CN102559581B - 一种无血清肝细胞培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种新的无血清培养基，还提供了该培养基的制备方法和用途。本发明提供的无血清培养基克服了传统含血清培养基的缺陷，且明显优于现有文献报道的无血清培养基，提高了细胞移植、组织工程肝脏和生物人工肝支持系统治疗临床应用的可能性，具有较强的实用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种肝细胞培养基，具体涉及一种无血清的肝细胞培养基。
背景技术
肝实质细胞，即肝细胞，是肝脏功能的主要执行者，其总重量占肝重80％左右。肝细胞吸收并处理血液中的营养物质和其他物质，如将胆红素糖脂化最终形成胆汁分泌到肠道，同时肝细胞还合成白蛋白、补体蛋白、糖原(葡萄糖的储存)和凝血蛋白，另外肝细胞还将血液中的氨转化为尿素完成解毒作用。肝脏在糖类、脂质和氨基酸调节中也起到重要作用，肝脏特异性功能由肝细胞合成的各种肝脏特异性酶完成，将由胃肠道吸收，经门静脉循环到达肝脏的营养物质合成储存，而将药物代谢并解毒。
随着肝细胞分离、培养技术的发展，体外培养的肝细胞能维持数小时的代谢活力，执行许多肝脏的代谢和解毒功能。由于肝移植供肝的严重短缺，利用体外培养的肝细胞进行细胞移植和构建生物人工肝(bioartificial liversystems，BAL)来治疗急性或慢性肝功能衰竭患者的方法正日益受到关注。
目前在肝细胞体外培养中通常使用添加10％(v/v)胎牛血清(FBS)的William’s-E培养基。然而，血清中的成分十分复杂，其中存在的未知物质和可变因素往往影响研究结果和治疗效果的准确性和重复性。另外，FBS等动物血清或血清蛋白等动物源成分进入人体后会引发多种不良反应及疾病，为细胞移植和BAL治疗的临床应用埋下了隐患。美国FDA即将停止受理用含血清细胞培养工艺的医疗技术以及制备的生物技术新药的申报。无血清培养已经成为生物技术制药生产和生物医学工程临床治疗的总趋势。
目前，美国Invitrogen公司的HepatoZYME-SFM无血清培养基已经上市，但Masashi Kitazawa etal.(2007)Angiopoietin-related growth factor suppressesgluconeogenesis through the akt/forkhead box calss O 1-dependent pathway inhepatocytes中报道，使用HepatoZYME-SFM无血清培养基培养原代大鼠肝细胞时，仍需加入了10％胎牛血清，不能真正实现无血清培养。Structuralpolarity and functional bile canaliculi in rat hepatocyte spheroids.Experimentalcell research 274：56-67，2002；Sustaining a bioatificial liver under hypothermicconditions.Tissue engineering 11：427-437，2005.；Three-dimensional co-cultureof hepatocytes and stellate cells.Cytotechnology 45：125-140，2004.；Dexamethasone effects on rat hepatocyte spheroid formation and function.Tissueengineering 11：415-426，2005.；Hypothermic maintence of Hepatocye spheroids.Cell transplantation 14：375-389，2005.等文献中公开了三种无血清培养基，但是这三种无血清培养基含有动物来源成分，且不能用于肝细胞悬浮培养，难以满足科研和临床应用的需求。其他商品化的肝细胞无血清培养基存在培养基的成分配方秘而不宣等问题，且价格昂贵，使得广大肝细胞移植和BAL研究者和使用者望而却步，亟需寻找一种新的肝细胞无血清培养基。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种新的肝细胞无血清培养基。
首先，本发明提供了一种肝细胞培养基，每升培养基含有如下组分：
余量为去离子水。
优选地，每升培养基含有如下组分：
余量为去离子水。
进一步优选地，每升培养基含有如下组分：
余量为去离子水。
本发明还提供了制备前述培养基的方法，包括如下步骤：
(1)取前述组分，加入去离子水中，搅拌，使各组分充分溶解；
(2)加入去离子水定容，除菌。
本发明还提供了前述培养基在肝细胞培养中的用途。
本发明提供的无血清培养基化学成分明确且成本低廉，在本发明培养基中，肝细胞生长良好，细胞形态、密度与含血清培养基相当，细胞功能和活力优于含血清培养基，克服了传统含血清培养基的缺陷，且不含动物来源成分，能够支持肝细胞高密度悬浮培养生长，明显优于现有文献报道的无血清培养基。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1本发明无血清培养基中贴壁生长的HepG2人肝癌细胞系细胞生长状况(倒置显微镜下观察)。
图2含血清培养基中贴壁生长的HepG2人肝癌细胞系细胞生长状况(倒置显微镜下观察)。
图3本发明无血清培养基中摇动悬浮生长的原代猪肝细胞球生长状况(倒置显微镜下观察)。
图4含血清培养基中摇动悬浮生长的原代猪肝细胞球生长状况(倒置显微镜下观察)。
图5本发明无血清培养基中摇动悬浮生长的原代大鼠肝细胞球生长状况(倒置显微镜下观察)。
图6含血清培养基中摇动悬浮生长的原代大鼠肝细胞球生长状况(倒置显微镜下观察)。
图7本发明无血清培养基与含血清培养基及另外3种无血清培养基中悬浮培养(细胞浓度1×106cells/ml)原代大鼠肝细胞成肝细胞球比例对比图。
图8本发明无血清培养基与含血清培养基及另外3种无血清培养基中悬浮培养(细胞浓度1×106cells/ml)原代大鼠肝细胞白蛋白分泌量对比图。
图9本发明无血清培养基与含血清培养基及另外3种无血清培养基中悬浮培养(细胞浓度1×106cells/ml)原代大鼠肝细胞尿素合成量对比图。
图10本发明无血清培养基与含血清培养基及另外3种无血清培养基中高密度悬浮培养(细胞浓度5×106cells/ml)原代大鼠肝细胞成肝细胞球比例对比图。
图11本发明无血清培养基与含血清培养基及另外3种无血清培养基中高密度悬浮培养(细胞浓度5×106cells/ml)原代大鼠肝细胞白蛋白分泌量对比图。
图12本发明无血清培养基与含血清培养基及另外3种无血清培养基中高密度悬浮培养(细胞浓度5×106cells/ml)原代大鼠肝细胞尿素合成量对比图。
具体实施方式
实验材料：Williams’-E粉末、碳酸氢钠、胰岛素、青霉素、链霉素、人血清白蛋白、亚油酸、人表皮生长因子、地塞米松、人胰高血糖素、人转铁蛋白、Gly-His-Lys、五水硫酸铜、亚硒酸钠、七水硫酸锌、L-肉毒碱、L-精氨酸、甘氨酸、肝素钠，均为市售品。
实施例1 本发明培养基的制备
1、制备方法
(1)取如下成分：
(2)将上述培养基成分混合，溶于去离子水，室温下搅拌10分钟，使其充分溶解，定容至1L，灭菌，即可。
使用培养基时，用去离子水调节培养基钠离子浓度至1.3g/L(允许的误差范围为1.28g/L～1.32g/L)，调节pH至7.2，用0.2微米滤膜过滤除菌，预热至37℃。
实施例2 本发明培养基的制备
1、制备方法
(1)取如下成分：
(2)将上述培养基成分混合，溶于去离子水，室温下搅拌10分钟，使其充分溶解，定容至1L，灭菌，即可。
使用培养基时，用去离子水调节培养基钠离子浓度至1.3g/L(允许的误差范围为1.28g/L～1.32g/L)，调节pH至7.2，用0.2微米滤膜过滤除菌，预热至37℃。
实施例3 本发明培养基的制备
1、制备方法
(1)取如下成分：
(2)将上述培养基成分混合，溶于去离子水，室温下搅拌10分钟，使其充分溶解，定容至1L，灭菌，即可。
使用培养基时，用去离子水调节培养基钠离子浓度至1.3g/L(允许的误差范围为1.28g/L～1.32g/L)，调节pH至7.2，用0.2微米滤膜过滤除菌，预热至37℃。
实施例4 本发明培养基的制备
1、制备方法
(1)取如下成分：
(2)将上述培养基成分混合，溶于去离子水，室温下搅拌10分钟，使其充分溶解，定容至1L，灭菌，即可。
使用培养基时，用去离子水调节培养基钠离子浓度至1.3g/L(允许的误差范围为1.28g/L～1.32g/L)，调节pH至7.2，用0.2微米滤膜过滤除菌，预热至37℃。
实施例5 本发明培养基的制备
1、制备方法
(1)取如下成分：
(2)将上述培养基成分混合，溶于去离子水，室温下搅拌10分钟，使其充分溶解，定容至1L，灭菌，即可。
使用培养基时，用去离子水调节培养基钠离子浓度至1.3g/L(允许的误差范围为1.28g/L～1.32g/L)，调节pH至7.2，用0.2微米滤膜过滤除菌，预热至37℃。
实施例6 用本发明培养基培养肝细胞
1、实验方法
(1)将冻存复苏的HepG2人肝癌细胞系细胞，分别用本发明实施例1制备的无血清培养基和含10％(v/v)胎牛血清(FBS)的William’s-E培养基分散细胞、调整细胞悬液浓度为1×105cells/ml。按5ml/瓶接种75ml组织培养瓶，37℃，5％CO2静置培养，用光学倒置显微镜观察细胞形态并拍照记录。每天更换新鲜培养基。培养2天后，观察其生长状况。
(2)将新鲜分离的猪肝细胞，分别用上述本发明实施例1制备的无血清培养基和含10％(v/v)胎牛血清(FBS)的William’s-E培养基将细胞重悬，调整细胞浓度到5×106cells/ml，然后加入20ml细胞悬液到40ml摇动培养玻璃皿中，置于摇动摇床上，速度为10cpm(cycle per minute)，整个培养体系置于二氧化碳组织培养箱中(37℃，5％CO2)，悬浮培养24小时，光学倒置显微镜下观察其生长状况。
(3)将新鲜分离的大鼠肝细胞，分别用上述本发明实施例1制备的无血清培养基和含10％(v/v)胎牛血清(FBS)的William’s-E培养基将细胞重悬，调整细胞浓度到5×106cells/ml，然后加入20ml细胞悬液到40ml摇动培养玻璃皿中，置于摇动摇床上，速度为10cpm(cycle per minute)，整个培养体系置于二氧化碳组织培养箱中(37℃，5％CO2)，悬浮培养24小时，光学倒置显微镜下观察其生长状况。
2、实验结果
(1)如图1～2所示，HepG2人肝癌细胞系细胞在本发明无血清培养基中和含10％FBS的William’s-E培养基中均汇合成单细胞层，细胞形态呈多角形，肝细胞形态无差别。
(2)如图3～4所示，猪肝细胞在本发明无血清培养基中和含10％FBS的William’s-E培养基中均聚集形成形态良好的肝细胞球，肝细胞的形态无差别。
(3)如图5～6所示，大鼠肝细胞在本发明无血清培养基中和含10％FBS的William’s-E培养基中均聚集形成形态良好的肝细胞球，肝细胞的形态无差别。
实验说明本发明无血清培养基适用于体外培养大鼠、猪和人肝细胞。
实施例7 与其他无血清培养基的对比实验
1、实验方法
(1)将新鲜分离的大鼠肝细胞，分别用表1列出的4种无血清培养基和含10％(v/v)胎牛血清(FBS)的William’s-E培养基将细胞重悬，调整细胞浓度到1×106cells/ml，然后加入20ml细胞悬液到40ml摇动培养玻璃皿中，置于摇动摇床上，速度为10cpm(cycle per minute)，整个培养体系置于二氧化碳组织培养箱中(37℃，5％CO2)，悬浮培养72小时，每24小时换液一次，并在培养24小时，48小时和72小时取样，利用Multisizer 3 BeckmanCoulter counter分析各时点各种培养条件下大鼠肝细胞成球(直径大于60微米)比例，光学倒置显微镜下观察其生长状况，同时检测培养基中白蛋白和尿素含量，分析大鼠肝细胞功能。
(2)将新鲜分离的大鼠肝细胞，分别用表1列出的4种无血清培养基和含10％(v/v)胎牛血清(FBS)的William’s-E培养基将细胞重悬，调整细胞浓度到5×106cells/ml，然后加入20ml细胞悬液到40ml摇动培养玻璃皿中，置于摇动摇床上，速度为10cpm(cycle per minute)，整个培养体系置于二氧化碳组织培养箱中(37℃，5％CO2)，悬浮培养72小时，每24小时换液一次，并在培养24小时，48小时和72小时取样，利用Multisizer 3 BeckmanCoulter counter分析各时点各种培养条件下大鼠肝细胞成球(直径大于60微米)比例，光学倒置显微镜下观察其生长状况，同时检测培养基中白蛋白和尿素含量，分析大鼠肝细胞功能。
4种无血清培养基的成分如表1所示：
表1 4种无血清培养基的成分
无血清培养基1见文献1和2，文献1：Structural polarity and functional bile canaliculi in rathepatocyte spheroids.Experimental cell research 274：56-67，2002；文献2：Sustaining abioatificial liver under hypothermic conditions.Tissue engineering 11：427-437，2005.
无血清培养基2见文献3和4，文献3；Three-dimensional co-culture of hepatocytes andstellate cells.Cytotechnology 45：125-140，2004.；文献4：Dexamethasone effects on rathepatocyte spheroid formation and function.Tissue engineering 11：415-426，2005.
无血清培养基3见文献5，文献5：Hypothermic maintence of Hepatocye spheroids.Celltransplantation 14：375-389，2005.
2、实验结果
(1)如表2-4和图7～9(图7、8、9分别对应表2、3、4)所示：
表2 原代大鼠肝细胞成肝细胞球比例(细胞浓度1×106cells/ml)成球率％(直径＞60um)
| 24h | 48h | 72h | |
| 本发明无血清培养基 | 87.1±6.7 | 85.6±7.5 | 68.8±4.3 |
| 有血清培养基 | 88.6±5.2 | 78.6±7.7 | 64.9±8.6 |
| 无血清培养基1 | 45.1±3.4 | 56.7±5.6 | 48.2±6.2 |
| 无血清培养基2 | 42.8±6.2 | 48.9±5.3 | 46.5±7.3 |
| 无血清培养基3 | 38.8±5.3 | 48.2±6.8 | 39.8±5.6 |
表3 原代大鼠肝细胞白蛋白分泌量(细胞浓度1×106cells/ml)白蛋白(ug/ml)
| 24h | 48h | 72h | |
| 本发明无血清培养基 | 94.5±2.2 | 56.8±1.4 | 42.3±1.8 |
| 有血清培养基 | 91.7±1.9 | 25.3±0.9 | 8.4±0.4 |
| 无血清培养基1 | 92.5±2.1 | 32.8±1.2 | 20.2±2.0 |
| 无血清培养基2 | 94.2±3.2 | 34.2±2.1 | 18.7±1.0 |
| 无血清培养基3 | 91.5±2.1 | 36.4±1.1 | 19.2±1.0 |
表4 原代大鼠肝细胞尿素合成量(细胞浓度1×106cells/ml)尿素(mg/dL)
| 24h | 48h | 72h | |
| 本发明无血清培养基 | 33.1±1.2 | 26.8±1.1 | 25.4±1.7 |
| 有血清培养基 | 26.5±1.0 | 22.6±1.0 | 15.9±2.1 |
| 无血清培养基1 | 32.1±1.4 | 22.5±2.1 | 17.1±2.5 |
| 无血清培养基2 | 30.3±1.6 | 23.4±1.1 | 18.9±3.1 |
| 无血清培养基3 | 31.2±1.2 | 24.2±1.0 | 17.6±2.1 |
在原代大鼠肝细胞悬浮成球培养中(肝细胞接种密度1×106cells/ml)，培养24小时后，无血清培养基1-3的肝细胞成球率(肝细胞球直径大于60微米)不到50％，本发明中的无血清培养基成球率超过85％，与含血清培养基培养效果相当，且长期培养(培养超过48小时)时，白蛋白分泌量和尿素合成量两项肝细胞功能维持效果明显优于含血清培养基和其他3种无血清培养基。
(2)如表5-7和图10～12所示(图10、11、12分别对应表5、6、7)：
表5 原代大鼠肝细胞成肝细胞球比例(细胞浓度5×106cells/ml)成球率％(直径＞60um)
| 24h | 48h | 72h | |
| 本发明无血清培养基 | 61±4.5 | 75.7±6.7 | 83.3±9.2 |
| 有血清培养基 | 56.6±6.5 | 72.7±6.7 | 67.7±8.2 |
| 无血清培养基1 | 1.6±0.1 | 1.8±0.2 | 2.1±0.4 |
| 无血清培养基2 | 2.3±0.6 | 1.2±0.2 | 2.4±0.1 |
| 无血清培养基3 | 3.2±0.5 | 2.3±0.2 | 2.1±0.6 |
表6 原代大鼠肝细胞白蛋白分泌量(细胞浓度5×106cells/ml)白蛋白(ug/ml/106cells)
| 24h | 48h | 72h | |
| 本发明无血清培养基 | 59.4±1.4 | 54.4±1.3 | 22.4±0.5 |
| 有血清培养基 | 25.3±0.9 | 22.4±1.2 | 10.8±0.9 |
| 无血清培养基1 | 20.2±1.0 | 2.1±0.2 | 1.0±0.1 |
| 无血清培养基2 | 18.9±1.2 | 1.8±0.2 | 1.2±0.1 |
| 无血清培养基3 | 21.0±1.1 | 2.0±0.2 | 0.9±0.1 |
表7 原代大鼠肝细胞尿素合成量(细胞浓度5×106cells/ml)尿素(mg/dL/106cells)
| 24h | 48h | 72h | |
| 本发明无血清培养基 | 20.5±4.7 | 26.1±4.1 | 26.5±5.8 |
| 有血清培养基 | 13.9±1.1 | 21.3±2.0 | 13.0±2.0 |
| 无血清培养基1 | 12.2±2.4 | 3.0±0.1 | 2.8±1.0 |
| 无血清培养基2 | 11.7±2.1 | 2.9±0.1 | 2.6±1.1 |
| 无血清培养基3 | 11.2±2.0 | 2.8±0.2 | 3.0±1.0 |
用无血清培养基1-3培养肝细胞，细胞密度达到5×106cells/ml以上时，原代大鼠肝细胞全部死亡，无法形成肝细胞球；而本发明无血清培养基可以支持肝细胞高密度悬浮培养，密度在5×106cells/ml-1×107cells/ml之间时，成球率高于60％，与含血清培养基培养效果相当，且长期培养(培养超过48小时)时，本发明无血清培养基在白蛋白分泌量和尿素合成量两项肝细胞功能维持效果上，明显优于含血清培养基。
实验说明本发明无血清培养基显著优于含血清培养基和上述三种无血清培养基。
综上，本发明提供的无血清培养基化学成分明确且成本低廉，不含动物来源成分，能够支持肝细胞高密度悬浮培养生长，明显优于传统含血清培养基和现有文献报道的无血清培养基，可用于细胞移植、组织工程肝脏和生物人工肝支持系统治疗，具有良好的市场应用前景。
Claims (4)
1.一种肝细胞培养基，其特征在于：每升培养基含有如下组分：
Williams’-E 粉末 9.5~10.8g
碳酸氢钠 2.2g
胰岛素 200U
青霉素 100000 U
链霉素 100mg
人血清白蛋白 2~4g
亚油酸 150μg
人表皮生长因子 5~50μg
地塞米松 0.01~1μmol
人胰高血糖素 4~60μg
人转铁蛋白 6 mg
Gly-His-Lys 20μg
五水硫酸铜 0.1μmol
亚硒酸钠 30 nmol
七水硫酸锌 50pmol
L-肉毒碱 0.5~2g
L-精氨酸 0.1~0.2g
甘氨酸 8~10mg
肝素钠 10~1000 U
余量为去离子水。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于：每升培养基含有如下组分：
Williams’-E 粉末 10.8 g
碳酸氢钠 2.2g
胰岛素 200 U
青霉素 100000U
链霉素 100mg
人血清白蛋白 3g
亚油酸 150μg
人表皮生长因子 5μg
地塞米松 0.1μmol
人胰高血糖素 40μg
人转铁蛋白 6mg
Gly-His-Lys 20μg
五水硫酸铜 0.1μmol
亚硒酸钠 30nmol
七水硫酸锌 50pmol
L-肉毒碱 1g
L-精氨酸 0.2g
甘氨酸 10mg
肝素钠 1000U
余量为去离子水。
3.一种制备权利要求1或2所述培养基的方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）取权利要求1或2所述的组分，加入去离子水中，搅拌，使各组分充分溶解；
（2）加入去离子水定容，除菌。
4.权利要求1或2所述培养基在肝细胞培养中的用途。
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