体积的蒸馏水，并且将板用6柱体积的平衡溶液(25mM Tris，0.1M NaCl，pH 8.5)洗涤。加入2柱体积的样品后，通过用4柱体积的平衡溶液去除未结合的样品。将板用10柱体积的洗涤溶液(25mM Tris，0.1M NaCl，50mM咪唑，pH 8.5)洗涤，然后用2柱体积的洗脱溶液(25mM Tris，0.1M NaCl，250mM咪唑，pH8.5)洗脱，以回收结合到柱子上的TNFRI108。
将1.0M硫酸铵((NH4)2SO4)溶液以400mM的浓度添加到通过固定的金属亲和层析洗脱的蛋白溶液中。将300μl苯基琼脂糖树脂(Cat.No：17-108201，GE)装载到96孔过滤板上，对其流过6柱体积的平衡溶液(20mM磷酸钠(Na2PO4)，400mM硫酸铵，pH 7.0)。将固定的金属亲和层析洗脱物添加到柱上，并且用2柱体积的平衡溶液冲洗，以去除未结合的蛋白。将该板用10柱体积的洗涤溶液(20mM磷酸钠(Na2PO4)，160mM硫酸铵，pH 7.0)洗涤，然后用6柱体积的洗脱溶液(20mM磷酸钠，pH 7.0)洗脱。将洗脱的样品浓缩至100μg/mL以上，并且通过Bradford测定法定量。将所有纯化的样品通过SDS-PAGE分析进行纯度验证(图2)。
实验例1：确定配体(TNF-α)和TNFRI108之间的结合能力
将作为细胞内可溶性蛋白产生的TNFRI108片段和TNFRI108单一变体(TNFRI108-68)通过固定的金属亲和层析和疏水性层析纯化和分离。通过Bradford测定法的方式定量纯化的TNFRI108片段(对照)和TNFRI108片段变体，并且通过ELISA和BIAcore测定法的方式测量其结合TNF-α的能力(图3)。
具体地，在BIAcore3000系统中使用CM5芯片进行BIAcore测定。对于该芯片的第一个单元，不固定TNF-α，用0.05M NHS/0.2M EDC溶液活化，并用1.0M盐酸乙醇胺(pH 8.5)使之失活而进行测定。对于该芯片的第二个单元，固定TNF-α至800RU用于动力学分析。用0.05MNHS/0.2M EDC溶液活化CM5芯片，并且固定TNF-α至800RU。在固定800RU的TNF-α后，然后与1.0M盐酸乙醇胺(pH 8.5)反应，从而使芯片失活。通过从芯片第二个单元的RU值减去芯片第一个单元的RU值，同时以15μL/min的流速流过包含100mM NaCl的25mM Tris(pH 8.5)溶液而进行每种样品的分析。将样品以动力学模式以100μg/mL和50μg/mL的速率注射240秒，并且解离时间设定为900秒。对于再分析，以Quickinject模式注射洗涤溶液(5mM NaOH，10mM NaCl)20秒。通过使用BIAcore结果程序处理关于两个浓度的sensorgram结果而确定结合能力(图3A)。如在图3中验证的，本发明的TNFRI108单一变体(TNFRI108-68)表现出与TNFRI108相当的结合能力。
具体地，为了进行ELISA，将100μl TNF-α以1.0μg/ml的浓度注射到96孔板(Cat.No：2592，Costar)中，然后在4℃固定16小时。将该板用洗涤溶液(0.05％吐温-20，10mM PBS，pH 7.4)洗涤三次，然后在包含1％BSA的PBS(pH 7.4)溶液中在室温下反应2小时。将100μl样品以约1.5μg/ml至100μg/mL的浓度注射到每个孔中，然后在室温下反应2小时。将该板用洗涤溶液(0.05％吐温-20，10mM PBS，pH 7.4)洗涤三次，对其以200ng/ml的浓度注射100μl小鼠来源的TNFR复合抗体(Cat.No：DY225，RnD)，然后在室温下反应2小时。将该板用洗涤溶液洗涤3次，对其注射100μl 200倍稀释的HRP-缀合的二抗(Cat.No：DY225，RnD)，然后在室温下反应15分钟。将该板用洗涤溶液洗涤三次，对其注射100μl3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(Cat.No：DY999，RnD)(其为底物溶液)，然后在室温下反应15分钟，并且注射50μl 1.0M硫酸溶液(Cat.No：S2129，Samchun Chemical)以终止反应。使用ELISA微量平板读取仪(Model：VersaMax，MD)读取450和540nm下的吸光度。通过剂量依赖性的吸光度变化验证了TNFRI108结合TNF-α的能力(图3B)。
实验例2：确定TNFRI108和TNFRI108变体的蛋白酶耐受性
TNFRI108片段和TNFRI108片段变体的蛋白酶耐受性验证如下。测量纯化的液体的总蛋白浓度，用猪胰酶制剂处理至总蛋白量的24％(通过Bradford测定法定量的纯化的TNFRI108液体的总蛋白的值)，并且研究TNFRI108片段和TNFRI108片段变体的半衰期，由此与TNFRI108多肽片段比较来验证具有蛋白酶耐受性的TNFRI108片段变体。
为了鉴定蛋白酶耐受性变体TNFRI108，确定每种变体在胰酶制剂(Cat.No：P7545；Sigma)处理后的半衰期，并且选择与TNFRI108相比较具有增加的半衰期的变体。代表性变体TNFRI108-14、TNFRI108-64和TNFRI108-68对胰酶制剂处理的增加的耐受性的结果显示在图4中。
具体地，将通过Bradford测定法定量的TNFRI108(对照)和单个变体用PBS溶液调整至浓度为100μg/ml，并且在500μl离心管中制备250μl蛋白样品。向样品中加入30μl含有6μg胰酶制剂的0.1M磷酸钠，然后在37℃反应。在0，5，10，15，20，30，40和60分钟后，取出30μl样品，并且添加到270μl包含5μl蛋白酶抑制剂(Cat.No：11836170001，Roche)的5％BSA溶液中，然后混合。将混合物保存在液氮中。对于已经结束实验的样品，通过ELISA定量(Cat.No：DY225，RnD)分析每种变体的未切割的量，以计算TNFRI108变体的半衰期。通过以TNFRI108的半衰期作为参照，以百分数形式表示每种变体的相对半衰期(表4)。
[表4]TNFRI108变体的蛋白酶耐受性(在37℃反应)
(ND：未检测的)
实施例3：构建TNFRI126变体
(1)构建能够表达Met-TNFRI126或Met-TNFRI126变体的表达载体
通过Met-TNFRI126和Met-TNFRI126变体验证用TNFRI108对单一变体的选择。为了这一目的，以Met-TNFRI126形式产生变体7，8，9，10，14，64，65，68，73，和74，并且验证其蛋白酶耐受性。
具体地，通过将TNFRI126基因插入到pET44a载体中而完成用于表达Met-TNFRI126的大肠杆菌表达载体的构建。使用在制备实施例中构建的pGEM-TNFRI171作为模板与和下述引物通过PCR获得TNFRI126基因。分别在引物序列的5′端和3′端添加NdeI和BamHI限制酶位点，以使TNFRI126基因以不含pET44a载体的NusA蛋白的Met-TNFRI126形式表达。
正向引物：5′-acatatggatagcgtgtgcccgc-3′
反向引物：5′-cggatccttaacaaactgtattctgcttc-3′
在下述条件下进行PCR：在98℃初级变性5分钟，25个循环的下述：在98℃第二次变性30秒，在55℃引物退火30秒，在72℃延伸1分钟，然后在72℃最终酶反应10分钟。将限制酶(NdeI和BamHI)添加到扩增的基因和pET44a载体中，然后在37℃反应3小时。在用限制酶处理后，将反应产物在1％琼脂糖凝胶上进行电泳，并且用刀片从琼脂糖凝胶上切下在相对应尺寸位置处的DNA条带，并且使用DNA分离试剂盒提取。将50ng pET44a载体和200ng Met-TNFRI126基因添加到所述提取物中，向其中加入10μl 2X连接预混合液，最后加入无菌蒸馏水，使体积为20μl，并且反应物在室温下反应5分钟。取出2μl反应液体并且加入到BL21Star(DE3)细胞中，然后通过在47℃施加热击2分钟进行转化，然后在包含氨苄青霉素的LB固体培养基中静止培养，从而获得菌落。将菌落在包含氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，并且分离质粒。通过基因序列分析验证其基因序列。将这样获得的质粒称为pET44a-Met-TNFRI126质粒(图5)。
(2)表达Met-TNFRI126和Met-TNFRI126变体
取出1μl上述制备的质粒溶液并且添加到BL21Star(DE3)(Cat.No：C6010-03，Invitrogen)感受态细胞中，然后通过在42℃施加热击1分钟进行转化，然后在包含氨苄青霉素的LB固体培养基中静止培养，从而获得菌落。将包含表达载体的大肠杆菌BL21Star(DE3)接种在50ml包含100μg/ml氨苄青霉素的YP培养基(酵母提取物：Cat.No：103753，Merck；蛋白胨：Cat.No：243620，BD；NaCl：Cat.No：1064049025，Merck)中，然后在37℃通气培养16小时。将培养的培养基接种在1L填充有250ml包含100μg/ml氨苄青霉素的YP培养基的烧瓶中，以使获得600nm处的吸光度为0.1。当在37℃培养至在600nm处的吸光度为3至4时，以终浓度1.0mM加入IPTG来诱导表达。诱导表达后，在37℃进一步继续通气培养3小时，并且将培养的细胞以6,000rpm离心20分钟来收集细胞。
(3)纯化Met-TNFRI126和Met-TNFRI126变体
将收集的细胞重悬在重悬溶液(50mM Tris，0.5mM EDTA，pH 8.5)中。使用超声仪(Cat.No：VCX 750，Sonics)进行悬浮细胞的裂解。细胞裂解之后以8000xg且在10℃离心30分钟，弃掉上清，并且将沉淀的沉淀物悬浮在35mL沉淀洗涤溶液(50mM Tris，10mM EDTA，0.5％TritonX-100，pH 8.0)中，然后以8000xg且在10℃离心20分钟。弃掉上清，并且将沉淀物重悬在35mL重悬溶液中，然后以8000xg且在10℃离心20分钟。将洗涤的沉淀物立即使用或冷冻保存在-80℃。
加入6mL变性溶液(6-8M尿素或6-8M盐酸胍，10mM二硫苏糖醇(DTT)，2.0mM EDTA，0.2M NaCl)以完全溶解上述获得的沉淀物。然后，将未溶解的沉淀物用0.45μm注射器滤器去除。将溶解的沉淀物溶液以20倍稀释在重折叠溶液(50mM Tris，1.0mM EDTA，0.5M L-精氨酸，pH 7.5)中，并且在4℃轻轻搅拌12至24小时，以诱导重折叠。
对于重折叠的Met-TNFRI126和Met-TNFRI126变体的纯化，将重折叠溶液用3kD Amicon Ultra(Cat.No：UFC900324，Millipore)浓缩20倍。然后，通过用填装有Superdex 75制备级(GE)树脂的XK25/70(Cat.No：19-0146-01，GE)柱的凝胶过滤层析进行纯化。
具体地，在将重折叠的样品上样到柱上之前，将该柱用4-5柱体积的平衡溶液(50mM磷酸钠，100mM NaCl，pH 7.0)平衡。将2mL样品上样到柱上后，在以5.0mL/min的流速流过平衡溶液的同时，将样品以5mL/级分的体积等分。将收集的样品通过SDS-PAGE分析，仅取纯度超过90％的级分(图6)。Met-TNFRI126和Met-TNFRI126变体以上述相同的方式纯化。
实验例3：确定Met-TNFRI126和Met-TNFRI126变体结合配体 (TNF-α)的能力
通过Bradford测定法定量纯度超过90％的纯化的Met-TNFRI126(对照)和Met-TNFRI126变体的浓度，并且通过ELISA验证其结合TNF-α的能力。
将100μl TNFRI190(由SEQ ID NO：1所示的TNFRI的氨基酸残基22延伸至氨基酸残基211的190个氨基酸组成的蛋白，Cat No：636-R1-025-CF，R&D)以1μg/ml的浓度上样到96孔板上，然后在4℃固定16小时。每个孔用300μl洗涤溶液(0.05％吐温-20，PBS，pH 7.4)洗涤3次，并向每个孔中加入300μl封闭溶液(5％脱脂乳，PBS，pH 7.4)，然后在室温下反应2小时。然后以如前述相同的方式进行洗涤。以500nM，125nM，31nM，7.8nM，1.9nM，0.48nM，0.12nM和0.03nM的不同浓度制备测定样品，然后以100μl/孔的剂量一式两份上样。将100μl TNF-α以50ng/ml的剂量添加到每个样品上样孔中，然后在室温下反应2小时。在用洗涤溶液洗涤后，将100μg/mL TNF-α抗体溶液稀释至1/1000，然后以100μl/孔的剂量加入，然后在室温下反应2小时。在用洗涤溶液洗涤后，向其中以100μl/孔的剂量加入底物溶液，然后在室温下反应15分钟，将作为底物溶液的100μl 3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(Cat.No：DY999，RnD)注射到其中，然后在室温下反应15分钟，并且注射50μl 1.0M硫酸溶液(Cat.No：S2129，Samchun Chemical)来终止反应。使用ELISA微量平板读数仪(Model：VersaMax，MD)读取在450和540nm的吸光度。
Met-TNFRI126和Met-TNFRI126变体的结合能力通过吸光度的剂量依赖性变化而验证(图7)。
实验例4：确定Met-TNFRI126和Met-TNFRI126变体的蛋白酶耐 受性
除用Met-TNFRI126或Met-TNFRI126变体替代TNFRI108外，以与实验例2相同的方式评价蛋白酶耐受性(表5)。在TNFRI108中测量具有高蛋白酶耐受性的变体14，64，68，73和74表现出同样高的蛋白酶耐受性，而在TNFRI108中测量具有低蛋白酶耐受性的变体9和10表现出低蛋白酶耐受性。
[表5]Met-TNFRI126变体相对于Met-TNFRI126的蛋白酶耐受性
  变体号   Met-TNFRI126变体相对于Met-TNFRI126的耐受性(％)
  TNFRI126-7   87％
  TNFRI126-8   95％
  TNFRI126-9   65％
  TNFRI126-10   30％
  TNFRI126-14   143％
  TNFRI126-64   152％
  TNFRI126-65   99％
  TNFRI126-68   120％
  TNFRI126-73   159％
  TNFRI126-74   169％
实施例4：构建TNFRI171变体
(1)构建能够表达Met-TNFRI171或Met-TNFRI171变体的的表达载 体
在实施例1所设计的单一变体中，制备在TNFRI第四结构域中存在的单一变体为Met-TNFRI171并且进行评价。
为了这一目的，构建能够在大肠杆菌中表达Met-TNFRI171或Met-TNFRI171变体的表达载体。
具体地，使用在制备实施例中构建的pGEM-TNFRI171质粒作为模板，通过PCR获得Met-TNFRI171基因(SEQ ID NO：267)。此时，为了克隆到pET44a载体中，在基因的5′端和3′端分别添加NdeI和BamHI限制酶识别位点。
用于PCR扩增的引物如下。
正向引物：5′-acatatggatagcgtgtgcccgc-3′
反向引物：5′-cggatccttatgtggtgcctgagtcctc-3′
在下述条件下进行PCR：在98℃初级变性5分钟，25个循环的下述：在98℃第二次变性30秒，在55℃引物退火30秒，在72℃延伸1分钟，然后在72℃最终酶反应10分钟。将限制酶(NdeI和BamHI)添加到扩增的基因和pET44a载体中，然后在37℃反应3小时。在用限制酶处理后，将反应产物在1％琼脂糖凝胶上进行电泳，并且用刀片从琼脂糖凝胶上切下在相对应尺寸位置处的DNA条带，并且使用DNA分离试剂盒提取。将50ng pET44a载体和200ng Met-TNFRI171基因添加到所述提取物中，向其中加入10μl 2X连接预混合液，最后加入无菌蒸馏水，使体积为20μl，并且反应物在室温下反应5分钟。取出2μl反应液体并且加入到BL21Star(DE3)细胞中，然后通过在47℃施加热击1分钟进行转化，然后在包含氨苄青霉素的LB固体培养基中静止培养，从而获得菌落。将菌落在包含氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，并且分离质粒。通过基因序列分析验证其基因序列。将这样获得的质粒称为pET44a-Met-TNFRI171质粒。
使用pET44a-Met-TNFRI171质粒作为模板联合与表6列出的对应于每个变体的引物，通过PCR构建Met-TNFRI171变体。
[表6]用于定点诱变的引物
扩增反应中所用的溶液的组成如下。添加1.0μl pET44a-Met-TNFRI171模板质粒DNA，1.0μl每种20pmol正向引物，1.0μl每种20pmol反向引物，25.0μl 2X PrimeSTAR PCR缓冲液，4.0μl每种200μMdNTPs，0.5μl PrimeSTAR HS DNA聚合酶(Cat.No：R044A，Takara)和17.5μl蒸馏水，制成50μl反应溶液。
在下述条件下进行PCR：在98℃初级变性5分钟，17个循环的下述：在98℃第二次变性30秒，在55℃引物退火30秒，在72℃延伸9分钟，然后在72℃最终酶反应10分钟。
将PCR产物用DpnI酶在37℃处理2小时，以降解大肠杆菌来源的DNA并且获得PCR扩增的DNA。取出2μl DNA溶液，并且加入到XL1-blue感受态细胞(Cat.No：RH119-J80，RBC)中，然后通过在42℃施加热击1分钟进行转化，然后在包含氨苄青霉素的LB固体培养基中静止培养，从而获得菌落。将菌落在包含氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，分离质粒并且进行核苷酸测序分析，从而验证位点特异性突变的完成。
(2)表达Met-TNFRI171he Met-TNFRI171变体
提取所构建的Met-TNFRI171和Met-TNFRI171变体质粒，然后按照实施例3-(2)的方法进行表达的诱导。除使用Met-TNFRI171替代Met-TNFRI126外，以与实施例3-(2)相同的方式进行表达。
(3)纯化Met-TNFRI171和Met-TNFRI171变体
按照实施例3-(3)的方法纯化所表达的Met-TNFRI171和Met-TNFRI171变体。除使用Met-TNFRI171替代Met-TNFRI126外，纯化以与实施例3-(3)相同的方式进行(图6)。
实验例5：确定Met-TNFRI171和Met-TNFRI171变体结合配体 (TNF-α)的能力
除使用Met-TNFRI171替代Met-TNFRI126外，以与实验例3相同的方式进行活性评价。代表性变体Met-TNFRI171-83、Met-TNFRI171-84和Met-TNFRI171-92的结合能力的测量结果显示在图8A中。
实验例6：确定Met-TNFRI171和Met-TNFRI171变体的蛋白酶耐 受性
除使用Met-TNFRI171或Met-TNFRI171变体替代TNFRI108外，以与实验例2相同的方式评价蛋白酶耐受性(表7)。代表性变体Met-TNFRI171-83、Met-TNFRI171-84和Met-TNFRI171-92对抗胰酶制剂处理的提高的耐受性的测量结果显示在图8B中。
[表7]Met-TNFRI171变体相对于Met-TNFRI171的蛋白酶耐受性
  变体号   Met-TNFRI171变体相对于Met-TNFRI171的耐受性
  TNFRI171-77   120％
  TNFRI171-78   87％
  TNFRI171-79   113％
  TNFRI171-80   103％
  TNFRI171-81   57％
  TNFRI171-82   68％
  TNFRI171-83   187％
  TNFRI171-84   187％
  TNFRI171-85   116％
  TNFRI171-86   90％
  TNFRI171-87   111％
  TNFRI171-88   99％
  TNFRI171-89   114％
  TNFRI171-90   102％
  TNFRI171-91   117％
  TNFRI171-92   127％
实施例5：设计TNFRI双重变体
此外，本发明人已经通过组合在单一变体中具有提高的稳定性的突变而设计了具有两个氨基酸置换的双重变体。通过组合在单一变体中表现出显著提高的蛋白酶耐受性的变体14，64，74，83，84，85和92而设计双重变体。双重变体的设计表提供在表8中。
[表8]双重变体的设计表
  变体号   变异
  TNFRI171-201   L68V/R133Q
  TNFRI171-202   L68V/F141V
  TNFRI171-203   R133Q/F141V
  TNFRI171-204   L68V/K161Q
  TNFRI171-205   L68V/K161N
  TNFRI171-206   L68V/D207N
  TNFRI171-207   K161Q/D207N
  TNFRI171-208   L68V/E200Q
  TNFRI171-209   E200Q/D207N
实施例6：构建Met-TNFRI171双重变体
(1)构建能够表达Met-TNFRI171双重变体的表达载体
制备实施例5设计的双重变体为Met-TNFRI171并且进行评价。为了这一目的，构建能够在大肠杆菌中表达Met-TNFRI171双重变体的表达载体。
具体地，关于表8中列出的双重变体中的变体201，202，204，205，206和208，使用Met-TNFRI171-14单一变体的质粒作为模板联合表9提供的引物，通过PCR构建编码双重变体的DNA。在双重变体中，使用Met-TNFRI171-64单一变体的质粒作为变体203的模板，Met-TNFRI171-83单一变体的质粒作为变体207的模板，和使用Met-TNFRI171-85单一变体的质粒作为变体209的模板，联合表9提供的引物，通过PCR构建编码双重变体的DNA。
扩增反应中所用的溶液的组成如下。添加1.0μl的上述每种模板质粒DNA，1.0μl每种20pmol正向引物，1.0μl每种20pmol反向引物，25.0μl2X PrimeSTAR PCR缓冲液，4.0μl每种200μM dNTPs，0.5μl PrimeSTARHS DNA聚合酶(Cat.No：R044A，Takara)和17.5μl蒸馏水，制成50.0μl反应溶液。
在下述条件下进行PCR：在98℃初级变性5分钟，17个循环的下述：在98℃第二次变性30秒，在55℃引物退火30秒，在72℃延伸9分钟，然后在72℃最终酶反应10分钟。
[表9]用于双重诱变的引物
将PCR产物用DpnI酶在37℃处理2小时，以降解大肠杆菌来源的DNA并且获得PCR扩增的DNA。取出1μl DNA溶液，并且加入到XL1-blue感受态细胞中，然后通过在42℃施加热击1分钟进行转化，然后在包含氨苄青霉素的LB固体培养基中静止培养，从而获得菌落。将菌落在包含氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，分离质粒并且进行核苷酸测序分析，从而验证位点特异性突变的完成。
(2)表达Met-TNFRI171双重变体
提取所构建的Met-TNFRI171双重变体质粒，然后按照实施例3-(2)的方法进行表达的诱导。除使用Met-TNFRI171双重变体替代Met-TNFRI126外，以与实施例3-(2)相同的方式进行表达。
(3)纯化Met-TNFRI171双重变体
按照实施例3-(3)的方法纯化所表达的Met-TNFRI171双重变体。除使用Met-TNFRI171双重变体替代Met-TNFRI126外，纯化以与实施例3-(3)相同的方式进行。
实验例7：确定Met-TNFRI171双重变体结合配体(TNF-α)的能力
除使用Met-TNFRI171双重变体替代Met-TNFRI126外，以与实验例3相同的方式进行活性评价。代表性双重变体Met-TNFRI171-204、Met-TNFRI171-205和Met-TNFRI171-206的结合能力的测量结果显示在图9中。
实验例8：Met-TNFRI171双重变体的蛋白酶耐受性
除使用Met-TNFRI171双重变体替代TNFRI108外，以与实验例2相同的方式评价蛋白酶耐受性(表10)。代表性双重变体Met-TNFRI171-204、Met-TNFRI171-205和Met-TNFRI171-206对抗胰酶制剂处理的提高的耐受性的测量结果显示在图10中。
[表10]Met-TNFRI171双重变体相对于Met-TNFRI171的蛋白酶耐受性

Claims (15)

1.修饰的TNFRI(人肿瘤坏死因子受体I)多肽,其包含在位置L150I,K161Q,K161N或D207N处的一个或多个氨基酸修饰，其中所述多肽除修饰的氨基酸残基之外的氨基酸残基与SEQ ID NO:1所示的天然人肿瘤坏死因子受体I的氨基酸残基41-211相同。
2.修饰的人肿瘤坏死因子受体I多肽,其包含在位置L68V/K161Q,L68V/K161N或L68V/D207N处的两个氨基酸修饰，其中所述多肽除修饰的氨基酸残基之外的氨基酸残基与SEQ ID NO:1所示的天然人肿瘤坏死因子受体I的氨基酸残基41-211相同。
3.根据权利要求1所述的修饰的人肿瘤坏死因子受体I多肽，其是SEQ ID NOS:242,248,249或257所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求2所述的修饰的人肿瘤坏死因子受体I多肽，其是261,262或263所示的氨基酸序列。
5.根据权利要求1-4任一项所述的修饰的人肿瘤坏死因子受体I多肽，其具有提高的针对蛋白酶的耐受性。
6.人肿瘤坏死因子受体I多肽的复合物，所述复合物通过共价连接两个或三个以上权利要求1-4任一项所述的修饰的人肿瘤坏死因子受体I多肽而形成。
7.根据权利要求1-4任一项所述的修饰的人肿瘤坏死因子受体I多肽，其中所述人肿瘤坏死因子受体I多肽包含下述另外的修饰：糖基化，酰化，甲基化，磷酸化，hesylation，硫酸化，异戊二烯化，氧化，胍基化，脒基化，三硝基苯基化，硝化，或PEG化。
8.根据权利要求7所述的修饰的人肿瘤坏死因子受体I多肽，其中所述酰化是氨甲酰化。
9.编码权利要求1-4任一项所述的修饰的人肿瘤坏死因子受体I多肽的基因。
10.根据权利要求9所述的基因，其中所述基因基于SEQ ID NO:5的核苷酸序列构建，其中处理密码子使其适于在大肠杆菌(E.coli)中表达。
11.包含权利要求9的基因的载体。
12.用权利要求11的载体转化的细胞。
13.根据权利要求12的细胞，其中所述细胞是大肠杆菌。
14.药物制剂，其包含权利要求1-4任一项所述的修饰的人肿瘤坏死因子受体I多肽。
15.产生人肿瘤坏死因子受体I多肽的方法，所述方法包括使用权利要求9的基因或包含所述基因的载体。
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