CN102552437B - 治疗艾滋病的中药组合物及其制备 - Google Patents

Abstract

本发明目的在于提供一种中药组合物及其制备方法。该组合物能有效治疗艾滋病，抑制艾滋病毒(HIV)的复制，同时能够增加CD₄ ⁺细胞的数量。涉及的中药组合物组方及配比如下：处方总量按100份计，其中连翘45～55份，虎杖27～33份，白芍9～11份，淫羊藿9～11份。

Description

治疗艾滋病的中药组合物及其制备

技术领域

本发明属于中药组合物、制备方法以及用途的技术领域。尤其涉及应用于治疗艾滋病、抑制HIV病毒复制和增加CD₄ ⁺细胞数量，及其制备方法。

背景技术

自1981年发现第一例艾滋病(AIDS)患者以来，三十年来艾滋病一直严重威胁着人类的生命健康，因而引起了全世界各国的极大关注。在我国，艾滋病防治形势十分严峻。其流行经历了传染期、扩散期，目前已开始进入快速增长期，疫情蔓延之势不断扩大，疫情从高危人群向一般人群传播，发病和死亡数量日益增多严重，截至2010年我国现存艾滋病毒感染者和病人约74万人，在亚洲居第二位。其中性传播途径占第一位，高达75％。

目前在药物治疗艾滋病的领域中，HAART(高效抗逆转录病毒疗法)的临床疗效得到了肯定。十多年来，HAART以其良好的抑制病毒效果，被作为治疗艾滋病的最主要手段在全世界范围内广泛应用。但是，HAART疗法虽能在体内很快降低HIV的载量，甚至可以做到测不出病毒，但该疗法尚不能彻底清除患者体内的HIV。有的病人HAART治疗可以测不到HIV病毒，但CD₄ ⁺细胞不上升，最终死亡，而中药有利于提高CD₄ ⁺细胞数。目前在用的药物多具有较大的毒副作用，造成患者服药的依从性差。加上由于HIV-1极易发生突变，病毒产生耐药性，从而导致药物失效。另外HAART中所用药物多价格昂贵，多数患者无力承担。以上众多现状成为HAART面临的主要问题和抗病毒治疗失败的主要原因。因此不断寻找新的HIV/AIDS药物，刻不容缓。

当前国际上有30余种抗病毒药物，而我国仅有6种一线治疗药物，而且其中没有包括蛋白酶抑制剂。而二线治疗药物则全部依靠进口，价格比一线药高6～7倍。而对于治疗失败的患者，如果不能早期更换二线药物，则将使患者病情更严重，甚至导致死亡。因此加速国产抗HIV创新药物包括中药和西药新药的开发，迫不及待。

发明内容

中医中药是祖国伟大的宝库，自古以来为我国人民的健康做出了巨大的贡献。上世纪七十年代初，我国从中药青蒿中发现的青蒿素是当今国际上治疗疟疾最有效的药物。本专利的发明人之一李泽琳教授就是参与青蒿素的研发的主要成员。

本发明目的在于提供一种中药组合物，能有效抑制HIV-1的复制，增加CD₄ ⁺细胞的数量，以及增强免疫功能。为实现此目的，本发明设计了中药组合物组方及配比如下：

【处方】：总处方量以100份计

连翘45～55份，虎杖27～33份，白芍9～11份，淫羊藿9～11份

【药物特性】

1、连翘：清热解毒、消痈散结。具有抗菌、抗病毒、抗肝损伤等作用。

2、虎杖：活血祛瘀、清热、利湿。具有抗菌、抗病毒、抗癌、升高白细胞等作用。

3、白芍：养血和营，敛阴平肝。具有镇痛、镇静、调节免疫功能，抗菌，保肝等作用。

4、淫羊藿：补肾强筋，祛风除湿。具有增强非特异免疫功能作用，调节体液免疫和细胞免疫的作用，亦具抗病原体，抗炎作用。

【制备方法】

(1)按照上述处方量称取四味药材，分别粉碎，混合，加适量乙醇浸渍后渗漉，收集渗漉液。

(2)渗漉液放置，滤过，滤液减压浓缩干燥。

(3)浓缩液稀释得口服液；浓缩液干燥成粉装胶囊；干粉制颗粒成颗粒剂；干粉与适当辅料混合压片成片剂。

附图说明

附图为本发明提供的中药组合物的制备方法流程图。处方量的药材经渗漉提取得到提取液，或提取液干燥成提取物粉末，与药学可接受辅料适当混合制成口服液、片剂、胶囊剂和颗粒剂。

具体实施方式

实施例1、中药组合物的组成和配比。

【处方】：按100份计

连翘45～55份，虎杖27～33份，白芍9～11份，淫羊藿9～11份。

实施例2、中药组合物的制备工艺流程：见附图1。

本发明的中药组合物可与药学上可接受的载体，例如：填充剂如淀粉、微晶纤维素等；粘合剂如维生素衍生物、淀粉；崩解剂如羧甲基纤维素、羧甲基淀粉钠等；通过口服液、颗粒剂、胶囊剂、片剂口服给药方式应用。

按照实施例1中的处方量称取4味药材，分别粉碎，混合后加入3～6倍量体积的40～70％乙醇浸渍6～10h，参照《中国药典》2010版附录流浸膏剂与浸膏剂项下的渗漉法(附录I O)以每Kg药材2～5mL/min的速度缓缓渗漉，收集处方量9～14倍(Kg/L)量的渗漉液(即投料1Kg药材则收集9～14升渗漉液)。渗漉液放置，普通医用纱布过滤除去粗滤渣，减压旋转蒸发浓缩至相对密度为1.11-1.14(50℃)，或继续喷雾干燥成粉或65℃减压烘干成粉。浓缩液按照1Kg处方量稀释得1000mL药液稀释得口服液(即每mL口服液含生药1g)；干燥粉末用60～80％乙醇湿法制粒，干燥后，按每袋4～5g装袋即得颗粒剂；亦可干燥粉末以60～80％乙醇湿法制粒，按照每粒0.47g装入空胶囊得胶囊剂；或每400g干燥粉末加淀粉50g，羧甲基淀粉钠5g，为辅料混匀制颗粒后压片，包衣即得片剂。

以下实施实例中用到的是本发明提供的中药组合物颗粒剂。

实施例2、中药组合物体外能明显抑制HIV-1病毒的复制

试验采用了MT4、Hela-CD4-LTR-β-gal及H9共三种细胞株，分别被HIV-1感染，加入本组合物颗粒溶液，观察其对病毒复制的抑制作用。

方法1：HIV-1 NL4.3株感染的MT4细胞

HIV-1 NL4.3病毒株(本实验室保存，参见：两种HIV非核苷类逆转录酶抑制剂耐药病毒株的体外选择和鉴定，刘思扬等，药学学报，2010，45(2)：241-246)，为单一生活周期报告病毒模型(Single life-cycle reporter virus)，由HIV质粒克隆表达、转染而得。细胞实验在96孔培养板中进行，于接种MT4细胞(本实验室保存，参见：APOBEC3G对HIV-1及其Vif缺失株的抑制作用，李岚等，首都医科大学学报，2011，32(2)：177～181)的各孔加入100μL四倍比稀释浓度的药液，自最大无毒剂量(19.1mg/mL)起依次四倍比稀释5个浓度，即4.8mg/mL、1.2mg/mL、298μg/mL、74μg/mL、19μg/mL，每个浓度至少设两个复孔，37℃，5％CO₂培养箱备用。另以离心管取新鲜培养的MT4细胞5×10⁶cells，离心去上清，加HIV-1 NL4.3病毒1×10⁴TCID₅₀/mL，混匀，37℃，5％CO₂培养箱中培养，两小时后离心，弃去上清，再用RPMI 1640培养基洗一次，去除游离的病毒，加含20％血清的培养基到总体积为10mL。于加有药液的96孔板，每孔中加入此感染HIV-1的细胞悬液100μL，并设细胞对照、病毒对照及AZT(阳性治疗药物)对照孔，37℃，5％CO₂培养箱中培养。第三天换药，从每孔中吸出100μL上清，加入100μL与本孔相同浓度的新鲜药液，细胞及病毒对照组加入100μL培养基。继续培养至第六天，各孔取上清样品待测，采用市售瑞典Microelisa试剂盒，按其要求做标准曲线，测定P24抗原量(pg/mL)，所测P24抗原量按下列公式计算抑制率。

计算抑制率及半数抑制浓度IC₅₀，结果IC₅₀＝102μg/mL。

方法2、HIV-1 BH10wt感染的H9细胞

需要说明的是，此方法与方法1使用的病毒株不同，是因为基于两种不同细胞株和两种不同病毒株的抗HIV活性实验所针对的病毒对细胞的感染阶段的不同，HIV-1 NL4.3感染MT4细胞是在急性感染期发挥作用，而后者是慢性感染毒株。而且抗病毒活性实验要求是需要用不同细胞株和不同病毒株对样品活性进行反复验证的，故此处病毒株的不同是试验方法的需要，也从另一角度表明了本发明要保护的组方对病毒感染的不同阶段都有抑制作用。

H9细胞(本实验室保存，参见：APOBEC3G对HIV-1及其Vif缺失株的抑制作用，李岚等，首都医科大学学报，2011，32(2)：177～181)中加入含有HIV-1 BH10wt病毒株(本实验室保存，参见：APOBEC3G对HIV-1及其Vif缺失株的抑制作用，李岚等，首都医科大学学报，2011，32(2)：177～181)的RPMI 1640培养液，37℃，5％CO₂孵箱孵育2h。离心，洗涤铺96孔板，自最大无毒剂量(19.1mg/mL)起依次四倍比稀释5个浓度，即4.8mg/mL、1.2mg/mL、298μg/mL、74μg/mL、19μg/mL，，每个浓度4个复孔，同时设立病毒对照组、细胞对照组。于37℃，5％CO₂孵箱培养，3天更换药液。第5天，收获培养上清，以测定各孔P24抗原含量。将给药组与病毒对照组进行比较，计算药物的抑制率，公式同方法1中所述。最并计算IC₅₀。

结果显示本中药组合物在H9细胞体外试验中对HIV-1 BH10wt具有较明显的抑制作用。IC₅₀＝124μg/mL。

方法3：HIV-1 NL4.3感染的Hela-CD4-LTR-β-gal细胞试验(MAGI TEST)

所用HIV-1 NL4.3病毒同方法1。以4×10⁴cells/0.25mL/孔的浓度将Hela-CD4-LTR-β-gal细胞(本实验室保存，参见：APOBEC3G对HIV-1及其Vif缺失株的抑制作用，李岚等，首都医科大学学报2011，32(2)：177～181)接种于24孔板，放置于37℃，5％CO₂培养箱中24h，使之吸附，贴壁。第二天，吸去各孔中上清，加100μL四倍比稀释浓度的药液(单味药物60％乙醇提取物)，选用自白芍和淫羊藿的最大无毒剂量19.2mg/mL和4.8mg/mL开始四倍比稀释5个浓度，分别为白芍：4.8mg/mL、1.2mg/mL、300μg/mL、75μg/mL和18.8μg/mL，淫羊藿：1.2mg/mL、300μg/mL、75μg/mL、18.8μg/mL和4.7μg/mL。每个浓度至少设两个复孔。加入孔前，每100μL药液内加入定量HIV-1 NL4.3使病毒对照孔产生蓝斑数在200个为宜，空白对照孔加入培基(Mock)，37℃，5％CO₂培养两小时后，各孔再加入200μL相同药液或培基，培养48h后，各孔吸去上清加入固定液1mL再以K₄[Fe(CN)₆]·3H₂O，K₃[Fe(CN)₆]及X-gal染色，病毒颗粒被染成蓝色。用Elaspot扫描计数每孔蓝色病毒颗粒，按如下公式计算抑制率，再计算IC₅₀。

本组方中的两味药在体外MAGI TEST试验中对HIV-1具有较明显的抑制作用，IC₅₀分别为白芍：39.2μg/mL，淫羊藿：262.2μg/mL。

结论：三种方法的体外药效学实验结果均不同程度的表明本中药组合物在体外能够明显抑制HIV-1在细胞内的复制。其中MT4细胞方法由以下公式得出治疗指数为188，表明该药物抑制病毒复制的效果明显且毒性小。

实施例3、中药组合物能明显抑制恒河猴体内SIV病毒复制

用SIVmac251感染恒河猴，SIV病毒感染后两周后起，动物均有浅表淋巴结进行性肿大，表明动物在临床上感染成功。实验分为4个组：本组合物低剂量组、本组合物高剂量组、AZT阳性药物治疗组和SIVmac251感染对照组。其中组合物低剂量组和高剂量组动物在病毒感染前10天开始给药，给药方式为颗粒水溶液灌胃给药，剂量分别为低剂量组每动物每日口服给药一次，一次0.6g，连续给药70天；高剂量组每动物每日口服给药一次，一次1.8g，连续给药40天；AZT阳性药物对照组动物在病毒感染后30min开始给药，每动物每日口服给药一次，每次100mg，连续给药60天；SIVmac251感染对照组不给药治疗。感染后每7天取血，从血浆中分离SIV病毒，测定病毒滴度。结果表明，给药组第3～4周血浆中病毒载量明显低于感染对照组，详见下表：

表1.感染SIVmac251的恒河猴组合物给药后血浆病毒滴度(TCID/mL)

结果表明，本中药组合物能够明显抑制感染SIVmac251的恒河猴体内病毒的复制，而且有明显的效剂关系。

实验过程中本组合物治疗组和AZT治疗组动物均未发生严重的感染并发症和死亡。

此实验结果表明本中药组合物在对SIV感染的恒河猴给药后能够有效降低感染动物体内SIV病毒载量，并且在给药过程中动物没有发生感染，证明该组合物在抑制SIV病毒复制过程中具有充分的安全性和有效性。

实施例4、中药组合物能明显增加恒河猴体内CD₄ ⁺淋巴细胞数

实验动物分组，感染及给药过程同实施例4。取血测定血液中CD₄ ⁺淋巴细胞数。感染对照组动物血液CD₄ ⁺淋巴细胞数，在感染SIV病毒后至感染病毒后4周期间有一个急剧的降低过程，4周以后逐渐稳定在一低水平上；本组合物治疗组与感染对照组比较，4周期间CD₄ ⁺淋巴细胞下降速度较慢，其数值比感染对照组高200～300，甚至比AZT治疗组细胞数还高，第4周高达150。由于病毒血症平均水平较低，所以降低了SIV感染所造成的细胞免疫损害。详见下表：

表2.恒河猴体内药效学实验CD₄ ⁺淋巴细胞FACS计数平均值(10⁶/L)

结果表明，本中药组合物能明显增高感染SIVmac251的恒河猴体内CD₄ ⁺淋巴细胞的数量，有助于提高感染动物的抵抗力。

本中药组合物经过在小鼠体内的急性毒性实验和大鼠长期毒性实验，结果以40g/Kg/d剂量给药的急毒实验动物无一例死亡，一切活动正常，体重增长与对照组动物比较无显著差异。最大以26.4g/Kg/d剂量给药的大鼠的长期毒性实验结果，实验动物一般指标5项、血液学指标16项、以及血液生化指标10项变化均在正常范围内，心电图检查结果正常，病理镜检结果显示各脏器无器质性改变。综合以上结果，本组合物体内给药未见明显毒性反应。

本中药组合物具有抑制HIV(SIV)病毒复制的功效，又有增加免疫力提高CD₄ ⁺细胞数量的作用。本组方中的各种成分分别作用于不同的靶点，包括阻止病毒进入，抑制逆转录酶和整合酶，各组分间发挥协同作用，因此既可以单独给艾滋病人或HIV感染者使用，又可以与HAART药物联合使用。

Claims (8)

1.一种治疗艾滋病的药物组合物，其原料药组成及配比如下：原料药总量按100份计，其中连翘45～55份，虎杖27～33份，白芍9～11份，淫羊藿9～11份。

2.根据权利要求1所述的中药组合物，其特征在于所述的药物组合物是口服液、颗粒剂、胶囊剂或片剂。

3.根据权利要求1或2所述的中药组合物的制备方法，其特征在于所述制备方法是：

（1）按照权利要求1所述的处方量称取四味药材分别粉碎，混合，加适量乙醇浸泡后渗漉，收集渗漉液；

（2）渗漉液放置后滤过，滤渣弃去，滤液减压浓缩，干燥；

（3）浓缩液稀释得口服液；浓缩液干燥成粉，湿法制粒成颗粒剂；干粉制粒装胶囊成胶囊，或干粉制粒压片成片剂。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述的乙醇为40～70%的乙醇。

5.根据权利要求1或2所述的药物组合物，在制备具有抑制HIV病毒复制的药物中的用途。

6.根据权利要求1或2所述的药物组合物，在制备具有增加CD4⁺细胞数量作用的药物中的用途。

7.根据权利要求1或2所述的药物组合物，在制备治疗艾滋病人或艾滋病带毒者的药物中的用途。

8.根据权利要求1或2所述的药物组合物，在制备既可以单独给药，又可以与HAART药物联合应用治疗艾滋病的药物中的用途。

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