CN102559529B - 一株产谷胱甘肽的酵母工程菌及其在生产谷胱甘肽中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株产谷胱甘肽的酵母工程菌，菌株名为101-V，分类命名为：酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，已于2012年02月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.5758。本发明还公开了一种构建高产谷胱甘肽工程菌株的方法，是将透明颤菌血红蛋白基因vgb整合到产谷胱甘肽的酵母基因组中，筛选得到能够表达透明颤菌血红蛋白基因的重组酵母，如此，从分子水平上提高了血红蛋白基因重组菌对氧气的利用能力，解决了微生物发酵过程中的氧气供求矛盾，降低了氧气及能量的消耗，并同时提高了谷胱甘肽的产量。

Description

一株产谷胱甘肽的酵母工程菌及其在生产谷胱甘肽中的应用

技术领域

本发明涉及一株产谷胱甘肽的酵母工程菌，其构建方法，及其在生产谷胱甘肽中的应用。

背景技术

谷胱甘肽(glutathione，GSH)又名γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酰-甘氨酸，是由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸缩合形成的生物活性三肽化合物，广泛存在于动物、植物和微生物细胞中。发酵法因其可以利用廉价的生产原料通过特定的微生物代谢合成谷胱甘肽，操作简单、成本较低且生产速率快而越来越受到青睐(Meister A，Anderson M E.Glutathione[J].Ann Rev Biochem，1983，52：711-760.Li Y，Wei G Y，Chen J，Glutathione：a review on biotechnological production[J]Appl Microbiol Biotechnol，2004，66(3)：233-242)。GSH的生理功能主要有以下几方面：(1)抗自由基对细胞的损伤：机体代谢产生的过多自由基会损伤生物膜、侵袭生命大分子、加快机体衰老、诱发肿瘤或动脉硬化的产生。GSH可以通过巯基与体内的自由基结合转化成易代谢的酸性物质，加速自由基的排泄，对细胞起到强有力的保护作用。(2)除外源有毒物质的毒性：GSH能与进入机体有毒化合物、重金属离子等直接结合，并促其排出体外，起到中和解毒的作用。临床上已应用GSH来解除丙烯腈、氟化物、CO、重金属、有机溶剂的中毒现象。(3)促进细胞合成蛋白质：GSH可通过γ-谷氨酰基转运酶直接进入细胞内，并通过γ2谷氨酰基循环参与众多氨基酸的转运，进而促进蛋白质的合成。(4)是多种酶的辅基或辅酶：GSH参与三羧酸循环与糖代谢，组织中有许多酶是以GSH为辅酶，其活性需要GSH的存在才能表现出来。另外，GSH对于需要巯基的酶有保护或恢复活性的作用。(5)参与转甲基、转丙氨基反应，维持肝细胞正常功能(刘娟，刘春秀，王雅琴等。发酵法生产谷胱甘肽的研究进展[J].微生物学通报，2002，29(6)：71-75)。

谷胱甘肽的生物合成由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸通过谷氨酰半胱氨酰合成酶(GSH I)和谷胱甘肽合成酶(GSH II)催化的。其中，GSH I是GSH合成中的限速酶，受GSH的反馈抑制。在合成过程中，每合成一分子的谷胱甘肽需要消耗二分子的ATP。另外，GSH也可以在NADPH存在时通过谷胱甘肽还原酶将氧化型谷胱甘肽(GSSG)还原得到。

在微生物界，GSH产生菌主要集中在真核生物和革兰氏阴性菌中。野生型酿酒酵母和产朊假丝酵母本身具有较高的GSH含量(占细胞干重的0.1％～1.0％)，并且能够持续保持GSH的合成能力，因此它们已成为工业生产谷胱甘肽最常用的菌种。在实际发酵生产中，GSH产量的提高可以通过两个方面来实现：一是菌体本身细胞内GSH含量的提高；二是通过提高菌体生物量使GSH的总量提高。工业发酵的最终目标是以最低的生产成本获得最大的产值和收益，而实现这一目标的手段就是针对每个特定过程建立相应的高效发酵模式。GSH的发酵过程可以分为两个阶段：细胞生长阶段和GSH的合成阶段。所以，GSH总量的增加可以分别在这两个阶段通过增加细胞的生物量或者细胞内GSH的合成量来实现。而对发酵过程的控制可以同时从这两个方面使GSH的总量提高。目前，通过补料分批培养实现高密度发酵是增加细胞生物量的最成熟和最完善的方法。但是，在实际发酵过程中，由于溶氧、副产物积累等因素影响了细胞的生长，从而难以实现高密度发酵。因此，解决供氧问题是获得大量目的产物的关键之一。传统的解决办法是改善设备的供氧能力，提高搅拌速度，增大通气量，以增加空气在培养液中的截留率，增加气液相接触的比表面积；或者在培养液中加入某些助溶剂，以提高氧的溶解度。所有这些方法均受到设备和能耗的限制，现在仅用于通气和搅拌的能耗已占整个发酵成本的1/3，严重限制了发酵工业的发展。

透明颤菌血红蛋白(Vitreoscilla hemoglobin，简称为VHb)是原核生物中迄今发现的唯一的一种血红蛋白，能够从分子水平上提高透明颤菌血红蛋白基因(vgb)重组菌对氧气的利用能力，因此能在限氧条件下促进细胞生长和产物合成，从而大幅度提高发酵过程中目的产物的产量和收率。VHb的应用不仅可以降低氧气及能量的消耗，还不需要附加的设备投资，因此可大大降低发酵成本。可以说，VHb的发现及研究进展为利用分子克隆技术解决微生物发酵过程中的氧气供求矛盾及实现高密度发酵培养提供了良好途径，因此VHb的研究与应用必将成为发酵工业中的一项关键技术，具有十分光明的前景。

酿酒酵母表达系统既有原核生物生长快、操作简单的优点，又具有真核生物能够对蛋白质进行翻译后修饰的的优点。酿酒酵母表达系统表达外源基因的优点有很多：酿酒酵母培养条件普通，生长繁殖迅速，用于表达基因工程产品时工艺简单，能够耐受较高的流体静压，可以大规模生产，有效降低生产成本，已广泛应用于酿酒和食品工业；它不会产生毒素，安全可靠；酿酒酵母表达外源基因具有一定的翻译后加工能力，收获的外源蛋白具有一定程度上的折叠加工和糖基化修饰，特别适合于表达真核生物基因，有利于保持生物产品的活性和稳定性(唐香山，张学文。酿酒酵母表达系统[J].生命科学研究，2004，8(2)：106-109)。

VHb已成功的用于提高多种微生物中目的产物的产量，但至今没有利用VHb提高酿酒酵母菌发酵生产谷胱甘肽产量的报道。将VHb应用于酿酒酵母表达系统中，有望解决酿酒酵母高密度发酵中供氧不足的问题，进而提高谷胱甘肽在酿酒酵母中的产量。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一株产谷胱甘肽的酵母工程菌，其构建方法，及其在生产谷胱甘肽中的应用。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一株产谷胱甘肽的酵母工程菌，菌株名为101-V，分类命名为：酿酒酵母Saccharomycescerevisiae，已于2012年02月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.5758。

一种产谷胱甘肽的酵母工程菌的构建方法，是将透明颤菌血红蛋白基因vgb整合到产谷胱甘肽的酵母基因组中，筛选得到能够表达透明颤菌血红蛋白基因的重组酵母，其中，透明颤菌血红蛋白基因序列如SEQ ID NO.1所示，为GenBank号为M27061的5′-端第142-582位核苷酸序列。

所述用于将透明颤菌血红蛋白基因vgb整合到酵母基因组中使用的重组载体是pYM-vgb，该载体是将透明颤菌血红蛋白基因vgb连接到质粒pYMIKP(本实验室保存，图谱参照说明书附图1所示。刘向勇，沈煜，郭亭等。rDNA介导的多拷贝整合表达载体的构建及其在酿酒酵母工业菌株中的应用[J]。山东大学学报(理学版)，2005，40(3)：105-109)上构建而成。

具体构建步骤如下：

(1)以载体pYES3/CT-vgb为模板扩增目的基因vgb；

(2)利用Bgl II分别酶切vgb片段和载体pYMIKP，然后用T4DNA连接酶连接；

(3)连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，筛选阳性克隆并通过PCR及DNA测序分析鉴定重组质粒pYM-vgb，最终获得重组表达质粒pYM-vgb；

(4)将测序正确的重组质粒pYM-vgb用限制性内切酶Kpn I酶切线性化，利用电击转化法将线性化质粒pYM-vgb转化到酿酒酵母中，在筛选平板上筛选阳性转化子，2～3天后挑取单菌落于液体培养基中培养24h，提培养物基因组，利用上述vgb的引物进行PCR验证，获得含有vgb基因的工程菌；

(5)工程菌发酵及vgb表达产物检测。

所述步骤(1)中，引物为：

上游引物：5′GGCGCAGATCTATGTTAGACCAGCAAAC3′；

下游引物：5′GGCAGATCTTTATTCAACCGCTTGAGC3′；

其中引物的5′均引入Bgl II酶切位点，扩增条件为：①95℃，5min；②94℃，30s；③56℃，30s；④72℃，1min；⑤循环30-35次；⑥72℃，10min。

所述步骤(4)中，电击转化的条件是：电压1.5kV，电容25μF，电阻200Ω，电击时间4～5ms。

所述步骤(4)中，筛选平板为含遗传霉素G418的抗生素平板。

所述步骤(5)中，工程菌发酵的条件为：30℃，200～250r/min培养2～3天。

所述步骤(5)中，vgb表达产物检测的方法为：CO-差示光谱法，具体步骤如下：

(1)取细菌培养液6ml离心，沉淀用生理盐水洗涤一次后重悬于3ml缓冲液中，超声破碎，所述缓冲液为含有100mmol/L Tris-HCI、50mmol/L NaCI的水溶液，pH7.5；

(2)4℃、10000r/min离心15min，留上清；

(3)上清用3ml步骤(1)所述的缓冲液稀释一倍，并加入连二亚硫酸钠至终浓度2.5mg/m1；

(4)将经步骤(1)～(3)处理过的样品分成两份，一份通CO，3min，l个气泡/s；

(5)用紫外可见光分光光度计在400～500nm范围内分别对两份样品扫描，以未经CO处理的样品作对照，所得的曲线即为CO-差示光谱图，通过CO-差示光谱图判断透明颤菌血红蛋白基因是否表达产物中是否含有透明颤菌血红蛋白。

本发明的产谷胱甘肽的酵母工程菌，能够表达透明颤菌血红蛋白，从而从分子水平上提高重组菌对氧气的利用能力，进而在限氧条件下促进细胞生长和产物合成，从而大幅度提高发酵过程中谷胱甘肽的产量和收率。本发明的工程菌，可以用于生产谷胱甘肽，其产量和收率，远远高于普通的产谷胱甘肽菌。

附图说明

产谷胱甘肽的酵母工程菌，菌株名为101-V，分类命名为：酿酒酵母Saccharomycescerevisiae，已于2012年02月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.5758，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。

图1为pYM-vgb重组载体的构建过程示意图。

图2为pYM-vgb重组载体酶切验证电泳图，其中，泳道1为Bgl II酶切重组质粒pYM-vgb，泳道2为Bgl II酶切pYMIKP，泳道3为pYM-vgb，泳道4为pYMIKP，泳道5为DNAMarker(10000bp、8000bp、7000bp、6000bp、5000bp、4000bp、3000bp、2000bp、1000bp)。

图3为目的基因整合到酿酒酵母基因组上得PCR验证的电泳图，其中，泳道1为原始菌基因组，泳道2为无菌水，泳道3为质粒pYM-vgb，泳道4、5分别为转化子1和2，泳道6为DNAMarker(10000bp、8000bp、7000bp、6000bp、5000bp、4000bp、3000bp、2000bp、1000bp)。

图4为CO-差示光谱图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1：表达VHb的酿酒酵母整合载体的构建

1.透明颤菌血红蛋白基因vgb序列的获得。以载体pYES3/CT-vgb为模板扩增目的基因vgb，引物为：

上游引物：5′GGCGCAGATCTATGTTAGACCAGCAAAC3′

下游引物：5′GGCAGATCTTTATTCAACCGCTTGAGC3′

其中引物的5′均引入Bgl II酶切位点。扩增条件为：①95℃，5min；②94℃，30s；③56℃，30s；④72℃，1min；⑤循环30-35次；⑥72℃，10min。

2.利用Bgl II分别酶切vgb片段和载体pYMIKP，然后用T4DNA连接酶连接。

3.连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，筛选阳性克隆并通过PCR及DNA测序分析鉴定重组质粒pYM-vgb，最终获得重组表达质粒pYM-vgb(其构建过程见图1，重组质粒酶切验证见图2)。

实施例2：含VHb基因工程菌的构建

将实施例1中的测序正确的重组质粒pYM-vgb用限制性内切酶Kpn I酶切线性化，用乙醇沉淀纯化酶切产物，回收后用于电转化。具体方法如下：

(1)将转化用酵母菌株的单菌落接种于YPD培养基5ml中，在30℃、摇床转速为220r/min的培养条件下过夜培养至饱和；

(2)接种适量的过夜培养液于50ml YPD培养基，直到OD600约为1.3～1.5；于4℃、3000r/min离心收获培养细胞，细胞用无菌水100ml重悬；

(3)加入适量1mol/L二硫苏糖醇(DTT，用来疏松细胞壁)溶液，并同时旋转摇动，于30℃轻轻摇动15min；

(4)用预冷的无菌水洗2～3次，离心条件为：4℃，3000r/min，5min；

(5)用预冷的1mol/L山梨醇溶液洗2次，离心条件为：4℃，3000r/min，5min；

(6)最后用1mol/L山梨醇溶液200μl悬浮，分装至1.5ml EP管中(100μl/个)放置10min后电转；

(7)将电转杯置于冰上预冷，取线性化DNA溶液10μl与酵母感受态细胞悬液100μl混合，冰上放置5min；

(8)转入预冷的电转杯中，1.5kV电击，电容25μF，电阻200Ω，然后立即加入预冷1mol/L山梨醇溶液900μl，转入离心管中，冰上放置10min；

(9)再转入15ml离心管中，30℃复苏2～3h；

(10)取50μl、100μl涂含有1000μg/ml遗传霉素(G418)的抗性YPD平板；

(11)在30℃培养箱中避光培养3～4天后挑单菌落，在含G418的YPD液体培养基中，30℃、220r/min过夜培养：其中涉及的YPD培养基配方为：酵母抽提物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L。

(12)提取酵母基因组，用以下引物进行PCR验证(附图3)，得到转化成功的工程菌。

上游引物：5′GGCGCAGATCTATGTTAGACCAGCAAAC3′

下游引物：5′GGCAGATCTTTATTCAACCGCTTGAGC3′

(13)VHb基因表达产物的验证采用的是CO-差示光谱法。具体操作如下：将工程菌在30℃、摇床转速为220r/min的培养条件下过夜培养，取发酵培养液6ml离心，离心条件为：4℃，3000r/min，5min；沉淀用生理盐水洗涤一次后重悬于缓冲液(100mmol/L Tris-HCl，50mmol/L NaCl，pH7.5)3ml中，超声破碎(500W，工作时间10s，间歇时间20s，破碎时间40～60min，在冰上进行)；4℃、10000r/min离心15min，留上清；上清用缓冲液3ml稀释一倍，并加入连二亚硫酸钠至终浓度2.5mg/ml；将经上处理过的样品分成两份，一份通CO 3min(l个气泡/s)；然后用紫外可见光分光光度计在400～500nm范围内分别对两份样品扫描，以未经CO处理的样品作对照，所得的曲线即为CO-差示光谱图。从图4中可以看到，重组菌与原始菌相比，在419nm处有明显的吸收峰，说明重组菌已成功表达出有生物活性的透明颤菌血红蛋白。

实施例3：基因工程菌的发酵实验

将原始菌株和实施例2得到的重组菌株分别接种在250ml含有YPD液体培养基50ml的三角瓶中，30℃过夜培养，摇床转速为220r/min。将培养好的种子培养基以2％的接种量接种于250ml含有发酵培养基100ml的三角瓶中，30℃培养28h，摇床转速为220r/min。发酵结束后，谷胱甘肽的含量采用Alloxan法(上海医学化验所.临床生化检验[M].上海科技出版利，1979，86-88.)进行测定。发酵结果表明：100ml的装液量对于250ml的三角瓶来说通气量不够，不能满足酵母在生长过程中对氧气的需求量。原始菌株在100ml发酵培养基中的产量为84mg/L，而重组菌的谷胱甘肽产量达到122.5mg/L。由此可知重组菌中谷胱甘肽的产量较原始菌高出45.8％，申请人将该菌株进行了保藏，分类命名为：酿酒酵母Saccharomycescerevisiae，于2012年02月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.5758。

此实验说明了，在低氧条件下，原始菌的生长代谢明显受到影响，而含有VHb基因的重组菌能够实现在较低溶氧水平条件下生产出较高产量的谷胱甘肽，解决了在大规模发酵生产过程中要求高溶氧的问题，为谷胱甘肽的大规模工业化生产提供了可行性。

需要注意的是，本发明的工程菌的构建方法是有成功率的，也就是说，利用本发明的构建方法所得到的重组工程菌，并非都能够使谷胱甘肽的产量得到明显提高，本发明的保藏的菌株，是发明人通过多次实验所得到的效果最好的重组工程菌，其谷胱甘肽产量达到122.5mg/L，远远高于其它通过同样的方法构建得到的工程菌。

Claims (1)

1.一株产谷胱甘肽的酵母工程菌，其特征在于：菌株名为101-V，分类命名为：酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，已于2012年02月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.5758。

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