CN102559519B - 一株产酯酵母及其生产乙酸乙酯和酒精的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种产酯酵母以及一种用该产酯酵母同时高产乙酸乙酯和酒精的方法，获得的斋酒酯香突出、舒适且酒体更丰满。这是一种工艺简单、成本低廉的白酒增香提产生产工艺，生产的斋酒质量及出酒率均高于日常生产斋酒。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵领域，具体涉及一株产酯酵母及其生产乙酸乙酯和酒精的方法。
背景技术
目前，国家对白酒产业政策进行调整，严禁在成品酒中添加香味成分以丰富酒体，鼓励酒厂通过发酵过程的调控来增加酒体香味成分，而酿酒工业，尤其是广大清香型、豉香型小曲和生料酿酒企业，由于技术落后，在发酵中很难提高酒中香味成分的含量。
小曲米酒中的呈香呈味物质含量较少，口味淡薄，与固态发酵酒相比丰满度及放香不足；采用生物技术方法提高斋酒的总酯、总酸、β-苯乙醇的含量，可提高小曲白酒的丰满度及放香，进而提高小曲白酒的质量，使生产的小曲白酒成为高档白酒。
选用产酯、酸、β-苯乙醇能力强的酵母菌种并设法应用于白酒生产工艺是提高白酒呈香呈味物质含量的有效途径之一。
发明内容
本发明的目的是提供一株产酯酵母JJJC-2。
本发明提供的产酯酵母JJJC-2是从酒曲中分离纯化获得的，产酯酵母JJJC-2(酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae JJJC-2)已于2011年9月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(其简称为CGMCC)，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No：5232。
产酯酵母JJJC-2、CGMCC No：5232为椭圆形，菌落扁平、无光泽、乳白色、边缘整齐。最适生长温度为28--32℃，最适生长pH为5.0-6.0.
本发明的另一目的是提供一种利用上述产酯酵母同时高产乙酸乙酯和酒精的方法。为实现这一目的，本发明采取以下设计方案：
一种同时生产乙酸乙酯和酒精的方法，包括以下步骤：
1)将产酯酵母JJJC-2接种于总还原糖浓度为80--400g/L，含10--50g/L乙醇和1-3g/L乙酸，1g/L磷酸二氢钾，pH为4.5-6.5的发酵培养基中，25--35℃条件下搅拌培养72-120小时。
2)将得到的发酵液与小曲米酒发酵成熟的醪液以1∶30的比例混合串蒸，使得斋酒(30％v/v)的乙酸乙酯达到3.0-3.2g/L，出酒率明显提高。
串蒸过程中，初蒸时汽压不得超过0.4Mpa，流酒时保持0.10-0.15Mpa，流酒温度应在30℃以下。
3)获得的斋酒(30％v/v)酯香突出、舒适且酒体更丰满。这是一种工艺简单、成本低廉的白酒增香增产生产工艺，生产的斋酒质量及出酒率均高于日常生产斋酒。
在上述过程中，所述菌种的量为2-20％(体积比)，指接种种子液的量占发酵培养基和种子液的体积(接种种子液与发酵培养基的体积比)，其中最优选的是5％。
斋酒可称为刚蒸馏出来的新酒。把刚蒸馏出来的新酒混匀，取100ml装入100ml量筒，用温度计测酒温，用酒度计测酒度，通过查换算表把测得的酒度换算成酒温20℃时的酒度，要求换算后新蒸馏出来的新酒的酒度为30％V/V，即要求一边蒸馏一边作在线测量。直至全部刚蒸馏出来的新酒的换算成酒温20℃时的酒度为30％V/V时，停止收酒。
所述培养基的还原糖为大米淀粉糖化液、大麦淀粉糖化液。
所述的发酵培养基的pH值为4.5-6.5，优选为5.5。
所述的发酵培养条件优选为28--32℃搅拌培养80小时。
为了使发酵的效果较好，所述接种的产酯酵母JJJC-2在接种之前，应将斜面培养的菌种活化，培养成液体菌种，液体菌种经过至少二级种子培养后，接种到发酵培养基中进行发酵培养。
所述的斜面菌种是将产酯酵母JJJC-2接种于总糖含量为20-120g/L的麦芽汁固体斜面上，在25--35℃条件下培养30-72小时后，放入4℃冰箱保存。
所述的液体菌种是将保存的产酯酵母JJJC-2菌种活化后，接种一环细胞于装有100毫升总糖含量为80-160g/L的麦芽汁或米曲汁液体培养基的三角瓶中，于25--35℃条件下搅拌培养16-22小时，即为液体菌种。
所述的至少二级液体种子培养是指：一级液体种子培养，是将液体菌种按5-15％的接种量，即培养基体积的5-15％，接入装有200毫升，总糖含量为80-160g/L的糖化液的三角瓶中，于25--35℃条件下搅拌培养16-22小时，即为一级液体种子培养物；所述二级液体种子培养，是将一级种子培养液按5-15％的接种量，即培养基体积的5-15％，接入装有300升，总糖含量为80-160g/L的糖化液的种子培养罐，在25--35℃条件下搅拌培养16-22小时，即为二级液体种子培养物。
本发明使用的发酵底物是普通的麦芽汁、大米淀粉糖化液，只需要调节其还原糖总含量，适当添加乙醇、乙酸、磷酸二氢钾，即可进行正常生产，方法简单，生产投资较少。
本发明的方法生产的乙酸乙酯和酒精与成熟发酵醪液串蒸后获得的斋酒，既提高了乙酸乙酯的含量又提高了出酒率，获得的斋酒的乙酸乙酯、总酯、乙酸、β-苯乙醇含量高，酯香突出、酒体更丰满。本发明的方法实用性强，操作简便，易于推广。由于一次发酵同时获得乙酸乙酯和酒精两个产品，所以投资少、见效快、效益高，具有很强的市场竞争力。
色谱检测方法：
气相色谱仪：Agilent 6890
色谱柱：HP19095F123(J&W Scientific)
内标：乙酸正戊酯，2-乙基正丁酸
GC-F1D条件：
HP-FFAP(30m长，0.53mm内径，1.0μm膜厚)
载气：高纯氮
分流模式：不分流
升温程序：35℃保持3.5min，再以10℃/min升温至110℃保持1min，然后以12℃/min升温至200℃保持3min。
检测器：300℃
进样口：250℃
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为本发明的限制。
实施例1
利用产酯酵母JJJC-2发酵生产乙酸乙酯和酒精，步骤如下：
1)斜面菌种：将产酯酵母JJJC-2菌种接种于含有总糖含量为60g/L的麦芽汁固体斜面上，在28℃条件下培养48小时后，放入4℃冰箱保存；
2)液体菌种：将保存的产酯酵母JJJC-2斜面菌种活化后，接一环细胞于装有100毫升，总糖含量为120g/L的麦芽汁液体培养基的三角瓶中，于30℃条件下搅拌培养20小时，即为液体菌种；
3)一级液体种子培养：将液体菌种按5％的接种量接入装有200毫升，总糖含量为120g/L的大米淀粉糖化液三角瓶中，于30℃条件下搅拌培养18小时，得到一级液体种子培养物；
4)二级液体种子培养：将一级种子培养液按5％的接种量接入装有300升，总糖含量为120g/L的大米淀粉糖化液种子罐，在30℃条件下搅拌培养18小时，得到二级液体种子培养物；
5)发酵培养基的制备：培养基是总还原糖浓度为200g/L的大米淀粉糖化液，添加20g/L乙醇、2g/L乙酸、1g/L磷酸二氢钾，培养基的pH为5.5。
6)发酵罐发酵：将二级种子培养液按5％的接种量接入装有1000升上一步配制的总糖含量为200g/L的大米淀粉糖化液培养基中，在30℃条件下搅拌培养80小时；
7)将得到的发酵液与小曲米酒发酵成熟的醪液以1∶30的比例混合串蒸，获得既提高了乙酸乙酯含量且提高了出酒率的(30％v/v)斋酒。试验对比数据如下表：
表1.与日常斋酒对比数据
| 样品名称 | 乙酸乙酯(g/L) | 总酯(g/L) | 乙酸(g/L) | 出酒量(L) |
| 日常斋酒 | 1.217 | 1.876 | 0.50 | 422 |
| 本发明斋酒 | 3.186 | 3.795 | 0.62 | 495 |
注：1.表中斋酒酒度均为30％v/v。2.表中数据为小曲米酒的斋酒数据。
2.日常斋酒是指发酵成熟的醪液直接蒸馏，与本发明斋酒的不同点只在于没有添加本发明生产的发酵液与其串蒸，蒸馏方法相同。
实施例2
利用产酯酵母JJJC-2发酵生产乙酸乙酯和酒精，步骤如下：
1)斜面JJJC-2在30℃条件下培养36小时后，放入4℃冰箱保存；
2)液体菌种：将保存的产酯酵母JJJC-2斜面菌种活化后，接一环细胞于装有100毫升，总糖含量为160g/L的麦芽汁液体培养基的三角瓶中，于30℃条件下搅拌培养20小时，即为液体菌种；
3)一级液体种子培养：将液体菌种按10％的接种量接入装有200毫升，总糖含量为160g/L的大米淀粉糖化液三角瓶中，于30℃条件下搅拌培养20小时，得到一级液体种子培养物；
4)二级液体种子培养：将一级种子培养液按10％的接种量接入装有300升，总糖含量为160g/L的大米淀粉糖化液种子罐，在30℃条件下搅拌培养20小时，得到二级液体种子培养物；
5)三级液体种子培养：将二级种子培养液按10％的接种量接入装有3000升，总糖含量为160g/L的大米淀粉糖化液种子罐，在30℃条件下搅拌培养20小时，得到三级液体种子培养物；
6)发酵培养基的制备：培养基是总还原糖浓度为300g/L的大米淀粉糖化液，添加30g/L乙醇、1g/L乙酸、1g/L磷酸二氢钾，培养基的pH为6.0。
7)发酵罐发酵：将三级种子培养液按15％的接种量接入装有1000升上一步配制的总糖含量为300g/L的大米淀粉糖化液培养基中，在30℃条件下搅拌培养72小时；
8)将得到的发酵液与小曲米酒发酵成熟的醪液以1∶30的比例混合串蒸，获得既提高了乙酸乙酯含量且提高了出酒率的(52％v/v)斋酒。试验对比数据如下表：
表2.与日常斋酒对比数据
注：1.表中斋酒酒度均为52％v/v。2.表中数据为小曲米酒的斋酒数据。
从上表数据可知，串蒸(52％v/v)斋酒的乙酸乙酯、总酯、乙酸、β-苯乙醇、出酒量与日常斋酒相比均得到明显提高。
实施例3
利用产酯酵母JJJC-2发酵生产乙酸乙酯和酒精，步骤如下：
1)斜面菌种：将产酯酵母JJJC-2菌种接种于含有总糖含量为20g/L的麦芽汁固体斜面上，在25℃条件下培养30小时后，放入4℃冰箱保存；
2)液体菌种：将保存的产酯酵母JJJC-2斜面菌种活化后，接一环细胞于装有100毫升，总糖含量为80g/L的麦芽汁液体培养基的三角瓶中，于25℃条件下搅拌培养16小时，即为液体菌种；
3)一级液体种子培养：将液体菌种按8％的接种量接入装有200毫升，总糖含量为80g/L的大麦淀粉糖化液三角瓶中，于25℃条件下搅拌培养16小时，得到一级液体种子培养物；
4)二级液体种子培养：将一级种子培养液按8％的接种量接入装有300升，总糖含量为80g/L％的大麦淀粉糖化液种子罐，在25℃条件下搅拌培养16小时，得到二级液体种子培养物；
5)发酵培养基的制备：培养基是总还原糖浓度为150g/L的大麦淀粉糖化液，添加1％乙醇、0.1％乙酸、0.1％磷酸二氢钾，培养基的pH为4.5。
6)发酵罐发酵：将二级种子培养液按10％的接种量接入装有1000升上一步配制的总糖含量为150g/L的大麦淀粉糖化液培养基中，在25条件下搅拌培养100小时；
7)将得到的发酵液与小曲米酒发酵成熟的醪液以1∶30的比例混合串蒸，获得既提高了乙酸乙酯含量且提高了出酒率的(30％v/v)斋酒。试验对比数据如下表：
表3.与日常斋酒对比数据
| 样品名称 | 乙酸乙酯(g/L) | 总酯(g/L) | 乙酸(g/L) | 出酒量(L) |
| 日常斋酒 | 1.217 | 1.876 | 0.50 | 422 |
| 串蒸斋酒 | 3.152 | 3.613 | 0.56 | 471 |
注：1.表中斋酒酒度均为30％v/v。2.表中数据为小曲米酒的斋酒数据。
实施例4
利用产酯酵母JJJC-2发酵生产乙酸乙酯和酒精，步骤如下：
1)斜面菌种：将产酯酵母JJJC-2菌种接种于含有总糖含量为100g/L的麦芽汁固体斜面上，在35℃条件下培养72小时后，放入4℃冰箱保存；
2)液体菌种：将保存的产酯酵母JJJC-2斜面菌种活化后，接一环细胞于装有100毫升，总糖含量为140g/L％的麦芽汁液体培养基的三角瓶中，于35℃条件下搅拌培养22小时，即为液体菌种；
3)一级液体种子培养：将液体菌种按15％的接种量接入装有200毫升，总糖含量为140g/L的大米淀粉糖化液三角瓶中，于35℃条件下搅拌培养22小时，得到一级液体种子培养物；
4)二级液体种子培养：将一级种子培养液按15％的接种量接入装有300升，总糖含量为140g/L的大米淀粉糖化液种子罐，在35℃条件下搅拌培养22小时，得到二级液体种子培养物；
5)三级液体种子培养：将二级种子培养液按15％的接种量接入装有3000升，总糖含量为140g/L的大米淀粉糖化液种子罐，在35℃条件下搅拌培养22小时，得到三级液体种子培养物；
6)发酵培养基的制备：培养基是总还原糖浓度为400g/L的大米淀粉糖化液，添加5％乙醇、0.3％乙酸、0.1％磷酸二氢钾，培养基的pH为6.5。
7)发酵罐发酵：将三级种子培养液按8％的接种量接入装有1000升上一步配制的总糖含量为400g/L的大米淀粉糖化液培养基中，在35℃条件下搅拌培养120小时；
8)将得到的发酵液与发酵成熟的醪液以1∶30的比例混合串蒸，获得既提高了乙酸乙酯含量且提高了出酒率的(52％v/v)斋酒。试验对比数据如下表：
表4.与日常斋酒对比数据
| 样品名称 | 乙酸乙酯(g/L) | 总酯(g/L) | 乙酸(g/L) | β-苯乙醇(mg/L) | 出酒量(L) |
| 日常斋酒 | 2.072 | 3.867 | 0.489 | 56.55 | 78 |
| 串蒸斋酒 | 4.522 | 6.017 | 0.561 | 67.75 | 84 |
注：1.表中斋酒酒度均为52％v/v。2.表中数据为小曲米酒的斋酒数据。
从上表数据可知，串蒸(52％v/v)斋酒的乙酸乙酯、总酯、乙酸、β-苯乙醇、出酒量与日常斋酒相比均得到明显提高。
实施例5
1.酒曲的原料、制作、成曲：
(1)原料配比：大米100公斤，大豆20公斤，饼泥20公斤，饼叶10公斤，曲母2公斤。
(2)蒸料、制坯、培曲：大米加水量为80％--85％，用蒸汽蒸煮至米饭熟度为75％--80％即可；大豆采用常压蒸煮16-20小时，务必熟透。将米饭冷却至36℃左右，加入经冷却的熟大豆后，再加入饼泥、饼叶、曲母混合拌匀。然后，装料入压曲机，由螺旋推进挤压成坯。曲坯呈方块状，规格为30cmX20cmX3cm，质量约0.5公斤。曲坯挂入曲房，保温保湿培养一周。
(3)成曲：培养一周后开蒸汽干燥一天，出房，放入饼仓贮存
2.试验酒曲的来源及取样：
(1)从饼仓随机抽取5吨酒饼，作试验备用饼，在饼仓中作标识，贮存备用。
(2)从这5吨酒饼中随机抽取40块酒饼，分别取饼边、饼心，混匀，粉碎后用四分法抽取约0.5公斤，作分离菌种用。
3.菌种分离纯化方法及筛选菌种的过程：
(1)培养基：
1)富集培养基：12Bx麦芽汁，灭菌后冷却备用。
2)分离、纯化培养基：12Bx麦芽汁，灭菌冷却后加入20g/L乙醇。
3)保存培养基：6Bx麦芽汁，灭菌后冷却备用。
4)12Bx麦芽汁，灭菌冷却后添加20g/L乙醇和2g/L乙酸。
(2)富集培养：称取酒曲样品10g，放入250ml三角瓶中，用90ml无菌水浸泡30min，用玻璃珠(要求直径为0.5cm、表面光滑)打散、澄清。取上清液1ml，用无菌水稀释10倍，取稀释液0.5ml接种于富集培养基中，30±1℃、120转/min摇床培养2天后，转接于另一富集培养基中培养2天，如此反复多次，选取菌体强壮的作为分离对象。
(3)分离培养：
取选取的富集试样1ml加入到9ml无菌水中，依次用10倍无菌水作系列稀释，稀释至10-8.取各稀释度的0.2ml样加入到固体培养基平皿中，30±1℃培养2天。
(4)纯化培养
选取不同菌落形态、菌体健壮的菌株转接于试管斜面培养基上，进一步对其纯化。再经反复多次分离、纯化，最后得到8株菌种，编号为JJJC-2，A-2，……A-8。分别贮存于6Bx麦芽汁斜面试管。
(5)筛选高酯化力菌株
1)酶液的制备：将待测菌株接入100ml酯化用液体培养基中，于30±1℃培养5天。
2)酯化酶活力测定
用酯化用液体培养基对分离得到的8种酵母以进行产酯能力对比试验，29～30℃摇床培养6天，取培养好的酯化培养液加入100ml自来水蒸馏再用色谱检测，筛选出一种产酯能力较高的酵母为JJJC-2酵母，试验结果见下表：
表5产酯能力表
| 菌株名称 | 乙酸乙酯(g/L) | 乙酸(g/L) | β-苯乙醇(mg/L) |
| JJJC-2 | 1.2168 | 1.6842 | 5.8 |
| JJJC-1 | 0.0671 | 0.0515 | 71.9 |
| JJJC-3 | 0.0070 | 0.0321 | 52.7 |
| JJJC-4 | 0.0055 | 0.5276 | 21.3 |
| JJJC-5 | 0.0135 | 0.0526 | 39.4 |
| JJJC-6 | 0.0055 | 0.6188 | 17.1 |
| JJJC-7 | 0.0146 | 0.0387 | 47.4 |
| JJJC--8 | 0.0090 | 0.5702 | 31.4 |
从上表数据可知，在8株菌的酯化力测定结果中，产酯性能最高的为JJJC-2。因此，可以初步确定JJJC-2为分离筛选的高产酯酵母。
试验例1
下面以本发明应用于小曲白酒酿酒实验，论述本发明及其使用方法和效果：
表6.试验设计方案
表7.试验斋酒对比数据
注：1.表中斋酒酒度均为30％v/v。2.表中数据为小曲米酒的斋酒数据。
从上表数据可知：采用新菌种、新工艺(试验4)生产的斋酒的乙酸乙酯、总酯、乙酸、出酒量与采用旧菌种、常规工艺(试验1)生产的斋酒相比均得到明显提高。采用新菌种、常规工艺(试验2)与试验1相比乙酸乙酯、总酯、乙酸都有所提高，但出酒率下降。采用旧菌种、新工艺(试验3)与试验1相比乙酸乙酯、总酯、乙酸、出酒率均有所提高，但与试验4相比，不及试验4的效果显著。
表8.实施例1的品评结果：(品评人数为8人)
经过品评，认为JJJC-2酵母串蒸酒的香气较舒适、回味悠长，适用于双蒸酒串香。
Claims (6)
1.产酯酵母JJJC-2(Saccharomyces cerevisiae)，其保藏号为CGMCC NO：5232。
2.一种利用权利要求1所述的产酯酵母生产乙酸乙酯和酒精的方法，具体包括以下步骤：菌种斜面培养，活化后培养成液体菌种，液体菌种经过至少二级液体种子培养后，接种到发酵培养基中进行发酵培养；所述的菌种斜面培养是指将产酯酵母JJJC-2菌种接种于总糖含量为20-120g/L的麦芽汁固体斜面上，在25-35℃条件下培养30-72小时后，放入4℃冰箱保存；所述的液体菌种是将保存的产酯酵母JJJC-2菌种活化后，接一环细胞于装有100毫升总糖含量为80-160g/L的麦芽汁或米曲汁液体培养基的三角瓶中，于25-35℃条件下搅拌培养16-22小时，即为液体菌种；所述至少二级液体种子培养是指：一级液体种子培养，是将液体菌种按5-15％的接种量，即培养基体积的5-15％，接入装有200毫升，总糖含量为80-160g/L的糖化液的三角瓶中，于25-35℃条件下搅拌培养16-22小时，即为一级液体种子培养物；所述二级液体种子培养，是将一级种子培养液按5-15％的接种量，即培养基体积的5-15％，接入装有300升，总糖含量为80-160g/L的糖化液的种子培养罐，在25-35℃条件下搅拌培养16-22小时，即为二级液体种子培养物；
所述发酵培养的步骤为：
1)将所述酵母JJJC-2接种于总还原糖浓度为150-400g/L，含10-50g/L乙醇和1-3g/L乙酸，1g/L磷酸二氢钾，pH为4.5-6.5的发酵培养基中，25-35℃条件下搅拌培养72-120小时；
2)将得到的发酵液与小曲米酒发酵成熟的醪液以1∶30的比例混合串蒸。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述所述发酵培养的步骤中，菌种的接种量为2％-20％，指接种种子液的量占发酵培养基和种子液的体积。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述菌种的接种量为5％。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述培养基的还原糖为大米淀粉糖化液或大麦淀粉糖化液。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述的发酵培养基的pH值为5.5。
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