CN102558305B

CN102558305B - 凝血酶直接抑制剂多肽水合盐及合成方法

Info

Publication number: CN102558305B
Application number: CN201110419630.9A
Authority: CN
Inventors: 范业梅; 梅世昌
Original assignee: Shenzhen Salubris Pharmaceuticals Co Ltd
Current assignee: Shenzhen Salubris Pharmaceuticals Co Ltd
Priority date: 2007-02-08
Filing date: 2008-02-13
Publication date: 2014-10-22
Anticipated expiration: 2028-02-13
Also published as: CN101538317A; CN102558305A; CN101538317B

Abstract

本发明涉及药品领域，是一种凝血酶直接抑制剂多肽水合盐及合成方法，解决了现有技术中没有凝血酶直接抑制剂多肽水合盐、相关类型化合物的合成方法以及后处理困难、对环境存在污染和对人体毒害比较大的问题，提供一种简单方便、有效的凝血酶直接抑制剂多肽水合盐，通式为C₉₈H₁₃₈N₂₄O₃₃·mX·nH₂O，及其合成方法；合成方法以单个氨基酸偶联或多肽片段的形式偶联，详细内容见说明书；本发明方法操作过程简单，反应条件稳定，重复性好，可采用合成仪自动合成，整个反应过程均在一个反应器中进行，从而避免了由于中间体的转移而使产物损失，大大节省了人力物力；反应过程所使用的试剂对环境污染小，对操作人员的健康危害小。

Description

凝血酶直接抑制剂多肽水合盐及合成方法

本申请是分案申请，其母案是申请日为2008年02月13日、申请号为CN200810008131.9、发明名称为“凝血酶直接抑制剂多肽水合盐及合成方法”的申请。

技术领域

本发明涉及药品领域，是凝血酶直接抑制剂的多肽水合盐及合成方法。

背景技术

凝血酶直接抑制剂的多肽部分已有相关的报道(美国专利号为5433940)，但对其水合盐类并没有提及。在实际合成过程中，如果产物最后的精制过程是以水合盐的形式存在，由于多肽水合盐易溶于水，且比较稳定，尤其是盐酸、醋酸盐和三氟醋酸盐在临床应用过程中，没有毒副作用，是多肽产物最佳存在形式，因此对该化合物水合盐类的研究是必要的。

相关类型化合物的合成方法国外有文献报道是利用叔丁氧羰基(t-Boc)氨基酸保护策略的固相合成方法(MaraganoreJM.，1989)，该方法的缺点是所使用的裂解剂是HF，由于它的强挥发性，对人体有强腐蚀性，对环境的破坏也很大，而且在化合物中引进了氟化物，在临床应用中需严格控制氟的含量，因此后处理很困难，加大了合成成本。

发明内容

本发明的一个目的是为解决上述现有技术中没有凝血酶直接抑制剂多肽水合盐、相关类型化合物合成方法处理困难、污染和毒性比较大的问题，提供一种可用于临床的凝血酶直接抑制剂多肽水合盐，以及一种简单、方便且对环境没有污染的凝血酶直接抑制剂多肽水合盐的合成方法。

为实现上述目的，本发明的一个技术方案提供了一种凝血酶直接抑制剂多肽水合盐：H-D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH，其多肽水合盐的通式为C₉₈H₁₃₈N₂₄O₃₃·mX·nH₂O。

X为醋酸、盐酸或三氟醋酸。

m的取值范围为1≤m≤4。

n的取值范围为2≤n≤12。

m的优选取值范围为2≤m≤3

n的优选取值范围为4≤n≤8。

本发明的另一个技术方案提供了一种凝血酶直接抑制剂多肽水合盐的合成方法，该方法为Fmoc保护氨基酸的多肽固相合成方法；合成过程包括单个氨基酸偶联和多肽片段偶联。

合成方法以单个氨基酸偶联或多肽片段的形式偶联：

1)根据Fmoc多肽固相合成方法合成多肽片段；

2)将这些不同片段偶联；

3)重复上述4、5和6步骤，直至得到产品。

合成方法为下述步骤：

1、C端第1个氨基酸Fmoc-Leu-Wang树脂的脱保护；

2、C端第2个氨基酸与Leu-Wang树脂的偶联；

3、C端第3-20个氨基酸的偶联；

4、最终产物20肽Fmoc保护的脱除；

5、脱除肽的侧链保护及肽从树脂上的裂解；

6、粗品的纯化；

原料选自合成所需的11种氨基酸：D-苯丙氨酸(D-Phe)、脯氨酸(Pro)、精氨酸(Arg)、甘氨酸(Gly)、天冬酰胺(Asn)、天冬氨酸(Asp)、苯丙氨酸(Phe)、谷氨酸(Glu)、异亮氨酸(Ile)、酪氨酸(Tyr)和亮氨酸(Leu)。

氨基酸的氨基端为没有保护和芴甲氧羰基(Fmoc)保护；氨基酸的羧基端为没有保护、苄酯(OBzl)保护、甲酯(OMe)保护或乙酯(OEt)保护中的任意一种或多种。

脱氨基保护的试剂为1-50％的哌啶/溶剂(体积比)，优选体积比15-25％的哌啶/溶剂；溶剂为N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷(DCM)或N-甲基吡咯烷酮(NMP)；最终产物从树脂上裂解的裂解剂为95％三氟醋酸(TFA)：2.5％Y：2.5％H₂O。

所述Y为三异丙基硅烷(TIS)、苯甲醚(Anisol)、苯甲硫醚；合成反应的活化剂为N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)、N，N’-二异丙基碳二酰亚胺(DIC)、苯并三氮唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)、O-(7-偶氮苯并三氮唑-1-氧)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、7-氮杂苯并唑-1-基-氧-(三-(二甲胺基)膦)六氟磷酸盐(BOP)、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷酸盐(PyPOP)中任意一种或多种，或者，上述活化剂中的一种或一种以上的物质和HOBt同时使用。

更进一步地说合成方法为下述步骤：

1、C端第1个氨基酸对-烷氧基苯甲醇(Fmoc-Leu-Wang)树脂的脱保护

(a)称取Fmoc-Leu-Wang树脂置于硅烷化的玻璃反应器中，每10mg树脂加DMF1-10ml，优选3-7ml，使树脂完全浸入其中，溶胀25-60min。

(b)抽滤掉DMF，在树脂中加入1-10ml浓度为1-50％哌啶/溶剂，优选3-7ml浓度为15-25％哌啶/溶剂，轻微震荡下反应3-10min，抽滤掉反应液后，再加入1-10ml浓度为1-50％哌啶/溶剂，优选3-7ml浓度为15-25％哌啶/溶剂，轻微震荡下反应10-20min，抽去反应液。

(c)用DMFx2、MeOHx2、DMFx2洗涤树脂，取出0.1mg树脂放入小玻璃试管中，加入茚三酮检测试剂各一滴，100-110℃下反应4-6min，溶液和树脂呈深兰色，说明脱除Fmoc完全。

2、C端第2个氨基酸与Leu-Wang树脂的偶联

反应式：

称取原料：Fmoc-Tyr(But)-OH：是树脂负载量的2-5倍。

DIC：是树脂负载量的2-5倍。

HOBt：是树脂负载量的2-5倍。

(a)将称取的Fmoc-Tyr(But)-OH和HOBt溶于1-10ml，优选3-7ml DMF中，加入到反应管中，然后加入DIC，室温下振荡反应30-60分钟。

(b)用DMFx2、MeOHx2、DMFx2洗涤树脂，取出0.1mg树脂放入小玻璃试管中，加入茚三酮检测试剂各一滴，100-110下反应4-6min，溶液和树脂均呈浅黄色，说明偶联反应完全。

3、C端第3-20个氨基酸的偶联

重复上述1、2步骤，完成了20个氨基酸的偶联反应。

3-20个氨基酸的称取量均为树脂负载量的2-5倍。

4、最终产物20肽Fmoc保护的脱除

(a)将上述20肽产物用DMFx2、MeOHx2、DMFx2洗涤树脂，向反应管中加入1-10ml浓度为1-50％哌啶/溶剂，优选3-7ml浓度为15-25％哌啶/溶剂，室温下轻轻振荡反应3-10min，抽去反应液，再加入1-10ml浓度为1-50％哌啶/溶剂，优选3-7ml浓度为15-25％哌啶/溶剂反应10-20min。

(b)用DMFx2、MeOHx2、DMFx2洗涤树脂后，取0.1mg树脂进行茚三酮检测，溶液和树脂呈深兰色，说明脱除Fmoc完全。

5、脱除肽的侧链保护及肽从树脂上的裂解

(g)将上述产物用DMFx2、MeOHx2、DCMx4洗涤后，在真空下抽空干燥30-60min。

(h)该产物中不含有Arg(Mtr)、Cys(Trt)、Met，故选择95％TFA∶2.5％H₂O∶2.5％Anisol(v∶v∶v)作为裂解剂。

(i)取出5-50mg干燥好的树脂，配制5-50ml裂解液，加入到反应管中，在室温下反应2-4个小时后，将反应液滤到10-100ml的离心管中，分别用少量TFA洗涤两次树脂，与滤液合并。

(j)滴加5-50ml预先冰浴的乙醚，这时有白色沉淀物析出，充分振荡，使裂解产生的副产物溶解在乙醚中，在冰浴中放置15-30mi n，然后离心，倾掉上层乙醚，再加入5-50ml冰浴的乙醚，使沉淀物充分悬浮，离心，反复5次。

(k)在室温下放置，挥发掉乙醚，得粗品。

(l)将粗品进行质谱分析，主峰的分子量与理论分子量一致，为目的产物。以此为裂解条件，配制5-50ml裂解液，加入到反应管中，室温下轻轻振荡反应2个小时，重复上述(c)-(e)操作，得到最终粗品。

反应式如下：

6、粗品的纯化

粗品的纯化是利用半制备的HPLC进行，制备柱选择C18填料，流动相A：0.1％TFA/H₂O(w/v)，B：0.1％TFA/CH₃CN(w/v)，检测波长为210-254nm，将粗品溶解后上柱，收集流份，将流份进行质谱和HPLC分析，产物的分子量与理论值一致，其纯度达到98％以上，减压蒸馏除去大部分乙腈，冷冻干燥后得到该多肽的水合三氟醋酸盐，最终产物的组成为C₉₈H₁₃₈N₂₄O₃₃·mX·nH₂O。

脱保护试剂为哌啶，脱保护反应2次，时间分别为5分钟、10分钟，洗涤后将加入氨基酸和活化剂，在室温或加热下反应，反应时间至少应40分钟，重复上述步骤，直至20个氨基酸反应完毕，然后加入裂解剂，在室温下将多肽从树脂上裂解下来，用乙醚萃取后，干燥，上柱纯化，流动相A为0.1％TFA/H₂O，B为0.1％TFA/CH₃CN，收集流份，冷冻干燥，获得该产物的三氟醋酸盐。

所述DMF、哌啶/溶剂等溶液均可过量，但过量部分在反应中不起任何作用。

有益效果

该合成方法的特点是①与不溶性高分子树脂键合的产物只需简单地反复过滤和洗涤就可以从可溶性的未反应物和副产物中分离出来；②整个反应过程均在一个反应器中进行，从而避免了由于中间体的转移而使产物损失；③由于固相合成的特点，可使反应试剂充分过量，获得高产率的产物；④试验操作过程简单，反应条件稳定，重复性好，可采用合成仪自动合成，大大节省了人力；⑤反应过程所使用的试剂对环境污染小，比t-Boc保护策略的固相合成方法对操作人员的健康危害小；⑥获得粗产物的纯度高，使纯化过程更为容易，相应的精产物收率和纯度高。

凝血酶直接抑制剂多肽水合盐，C₉₈H₁₃₈N₂₄O₃₃·mX·nH₂O；当该盐为醋酸、盐酸尤其是三氟醋酸时，易溶于水，产品的性能比较稳定有很好的保障；盐酸、醋酸盐尤其是三氟醋酸盐在临床应用过程中，毒副作用及其小，是多肽产物最佳存在形式。

本发明以Fmoc为保护策略的合成方法，其裂解剂是比较温和的三氟醋酸，与多肽形成了三氟醋酸盐，由于精制后的最终产物是三氟醋酸盐，因此后处理较简单。

说明书附图：

图1：产物质谱图；

图2：粗品HPLC谱图；

图3：粗品HPLC纯化自动流分收集结果；

图4：fc：3流分的纯度分析结果；

图5：fc：4流分的纯度分析结果；

图6：产物三氟醋酸测定HPLC谱图；

具体实施方式

下面结合实施例来进一步说明本发明，但并不作为对本发明的限定。

实施例1

单个氨基酸的偶联反应

1、C端第1个氨基酸Fmoc-Leu-Wang树脂的脱保护

称取Fmoc-Leu-Wang树脂5.0g，4.5mmol(负载量为0.9mmol/g，100-200目，DVB 1％)。

(a)将Fmoc-Leu-Wang树脂置于100ml硅烷化的玻璃反应器中，加50ml DMF，使树脂完全浸入其中，溶胀30min。

(b)抽滤掉DMF，在树脂中加入40ml 20％哌啶/DMF，轻微震荡下反应5分钟，抽滤掉反应液后，再加入40ml 20％哌啶/DMF，轻微震荡下反应15分钟，抽去反应液。

(c)用DMFx2、MeOHx2、DMFx2洗涤树脂，取出少许树脂放入小玻璃试管中，加入茚三酮检测试剂各一滴，105下反应5min，溶液和树脂呈深兰色，说明脱除Fmoc完全。

2、C端第2个氨基酸Leu-Wang树脂的偶联

反应式：

称取Fmoc-Tyr(But)-OH：5.17g(5.17/459.6＝11.25mmol)

DIC：1.753ml(11.25mmol)；HOBt：1.722g(11.25mmol)三种反应物均2.5倍于树脂负载量

(a)将称取的Fmoc-Tyr(But)-OH和HOBt溶于大约30ml DMF中，加入到反应管中，然后加入DIC，室温下振荡反应45分钟。

(b)用DMFx2、MeOHx2、DMFx2洗涤树脂，取出少许树脂放入小玻璃试管中，加入茚三酮检测试剂各一滴，105℃下反应5min，溶液和树脂均呈浅黄色，说明偶联反应完全。

3、C端第3-20个氨基酸的偶联

重复上述1、2步骤，完成了20个氨基酸的偶联反应。

3-20个氨基酸的称取量为：

Fmoc-Glu(OBut)-OH：4.79g

Fmoc-Pro-OH：3.80g

Fmoc-Ilu-OH：3.98g

Fmoc-Glu-OH：4.79g

Fmoc-Phe-OH：4.36g

Fmoc-Asp(OBut)-OH：4.63g

Fmoc-Gly-OH：3.34g

Fmoc-Asn-OH：6.71g

Fmoc-Gly-OH：3.34g

Fmoc-Pro-OH：3.80g

Fmoc-Arg(Pmc)-OH：7.46g

Fmoc-Pro-OH：3.80g

Fmoc-D-Phe-OH：4.36g

4、最终产物20肽Fmoc保护的脱除

(a)将上述20肽产物用DMFx2、MeOHx2、DMFx2洗涤树脂，向反应管中加入40ml 20％哌啶/DMF，室温下轻轻振荡反应5min，抽去反应液，再加入40ml 20％哌啶反应15min。

(b)用DMFx2、MeOHx2、DMFx2洗涤树脂后，取少量树脂进行茚三酮检测，溶液和树脂呈深兰色，说明脱除Fmoc完全。

5、脱除肽的侧链保护及肽从树脂上的裂解

(m)将上述产物用DMFx2、MeOHx2、DCMx4洗涤后，在真空下抽空干燥30min。

(n)该产物中不含有Arg(Mtr)、Cys(Trt)、Met，故选择95％TFA：2.5％H₂O：2.5％Anisol(v∶v∶v)作为裂解剂。

(o)取出约50mg干燥好的树脂，配制1ml裂解液，加入到反应管中，在室温下反应2个小时后，将反应液滤到10ml的离心管中，分别用少量TFA洗涤两次树脂，与滤液合并。

(p)滴加5ml预先冰浴的乙醚，这时有白色沉淀物析出，充分振荡，使裂解产生的副产物溶解在乙醚中，在冰浴中放置15min，然后离心，倾掉上层乙醚，再加入5ml冰浴的乙醚，使沉淀物充分悬浮，离心，反复5次。

(q)在室温下放置，挥发掉乙醚，得粗品。

(r)称取约1mg粗品，稀释为1mg/ml溶液，进行质谱分析，主峰的分子量与理论分子量一致，理论分子量为2180(见图1)，为目的产物。将该产物进行HPLC分析，粗品的纯度达到了74％(见图2)，这表明该方法合成的粗品纯度是很高的，反应条件易控，分析条件为ZorbaxC18柱，45x250mm，5μ，流动相A：0.1％TFA/H₂O(w/v)，B：0.1％TFA/CH₃CN(w/v)，流速1ml/min，检测波长为214nm。以此为裂解条件，配制50ml裂解液，加入到反应管中，室温下轻轻振荡反应2个小时，重复上述(c)-(e)操作，粗品称重7151.5mg，粗品收率＝7151.5mg/5x0.9x2180.29mg＝72.89％。

反应式如下：

6、粗品的纯化

粗品的纯化是利用Vydac C18，22x250mm，10μ，流动相A：0.1％TFA/H₂O(w/v)，B：0.1％TFA/CH₃CN(w/v)，流速10ml/min，检测波长为214nm。将粗品溶解后上柱，收集流份(见图3)，分别分析流份3、4、5，其纯度均达到98％以上(见图4、5)，将3个流份合并，减压蒸馏除去大部分乙腈，冷冻干燥32小时后得到该多肽的水合三氟醋酸盐。经质谱测定结果为(m/z)：2181.5(M+1)，HPLC方法测定TFA含量为9.6％(见图6)，由于该多肽有两个氨基，因此其理论TFA为2个，利用卡尔-费休氏滴定仪测定水分为5.1％，最终产物的组成为：C₉₈H₁₃₈N₂₄O₃₃·2TFA·7H₂O。

具体实施例2

1、C端第1个氨基酸Fmoc-Leu-Wang树脂的脱保护

(c)用DMFx2、MeOHx2、DMFx2洗涤树脂，取出少许树脂放入小玻璃试管中，加入茚三酮检测试剂各一滴，105℃下反应5min，溶液和树脂呈深兰色，说明脱除Fmoc完全。

2、C端第2个氨基酸Leu-Wang树脂的偶联

反应式：

称取Fmoc-Tyr(But)-OH：5.17g(5.17/459.6＝11.25mmol)

DIC：1.753ml(11.25mmol)；HOBt：1.722g(11.25mmol)三种反应物均5倍于树脂负载量

(a)将称取的Fmoc-Tyr(But)-OH和HOBt溶于大约30ml DMF中，加入到反应管中，然后加入DIC，室温下振荡反应30分钟。

(b)用DMFx2、MeOHx2、DMFx2洗涤树脂，取出少许树脂放入小玻璃试管中，加入茚三酮检测试剂各一滴，105下反应5min，溶液和树脂均呈浅黄色，说明偶联反应完全。

3、C端第3-20个氨基酸的偶联

重复上述1、2步骤，反应物均过量于树脂负载量5倍，且反应时间较实施例缩短为30min，完成了20个氨基酸的偶联反应。

3-20个氨基酸的称取量为：

Fmoc-Glu(OBut)-OH：4.79g Fmoc-Glu(OBut)-OH：4.79g

Fmoc-Pro-OH：3.80g Fmoc-Ilu-OH：3.98g

Fmoc-Glu-OH：4.79g Fmoc-Glu-OH：4.79g

Fmoc-Phe-OH：4.36g Fmoc-Asp(OBut)-OH：4.63g

Fmoc-Gly-OH：3.34g Fmoc-Asn-OH：6.71g

Fmoc-Gly-OH：3.34g Fmoc-Gly-OH：3.34g

Fmoc-Pro-OH：3.80g Fmoc-Arg(Pmc)-OH：7.46g

Fmoc-Pro-OH：3.80g Fmoc-D-Phe-OH：4.36g

4、最终产物20肽Fmoc保护的脱除

5、脱除肽的侧链保护及肽从树脂上的裂解

(s)将上述产物用DMFx2、MeOHx2、DCMx4洗涤后，在真空下抽空干燥30min。

(t)该产物中不含有Arg(Mtr)、Cys(Trt)、Met，故选择95％TFA∶2.5％H₂O∶2.5％Anisol(v∶v∶v)作为裂解剂。

(u)取出约50mg干燥好的树脂，配制1ml裂解液，加入到反应管中，在室温下反应2个小时后，将反应液滤到10ml的离心管中，分别用少量TFA洗涤两次树脂，与滤液合并。

(v)滴加5ml预先冰浴的乙醚，这时有白色沉淀物析出，充分振荡，使裂解产生的副产物溶解在乙醚中，在冰浴中放置15min，然后离心，倾掉上层乙醚，再加入5ml冰浴的乙醚，使沉淀物充分悬浮，离心，反复5次。

(w)在室温下放置，挥发掉乙醚，得粗品。

(x)称取约1mg粗品，稀释为1mg/ml溶液，进行质谱分析，主峰的分子量与理论分子量一致(见图1)，为目的产物。将该产物进行HPLC分析，粗品的纯度达到了74％(见图2)，分析条件为ZorbaxC18柱，45x250mm，5μ，流动相A：0.1％TFA/H₂O(w/v)，B：0.1％TFA/CH₃CN(w/v)，流速1ml/min，检测波长为214nm。以此为裂解条件，配制50ml裂解液，加入到反应管中，室温下轻轻振荡反应2个小时，重复上述(c)-(e)操作，粗品称重7151.5mg，粗品收率＝7151.5mg/5x0.9x2180.29mg＝72.89％。

反应式如下：

6、粗品的纯化

粗品的纯化是利用Vydac C18，22x250mm，10μ，流动相A：0.1％TFA/H₂O(w/v)，B：0.1％TFA/CH₃CN(w/v)，流速10ml/mi n，检测波长为214nm。将粗品溶解后上柱，收集流份，分别分析流份3、4、5，其纯度均达到98％以上，将3个流份合并，减压蒸馏除去大部分乙腈，冷冻干燥32小时后得到该多肽的水合三氟醋酸盐。经质谱测定结果为(m/z)：2181.5(M+1)，HPLC方法测定TFA含量为9.6％，利用卡尔-费休氏滴定仪测定水分为5.1％，最终产物的组成为：C₉₈H₁₃₈N₂₄O₃₃·2TFA·7H₂O。

具体实施例3

两个多肽片断的偶联反应

1、C端1-10个氨基酸的偶联：

(1)C端第1个氨基酸的脱保护

(2)C端第2个氨基酸与Leu-Wang树脂的偶联

反应式：

称取原料：Fmoc-Tyr(But)-OH：5.17g(5.17/459.6＝11.25mmol)

DIC：1.753ml(11.25mmol)；HOBt：1.722g(11.25mmol)；三种反应物均2.5倍于树脂负载量

(a)将称取的Fmoc-Tyr(But)-OH和HOBt溶于大约30ml DMF中，加入到反应管中，然后加DIG，室温下振荡反应45分钟。

(3)C端第3-10个氨基酸的偶联

重复上述(1)、(2)步骤，完成了C端3-10个氨基酸的偶联反应。按实施例1的裂解和纯化方法获得了C端1-10个氨基酸的多肽片断，序列为H-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH。

2、C端第11个到20个氨基酸的偶联：

(1)C端第11个氨基酸的脱保护

称取Fmoc-Gly-Wang树脂5.0g，4.5mmol(负载量为0.9mmol/g，100-200目，DVB 1％)。

(a)将Fmoc-Gly-Wang树脂置于100ml硅烷化的玻璃反应器中，加50mlDMF，使树脂完全浸入其中，溶胀30min。

(2)C端第12个氨基酸Fmoc-Asn-OH与Gly-Wang树脂的偶联

反应式：

称取Fmoc-Asn-OH：6.71g(3.34/596.5＝11.25mmol)

(a)将称取的Fmoc-Asn-OH和HOBt溶于大约30ml DMF中，加入到反应管中，然后加入DIC，室温下振荡反应45分钟。

(3)C端第13-20个氨基酸的偶联

重复上述(1)、(2)步骤，完成了C端13-20个氨基酸的偶联反应。按实施例1的裂解和纯化方法获得了C端11-20个氨基酸的多肽片断，序列为H-D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-OH。将获得的两个多肽片断溶解在40ml DMF中，加HOBt和DIC，在室温下反应1个小时，用乙醚萃取，获得该化合物的粗品，然后上柱纯化，其纯化条件及方法同实施例1，该产物的组成为C₉₈H₁₃₈N₂₄O₃₃·2.5TFA·7.2H₂O。

具体实施例4

化学反应部分同实施例1，为了该化合物更稳定，需控制该多肽水合盐中TFA的含量，在纯化方法上进行了改变，将上述方法获得的精品，重新溶解后上柱，流动相A为纯水，流动相B为乙腈，柱子为Vydac C18，22x250mm，10μ，流速10ml/min，检测波长为214nm，先用A相冲洗20分钟，然后以25％的B相将多肽洗脱下来，减压蒸馏除去大部分乙腈，冷冻干燥32小时后得到该多肽的水合三氟醋酸盐，HPLC方法测定TFA含量为3.7％，最终产物的组成为：C₉₈H₁₃₈N₂₄O₃₃·0.77TFA·6.18H₂O。

具体实施例5

在不同冻干真空度下该多肽水合盐水分含量是不同的，在真空度分别为0、50、100、200mTorr下，冻干时间为32小时，该多肽水合盐的含水量分别为2.3％、3.8％、4.2％和6.9％，获得了水分不同的多肽水合盐。

具体实施例6

水合盐酸盐的制备

将获得的多肽水合三氟醋酸盐充分搅拌溶于0.1M的HCl中，在室温下放置30分钟，放入-80℃冰箱冷冻，然后真空干燥，获得该产物的水合盐酸盐，产物组成为C₉₈H₁₃₈N₂₄O₃₃·2.7HCl·6.5H₂O。

实施例7

水合醋酸盐的制备

利用阴离子交换树脂装柱，用1M的醋酸钠溶液洗涤柱子，然后用蒸馏水将多余的醋酸钠冲洗干净，将上述多肽水合三氟醋酸盐用水溶解后上柱，用蒸馏水洗脱出来，收集馏份后冷冻干燥，获得该产物的水合醋酸盐，产物组成为C₉₈H₁₃₈N₂₄O₃₃·3.1CH₃COOH·6.8H₂O。

实施例8-16

由实施例2的方法制备的C₉₈H₁₃₈N₂₄O₃₃·mX·nH₂O；

其中X，m，n的数值如下表所示：

Claims

1.凝血酶直接抑制剂多肽水合盐，其特征在于，多肽水合盐为C₉₈H₁₃₈N₂₄O₃₃·mX·nH₂O；凝血酶直接抑制剂为H-D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH的多肽水合盐；

X为三氟醋酸，m的取值范围为2≤m≤4，n的取值范围为4≤n≤8。

2.根据权利要求1所述的凝血酶直接抑制剂多肽水合盐，其特征在于，m的取值范围为2≤m≤3。

3.凝血酶直接抑制剂多肽水合盐，其特征在于，多肽水合盐为C₉₈H₁₃₈N₂₄O₃₃·mX·nH₂O；凝血酶直接抑制剂为H-D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH的多肽水合盐；

X为三氟醋酸；

当m＝2时，n＝3；或者当m＝2时，n＝6；或者当m＝2时，n＝7；或者当m＝2.5时，n＝7.2；或者当m＝3时，n＝8；或者当m＝4时，n＝4。

4.根据权利要求1-2任一权利要求所述的凝血酶直接抑制剂多肽水合盐，其特征在于，该多肽水合盐纯度≥98％。