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CN102573914B - 卟啉纳米囊泡 - Google Patents

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CN102573914B
CN102573914B CN201080046737.7A CN201080046737A CN102573914B CN 102573914 B CN102573914 B CN 102573914B CN 201080046737 A CN201080046737 A CN 201080046737A CN 102573914 B CN102573914 B CN 102573914B
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Abstract

本申请涉及包含至少15mol％的卟啉-磷脂结合物的双分子层的纳米囊泡，其中该结合物包括共价连接于磷脂侧链的卟啉、卟啉衍生物或卟啉类似物。该纳米囊泡可用于光热治疗、光声成像和荧光成像。本申请还公开了制备该纳米囊泡的方法。

Description

卟啉纳米囊泡
技术领域
本发明涉及纳米囊泡的领域，更具体地，涉及卟啉囊泡，涉及卟啉囊泡，其是由卟啉结合于磷脂侧链而形成的具有卟啉双分子层的纳米囊泡。
背景技术
受益于大量吸收光的成分的治疗和诊断技术包括荧光和比色检测1，2、光热和光动力学治疗3-5，光声层析成像(也称为光声断层成像(optoacoustictomography))6-9、光频域成像(opticalfrequencydomainimaging)10、以及多模技术(multimodaltechnique)11。由于无机纳米颗粒与光发生强烈的相互作用，因此它们可用作这些技术的试剂。例如，量子点(quantumdot)是贵重的荧光探针，其消光系数范围为105至106M-1cm-1，12。由于金纳米颗粒具有约为109至1011M-1cm-1数量级的非常高的消光系数，因此其可用于比色检测、光热和光声技术13。尽管最近的研究取得了进展14，但光学活性的无机纳米颗粒仍未实现广泛的临床实践，这可能是由于所负载的药物通常限于纳米粒表面以及出于长期安全性的考虑15-18。相比之下，人们发现有机纳米颗粒(包括脂质体、胶束、纳米球和聚合物囊泡(polymersome))由于稳定的安全性、生物利用度和药物递送能力而能够被广泛应用于人类治疗18。然而，由于有机纳米颗粒在近红外处通常不吸收光，因此将它们用作生物光子(biophotonic)也受到限制。虽然超分子组装体可由卟啉(强烈吸光的有机小分子)组成，但由于稳定性、溶解度、或生物光子效用不足，还未将这些构建体作为生物工具进行全面研究。
光动力学治疗将光敏剂与光结合以消灭不想要的细胞。与其他疾病治疗相比，PDT提供了仅当光和光敏剂相交时才能杀死细胞，以使得体内的其他组织和器官免受损害的优势。在过去几十年中，PDT已被认可为眼部疾病22、皮肤病23，尤其是肿瘤疾病24的多种疾病的可行治疗选择。PDT已成为一种有用的癌症治疗，其能够通过单线态氧产生的细胞损伤诱导的坏死或凋亡来破坏不想要的细胞25。由于具有较高的单线态氧量子产量及具有较大的消光系数，卟啉衍生物是使用最广泛的光敏剂26。然而，由于传统的卟啉为疏水性分子，因此通常必须对其进行化学修饰以使其更加亲水或必须使用递送载体。因此，光敏剂的递送是PDT的重要要素。光敏剂的脂质体制剂已被广泛应用27，并且也展现出商业上的成功(Novartis的Visudyne；Biotec的Foscan、Foslip和Fospeg)。
虽然PDT与许多其他治疗相比副作用较小，但对于更为有效的治疗而言，对靶点周围组织的损伤是一个限制因素。因此，靶向于特定的不想要的细胞的PDT是一个有吸引力的构思。然而，由于在干扰抗体功能之前能够结合于抗体的光敏剂数量较低，因此使用抗体使光敏剂改变方向的尝试受到阻碍28。通过抗体将负载有光敏剂的脂质体引导至靶点是不切实际的，这是因为光敏剂在体内从脂质体中迅速重新分布至血清蛋白中。光热治疗是一种有希望的疾病治疗方法，其中在靶部位将光转化为热。所产生的热随后破坏局部组织。光声成像是一种新兴的成像技术，其依赖于纳秒脉冲激光和光热膨胀来产生声波，该声波能够提供任何光学技术的最深深度的结构性分辨率。
发明内容
根据一个方面，提供了包括至少15摩尔％卟啉-磷脂结合物的双分子层的纳米囊泡，其中该卟啉-磷脂结合物包含共价连接于脂质侧链的一个卟啉、卟啉衍生物或卟啉类似物，优选连接于一个磷脂的sn-1位和sn-2位。
根据另一个方面，提供了一种制备纳米囊泡的方法，包括：
a.将卟啉-磷脂结合物与缓冲液混合，其中该卟啉-磷脂结合物包含共价连接于脂质侧链的一个卟啉、卟啉衍生物或卟啉类似物，优选连接于一个磷脂的sn-1和/或sn-2位；
b.挤出步骤(a)的混合物以产生包含至少15摩尔％卟啉-磷脂结合物的双分子层的卟啉-磷脂双分子层纳米囊泡。
根据另一个方面，提供了一种制备纳米囊泡的方法，包括：
a.将卟啉-磷脂结合物与缓冲液混合，其中该卟啉-磷脂结合物包含共价连接于脂质侧链的一个卟啉、卟啉衍生物或卟啉类似物，优选连接于一个磷脂的sn-1和/或sn-2位；
b.对步骤(a)的混合物进行声处理以产生包含至少15摩尔％卟啉-磷脂结合物的双分子层的卟啉-磷脂双分子层纳米囊泡。
根据另一个方面，提供了一种在受试者的靶区域进行光动力学治疗的方法，包括：
a.提供如本文所述的纳米囊泡；
b.将该纳米囊泡给予受试者；和
c.使用一定波长的光辐照靶区域处的纳米囊泡，其中该波长的光活化卟啉-磷脂结合物以产生单线态氧。
根据另一个方面，提供了一种在受试者的靶区域进行光热治疗的方法，包括：
a.提供如本文所述的纳米囊泡；
b.将该纳米囊泡给予受试者；和
c.使用一定波长的光辐照靶区域处的纳米囊泡，其中该波长的光使纳米囊泡的温度升高。
根据另一个方面，提供了一种对受试者的靶区域进行成像的方法，包括：
a.提供如本文所述的纳米囊泡；
b.将该纳米囊泡给予受试者；和
c.使用一定波长的光辐照靶区域处的纳米囊泡，其中该纳米囊泡响应该波长的光而发出光声信号；和
d.测量和/或检测靶区域处的光声信号。
根据另一个方面，提供了一种对受试者的靶区域进行成像的方法，包括：
a.提供如本文所述的纳米囊泡；
b.将该纳米囊泡给予受试者；和
c.测量和/或检测靶区域处的荧光。
根据另一个方面，提供了本文所述的纳米囊泡用于进行光动力学治疗的应用。
根据另一个方面，提供了本文所述的纳米囊泡用于进行光热治疗的应用。
根据另一个方面，提供了本文所述的纳米囊泡用于进行光声成像的应用。
根据另一个方面，提供了本文所述的纳米囊泡用于进行荧光成像的应用。
根据另一个方面，提供了本文所述的纳米囊泡用于与装载于该纳米囊泡内的化疗药物(如多柔比星)的递送相结合来进行光热治疗的应用。
附图说明
通过参照以下描述和附图能够更好地理解本发明的实施方式。其中：
图1示出了焦脱镁叶绿酸-脂质结合物(表示为Pyro-脂质)的合成。
图2示出了Pyro-脂质的纯度和确认。左侧：Pyro-脂质RP-HPLC色谱，显示具有较良的纯度。右侧：Pyro-脂质的预期质谱。
图3示出了氧基-细菌叶绿素-脂质的合成。
图4示出了金属Pyro-脂质的生成。
图5出示了锌和钯卟啉-脂质结合物的纯度和质量。左侧画面示出了HPLC洗脱，右侧画面示出了预期质谱。
图6示出了不同卟啉囊泡的生成。在PBS中，通过使用100nm聚碳酸酯膜在浓度为0.5mg/mL下挤出95％的各种卟啉-脂质和5％的聚乙二醇-2000结合的脂质(PEG-脂质)而形成卟啉囊泡。A)各种卟啉囊泡的归一化吸收谱。B)各种卟啉囊泡的动态光散射，示出了单分散尺寸约为100nm。
图7示出了通过声处理产生的30nm卟啉囊泡。DLS测量显示，与通过100nm聚碳酸酯膜挤出而产生的卟啉囊泡(蓝色)相比，再水化和超声处理的Pyro-脂质产生更小的卟啉囊泡(红色)。
图8示出了由TEM显示的卟啉囊泡的结构。1％乙酸铀酰染色的卟啉囊泡的透射电子显微图。注意到，双分子层特征在更高放大倍率下较明显。
图9示出了卟啉囊泡亚单元和结构的示意图。左侧画面示出了Pyro-脂质的化学结构，以圆形突出显示磷酰胆碱首基，以六边形突出显示卟啉。右侧画面示出了卟啉囊泡的示意图。
图10示出了表现出显著活化电位的卟啉囊泡。A)在PC∶Chol(3∶2)的脂质体中Pyro-脂质的滴定。FDET代表使用0.5％洗涤剂(TritonX-100)裂解卟啉囊泡后的荧光，Fo代表卟啉的初始荧光。B)卟啉囊泡的活化比具有游历Pyro-脂质或NBD-脂质的脂质体要高得多。结合少量PEG-脂质产生最高的活化电位。
图11示出了通过卟啉囊泡进行的有效光热转换。使用150mW，670nm的激光辐照5uL液滴，并使用红外相机成像。脂质体由标准PC∶Chol(3∶2)组合物形成。右侧的光谱图例示出了20C处为紫色，穿过靛青色、蓝色、绿色、黄色、橙色到达55C处的红色和粉色。在上面的两个画面中，PBS和脂质体示出了蓝色中心。在下面的两个画面中，金纳米棒和卟啉囊泡示出了红色中心，穿过橙色和黄色到达绿色的外缘。
图12示出了卟啉囊泡的较强光声特性。A)在760nm处氧基细菌叶绿体卟啉囊泡的灵敏度降至低皮摩范围。B)卟啉囊泡自组装体产生光声信号。当使用洗涤剂破坏卟啉囊泡时光声信号发生衰减，但在溶液中吸收量相同。C)中等浓度的卟啉囊泡的信号比牛全血高11倍。假定这些卟啉囊泡的浓度为每个卟啉囊泡具有100,000个卟啉-脂分子。误差条示出了来自10次测量的标准偏差。
图13示出了使用卟啉囊泡作为造影剂对大鼠体内前哨淋巴结进行显影。A)成像的时程。BV标记血管，其在动物的爪子中进行皮内注射卟啉囊泡之前可见。前哨淋巴结(SLN)和淋巴管(LV)在皮内注射15分钟后即可见。B)2小时后处死大鼠，摘取动物的每侧两个前哨淋巴结并进行光声断层成像。仅可检测到注射了卟啉囊泡的左侧淋巴结。来自3个独立实验的代表性数据。
图14示出了显示Pyro-脂质不具有转变温度的差示扫描热量法。在PBS中5mg/mL的脂质浓度下进行DSC。
图15示出了通过叶酸配体靶向进行的卟啉囊泡的靶向活化的活细胞成像。在共聚焦显微术前使用指定卟啉囊泡孵化KB细胞2小时。
图16示出了在表达叶酸受体的细胞中卟啉囊泡摄取的经固定细胞成像。在共聚焦显微术前使用指定卟啉囊泡孵化KB细胞2小时。使用DAPI对细胞核进行染色。
图17示出了使用靶向卟啉囊泡进行PDT处理。使用结合叶酸的卟啉囊泡或常规卟啉囊泡孵化KB细胞4小时，随后使用670nm激光在指定光剂量下处理。第二天使用MTT测定评估细胞存活率。卟啉囊泡浓度基于每个卟啉囊泡中具有100,000个卟啉-脂质分子的假设。星号表示高光通量和卟啉囊泡浓度产生最多的细胞杀伤。误差条示出了n＝4的标准偏差。
图18示出了在KB异种移植小鼠中I.V.注射卟啉囊泡后的荧光活化。注意到，注射后，来自小鼠的荧光信号很少，表明卟啉囊泡被淬灭。在肿瘤摄取后，卟啉囊泡未被淬灭(unquench)并可在肿瘤中检测到荧光。
图19示出了卟啉囊泡在体内可进行酶生物降解并具有良好的耐受性，a，卟啉囊泡的酶降解。使用1％TritonX-100裂解卟啉囊泡并在PBS中使用脂肪酶孵化。使用HPLC-MS分析探测降解。使用过氧化物酶孵化纯化的焦脱镁叶绿酸，并通过监测在680nm处的吸光度降低来证实发生降解。b，静脉给予1000mg/kg卟啉囊泡或PBS后小鼠的质量变化(平均+/-SD，n＝3)。c，静脉给予卟啉囊泡或PBS的小鼠的血液检测参数(平均+/-SD，n＝3)。由于γ球蛋白的某些检测值结果小于5U/L，因此所有小于5U/L的值均报告为5U/L。d，I.V.注射1000mg/kg卟啉囊泡或PBS2周后小鼠指定器官的代表性的苏木精和曙红染色部分。
图20示出了卟啉囊泡的主动和被动装载。a，羧基荧光素(C.F.)的被动装载。在250mMC.F.中挤出不含胆固醇的卟啉囊泡(Porph)或含有30mol.％胆固醇的卟啉囊泡(Chol.Porph.)，并进行凝胶过滤以测定C.F.的结合。在0.5％TritonX-100中测定Pyro的荧光(蓝色)和C.F.的荧光(绿色)以避免淬灭，b，装载了C.F.(绿色)的Choi.Porph.(蓝色)的荧光淬灭。在加入0.5％TritonX-100前(虚线)后(实线)采集光谱并归一化至最大荧光，c，借助硫酸铵梯度的多柔比星(Dox.)的主动装载。(*当卟啉囊泡开始洗脱时收集的)不含(Porph)或含有(Choi.Porph.)50mol.％胆固醇的卟啉囊泡的凝胶过滤流分的荧光分析。在0.5％TritonX-100中测定pyro的荧光(蓝色)和Dox.的荧光(绿色)以避免淬灭。d，在装载了Dox.的Choi.Porph.中pyro的荧光淬灭。在加入0.5％TritonX-100前(虚线)后(实线)测量归一化光谱。e，被动装载C.F.(黑线)或主动装载多柔比星(灰线)的卟啉囊泡的大小分布。
图21示出了卟啉囊泡作为体内的光热转换器，a，使用便携式660nm激光进行光热治疗配置，b，24小时前I.V.注射PBS或42mg/kg卟啉囊泡的荷KB瘤小鼠中的代表性热响应。激光辐照(1.9W/cm2)60秒后获得热成像。c，在60秒激光辐照过程中的最大肿瘤温度(每组5只小鼠的平均+/-SD)，d，示出了使用卟啉囊泡的光热治疗的治疗应答的照片。e，在指定条件下处理的荷瘤小鼠的存活曲线。当肿瘤达到10mm大小时处死小鼠(每组n＝5)。
具体实施方式
本文所描述的“卟啉囊泡(porphysome)”；是由磷脂-卟啉结合物的亚单元自组装的有机纳米颗粒，其表现出脂质体样结构和装载能力、结构相关的纳米级光转换特性、优异的生物相容性，并且有望用于多种生物光子应用。所描述的结合卟啉亚单元，但卟啉密度较低的其他卟啉囊泡和二嵌段共聚物产生较小的消光系数，并且缺乏产生新型卟啉囊泡特性的特征性的显著荧光自淬灭20，21。
卟啉通常用于纳米结构应用中，包括形成树枝状聚合物29和纳米线30。最近，描述了卟啉的水不溶性球形组装体31。然而与卟啉囊泡相比，这些纳米颗粒具有不同类型的亚单元，显示出其有助于荧光自淬灭和光转换。
在一些实施方式中，卟啉囊泡包括卟啉-脂结合物双分子层，每个卟啉囊泡包含约100,000个卟啉分子。由于它们由卟啉亚单元形成并稳定化，因此能够利用一组细胞靶向部分使卟啉囊泡靶向至细胞。如下进一步详细描述的，卟啉囊泡是高度可变的，其具有由形成不同类型卟啉的能力，具有螯合不同类型金属的能力，并具有以不同尺寸组成的能力。此外，卟啉囊泡显示出新型纳米级性能，即在活化前具有高淬灭和光热转换效率。
虽然将卟啉插入到脂质体站进行光动力治疗(PDT)已经引起了关注，但卟啉囊泡提供2个显著的优势：1)有效载荷(payload)比任何其他脂质体PDT制剂高1-2个数量级，和2)该方法首次允许将大量光敏剂靶向于体内特定位置(其他制剂给予后会重新分配至血浆蛋白)。在卟啉脂中插入各种金属不干扰卟啉囊泡的形成，并生成稳定的锌和钯双分子层卟啉囊泡，其为靶向金属治疗开辟了新途径。卟啉囊泡可由不同类型的卟啉形成并可调整为不同大小。卟啉囊泡显示出前所未有的荧光和单线态氧活化，数量级高于先前所描述的任何物质。活化前，在高度淬灭状态下，卟啉囊泡以与金纳米棒相似的光热转化效率来驱除(dissipate)激发光，表明卟啉囊泡能够用作光热和光声探针。在表达叶酸受体的细胞中，结合叶酸的卟啉囊泡的摄取和活化可由受体介导的内吞作用来诱导，并且这些细胞在随后的光辐照下被破坏。作为新型、可靶向和具有治疗活性的纳米颗粒，显见卟啉囊泡在光动力学治疗和其他研究领域将得到广泛应用。
本文所述的纳米囊泡为小囊泡(即泡或囊)，通常小于200nm，由包含磷脂或其衍生物的双分子层的膜构成。然而，使用标准脂技术，本领域技术人员也能够生成更大的双分子层(如巨型单层囊泡)或平面脂质双分子层。
根据一个方面，提供了一种包含至少15摩尔％卟啉-磷脂结合物的双分子层的纳米囊泡，其中该卟啉-磷脂结合物包含共价连接于脂质侧链的一个卟啉、卟啉衍生物或卟啉类似物，优选连接于一个磷脂的sn-1位或sn-2位。
在优选的实施方式中，以升高的优先顺序，纳米囊泡包含至少25，34，45，55，65，75，85和95摩尔％的卟啉-磷脂结合物。
构成本发明所述纳米囊泡的卟啉-磷脂结合物包括卟啉、卟啉衍生物和卟啉类似物。示例性的卟啉包括血卟啉、原卟啉和四苯基卟啉。示例性的卟啉衍生物包括焦脱镁叶绿酸、细菌叶绿素、叶绿素a、苯并卟啉衍生物、四羟基苯基二氢卟酚类(二氢卟吩类，chlorins)、红紫素类(purpurin)、苯并二氢卟酚类、萘并二氢卟酚类、胆绿素类(verdins)、玫红素类(rhodins)、酮二氢卟酚类、氮杂二氢卟酚类、细菌二氢卟酚类、甲苯基卟啉类和苯并细菌二氢卟酚类。卟啉类似物包括扩展的卟啉家族成员(如德克萨卟啉类(texaphyrin)、噻啉类和六元卟啉类(六卟啉类，hexaphyrins))、和卟啉异构体(如卟啉烯类、反转卟啉类、酞菁类或萘酞菁类)。
优选地，扩展的卟啉为德克萨卟啉、噻啉或六元卟啉，卟啉异构体为卟啉烯、反转卟啉、酞菁或萘酞菁。
如本文所使用的，“磷脂”为具有包含磷酸酯基的亲水性首基和具有疏水性脂尾部的脂质类。
在一些实施方式中，卟啉-磷脂结合物中的磷脂包含磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸或磷脂酰肌醇。
优选地，磷脂包含12至22个碳的酰基侧链。
在一些实施方式中，卟啉-磷脂结合物中的卟啉为焦脱镁叶绿酸-a。在另一种实施方式中，卟啉-磷脂结合物中的卟啉为细菌叶绿素衍生物。
在一些实施方式中，卟啉-磷脂结合物中的磷脂为1-棕榈酰-2羟基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱。
在一些实施方式中，卟啉-磷脂结合物为Pyro-脂质。
在其他实施方式中，该卟啉-磷脂结合物为氧基细菌叶绿素脂。
在一些实施方式中，卟啉通过0至20个碳的碳链接头连接于磷脂上的甘油基。
在一些实施方式中，纳米囊泡进一步包括PEG，优选PEG-脂，并且进一步优选PEG-DSPE。优选地，PEG或PEG-脂以约5摩尔％的量存在。
在一些实施方式中，纳米囊泡基本为球形，直径为约30nm至约200nm，优选直径为约100nm或直径为约30nm。
在一些实施方式中，卟啉-磷脂结合物包含螯合在其中的金属，可选地为金属(优选Zn、Cu或Pd)的放射性同位素。
可将多种生物活性剂或治疗剂、药品或药物包封在卟啉囊泡内部。
在一些实施方式中，该纳米囊泡进一步包含包封在其中的活性剂，优选为治疗剂或诊断剂，优选为化疗剂，如多柔比星。
术语“治疗剂”是本领域认可的，是指作为生物、生理或药理活性物质的任何化学物质。治疗剂也被称为“药物”，其实例在著名参考文献中有描述，如MerckIndex、PhysiciansDeskReference、和ThePharmacologicalBasisofTherapeutics，并且其包括但不限于药物；维生素；矿物质补充剂；用于治疗、预防、诊断、治愈或缓解疾病或病痛的物质；影响身体结构或功能的物质；或前药，当将其置于生理环境后具有生物活性或活性更强。可使用各种形式的治疗药物，其中当给予受试者之后，组合物就能够从受试者中释放至邻近组织或流体中。
“诊断”或“诊断剂”为用于诊断的任何化学物质。例如，诊断激包括显像剂，如含有放射性同位素如铟或锝的显像剂；含有碘或钆的造影剂；酶，如辣根过氧化物酶、GFP、碱性磷酸酶、或β-半乳糖苷酶；荧光物质，如铕衍生物；发光物质，如N-甲基吖啶衍生物等。
在一些实施方式中，纳米囊泡进一步包含靶向分子，优选抗体、肽或适体或叶酸。
“靶向分子”是能够将纳米囊泡引导至特定靶点的任意分子，例如通过结合靶细胞表面的受体或其他分子。靶向分子可以是蛋白、肽、核酸分子、糖或多糖、受体配体或其他小分子。可通过选择靶向分子来调节特异性程度。例如，抗体通常显示较高的特异性。抗体可以为多克隆、单克隆、片段、重组体、或单链，其中许多可商购获得或可使用标准技术容易地获得。
在一些实施方式中，纳米囊泡的双分子层进一步包含胆固醇，优选包含30-50摩尔％的胆固醇。
根据另一个方面，提供了制备纳米囊泡的方法，包括将卟啉-磷脂结合物与缓冲液混合，其中该卟啉-磷脂结合物包含共价连接于脂侧链的卟啉、卟啉衍生物或卟啉类似物，优选连接于一个磷脂的sn-1和/或sn-2位；以及挤出该混合物以产生卟啉-磷脂双分子层纳米囊泡，其包含至少15摩尔％卟啉-磷脂结合物的双分子层。
优选地，卟啉-磷脂结合物包含螯合在其中的金属。
根据另一个方面，提供了制备纳米囊泡的方法，包括将卟啉-磷脂结合物与缓冲液混合，其中该卟啉-磷脂结合物包含共价连接于脂侧链的卟啉、卟啉衍生物或卟啉类似物，优选连接于磷脂的sn-1和/或sn-2位；以及对该混合物进行声处理以产生卟啉-磷脂双分子层纳米囊泡，其包含至少15摩尔％卟啉-磷脂结合物的双分子层。
根据另一个方面，提供了在受试者的靶区域进行光动力学治疗的方法，包括提供本文所述的纳米囊泡；将该纳米囊泡给予受试者；以及使用一定波长的光辐照靶区域的纳米囊泡，其中该波长的光可活化卟啉-磷脂结合物以产生单线态氧。优选地，在未被淬灭状态(unquenchedstate)下辐照纳米囊泡。
根据另一个方面，提供了在受试者的靶区域进行光热治疗的方法，包括提供本文所述的纳米囊泡；将该纳米囊泡给予受试者；使用一定波长的光辐照靶区域的纳米囊泡，其中该波长的光可使纳米囊泡的温度升高。优选地，在淬灭状态下辐照纳米囊泡。
根据另一个方面，提供了对受试者的靶区域进行成像的方法，包括提供本文所述的纳米囊泡；将该纳米囊泡给予受试者；使用一定波长的光辐照靶区域的纳米囊泡，其中纳米囊泡响应该波长的光而发出光声信号；以及测量和/或检测靶区域的光声信号。
根据另一个方面，提供了本文所述的纳米囊泡用于进行光动力学治疗的应用。
根据另一个方面，提供了本文所述的纳米囊泡用于进行光热治疗的应用。
根据另一个方面，提供了本文所述的纳米囊泡用于进行光声成像的应用。
根据另一个方面，提供了本文所述的纳米囊泡用于进行荧光成像的应用。
以下实施例对本发明的各方面进行说明，不限定本文所公开的较宽泛的方面。
实施例
材料和方法
Pyro-脂质(溶血磷脂酰胆碱(16:0)-焦脱镁叶绿酸)的合成
将以下物质中10mL无水二氯甲烷中合并：49.6mg(0.1mmol)1-棕榈酰-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(AvantiPolarLipids)、26.7mg(0.05mmol)焦脱镁叶绿酸-a(如前所述，纯化自SpirulinaPacifica)、0.05mmolEDC(Sigma)、0.025mmolDMAP(Sigma)和1滴DIPEA(Sigma)。氩气保护下，于室温下在暗处搅拌反应混合物48小时。将溶剂蒸发，对残留物进行薄层色谱(TLC)纯化(预包被了荧光指示剂的20x20cm硅胶TLC板，厚度为1.5mm)。氯仿-甲醇-冰醋酸-水65∶25∶8∶2(V∶V)用作溶剂。从板上分离Rf＝0.4的主条带并洗脱，得到45％的终产率。借助HPLC和质谱确认Pyro-脂质的纯度和成分，随后在氮气下干燥并以1umol的等份在氩气中于-20℃下储存。
氧基细菌叶绿素-脂的合成
在室温下将49.6mg(0.1mmol)1-棕榈酰-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱、30.5mg(0.05mmol)细菌脱镁叶绿酸-a、0.05mmolEDC、0.025mmolDMAP和1滴DIPEA加入10mL无水DCM中。在氩气保护下，于室温下在暗处搅拌反应混合物48小时。通过与纯Bchl酸相比，TLC显示仍有Bchl酸的斑点。将溶剂蒸发，对残留物进行TLC板纯化(预包被了荧光指示剂的20x20cm硅胶TLC板，厚度为1.5mm)。氯仿-甲醇-冰醋酸-水65∶25∶8∶2(V∶V)用作显影体系。以38％的产率获得Rf＝0.4的终产物。同时将终产物氧化以产生氧基Bchl-脂质，通过质谱进行确认。纯化后，通过分析HPLC-MS确认纯度和质谱。将脂质进行等分，干燥并在氩气中于-20℃下储存。
金属Pyro-脂质的生成
为了生成螯合金属的卟啉-脂质结合物，在氩气下于室温下在甲醇中将10倍过量的游离醋酸锌或氯化钯与Pyro-脂质孵化1小时。通过5次丁醇水提取除去游离金属。随后将金属卟啉脂质进行等分，干燥并在氩气中于-20℃下储存。通过HPLC和质谱证实金属的稳定结合、卟啉脂质的纯度和确认。
标准卟啉囊泡的形成
在标准制备中，将95摩尔％的卟啉-脂质溶于甲醇，5摩尔％的二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000(PEG-PE)]溶于氯仿，或将4％PEG-PE加上1％1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰乙醇胺-N-[叶酸(聚乙二醇)-2000(叶酸-PEG-PE)]溶于氯仿，在氮气流下干燥并进一步在真空下干燥1h。在氩气中于-20℃下储存直到使用磷酸盐缓冲盐水(PBS，150mMNaCl，10mM磷酸盐，pH7.4)水化并进行五个冷冻-解冻循环。在65℃下使用AvantiMini-Extruder(Avanti迷你挤出机)通过100nm孔径的聚碳酸酯膜挤出卟啉囊泡混悬液15次。在氩气中于4℃下储存卟啉囊泡备用。卟啉囊泡的浓度通常为0.5mg/mL。
小型30nm卟啉囊泡的形成
为形成小型30nm的卟啉囊泡，使用0.1mg卟啉-脂质生成纯卟啉-脂质膜并在氮气和真空下干燥。使用200uL水再水化膜并在55℃下声处理10分钟。在氩气中于4℃下储存小型卟啉囊泡备用。
卟啉囊泡大小和形状的表征
使用MalvernNanosizer(Malvern纳米粒度仪)(MalvemInstrumentsLtd.，伍斯特郡，UK)测量脂质体大小。使用PBS稀释脂质体溶液，进行三次测量，每次运行15次并计算平均结果。
卟啉囊泡的活化电位的表征
使用2nm狭缝宽度，借助Flouromax荧光计(HoribaJobinYvon，Edison，NJ)记录发射光谱。在420nm处激发含有Pyro和Pyro-脂质的脂质体，在470nm处激发含有NBD的那些。在600nm至750nm和500nm至600nm处分别收集Pyro/Pyro-脂质和NBD的荧光强度。通过用0.5％TritonX-100存在下的荧光除以不存在洗涤剂时的荧光来测定每个样品的荧光倍数自淬灭F/F0。
卟啉囊泡的光热性能的表征
将五滴uL的指定溶液置于一块封口膜上并使用150mW输出的670nm激光进行辐照。使用温度校准的红外摄像机(Mikroshot)监测温度。
卟啉囊泡的光声性能的表征
使用可调谐钛宝石激光器进行光声测量，如前所述使用超声转换器对其进行设置22。在PBS溶液中使用氧基细菌叶绿素卟啉囊泡在760nm下进行测量。将卟啉囊泡的光声信号与全牛血相比，也与1％TritonX-100所裂解的卟啉囊泡相比。对于体内研究，使用左前爪注射了100μL9nM卟啉囊泡的Sprague-Dawley大鼠(200g)进行卟啉囊泡的前哨淋巴结和淋巴管显影。在注射和光声测量之前对重要区域进行剃毛。
差示扫描量热法
使用CalorimetrySciencesCorp.的6100纳米差示扫描量热仪(Lindon，UT)对PBS中的5mg/mlDMPC，HSPC，溶血PC和Pyro-脂样品进行差示扫描量热法。测量前将样品置于真空中30分钟。对所有样品采用l℃/min的扫描速度。将PBS用作对照，PBS的一个扫描周期用作基线。对于每种脂类，进行三次冷却和加热扫描，计算平均结果以测定脂类的相变温度。
共聚焦显微研究
在含有10％FBS的无叶酸RPMI1640培养基(Invitrogen)中持续培养KB细胞。成像前一天，将细胞以每孔40,000个细胞接种于8室共聚焦室。除去培养基，在不含血清的无叶酸培养基中使用卟啉囊泡孵化细胞。卟啉囊泡孵化2小时后，使用共聚焦显微镜成像。633nm的激光用于激发荧光。
卟啉囊泡和PDT处理后的细胞存活率
在含有10％FBS的无叶酸RPMI1640培养基(Invitrogen)中将KB细胞接种于96孔板。37℃下在5％CO2孵化器中孵化16h后，使用含有卟啉囊泡的RMPI1640培养基更换该培养基。孵化细胞4小时后，使用670nm激光通过具有3种不同的光通量(1Jem-2、5Jem-2、或10Jem-2)的PDT进行处理，通量率为120mWcm，处理时间为0s、24s和60s。24小时后，使用MTT示踪剂3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑(Invitrogen)评估细胞存活率。
结果与讨论
各种卟啉囊泡亚单元的产生
开发了几种不同的卟啉-脂质结合物并用于形成卟啉囊泡。卟啉囊泡最初由磷脂酰胆碱(16:0)-焦脱镁叶绿酸(称为Pyro-脂质)的亚单元形成。如图1所示，使用市售溶血磷脂和先前所报导的在我们实验室合成的光敏剂焦脱镁叶绿酸，通过简单的如前所述的酰化反应32形成Pyro-脂质33。使用HPLC和质谱确认了化合物的组成和纯度(图2)。除了焦脱镁叶绿酸外，使用吸收更长波长的细菌叶绿素合成另一种卟啉-脂质结构，以生成氧基细菌叶绿素-脂质(图3)。公知多种离子可螯合在卟啉环内34。如图4所示，为了检查卟啉囊泡是否可由金属螯合双分子层形成，我们简单地通过将Pyro-脂质与过量金属离子孵化并通过数次丁醇-水提取除去游离金属离子而生成各种金属Pyro-脂质。使用HPLC和质谱确认了金属的组成和纯度(图5)。
卟啉囊泡的生成和表征
使用具有100nm聚碳酸酯膜的常规脂质体挤出装置，通过磷酸盐缓冲盐水(PBS)水化的卟啉-脂质膜可容易的生成卟啉囊泡。对于生物相容性，包括5摩尔％PEG-脂及95摩尔％卟啉-脂质。已知PEG可稳定脂质体并使其保持更长的循环而得到更好的药代动力学数据35。使用所生成的各种类型的卟啉-脂质可成功地挤出卟啉囊泡。如图6A所示，卟啉囊泡的吸收光谱根据所使用卟啉-脂质的类型而有所不同。值得注意的是，卟啉囊泡在近红外范围具有强烈的吸收，其中标准Pyro-脂质卟啉囊泡吸收680nm，氧基细菌叶绿素卟啉囊泡在比红外远100nm的波长处吸收。对于体内光学应用，纳米颗粒在近红外波长下发挥作用是必要的，以避免任意激发和发射光散射和被人体组织吸收。由于不同类型的卟啉囊泡在不同波长下吸收，因此适合限于特定波长的应用。由于锌诱导卟啉吸收的移位，因此锌卟啉囊泡的吸收光谱移位表明锌完全螯合至卟啉囊泡中。动态光散射(DLS)用于评估各种卟啉囊泡的大小。如图6B所示，所有三种类型的卟啉囊泡在100nm处均具有较好的粒度分布，并形成高度单分散的纳米颗粒。100nm卟啉囊泡为高度呵护需要的尺寸，这是因为认为该尺寸为脂质体通过提高渗透性和保留作用在肿瘤中蓄积的最佳尺寸36。虽然100nm卟啉囊泡可适用于某些目的，但在其他情况下需要使用更小并可扩散至所有脉管系统内外的囊泡。声处理通常用于产生小于50nm的脂质体。为产生更小的卟啉囊泡，对水化的Pyro-脂质膜进行10分钟的声处理。如图7所示，该步骤产生稳定的30nm卟啉囊泡，远小于通过挤出生成的100nm卟啉囊泡。虽然DLS表明挤出的卟啉囊泡平均为100nm并具有单分散性，但由于卟啉囊泡代表全新而未被表征的材料，并且仍未证实卟啉囊泡的确切结构，因此需要更多的结构细节。透射电子显微镜(TEM)用于检查卟啉囊泡，使用醋酸铀作为负染色剂。如图8所示，卟啉囊泡的形状为完美的球形，其特征为在较高TEM放大倍率下卟啉双分子层清晰可见。在严格染色和TEM成像过程中始终为圆形表明卟啉囊泡高度稳定并具有明确的球形结构。由于这些囊泡几乎完全由结合卟啉脂质构成，所观察的结构为卟啉双分子层，其形成直径为100nm的球形纳米囊泡。
根据所获得的化学和结构数据，在图9中提供了卟啉囊泡的示意图。左侧示出了Pyro-脂质亚单元的化学结构，以红色圆圆突出显示磷酰胆碱首基，以蓝色六边形突出显示结合的卟啉基团。右侧示出了卟啉囊泡的结构示意图，使用相同的亚单元颜色表示。之前的工作表明，在100nm脂质体中约有100,000个脂质37，38。由于卟啉囊泡具有与传统脂质体相同的首基，预计卟啉囊泡的每个粒子中包含相似数量的亚单元。由于焦脱镁叶绿酸的消光系数非常大(97,000M-1cm-1)，估计装配的卟啉囊泡的消光系数约为109M-1cm-1或1010M-1cm-1。该消光系数约比量子点高1000至10,000倍，而卟啉囊泡的尺寸仅大2-10倍。
由于具有纳米结构，卟啉囊泡在卟啉装载方面提供许多优于传统脂质体的优势。脂质体不能由浓度高于约15摩尔％的游离卟啉形成。在该浓度下脂质体不稳定，因此必须使用较小的摩尔百分比。由于可结合100摩尔％的卟啉，卟啉囊泡的卟啉装载可实现10-100倍的提高。当给予脂质体配制的光敏剂时，光敏剂迅速重新分布至血清蛋白，使脂质体靶向的利用不起作用。由光敏剂稳定形成卟啉囊泡，从而首次实现较高有效载荷的光敏剂靶向。卟啉囊泡比传统抗体结合的光敏剂载量提高10,000倍，而该传统抗体结合的光敏剂限制在每个粒子约10个光敏剂。
卟啉囊泡是具有前所未有的活化电位的光敏剂
由于卟啉囊泡具有两个紧挨着的球形卟啉层，在细胞纳入和活化前易于自淬灭。如图10A所示，将Pyro-脂质滴定至由PC∶Chol(比例为3∶2)组成的标准脂质体中引起活化电位的惊人升高。加入洗涤剂后，由100％Pyro-脂质构成的卟啉囊泡显示1300倍的活化。该活化电位的升高根据Pyro-脂质的浓度约成线性。图10B示出了由最大量的游离Pyro(15％)形成的脂质体仅显示10倍活化。更高百分比的结合至脂质膜的游离Pyro在膜水化过程中不能完全溶解。这表明所结合的游离Pyro在双分子层中具有任意方向，而卟啉囊泡的卟啉双分子层实际上可使纳米结构稳定化。使用具有较高转变温度的DSPC代替5％的Pyro-脂质未显著改变卟啉囊泡的活化电位。然而，当结合DSPE-PEG时，活化电位升高至超过1500倍。DSPE-PEG也可提高卟啉囊泡的长期稳定性，当储存于4℃下时可在2个月以上保持稳定。此外，PEG可提高药物的药代动力学和生物分布。当使用功能性侧链不同(PyrovsNBD)的荧光示踪脂质NBD-脂质代替Pyro-脂质时，仅观察到22倍的活化。DLS表明使用95摩尔％NBD-脂质无法形成稳定脂质体，强调了卟啉相互作用在生成稳定卟啉囊泡中的稳定效应。
卟啉囊泡的生物相容性
接下来我们评估了与卟啉囊泡的潜在临床应用相关的因素。卟啉囊泡易于发生酶降解(图19a)。当用洗涤剂和脂肪酶进行孵化，磷脂结构裂解，主要芳香产物为焦脱镁叶绿酸，其为生成卟啉-脂质的合成反应的起始原料。与叶绿素相同，已知当与过氧化物酶和过氧化氢孵化时，焦脱镁叶绿酸可酶裂解为无色吡咯。我们通过监测卟啉吸收的降低来证实该降解，并证实焦脱镁叶绿酸可由过氧化物酶有效降解。据我们所知，这是第一例酶生物可降解的光学活性纳米颗粒。接下来我们进行了初步研究，以评估卟啉囊泡的潜在毒性。当使用高剂量卟啉囊泡(1000mg/kg)处理小鼠时，其在两周内基本保持健康，无主要行为改变或体重减轻(图19b)。在两周的时间点，处死小鼠并进行血液测试(图19c)。肝功能测试表明小鼠肝功能基本正常，除了胆汁酸和丙氨酸转氨酶略有升高(小于正常上限范围的2倍)。红细胞计数和属性未受到高剂量卟啉-脂质的影响，不干扰内源性卟啉(血红素)的生理调节。白细胞计数未受影响表明即使以高剂量给予小鼠，在两周时间点处卟啉囊泡仍无免疫原性。对肝、脾和肾的尸体解剖的组织病理学检查表明这些器官状态良好，并未受到高静脉卟啉囊泡剂量的影响(图19d)。
卟啉囊泡较大水性核心的装载
卟啉囊泡最显著的观察数据之一为较大的水性核心，其具有物质装载(cargoloading)的潜力(图8)。与通常通过表面吸附或结合而装载物质的无机纳米颗粒(如金纳米颗粒)不同，卟啉囊泡可自由地填充其整个体积。当使用250mM羧基荧光素溶液水化并挤出卟啉囊泡(含有5％PEG-脂质)时，通过凝胶过滤测得仅有限量的羧基荧光素稳定地夹带在卟啉囊泡中(图20a)。由于已知胆固醇可提高化合物在基于磷脂酰胆碱的脂质体中的装载，我们在配方中包括30摩尔％胆固醇并重复被动羧基荧光素的装载。含有胆固醇的卟啉囊泡能够以比缺少胆固醇的卟啉囊泡高20倍的高效率装载羧基荧光素(图20a)。在该较高的装载浓度下，羧基荧光素在卟啉囊泡中发生自淬灭(图20b，左侧)。此外，卟啉囊泡仍然几乎完全自淬灭(图20b，右侧)，表明其保持了特征性光转换行为。如预期的那样，在水化溶液中，羧基荧光素的被动装载仅夹带总荧光团的一小部分。最有效的药物装载技术之一为主动装载，其利用pH或离子梯度将两性弱碱性分子聚集至脂质体和卟啉囊泡中。该装载技术的重要性体现在临床实施的第一种纳米颗粒-中，其为主动装载的多柔比星的脂质体制剂。我们应用硫酸铵梯度法43将多柔比星主动装载于卟啉囊泡中，其中多柔比星与pyro-脂质的摩尔比为1∶5。未加入胆固醇时，通过凝胶过滤可观察到多柔比星的装载，但从溶液中纳入的总多柔比星分数约为10％(图20c)。然而，当在卟啉囊泡配方中加入50摩尔％胆固醇时，可实现较强的主动装载，并且卟啉囊泡将溶液中所有游离多柔比星的90％装载至卟啉囊泡核心中。虽然使用了较大摩尔％的胆固醇，但由于预计胆固醇仅占据了磷脂酰胆碱亚单元空间的四分之一44，因此其对卟啉密度的影响是有限的，从而仅略微降低卟啉双分子层的密度。其由图20d示出的保持恒定的极限卟啉自淬灭所支持。除了具有与未装载卟啉囊泡相似的光转换性能外，主动和被动装载的卟啉囊泡保持单一分布并且所显示尺寸为150nm至200nm(图20e)。
卟啉囊泡作为光转换器
由研究如金纳米棒的高光热转换效率所示39，对光热治疗领域的兴趣日益增长。由于其在细胞摄取前具有较大的吸收系数和较高的淬灭态，对卟啉囊泡的光热性能进行了研究(图11)。通过温度校准的红外摄像机可显示使用670nm激光进行150mW的激光辐照时，PBS或标准PC∶Chol(3∶2)脂质体产生显著的光热响应。
当使用激光对670nm下吸收为0.8的金纳米棒进行辐照时，可有效产生热并通过红外摄像机检测。当测得卟啉囊泡具有相同吸收时，其产生相似的光热转换量。因此，虽然产生相似的光热效应，但卟啉囊泡代表非金属软纳米颗粒，可用于体温过高和光声应用。
事实上，当在体外测量时卟啉囊泡产生非常强烈的光声信号，可检测到低至较低的皮摩浓度，在血信号中可容易地检测到纳摩浓度(图12A和图12C)。卟啉囊泡具有与金纳米颗粒相似的光声信号，但在生物相容性和药物装载方面具有优势。此外，加入洗涤剂可减弱光声信号，提供了直接证据证明亚单元的自组装与生成光转换性能有关(图12B)。通过使用卟啉囊泡有效地对大鼠体内前哨淋巴结进行显影而证实卟啉囊泡作为光声探针的功效(图13)。前哨淋巴结的检测和检查为评估乳腺癌转移状态的常用步骤，而使用卟啉囊泡进行光声断层扫描是以高信噪比在体内检测这些前哨淋巴结的良好方法。卟啉囊泡能够不依赖靶向配体而清晰地显影前哨淋巴结(因此这些淋巴结可包含或不包含转移癌)。具有合适的靶向配体时，卟啉囊泡可进一步摄取至癌细胞中，导致不淬灭和荧光的产生。
为了进一步检查Pyro-脂质的热性能，使用差示扫描量热法(图14)。DMPC和HSPC的对照脂质表现如预期的，表明转变温度分别为24℃和52℃。有趣的是，Pyro-脂质未表现出明显的转变温度，这表明卟啉囊泡可能不易发生(倾向于，proneto)当脂质改变相时发生的转变温度。当加热至95℃保储15分钟并冷却至室温后，卟啉囊泡保持约为100nm的良好的粒度分布。这些数据共同显示，卟啉囊泡热稳定并为良好的光热和光声转换器。
虽然卟啉囊泡具有显著较高的对卟啉光敏剂的有效载荷，但在其非活性状态时其显示高度的淬灭荧光，表明单线态氧的产生也发生淬灭40。为了显示卟啉囊泡可在细胞中靶向和活化，我们靶向叶酸受体，其为在多种癌症中过表达的受体41。由于众所周知KB癌细胞可表达叶酸受体，因此使用KB细胞42。通过纳入1摩尔％叶酸-PEG脂，4摩尔％PEG-脂和95％Pyro-脂质来生成叶酸卟啉囊泡。使用活细胞共聚焦显微镜检查卟啉囊泡的摄取。如图15所示，将叶酸标记的卟啉囊泡与KB细胞孵化两小时后，卟啉囊泡不仅被细胞摄取，而且由于在活化前基本无荧光，因此较高的荧光信号表明卟啉囊泡在摄取后发生活化。活化机理可能是卟啉囊泡在内吞过程中分解。由于荧光去淬灭与单线态氧去淬灭相关，因此卟啉囊泡可能在特定靶向后增加其单线态氧应答。缺少叶酸靶向基团的卟啉囊泡显示最小摄取。当使用过量叶酸孵化细胞时未有效摄取叶酸标记的卟啉囊泡，显示摄取机制的特异性。我们也利使用核染色和固定细胞成像检查了卟啉囊泡的摄取(图16)。卟啉囊泡的摄取再次依赖叶酸结合。在活细胞成像中，卟啉囊泡从细胞核中排除，然而在固定细胞成像时，卟啉囊泡在细胞中的分布更为均匀。这可能表明在两个小时的时间点处，活细胞中的卟啉囊泡被分隔在内涵体中，还需要更多的时间使卟啉囊泡在细胞中重新分布。当将卟啉囊泡静脉注射于荷瘤小鼠中时，起初在小鼠中具有微弱的荧光(图18，左侧)。这表明卟啉囊泡最初在体内被淬灭。随着时间的推移，卟啉囊泡在肿瘤中蓄积并去淬灭(图18，右侧)。这表明卟啉囊泡可用作荧光成像(以及光动力治疗)的低背景探针。
为了显示卟啉囊泡可通过特定的分子靶向机制杀伤细胞，使用含有或不含1摩尔％叶酸靶向脂质的卟啉囊泡孵化KB细胞。然后将细胞暴露于不同激光辐照强度下。如图17所示，卟啉囊泡介导的细胞杀伤对卟啉囊泡浓度以及光剂量强度具有剂量响应性。有效的PDT需要将叶酸脂纳入卟啉囊泡中。与共聚焦显微法结果一致，当孵化过程中加入过量叶酸，叶酸靶向的卟啉囊泡介导的PDT细胞杀伤受到抑制，证实了卟啉囊泡靶向和杀伤的特异性。
为了证明有机纳米颗粒的生物光子治疗潜力，我们接下来使用卟啉囊泡作为光热治疗药物进行初步实验。使用输出750mW的658nm激光(具有1.9W/cm2的能量密度)辐照具有异种移植物的小鼠中的KB肿瘤，随后给予卟啉囊泡(图21a)。治疗前24小时，对小鼠静脉注射42mg/kg卟啉囊泡。给予卟啉囊泡或PBS24小时后，使用激光辐照肿瘤1分钟，并使用热感摄像机监测温度(图21b)。卟啉囊泡组中的肿瘤温度迅速达到60℃，而注射PBS的小鼠中的肿瘤限制在40℃(图21c)。治疗后卟啉囊泡和激光治疗组的小鼠的肿瘤上形成焦痂，而仅用激光治疗组和仅用卟啉囊泡治疗组则未形成焦痂。2周后治疗组中的焦痂愈合，肿瘤被永久破坏(图21d)。与使用卟啉囊泡和光治疗的小鼠中的肿瘤不同，仅接受激光治疗或卟啉囊泡注射的小鼠中的肿瘤继续迅速增长，并且在21天内不得不对在那些组中的所有小鼠实施安乐死(图21e)。该光热实验相当于治疗指数至少为25的治疗，得到卟啉囊泡的安全性为1g/kg。
结论
新型纳米颗粒及其所具有的新型性能是日益增长的纳米技术革命背后的推动力。卟啉囊泡代表了完全不同类型的纳米颗粒，其具有新型纳米级性能，可很好的适合治疗应用。卟啉囊泡是易变的并可生成具有不同光学和尺寸特性的卟啉囊泡。卟啉囊泡可由金属螯合的双分子层构成，代表靶向金属传输的新途径。由于每个卟啉囊泡可装配约100,000个光敏剂，卟啉囊泡可携带前所未有的光敏剂有效载量以进行PDT。此外，其为可靶向的，这是光敏剂的传统脂质体制剂所不具备的属性。细胞摄取后卟啉囊泡被活化，活化后荧光升高1000倍。卟啉囊泡显示与光热转换的现行标准-金纳米棒范围相同的光热转换效率，但与金纳米棒不同，卟啉囊泡的为有机性质，可生物降解并在体内具有良好的耐受性。与其他光学活性纳米颗粒不同，卟啉囊泡的较大水性核心可装载荧光团和药物。除具有多式光子成像能力外，基于其固有的药物装载适应性以及光动力和光热治疗，卟啉囊泡具有较强的治疗潜力。
虽然本文描述了本发明的优选实施方式，但本领域技术人员应理解，在不违背本发明精神或所附权利要求范围的前提下可对其进行修改。以下及本文所提及的所有参考文献的全部内容以引用方式并入本文作为参考。
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Claims (45)

1.一种纳米囊泡，其包含至少35mol％的卟啉-磷脂结合物的双分子层，其中，所述卟啉-磷脂结合物包含共价连接于一个磷脂的脂质侧链的一个卟啉、卟啉衍生物或卟啉类似物，连接于sn-1位或sn-2位，所述卟啉-磷脂结合物中的卟啉、卟啉衍生物或卟啉类似物选自由血卟啉、原卟啉、四苯基卟啉、焦脱镁叶绿酸、细菌叶绿素、叶绿素a、四羟基苯基二氢卟酚、红紫素、苯并二氢卟酚、萘并二氢卟酚、胆绿素、玫红素、酮二氢卟酚、氮杂二氢卟酚、细菌二氢卟酚、甲苯基卟啉、苯并细菌二氢卟酚、扩展的卟啉和卟啉异构体组成的组，其中所述扩展的卟啉为德克萨卟啉、噻啉或六元卟啉，所述卟啉异构体为卟啉烯、反转卟啉、酞菁或萘酞菁。
2.根据权利要求1所述的纳米囊泡，其包含至少45摩尔％卟啉-磷脂结合物。
3.根据权利要求1所述的纳米囊泡，其包含至少55摩尔％卟啉-磷脂结合物。
4.根据权利要求1所述的纳米囊泡，其包含至少65摩尔％卟啉-磷脂结合物。
5.根据权利要求1所述的纳米囊泡，其包含至少75摩尔％卟啉-磷脂结合物。
6.根据权利要求1所述的纳米囊泡，其包含至少85摩尔％卟啉-磷脂结合物。
7.根据权利要求1所述的纳米囊泡，其包含至少95摩尔％卟啉-磷脂结合物。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的纳米囊泡，其中，所述卟啉-磷脂结合物中的磷脂包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸或磷脂酰肌醇。
9.根据权利要求8所述的纳米囊泡，其中，所述磷脂包含12至22个碳的酰基侧链。
10.根据权利要求1-7中任一项所述的纳米囊泡，其中，所述卟啉-磷脂结合物中的卟啉为焦脱镁叶绿酸-a。
11.根据权利要求1-7中任一项所述的纳米囊泡，其中，所述卟啉-磷脂结合物中的卟啉为细菌叶绿素。
12.根据权利要求1-7中任一项所述的纳米囊泡，其中，所述卟啉-磷脂结合物中的磷脂为1-棕榈酰-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱。
13.根据权利要求1-7中任一项所述的纳米囊泡，其中，所述卟啉-磷脂结合物为焦脱镁叶绿酸-脂质。
14.根据权利要求1-7中任一项所述的纳米囊泡，其中，所述卟啉-磷脂结合物为氧基细菌叶绿素脂质。
15.根据权利要求1-7中任一项所述的纳米囊泡，其中，所述卟啉通过0至20个碳的碳链接头连接于磷脂上的甘油基。
16.根据权利要求1-7中任一项所述的纳米囊泡，进一步包含PEG。
17.根据权利要求1-7中任一项所述的纳米囊泡，进一步包含PEG-脂质。
18.根据权利要求1-7中任一项所述的纳米囊泡，进一步包含PEG-DSPE。
19.根据权利要求16所述的纳米囊泡，其中，所述PEG以5摩尔％的量存在。
20.根据权利要求1-7中任一项所述的纳米囊泡，其中，所述纳米囊泡基本为球形，直径为30nm至200nm。
21.根据权利要求1-7中任一项所述的纳米囊泡，其中，所述纳米囊泡基本为球形，直径为100nm。
22.根据权利要求1-7中任一项所述的纳米囊泡，其中，所述纳米囊泡基本为球形，直径为30nm。
23.根据权利要求1-7中任一项所述的纳米囊泡，其中，所述卟啉-磷脂结合物包含螯合在其中的金属。
24.根据权利要求23所述的纳米囊泡，其中，所述金属选自由Zn、Cu和Pd组成的组。
25.根据权利要求1-7中任一项所述的纳米囊泡，进一步包括包封在其中的活性剂。
26.根据权利要求1-7中任一项所述的纳米囊泡，进一步包含靶向分子。
27.根据权利要求26所述的纳米囊泡，其中，所述靶向分子为叶酸。
28.根据权利要求1-7中任一项所述的纳米囊泡，其中，所述双分子层进一步包含胆固醇。
29.根据权利要求1-7中任一项所述的纳米囊泡，其中，所述双分子层的余量基本由磷脂构成。
30.根据权利要求1-7中任一项所述的纳米囊泡，进一步包括包封在其中的治疗剂或诊断剂。
31.根据权利要求1-7中任一项所述的纳米囊泡，进一步包括包封在其中的化疗剂。
32.根据权利要求1-7中任一项所述的纳米囊泡，进一步包括包封在其中的多柔比星。
33.根据权利要求1-7中任一项所述的纳米囊泡，进一步包含抗体、肽或适体。
34.根据权利要求1-7中任一项所述的纳米囊泡，其中，所述双分子层进一步包含30-50摩尔％的胆固醇。
35.根据权利要求17所述的纳米囊泡，其中，所述PEG-脂质以5摩尔％的量存在。
36.根据权利要求1-7中任一项所述的纳米囊泡，其中，所述卟啉-磷脂结合物包含螯合在其中的金属的放射性同位素。
37.一种用于制备纳米囊泡的方法，包括：
a.将卟啉-磷脂结合物与缓冲液混合，其中，所述卟啉-磷脂结合物包括共价连接于一个磷脂的脂质侧链的卟啉、卟啉衍生物或卟啉类似物，连接于sn-1位和/或sn-2位，所述卟啉-磷脂结合物中的卟啉、卟啉衍生物或卟啉类似物选自由血卟啉、原卟啉、四苯基卟啉、焦脱镁叶绿酸、细菌叶绿素、叶绿素a、四羟基苯基二氢卟酚、红紫素、苯并二氢卟酚、萘并二氢卟酚、胆绿素、玫红素、酮二氢卟酚、氮杂二氢卟酚、细菌二氢卟酚、甲苯基卟啉、苯并细菌二氢卟酚、扩展的卟啉和卟啉异构体组成的组，其中所述扩展的卟啉为德克萨卟啉、噻啉或六元卟啉，所述卟啉异构体为卟啉烯、反转卟啉、酞菁或萘酞菁；
b.挤出步骤(a)所述的混合物以产生卟啉-磷脂双分子层纳米囊泡，其包含至少15摩尔％卟啉-磷脂结合物的双分子层。
38.根据权利要求37所述的方法，其中，所述卟啉-磷脂结合物包括螯合在其中的金属。
39.一种用于制备纳米囊泡的方法，包括：
a.将卟啉-磷脂结合物与缓冲液混合，其中，所述卟啉-磷脂结合物包括共价连接于一个磷脂的脂质侧链的卟啉、卟啉衍生物或卟啉类似物，连接于sn-1位和/或sn-2位，所述卟啉-磷脂结合物中的卟啉、卟啉衍生物或卟啉类似物选自由血卟啉、原卟啉、四苯基卟啉、焦脱镁叶绿酸、细菌叶绿素、叶绿素a、四羟基苯基二氢卟酚、红紫素、苯并二氢卟酚、萘并二氢卟酚、胆绿素、玫红素、酮二氢卟酚、氮杂二氢卟酚、细菌二氢卟酚、甲苯基卟啉、苯并细菌二氢卟酚、扩展的卟啉和卟啉异构体组成的组，其中所述扩展的卟啉为德克萨卟啉、噻啉或六元卟啉，所述卟啉异构体为卟啉烯、反转卟啉、酞菁或萘酞菁；
b.对步骤(a)的所述混合物进行声处理以产生卟啉-磷脂双分子层纳米囊泡，其包含至少15摩尔％卟啉-磷脂结合物的双分子层。
40.根据权利要求1-28中任一项所述的纳米囊泡在制备用于进行光动力学治疗的药物中的应用。
41.根据权利要求1-28中任一项所述的纳米囊泡在制备用于进行光热治疗的药物中的应用。
42.根据权利要求1-28中任一项所述的纳米囊泡在制备用于进行光声成像的药物中的应用。
43.根据权利要求1-28中任一项所述的纳米囊泡在制备用于进行荧光成像的药物中的应用。
44.根据权利要求1-28中任一项所述的纳米囊泡在制备用于与装载于所述纳米囊泡内的化疗药物的递送相结合来进行光热治疗的药物中的应用。
45.根据权利要求1-28中任一项所述的纳米囊泡在制备用于与装载于所述纳米囊泡内的多柔比星的递送相结合来进行光热治疗的药物中的应用。
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