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CN102549017A - 抗-EpCAM抗体 - Google Patents

抗-EpCAM抗体 Download PDF

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CN102549017A
CN102549017A CN2010800351667A CN201080035166A CN102549017A CN 102549017 A CN102549017 A CN 102549017A CN 2010800351667 A CN2010800351667 A CN 2010800351667A CN 201080035166 A CN201080035166 A CN 201080035166A CN 102549017 A CN102549017 A CN 102549017A
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antibody
seq
sequence
epcam
amino acid
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CN2010800351667A
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拉维尼娅·黛安娜·奇科尔塔什·贡纳松
迪德里克·派于斯
燕妮·玛加丽塔·卡尔松
雷姆科·阿尔贝特·格里普
谢尔盖·米哈伊洛维奇·基普里亚诺夫
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Original Assignee
Affitech Research AS
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Abstract

本发明披露了能与上皮细胞粘附分子(Ep CAM)结合的抗体，与已知的结合Ep CAM的抗体相比，表现出一定的优势，例如，本发明的抗体表现出良好的亲和力，良好的交叉反应性谱和出色的ADCC和CDCC活性。本发明披露了含有特殊重链和轻链CDRs的抗体。本发明因此涉及到这些抗体和它们的所有用途，特别是在治疗癌症上的用途。本发明因此提供了用于治疗癌症的基于新抗体的组合物、方法和结合方案。本发明同样提供了采用新的抗-Ep CAM抗体的优选的免疫偶联物组合物和方法。

Description

抗-EpCAM抗体
技术领域
本发明涉及与上皮细胞粘附分子(EpCAM)结合的结合蛋白以及它的所有用途。特别的，本发明涉及与EpCAM结合的抗体或抗体片段及其用途方法，包括癌症治疗。
背景技术
在2000年，全世界约2200万人患有癌症，620万人死于该类疾病。每年会多出1000万新患者，并且这一数值在未来15年内会增长50％(WHO，World Cancer Report.BernardW.Stewart和Paul Kleihues，编辑IARC Press，Lyon，2003)。由癌症导致的死亡占全部人类死亡的13％。根据美国癌症协会的数据，在2007年，全世界有760万人死于癌症。
目前最常见的癌症治疗措施一般限于创伤手术，放射疗法和化学疗法，这些治疗措施会导致潜在的严重副作用，非特异性毒性和/或对患者身体形象和/或生命质量带来损伤性变化。癌症可对化学疗法产生耐受，从而降低了进一步治疗的可能以及成功的概率。某些癌症具有相对较高的治疗成功率，如乳腺癌，但也具有非常高的发病率，因此，仍是主要的杀手。
还有很多种癌症的实例，现在的治疗措施由于缺乏疗效和/或因为较高的发病率和严重的副作用而无法达到患者的需求。因此，对于具有较高安全性和疗效的癌症治疗措施，仍然存在明确的需求。
多种现行癌症治疗措施存在不足，其中一个原因在于，对于受影响的组织和细胞，这些治疗措施缺乏选择性。外科切除术总会涉及切除明显正常的组织作为“安全界限”，因为该处能够增加发病率和并发症的风险。手术中也总会切除一些可能散布有肿瘤细胞的健康组织，这有可能维持或者重建受影响的器官或组织的功能。放射疗法和化学疗法由于它们非特异性的作用方式会杀死或损坏很多正常细胞。这会带来严重的副作用，如严重的恶心，体重下降，精力减少，脱发等等，也会增加在以后的生命中获得继发性癌症的风险。对于癌细胞具有更高选择性的治疗方法可使正常细胞不受损害，如此便可改善结果，副作用范围和生命质量。
采用对只在或大部分在癌细胞上出现，或在癌细胞上表达水平更高，或在癌细胞上过表达的分子特异的抗体，可提高癌症治疗的选择性。因此，免疫治疗方法，如对多种疾病，包括癌症采用抗体疗法，是目前研究和发展非常活跃的领域，并且在取得成功治疗效果方面显示了良好的前景。这种抗体可用于调节免疫系统，并通过患者自身的免疫系统而提高对癌的识别和杀伤。
到目前为止，大多数试验的抗体，以鼠源单克隆抗体，有时是通过分子工程学的“人源”的形式而针对已知的癌症标记物。不幸的是，这些抗体为鼠源蛋白，会被患者的免疫系统识别为外源蛋白。继而发生的免疫反应和抗体反应会导致效力损失或副作用。
EpCAM(CD326)也可称之为EGP-2、17-1A、HEA125、MK-1、GA733-2、EGP34、KSA、TROP-1、ESA、TACSTD1和KS1/4，属于最先被鉴定的肿瘤相关抗原之一。EpCAM抗原的特殊之处在于，它并不属于任何主要的粘附分子家族，如钙粘蛋白，选择蛋白或整合蛋白的一员。它属于I型膜蛋白，314个氨基酸(aa)中只有26个氨基酸在细胞质侧。EpCAM被认为是作为亲同种细胞的粘附分子起作用，能够干扰钙粘蛋白介导的细胞-细胞接触。EpCAM上调c-myc、细胞周期蛋白A和E、加快细胞周期和促进细胞增殖(Munz等，2004，Oncogene 23：5748-58)。
在人类不同起源的人癌细胞中，EpCAM均得以大量和同样地表达(Went等，2006，Br JCancer 94：128-35)。对前列腺癌和宫颈上皮内瘤变进行的免疫组织化学研究显示，EpCAM的表达可随疾病的发展和增殖而增加。这一明显的过表达在侵入性乳腺癌和卵巢癌患者中同样得到了描述，并强烈预示了较差的无病生存率和总体生存率(Spizzo等，2004，BreastCancer Res Treat 86：207-13；Spizzo等，2006，Gynecol Oncol 103：483-8)。在患有胆囊癌的患者中也观察到了EpCAM过表达和疾病进展之间相似的相互关系(Varga等，2004，Clin CancerRes 10：3131-6)。此外，在从结肠癌、乳腺癌、胰脏癌和前列腺癌中分离出来的癌起源或癌干细胞中，EpCAM均过表达(O′Brien等，2007，Nature 445：106-10；Marhaba等，2008，CurrMol Med 8：784-804)。这些数据强烈预示了将EpCAM作为免疫治疗靶标以治疗最常见的人类癌症的潜在功用。
在针对癌症的免疫疗法中，EpCAM同样是一种经过验证的靶标。在这一方面，EpCAM的多种抗体已经被用于免疫疗法，虽然应该提及多种抗体已经由于种种原因在临床试验中失败。这些EpCAM抗体有多种形式，包括裸抗体、免疫毒素和双特异或三特异性抗体(Baeuerle和Gires，Br.J.Cancer，2007，96：417-423)。
虽然双特异性抗体方法(例如Micromet在他们MT110抗体的方案中及Trion Pharma在Catumaxomab(Removab
Figure BPA00001503212300021
)的方案中所使用的)有多种优点，人们仍然非常希望开发具有单一特异性类型，也就是只有一种抗体特异性类型治疗效果的抗体。同样地，由于双特异性或三特异性抗体与单一特异性类型的抗体的作用机制具有本质的不同，直接的比较无法进行，也并不相关。
在临床试验中已经使用的另一种EpCAM抗体类型为免疫毒素类型(如Viventia在ProxiniumTM/ViciniumTM方案中所使用的)，也就是抗体的一部分与毒性分子结合，以产生杀灭肿瘤细胞的作用。ProxiniumTM/ViciniumTM是一种人源scFv(MOC31衍生)和假单胞菌外毒素(Di Paolo等，2003，Clin Cancer Res 9：2837-48)的融合蛋白。虽然这种抗体在临床应用中表现出了令人鼓舞的效果，然而由于免疫原性副作用，无法进行全身施用，需要在肿瘤位置直接/局部施用。另外，由于免疫毒素与裸抗体的作用机制完全不同，直接比较确实不可行，也不相关。
目前在临床试验中，最有效的裸类型的抗EpCAM的抗体为MT201(Adecatumumab，由Micromet公司开发，并授权给Merck Serono公司)，是一种完全人源的IgG1单克隆抗体。在前列腺癌和转移性乳腺癌的I期及II期临床试验中，这种抗体表现出了有希望的结果，不像一些其他裸EpCAM抗体那样(如ING-1，Xoma公司一种具有高度亲和性的人源改造的IgG1)到目前为止患者没有出现胰腺炎的迹象。其他试验的抗EpCAM抗体已经表现出了临床上的不利之处。例如，对于Edrecolomab(17-1A；Panorex)，尽管其具有良好的安全范围，但其仅仅表现出轻微的临床活性，并迅速被人体的抗-鼠源抗体(HAMA)反应所中和。MOC31(Viventia公司一种正在被使用的人源化抗体)是另一种抗-EpCAM抗体，已受到广泛的研究，是一种与鼠源可变区和人源恒定区嵌合的抗体。
由于EpCAM在正常上皮细胞中广泛表达，因此如在高度亲和力抗-EpCAM MAb ING-1看到的，机体无法承受EpCAM特异性的免疫毒素(ProxiniumTM/ViciniumTM)及三功能抗体(Removab
Figure BPA00001503212300031
)，还有急性胰腺炎，与正常EpCAM表达的组织的附带损伤情况相一致。另一方面，edrecolomab(Panorex
Figure BPA00001503212300032
)和adecatumumab(MT201)表现出很好的承受力，似乎不会作用在正常的EpCAM表达的组织上。因此，抗EpCAM抗体的治疗潜力是明确的，其挑战在于，开发与本领域已知抗体，特别是现在明显的领头羊，MT201相比，表现出替代或改进特性的抗EpCAM抗体。
发明内容
本发明的发明人鉴定了一种可与EpCAM结合的抗体，与现有抗体相比，特别是与上面所述的MT201和MOC31相比，表现出改良的特性。例如，本发明中的抗体显示了良好的亲和力、良好的交叉反应谱和出色的ADCC和CDCC活性。另外，优选的是，这类抗体由于是完全人源化的蛋白，可与患者的免疫系统完全相容。本发明的抗体可用作诊断或治疗用途(特别是在癌症方面)，或者可以之作为基础，设计其他与靶抗原，EpCAM相结合的抗体或结合蛋白，如双特异性抗体，免疫毒素或抗体-药物偶联物(ADC)。
本发明中与EpCAM结合的抗体分子的氨基酸和/或DNA序列，它们的VH和VL结构域，包括互补性决定区(CDRs)，会在本说明书中所附的多种SEQ ID NO中列出。本说明书中所描述的所有特异性抗体，其VH结构域中均具有相同的CDRs，但其VL结构域中CDRs会稍微有所不同。
在一个实施例中，本发明提供了一种与EpCAM结合的抗体，包括重链(VH)CDR1结构域，包含如SEQ ID NO：5所列的氨基酸序列，或一个与其大体上同源的序列。
可选的或者此外，在本发明的一个实施例中，与EpCAM结合的抗体包括一个重链(VH)CDR2结构域，包含如SEQ ID NO：6所列的氨基酸序列，或一个与其大体上同源的序列。
可选的或此外，在本发明的一个实施例中，与EpCAM结合的抗体包括一个重链(VH)CDR3结构域，包含如SEQ ID NO：7所列的氨基酸序列，或一个与其大体上同源的序列。由于抗体的CDR3结构域在与抗原结合方面经常非常重要，因此本发明特别优选具有基于SEQ ID NO：7的VH CDR3结构域的抗体。实际上，这种序列出现在本说明书描述的所有特异性抗体中。
可选的或此外，在本发明的一个实施例中，与EpCAM结合的抗体包括一个轻链(VL)CDR1结构域，包含如SEQ ID NO：8所列的氨基酸序列，或一个与其大体上同源的序列。
可选的或此外，在本发明的一个实施例中，与EpCAM结合的抗体包括一个轻链(VL)CDR2结构域，包含如SEQ ID NO：9所列的氨基酸序列，或一个与其大体上同源的序列。在本发明的一个可选的实施例中，抗体包括一个轻链(VL)CDR2结构域，包含如SEQ IDNO：29所列的氨基酸序列，或一个与其大体上同源的序列。
可选的或此外，在本发明的一个实施例中，与EpCAM结合的抗体包括一个轻链(VL)CDR3结构域，包含如SEQ ID NO：10所列的氨基酸序列，或一个与其大体上同源的序列。在本发明的可选实施例中，抗体包括一个轻链(VL)CDR3结构域，包含如SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：69或SEQ ID NO：82所列的氨基酸序列，或一个与其大体上同源的序列。
因此，在特定的实施例中，本发明提供了一种与EpCAM结合的抗体，包括一个或多个重链CDR结构域，其中重链CDR结构域从一个组中选择得到，该组包括：
(a)重链CDR1结构域，包含如SEQ ID NO：5所列的氨基酸序列，或一个与其大体上同源的序列；
(b)重链CDR2结构域，包含如SEQ ID NO：6所列的氨基酸序列，或一个与其大体上同源的序列；以及
(c)重链CDR3结构域，包含如SEQ ID NO：7所列的氨基酸序列，或一个与其大体上同源的序列。
本发明在某些实施例中同样提供了一种与EpCAM结合的抗体，包括一个或多个轻链CDR结构域，其中轻链CDR结构域从一个组中选择得到，该组包括：
(a)轻链CDR1结构域，包含如SEQ ID NO：8所列的氨基酸序列，或一个与其大体上同源的序列；
(b)轻链CDR2结构域，包含如SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：29所列的氨基酸序列，或一个与其大体上同源的序列；以及
(c)轻链CDR3结构域，包含如SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：43、SEQ IDNO：56、SEQ ID NO：69或者SEQ ID NO：82所列的氨基酸序列，或一个与其大体上同源的序列。
在某些优选实施例中，与EpCAM结合的抗体包括如下两种
(a)一种重链CDR3，包含如SEQ ID NO：7所列的氨基酸序列或一个与其大体上同源的序列；以及
(b)一种轻链CDR3，包含如SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：43、SEQ IDNO：56、SEQ ID NO：69或者SEQ ID NO：82所列的氨基酸序列，或一个与其大体上同源的序列。
更优选地，重链CDR1结构域包含如SEQ ID NO：5所列的氨基酸序列或一个与其大体上同源的序列，和/或轻链CDR1结构域包含如SEQ ID NO：8所列的氨基酸序列或一个与其大体上同源的序列，和/或重链CDR2结构域包含如SEQ ID NO：6所列的氨基酸序列或一个与其大体上同源的序列，和/或轻链CDR2结构域包含如SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：29所列的氨基酸序列，或一个与其大体上同源的序列，也同样做了介绍。
在一个优选实施例中，重链CDR1包含如SEQ ID NO：5的氨基酸序列或一个与其大体上同源的序列，CDR2包含如SEQ ID NO：6的氨基酸序列或一个与其大体上同源的序列，以及CDR3包含如SEQ ID NO：7的氨基酸序列，或一个与其大体上同源的序列，这些可单独出现或联合出现。
在又另外一个优选实施例中，轻链CDR1包含如SEQ ID NO：8的氨基酸序列或一个与其大体上同源的序列，CDR2包含如SEQ ID NO：9或者SEQ ID NO：29的氨基酸序列，或一个与其大体上同源的序列，以及CDR3包含如SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：69或者SEQ ID NO：82所列的氨基酸序列，或一个与其大体上同源的序列，这些可单独出现或联合出现。
换一种方式来看，在某些实施例中，本发明提供了一种与EpCAM结合的抗体，包含：
重链CDR3结构域，包含如SEQ ID NO：7的氨基酸序列或一个与其大体上同源的序列，和/或一个轻链CDR3结构域，包含如SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：43、SEQID NO：56、SEQ ID NO：69或者SEQ ID NO：82的氨基酸序列，或一个与其大体上同源的序列。
所述抗体可以进一步包括：
重链CDR2结构域，包含如SEQ ID NO：6的氨基酸序列或一个与其大体上同源的序列，和/或轻链CDR2结构域，包含如SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：29的氨基酸序列，或一个与其大体上同源的序列，和/或进一步包括：
重链CDR1结构域，包含如SEQ ID NO：5的氨基酸序列或一个与其大体上同源的序列，和/或
轻链CDR1结构域，包含如SEQ ID NO：8的氨基酸序列或一个与其大体上同源的序列。
换一种方式来看，在某些实施例中，本发明提供了一种与EpCAM结合的抗体，包含：
重链CDR2结构域，包含如SEQ ID NO：6的氨基酸序列或一个与其大体上同源的序列，和/或轻链CDR2结构域，包含如SEQ ID NO：9或者SEQ ID NO：29的氨基酸序列，或一个与其大体上同源的序列。
所述抗体可以进一步包括：
重链CDR3结构域，包含如SEQ ID NO：7的氨基酸序列或一个与其大体上同源的序列，和/或轻链CDR3结构域，包含如SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：43、SEQ IDNO：56、SEQ ID NO：69或者SEQ ID NO：82的氨基酸序列，或一个与其大体上同源的序列，和/或进一步包括：
重链CDR1结构域，包含如SEQ ID NO：5的氨基酸序列，或一个与其大体上同源的序列，和/或
轻链CDR1结构域，包含如SEQ ID NO：8的氨基酸序列或一个与其大体上同源的序列。
换一种方式来看，在某些实施例中，本发明提供了一种与EpCAM结合的抗体，包含：
重链CDR1结构域，包含如SEQ ID NO：5的氨基酸序列或一个与其大体上同源的序列，和/或轻链CDR1结构域，包含如SEQ ID NO：8的氨基酸序列或一个与其大体上同源的序列。
所述抗体可以进一步包括：
重链CDR3结构域，包含如SEQ ID NO：7的氨基酸序列或一个与其大体上同源的序列，和/或轻链CDR3结构域，包含如SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：43、SEQ IDNO：56、SEQ ID NO：69或者SEQ ID NO：82的氨基酸序列，或一个与其大体上同源的序列，和/或进一步包括：
重链CDR2结构域，包含如SEQ ID NO：6的氨基酸序列，或一个与其大体上同源的序列，和/或
轻链CDR2结构域，包含如SEQ ID NO：9或者SEQ ID NO：29的氨基酸序列，或一个与其大体上同源的序列。
本发明中某些优选的抗体包含一个或多个CDRs，这些CDRs从一个组中选择而出，这个组包含SEQ ID NOs：5、6、7、8、9及10，或者一个与前面任一个SEQ ID NOs大体上同源的序列。其他优选的CDRs从一个组中选择而出，这个组包括SEQ ID NOs：29(对于VL CDR2)和SEQ ID NOs：30、43、56、69和82(对于VL CDR3)。
其他某些优选的抗体包括两个或更多个重链CDRs，这些重链CDRs包含如SEQ IDNOs：5、6或7，或者与前面任一个SEQ ID NOs大体上同源的序列。特别优选的结合分子包括3个含SEQ ID NOs：5、6和7的重链CDRs，或者与前面任一个SEQ ID NOs大体上同源的序列(如每个上述重链CDR1和CDR2和CDR3或大体上同源的序列中的一个)。
某些优选的抗体包括两个或更多个轻链CDRs，如含SEQ ID NOs：8(对于VL CDR1)、9或29(对于VL CDR2)，或10、30、43、56、69或82(对于VL CDR3)，或者与前面任一个SEQ ID NOs大体上同源的序列。特别优选的结合分子包含3个轻链CDRs，如含SEQID NOs：8(对于VL CDR1)，9或29(对于VL CDR2)，或10、30、43、56、69或82(对于VL CDR3)，或与前面任一个SEQ ID NOs大体上同源的序列(如每个上述轻链CDR1和CDR2和CDR3或者与其大体上同源的序列中的一个)。
某些特别优选的抗体包括3个轻链CDRs，如含SEQ ID NOs：8(对于VL CDR1)，9或29(对于VL CDR2)，或10，30，43，56，69或82(对于VLCDR3)，或大体上与这些序列(如，每个上述轻链CDR1和CDR2和CDR3或者大体上与之同源的序列中的一个)同源的序列，还包括3个重链CDRs，如含SEQ ID NOs：5，6或7，或者大体上与这些序列中的任一个同源的序列(如，每个上述重链CDR1和CDR2和CDR3或者大体上与之同源的序列)。
某些特别优选的抗体包括：
含SEQ ID NO：5的重链CDR1结构域，
含SEQ ID NO：6的重链CDR2结构域，以及
含SEQ ID NO：7的重链CDR3结构域，
或者大体上与任一上述序列同源的序列；
和/或包括：
含SEQ ID NO：8的轻链CDR1结构域，
含SEQ ID NO：9的轻链CDR2结构域，以及
含SEQ ID NO：10的轻链CDR3结构域，
或者大体上与任一个上述序列同源的序列。
另一种优选的轻链CDR组合物为SEQ ID NO：8(对于VL CDR1)和SEQ ID NO：29(对于VL CDR2)和SEQ ID NO：30或者SEQ ID NO：43或者SEQ ID NO：56或者SEQ ID NO：69或者SEQ ID NO：82(对于VL CDR3)，或者大体上与任一个上述序列同源的序列。
在进一步优选实施例中，本发明提供了一种与EpCAM结合的抗体，该抗体包括至少一个包含三个CDRs的重链可变区和至少一个包含三个CDRs的轻链可变区，其中所述重链可变区包括：
(c)VH CDR3，含有如SEQ ID NO：7的氨基酸序列或一个与其大体上同源的序列。
在进一步优选实施例中，本发明提供了一种与EpCAM结合的抗体，至少包括包含三CDRs的重链可变区，至少包括包含三CDRs的轻链可变区，其中，所述重链可变区包括：
(a)VH CDR1，含有如SEQ ID NO：5的氨基酸序列或一个与其大体上同源的序列，
(b)VH CDR2，含有如SEQ ID NO：6的氨基酸序列或一个与其大体上同源的序列，以及
(c)VH CDR3，含有如SEQ ID NO：7的氨基酸序列或一个与其大体上同源的序列。
在本实施例的一个优选方面，一个或多个所述轻链可变区CDRs从一个组中选出，该组包括：
(d)可变轻链(VL)CDR1，含有如SEQ ID NO：8的氨基酸序列或一个与其大体上同源的序列，
(e)VL CDR2，含有如SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：29的氨基酸序列，或一个与其大体上同源的序列，以及
(f)VL CDR3，含有如SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：69或SEQ ID NO：82的氨基酸序列，或一个与其大体上同源的序列。
在本实施例的进一步优选方面，两个所述轻链可变区CDRs从一个组中选出，该组包括：
(d)可变轻链(VL)CDR1，含有如SEQ ID NO：8的氨基酸序列或一个与其大体上同源的序列，
(e)VL CDR2，含有如SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：29的氨基酸序列，或一个与其大体上同源的序列，以及
(f)VL CDR3，含有如SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：69或SEQ ID NO：82的氨基酸序列，或一个与其大体上同源的序列。
在本实施例的另一个进一步优选方面，三个所述轻链可变区CDRs从一个组中选出，该组包括：
(d)可变轻链(VL)CDR1，含有如SEQ ID NO：8的氨基酸序列或一个与其大体上同源的序列，
(e)VL CDR2，含有如SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：29的氨基酸序列，或一个与其大体上同源的序列，以及
(f)VL CDR3，含有如SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：69或SEQ ID NO：82的氨基酸序列，或一个与其大体上同源的序列。
在进一步优选实施例中，本发明提供了一种与EpCAM结合的抗体，包括至少一个包含三个CDRs的重链可变区和包括至少一个包含三个CDRs的轻链可变区，其中所述轻链可变区包括：
(i)可变轻链(VL)CDR1，含有如SEQ ID NO：8的氨基酸序列或一个与其大体上同源的序列，
(ii)VL CDR2，含有如SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：29的氨基酸序列，或一个与其大体上同源的序列，以及
(iii)VL CDR3，含有如SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：69或SEQ ID NO：82的氨基酸序列，或一个与其大体上同源的序列。
在本实施例的一个优选方面，一个或多个所述重链可变区CDRs从一个组中选出，该组包括：
(i)VH CDR1，含有如SEQ ID NO：5的氨基酸序列或一个与其大体上同源的序列，
(ii)VH CDR2，含有如SEQ ID NO：6的氨基酸序列或一个与其大体上同源的序列，
(iii)VH CDR3，含有如SEQ ID NO：7的氨基酸序列或一个与其大体上同源的序列。
在本实施例的进一步优选方面，两个所述重链可变区CDRs从一个组中选出，该组包括：
(i)VH CDR1，含有如SEQ ID NO：5的氨基酸序列或一个与其大体上同源的序列，
(ii)VH CDR2，含有如SEQ ID NO：6的氨基酸序列或一个与其大体上同源的序列，
(iii)VH CDR3，含有如SEQ ID NO：7的氨基酸序列或一个与其大体上同源的序列。
在本实施例的另一个进一步优选方面，三个所述重链可变区CDRs从一个组中选出，该组包括：
(i)VH CDR1，含有如SEQ ID NO：5的氨基酸序列或一个与其大体上同源的序列，
(ii)VH CDR2，含有如SEQ ID NO：6的氨基酸序列或一个与其大体上同源的序列，以及
(iii)VH CDR3，含有如SEQ ID NO：7的氨基酸序列或一个与其大体上同源的序列。
本发明的某些进一步优选实施例提供了一种与EpCAM结合的抗体，该抗体包括：
VH结构域，包括一个、两个或三个重链CDRs，该重链CDRs含SEQ ID NOs：5、6或7，或者大体上与一个或多个SEQ ID NOs：5、6或7同源的序列，和/或
VL结构域，包含一个、两个或三个轻链CDRs，该轻链CDRs含有SEQ ID NOs：8(对于VL CDR1)、9或者29(对于VL CDR2)，或者10、30、43、56、69或者82(对于VL CDR3)，或者与这些序列中的一个或多个大体上同源的序列。
特别优选的VH结构域包括3个重链CDRs，该重链CDRs包含SEQ ID NOs：5、6和7，或者与一个或多个与SEQ ID NOs：5、6或7大体上同源的序列(如，每个CDR1、CDR2和CDR3或者大体上与其同源的序列)。
特别优选的VL结构域包含3个轻链CDRs，如含SEQ ID NOs：8(对于VL CDR1)、9或29(对于VL CDR2)，或10、30、43、56、69或82(对于VL CDR3)，或与前面一个或多个这些序列大体上同源的序列(如每个上述CDR1、CDR2和CDR3或者与其大体上同源的序列中的一个)。
本发明中更加特别优选的实施例提供了一种与EpCAM结合的抗体，包括：VH结构域，包含3个重链CDRs，该重链CDRs含有SEQ ID NOs：5、6和7，以及VL结构域，包含3个轻链CDRs。在优选实施例中，一个、两个或三个轻链CDRs由SEQ ID NOs：8、9和10来限定。大体上与之同源的序列也同样包括在内。
在替代的VL结构域中，一个、两个或三个轻链CDRs由SEQ ID NOs：8、29和30；8、29和43；8、29和56；8、29和69；以及8、29和82而限定。大体上与之同源的序列也同样包括在内。
本发明的某些优选实施例中提供了一种与EpCAM结合的抗体，包含有如SEQ ID NO：3的氨基酸序列或一个与其大体上同源的序列的VH结构域，和/或含有如SEQ ID NOs：4、27、40、53、66或者79的氨基酸序列，或一个与其大体上同源的序列的VL结构域。
进一步优选的实施例提供了一种与EpCAM结合的抗体，包含有如SEQ ID NO：3的氨基酸序列的VH结构域，还包含有3个轻链CDRs的VL结构域。优选地，所述VL结构域含有如SEQ ID NOs：4、27、40、53、66或79的氨基酸序列。
本发明的其他实施例提供了一种与EpCAM结合的抗体，包括：
一个VL结构域，包括3个轻链CDRs，该轻链CDRs含有SEQ ID NOs：8、9和10，
还包括一个VH结构域，含有3个重链CDRs。在优选实施例中，一个、两个或三个重链CDRs由SEQ ID NOs：5、6和7来确定。
进一步优选的实施例提供了一种与EpCAM结合的抗体，所包含的VL结构域含有如SEQ ID NOs：4、27、40、53、66或79的氨基酸序列，还包含VH结构域，含有3个重链CDRs。优选地，所述VH结构域含有如SEQ ID NO：3的氨基酸序列。
在另一个进一步实施例中，本发明提供了一种与EpCAM结合的抗体，含有如SEQ IDNO：21的氨基酸序列(所述抗体在此处同样称为3-17I ScFv)，或含有与EpCAM结合的其片段，或一个与其大体上同源的序列。
本发明的其他抗体含有如SEQ ID NO：36(所述抗体在此处同样称为7-F17scFv)、SEQID NO：49(所述抗体在此处同样称为12-C15scFv)、SEQ ID NO：62(所述抗体在此处同样称为16-G5scFv)、SEQ ID NO：75(所述抗体在此处同样称为17-C20scFv)和SEQ ID NO：88(所述抗体在此处同样称为24-G6scFv)所列的氨基酸序列，或含有与EpCAM结合的片段，或一个与其大体上同源的序列。
本发明采用单克隆抗体3-17I作为例证，其单链形式如图1(SEQ ID NO：21和SEQ IDNO：20)所示，其全长IgG形式如例1和表1所描述。所述3-17I抗体包括一个含SEQ ID NO：3的VH结构域和含SEQ ID NO：4的VL结构域。3-17I抗体的CDR结构域、VH和VL结构域由表1和图1示出。包含这些CDR结构域或者VH和VL结构域(或大体上与其同源的序列)的抗体作为本发明的优选方面。
本发明其他作为例证的抗体有7-F17、12-C15、16-G5、17-C20以及24-G6。7-F17抗体包含如SEQ ID NO：3的VH结构域，以及如SEQ ID NO：27的VL结构域。12-C15抗体包含如SEQ ID NO：3的VH结构域，以及如SEQ ID NO：40的VL结构域。16-G5抗体包含如SEQ ID NO：3的VH结构域，以及如SEQ ID NO：53的VL结构域。17-C20抗体包含如SEQ ID NO：3的VH结构域，以及如SEQ ID NO：66的VL结构域。24-G6抗体包含如SEQID NO：3的VH结构域，以及如SEQ ID NO：79的VL结构域。因此，这些抗体含有与3-17I相同的重链，但其轻链不同，其序列分别在表2、3、4、5和6中示出。包含这些CDR结构域或者VH和VL结构域(或大体上与其同源的序列)的抗体作为本发明的优选方面。
本发明一个优选的实施例为SEQ ID NO：21(氨基酸)示出的3-17I抗体的scFv形式，其优选通过SEQ ID NO：20(核酸)进行编码。本发明另一个实施例为SEQ ID NO：36(氨基酸)示出的7-F17抗体的scFv形式，其优选通过SEQ ID NO：35(核酸)进行编码。本发明另一个实施例为SEQ ID NO：49(氨基酸)示出的12-C15抗体的scFv形式，其优选通过SEQ ID NO：48(核酸)进行编码。本发明另一个实施例为SEQ ID NO：62(氨基酸)示出的16-G5抗体的scFv形式，其优选通过SEQ ID NO：61(核酸)进行编码。本发明另一个实施例为SEQ ID NO：75(氨基酸)示出的17-C20抗体的scFv形式，其优选通过SEQ ID NO：74(核酸)进行编码。本发明另一个实施例为SEQ ID NO：88(氨基酸)示出的24-G6抗体的scFv形式，其优选通过SEQ ID NO：87(核酸)进行编码。
本发明另一种优选实施例为3-17I抗体的全长IgG形式，其重链由SEQ ID NO：24(氨基酸)示出，优选地由SEQ ID NO：22(核酸)进行编码；其轻链由SEQ ID NO：25(氨基酸)示出，优选地由SEQ ID NO：23(核酸)进行编码。7-F17、12-C15、16-G5、17-C20以及24-G6抗体的全长IgG形式也是优选的实施例。
因此，本发明优选的抗体包含3-17I的VH和VL结构域，即包含SEQ ID NO：3和SEQID NO：4或大体上与之同源的序列。其他优选的抗体包括7-F17、12-C15、16-G5、17-C20和24-G6的VH和VL结构域，或大体上与之同源的序列。
在此处描述的所有本发明的实施例中，VL CDR2结构域具有或者包括如G A S T X5 AX7(SEQ ID NO：37)的氨基酸序列或一个与其大体上同源的序列，其中X5和X7可以是任一种氨基酸。在这些实施例中X5可以是R或T，优选为T。X7可以是T或S，优选为S。因此，一种优选的VL CDR2具有或包括一种如G A S T R/T A T/S(SEQ ID NO：38)的氨基酸序列。可同样参见表7。
在此处描述的所有本发明的实施例中，VL CDR3结构域具有或者包括如Q X2 Y N X5 WP P X9 X10 T(SEQ ID NO：89)的氨基酸序列或一个与其大体上同源的序列，其中X2、X5、X9和X10可以是任一种氨基酸。在这些实施例中X2可以是Q或H或K，优选为Q。X5可以是N或D，优选为N。X9可以是G或T或S或M或A，优选为A。X10可以是F或W或Y，优选为Y。因此，一种优选的VL CDR3具有或包括一种如Q Q/H/K Y N N/D W P PG/T/S/M/AF/W/Y T(SEQ ID NO：90)的氨基酸序列。可同样参见表7。
某些大体上同源的序列的例子为与所披露的氨基酸序列至少具有70％一致性的序列。
在某些实施例中，本发明的与EpCAM结合的抗体至少包括一个轻链可变区，该轻链可变区包括一个氨基酸序列域，与SEQ ID NOs：4、27、40、53、66或79的氨基酸序列至少约70％或75％，更加优选的至少约80％，更加优选的至少约85％，更加优选的至少约90％或95％和最优选的至少约97％、98％或者99％的一致性；和/或至少包括一个重链可变区，该重链可变区包括一个氨基酸序列域，与SEQ ID NO：3的氨基酸序列至少约70％或75％，更加优选的至少约80％，更加优选的至少约85％，更加优选的至少约90％或95％和最优选的至少约97％、98％或者99％的一致性。
其他优选的大体上同源的序列的例子为含有对披露的氨基酸序列替换保守氨基酸的序列。
其他优选的大体上同源的序列的例子为在一个或多个披露的CDR结构域中含有1、2或3个，优选为1或2个改变的氨基酸的序列。这种变更可以是保守或非保守氨基酸的替换，或者是它的结合。
在所有这些实施例中，优选的变更为保守氨基酸的替换。
在所有实施例中，含有大体上同源的序列的抗体保留了与EpCAM结合的能力，优选保留此处所描述的一个或多个其他特性，如至少与人源EpCAM结合的能力，优选能与人源和猴源EpCAM结合的能力。
本发明的其他实施例提供了与EpCAM结合的结合蛋白，包括本发明的一种抗体，本发明的VH或VL结构域，或者本发明的一个或多个CDRs。在一个优选实施例中，这种结合蛋白为抗体。对于VH、VL和CDR结构域在应用到此类结合蛋白上的优选结合方式会在本说明书的其他地方谈及。
本发明优选的抗体最少包括一个含三个CDRs的重链可变区，以及最少包括含三个CDRs的轻链可变区。这些CDRs的示范和优选的序列会在此描述到。
正如本说明书中所使用的，简洁术语“EpCAM”，除非另外特别声明或者与科学术语区分开，指的是上皮细胞粘附分子。EpCAM也可被称之为EGP-2，、17-1A、HEA125、MK-1、GA733-2、EGP34、KSA、TROP-1、ESA、TACSTD1或者KS1/4。
“EpCAM”也指EpCAM的任一形式，特别是指EpCAM在哺乳动物物种中的保守类型(Trzpis等，2008，Transgenic Res 17：229-238)。本发明的抗体或抗体片段可因此与例如人类、猴(如食蟹猴)、奶牛(牛)、小鼠、大鼠、仓鼠、雪貂、豚鼠和/或兔的EpCAM结合。优选地，本发明的抗体或抗体片段至少能与人源EpCAM结合。在某些优选实施例中，本发明的抗体或抗体片段至少能与人源和猴源(如食蟹猴)EpCAM结合。在其他的优选实施例中本发明的抗体或抗体片段至少能与人源和鼠源EpCAM结合。在其他的优选实施例中本发明的抗体或抗体片段至少能与人源、猴源和鼠源EpCAM结合。EpCAM可以是游离EpCAM，如重组或纯化的EpCAM，或者也可以天然形式，如在细胞表面的形式呈现。
本发明的抗体或者结合蛋白也可与EpCAM的片段，特别是包含或组成部分为细胞外结构域的片段结合，或者能与包含EpCAM或EpCAM片段的实体相结合。实际上，本发明的抗体的表位位于EpCAM的细胞外结构域上。
正如本说明书中所使用的，在本发明的抗体或抗体片段背景下的术语“与EpCAM结合的”或者“抗-EpCAM”，指的是抗体或抗体片段，能够实现如下中的一个或多个；优选的，能够实现如下中的多于一个；最优选的，能够实现如下中的所有：
(a)在固相载体上结合至游离EpCAM；比如重组表达的EpCAM，例如由ELISA试验或BIAcore试验所验证的；
(b)结合至构象依赖的(如非线性的)EpCAM表位，如在非还原状态下通过蛋白质印迹与EpCAM结合来进行检测；
(c)结合至表达在细胞表面的EpCAM，如经流式细胞术或免疫组织化学检测的；
(d)至少与人源EpCAM结合，更加优选的与人源和猴源EpCAM或者人源和鼠源EpCAM结合，最优选的和人源、猴源和鼠源EpCAM结合；
(e)以10nM或更小水平，优选为5nM或更小，更加优选的为3nM或者更少或者2nM或更少，最优选的为1nM或更少的结合亲和力(Kd)与人源EpCAM结合，这些会在本说明书的其他地方提及；
(f)比如Kd为10nM或更少，优选的为5nM或更少，更加优选的为3nM或更少或2nM或更少，比如1nM或更少以相似的亲和力与人源和猴源EpCAM或者与人源和鼠源EpCAM结合，这些会在本说明书的其他地方提及。
本发明优选的抗体或者抗体片段同样能够完成一个或多个以下功能特性；优选的，能够完成多于一个的以下功能特性；最优选的，完成所有下述功能特性：
(g)向有肿瘤的动物施用后能够集中在肿瘤区域；
(h)如本说明书中其他地方所描述的那样诱导肿瘤细胞的ADCC；
(i)如本说明书中其他地方所描述的那样诱导肿瘤细胞的CDC；
(j)在体内诱导抗肿瘤效应。
关于这些优选的性质的进一步信息会在本说明书的其他地方描述。其他优选的性质包括在施用本发明的抗体后不会出现严重的体内毒性，也不会出现严重的其他体内副作用，比如胰腺炎，或对于其他抗EpCAM抗体比如会观察到的对于正常组织带来的其他附带损伤等副作用。本发明的抗体也有可能抑制或显著地降低EpCAM的作用或者防止或减少EpCAM与其天然配体的相互作用。本发明抗体的另一种优选的性质(但不是必需的)为具有一种能力，能够以单特异性的形式，如只有一种抗体特异性的形式而发挥治疗效果。
因此，根据本发明，一系列抗-EpCAM抗体可以被制造并应用于多种方案中，包括治疗癌症的方案中。
在整个申请文件中贯穿使用的词语“a”及“an”，它们所表达的意思为“最少一个”，“至少第一个”，“一种或多种”或者“多种”其指代的成份或步骤，除了在一些情况下，其上限由后面所具体声明。因此，一个“抗体”，正如本说明书所采用的，意味着“至少第一种抗体”。组合物可行的范围和参数，同任何单一试剂的量一样，由于本发明所披露的内容而为本领域普通技术人员所知。
本发明优选的实施例是至少包含一种本发明的抗-EpCAM抗体，或者其抗原结合片段的组合物。
包含编码由本说明书所限定的本发明中的抗体或其部分或片段的核苷酸序列的核酸分子，或者大体上与其同源的核酸分子，还构成了本发明的进一步方面。优选的核酸分子包括编码由SEQ ID NO：21列出的氨基酸序列的序列(优选由SEQ ID NO：20进行编码)。其他优选的核酸分子包括编码由SEQ ID NO：36所列出的氨基酸序列的序列(优选由SEQ IDNO：35进行编码)，或者编码由SEQ ID NO：49所列出的氨基酸序列的序列(优选由SEQ IDNO：48进行编码)，或者编码由SEQ ID NO：62所列出的氨基酸序列的序列(优选由SEQ IDNO：61进行编码)，或者编码由SEQ ID NO：75所列出的氨基酸序列的序列(优选由SEQ IDNO：74进行编码)，或者编码由SEQ ID NO：88所列出的氨基酸序列的序列(优选由SEQ IDNO：87进行编码)。其他优选的核酸分子包括编码具有由SEQ ID NO：24所列出的氨基酸序列的重链的序列(优选由SEQ ID NO：22进行编码)，和/或包括编码具有由SEQ ID NO：25所列出的氨基酸的轻链的序列(优选由SEQ ID NO：23进行编码)，或者编码具有由SEQ IDNO：51所列出的氨基酸序列的轻链的序列(优选由SEQ ID NO：50进行编码)，或者编码具有由SEQ ID NO：64所列出的氨基酸序列的轻链的序列(优选由SEQ ID NO：63进行编码)，或者编码具有由SEQ ID NO：77所列出的氨基酸序列的轻链的序列(优选由SEQ ID NO：76进行编码)。
其他优选的核酸分子包括编码本发明中IgG形式的抗体的序列，例如在例1中所描述的那些，或者鼠源的嵌合形式。
如上面所述，本发明所包含的其他核酸分子为编码本发明中人源抗体的部分或者片段，例如，为编码抗体的重链的核酸分子(比如，编码SEQ ID NO：24的核酸分子，如SEQ IDNO：22)，或者编码抗体的轻链的核酸分子(比如，编码SEQ ID NO：25的核酸分子，如SEQID NO：23)。其他优选的核酸分子为编码本发明中抗体的VH区(如，编码SEQ ID NO：3的核酸分子，比如SEQ ID NO：1)。其他优选的核酸分子可以编码本发明中抗体的VL区(比如，编码SEQ ID NO：4的核酸分子，如SEQ ID NO：2，编码SEQ ID NO：27的核酸分子，如SEQ ID NO：26，编码SEQ ID NO：40的核酸分子，如SEQ ID NO：39，编码SEQ ID NO：53的核酸分子，如SEQ ID NO：52，编码SEQ ID NO：66的核酸分子，如SEQ ID NO：65，或者编码SEQ ID NO：79的核酸分子，如SEQ ID NO：78)。
因此，在本说明书中限定的本发明抗体的片段，或者大体上与之同源的序列，或包含编码这些片段的序列的核酸分子，构成了本发明的进一步方面。
这里有一个总体的考虑，即高亲和力的抗-EpCAM抗体会有无法承受的毒性范围，因为它们无法区分恶性的及正常的组织。因此，只有对低亲和力的抗体，如edrecolomab和MT201，才存在治疗窗。另一方面，低亲和力的抗体在消除肿瘤方面效力较低。例如，根据Mircromet网站的信息，在治疗转移性乳腺癌和前列腺癌的II期临床试验中，Adecatumumab(MT201)未达到作为单一试剂的主要终点(比如，在第24周时取得25％的临床疗效)。
本发明的抗体，当呈IgG形式时，在EpCAM结合的亲和力方面具有独特的性质。虽然计算的平衡亲和力(KD)看上去比较高(约1nM)，其动力学成分(结合率和解离率)对亲和力起不同的作用。本发明的抗体具有非常高的结合率(约为107M-1s-1)，使其能与靶细胞快速地识别并结合，以及，同时，相对较高的解离率(10-2-10-3s-1)，使抗体能快速解离，在细胞表面的半衰期为3-4分钟。这种独特的结合属性有可能会带来较高的抗肿瘤效力及较低的毒性范围的综合结果。这种动力学特点，与现有技术的有明显不同，当将该抗体应用于体内时，有可能带来不同的(可能是更好的)药代动力学结果。
任何适于检测结合率和尤其是解离率的方法均可应用。然而，优选的测定动力学常数的方法在于，使用商业化结合模型软件，如BIAcore T100模型中的1∶1结合模型(如Langmuir结合模型)，在体外测定不同浓度下受试抗体与固定浓度的固定抗原(EpCAM)的反应。为了进行说明，在例3中描述了一种合适的试验方法。该常数优选采用位于固相载体，比如BIAcore芯片上的固定抗原(EpCAM)，并检测抗体与抗原的结合能力的方法进行测定。该结合亲和力优选在37℃(比如体温)下进行测定，虽然它也可在其他温度下，比如室温下，如25℃测定。
可选地，在EpCAM阳性的细胞表面上抗体的解离率和半衰期可以通过细胞表面保留试验而测定(Adams等，1998，Br J Cancer 77：1405-12；Le Gall等，1999，FEBS Lett 453：164-8)。后面的方法使得能够更好地模拟患者处于治疗状态下的真正状况。
本发明的抗体处于IgG形式时，对EpCAM具有相对较高的结合亲和力，例如，其Kd位于1x10-8M或者1x10-9M内或者更少的范围内。因此，本发明的抗体处于IgG形式时，其与EpCAM(优选为人源EpCAM)的结合亲和力相当于低于20nM、15nM或者10nM的Kd，更加优选的低于10、9.5、9、8.5、8、7.5、7、6.5、6、5.5、5、4.5、4、3.5、3、2.5、2、1.5、1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2或者0.1nM，然而，具有更高Kd值的抗体也同样可以应用于本发明中，只要它们具有如本说明书其他部分所述的适当功能特性。
任何合适的测定Kd值的方法均可应用。然而，优选的测定Kd的方法在于，在体外测定不同浓度下受试抗体与多种浓度下的固定抗原(EpCAM)的反应，以建立饱和曲线，例如采用Lineweaver-Burk法，或者优选采用商业化结合模型软件，如BIAcore T100模型中的1∶1结合模型(如Langmuir结合模型)。因此，BIAcore测定法优选用于测定Kd，为了进行说明，在例3中描述了一个合适的测定方法。Kd优选通过在固相载体，如BIAcore芯片上固定抗原(EpCAM)，优选游离抗原，如游离EpCAM或者一种包含EpCAM细胞外结构域的分子，并测定抗体与抗原的结合力而得出。结合亲和力优选在37℃(如，体温)下测定，虽然也可在其他温度下，比如室温，比如25℃测定。优选采用抗体的IgG形式测定结合亲和力。
如本说明书其他部分所讨论的，本发明优选的抗体与人源和猴源EpCAM结合。这种物种间，特别是在人类和常用于临床前动物模型的物种之间的交叉反应性是一种重要的优势，它可以更有效地将临床前的研究反映到临床应用上。例如，具有与使用的某种动物模型中存在的天然EpCAM交叉反应的抗体，意味着在这种模型中所得到的结果更有可能反映出患者的状况，从而可以更精确地评估出如剂量的选择，同样意味着提高了发现任何潜在的与之相关的或不确定的副作用的可能。如果抗体对猴源和人源的EpCAM具有相似的亲和性则尤其如此。
例如，本发明的抗体与人源EpCAM和猴源EpCAM结合的能力意味着这种抗体可用于临床前毒性研究，以评估治疗所导致的不利的副作用，寻找合适的可承受剂量。
另外，同时与人源EpCAM和鼠源EpCAM结合的能力，意味着本发明的这种抗体在小鼠模型，如在采用免疫活性小鼠的小鼠同源模型中所示的结果，更有可能代表着该抗体在人类使用对象中所表现出的活性。如果抗体对鼠源的和人源的EpCAM具有相似的亲和性则尤其如此。其理由在于，与人源EpCAM能够结合但不能与鼠源EpCAM结合的抗体，能够与在小鼠模型中生长的人源肿瘤细胞上表达的EpCAM结合，但无法与内源性的小鼠EpCAM结合。这当然与患者的状况不同，在患者中，由肿瘤表达的EpCAM以及内源性EpCAM同时存在。
这种情况的一个潜在的不利之处在于，一种抗体可以与人源EpCAM结合，但是不能与鼠源EpCAM结合，或者亲和力显著降低，有可能在免疫缺陷的小鼠(如裸鼠或SCID小鼠)的人源肿瘤移植模型中表现良好，但可能在含有更多EpCAM表达的人类系统中无法表现出类似的性能。换句话说，在小鼠移植系统中，能与人源EpCAM结合，但无法与鼠源EpCAM结合的抗体所表现出来的抗肿瘤作用，有可能比实际临床效果看上去更好。与之相对的，当使用既可与人源，又可以与鼠源EpCAM结合的抗体后，它便可以与小鼠模型系统中存在的所有形式的EpCAM结合，更有可能更好的反映出将该种抗体应用到人体时的情况。如果抗体对鼠源的和人源的EpCAM具有相似的亲和性则尤其如此。
本发明的3-17I抗体(以及本发明其他优选的抗体)对猴源和人源EpCAM相似的亲和力，与现有技术抗体MOC31(其对猴源EpCAM结合的亲和力明显低于对人源EpCAM的亲和力)相比具有明显优势，对MT201抗体这种与猴源EpCAM没有检测到亲和力的抗体同样具有优势。
因此，本发明优选的抗体与人源和猴源EpCAM结合，或者以相似的亲和力、相似的结合率或相似的解离率，如本说明书其他部分所描述的那样与人源和鼠源EpCAM结合。
通过“相似的亲和力”，“相似的结合率”或者“相似的解离率”同样意味着抗体对人源EpCAM以及对于一个或多个其他合适的物种(如猴或鼠)的抗体的结合的亲和力、结合率或者解离率，视情况而定，是可以相比的，例如，为不超过20倍。更加优选的，结合亲和力之间的差异少于15倍，更加优选的少于10倍，最优选的少于5、4、3或2倍。
可以相信，本发明的抗体可以结合在与已经被鉴定出的已知抗-EpCAM抗体不同的表位处。当然，该表位看上去与MOC31抗体的表位不同，因为在EpCAM处于还原状态后，位于人源EpCAM上的MOC31表位仍然存在，而本发明的优选抗体，3-17I的表位处于这种状态下明显已经被破坏掉了(见例3)。另外，由本发明的抗体，如3-17I所识别的表位看来可能与被MT201抗体识别的抗原表位不同。结果显示，3-17I抗体(以及本发明的其他抗体)与人源和猴源EpCAM均可结合，而MT201抗体只与人源EpCAM结合，这些结果可作为对此的间接证据。
因此，本发明的一个进一步实施例提供了一种抗体，优选为一种分离抗体，更加优选为人源抗体，与EpCAM细胞外结构域的一个抗原表位结合，并且具有与本说明书所述的3-17I抗体(比如，一种含有如SEQ ID NO：4的VL和如SEQ ID NO：3的VH的抗体)竞争的能力，或者具有与和3-17I含有相同CDRs的抗体竞争结合到EpCAM上的能力，所述具有与和3-17I含有相同CDRs的抗体也就是一种包含如SEQ ID NOs：8、9和10的VL CDR序列和如SEQ ID NOs：5、6和7的VH CDR序列的抗体。与7-F17、12-C15、16-G5、17-C20或者24-G6抗体竞争结合EpCAM的抗体也同样作为优选。
与相同的抗原表位/抗原结合可以轻易地通过本领域已知的并已被描述过的方法进行检测，如，采用结合分析法，如竞争性抑制分析法。因此，本领域技术人员应该明白，结合分析法可用于鉴别与本发明的抗体和抗体片段具有相同结合特性的其他抗体和抗体片段。如下面所述，竞争性结合分析法可用于发现这种类型的其他抗体。下面所描述的方法仅仅是合适的竞争性分析法的一个例子。本领域技术人员应该知道其他合适的方法和变形。
在用流式细胞仪进行竞争性分析之前，一定量的受试抗体需要通过如生物素化进行标记。生物素化的样品的功能(细胞结合特性的保留程度)，以及本发明的生物素化的抗体(Ab1)在与固定数量的肿瘤细胞，比如乳腺癌细胞实现亚-最大化结合时的最小浓度，便得以测定。从呈指数增长的培养物中收集了总量为106个细胞，并在4℃下与不同浓度的抗体孵育1小时。细胞洗涤后，在4℃下与合适的检测抗体另外孵育1个小时。洗涤以后，细胞用流式细胞仪进行分析。对于每一个受试抗体，通过描绘针对抗体浓度的中位荧光强度(MFI)，生成了一个饱和曲线。
对于竞争性分析法，肿瘤细胞，如乳腺癌细胞，按照上面所述的方法准备，用固定浓度的标记(生物素化)抗体(bio-Ab1)与浓度逐渐增加的非标记竞争性抗体的混合物进行处理一式两份。所采用的固定浓度是指相对于如上面所测定的固定数量的肿瘤细胞，能产生合适的荧光信号的抗体的最小浓度。比较理想的是，这种nM级的固定浓度应该低于平衡状态下处理的抗体的亲和力(KD)。这种情况下，所描述的方法可用于估计竞争性抗体的亲和力(Schodin和Kranz，1993，J Biol Chem 268：25722-7)。抗体混合物与靶细胞在4℃下孵育1小时。洗涤细胞，通过与FITC-标记的链霉亲和素孵育，与生物素化的抗体结合的细胞便可被显示出来。将每个测试样品(bio-Ab1+Ab2)读出的中位荧光信号减去背景荧光信号(PBS-5％FCS)后，对于每个Ab2浓度“c”，其抑制百分数可按照如下的公式进行计算得出：
抑制％＝(1-MFIbio-Ab1+Ab2”c”/MFIbio-Ab1)x 100.
计算得出。
抑制百分率与空白值相比，如果抑制百分率与对照组抑制百分率相比具有统计学上的显著性差异，则意味着受试抗体能够与相同的表位/抗原结合。该统计学上的显著性差异优选为概率值＜0.05。适合于检测统计学上显著性的方法在本领域中广为人知并有记录，它们中的任何一种均可被应用。优选的，受试抗体至少能够将本发明的抗体与EpCAM结合的量降低约95％。
优选的，这种抗体具有一个或多个如本说明书其他部分所限定的其他结合及功能特性，比如在上面的(a)到(j)中所述。
本发明的抗体能与EpCAM结合。因此本发明的抗体或者结合蛋白可用于检测体内或体外的EpCAM。由于EpCAM在肿瘤细胞中过表达，本发明的抗体或者结合蛋白可用于检测体内或体外的肿瘤细胞。另外，所述抗体集中于肿瘤细胞上的能力意味着本发明的抗体能够以存在肿瘤细胞的身体部位作为靶点，因此抗体能够作用于靶点处。例如，抗体，也就是裸抗体，其本身可诱导抗肿瘤效应，比如通过激活或者诱导ADCC或者CDC来实现。这种以裸抗体起作用的能力非常具有优势。可选择的，或者另外，凭借与附加的治疗性分子，如本说明书中所述的毒素或其它抗肿瘤分子相结合，这种抗体可诱导抗肿瘤效应。
本发明的抗体优选具有诱导体外肿瘤细胞，如表达EpCAM的肿瘤细胞，如乳腺癌细胞或胃癌细胞等的ADCC的能力。在例4中描述了一种适于在体外检测ADCC的试验。因此，本发明的抗体在比如存在人源PBMCs的时候，可以对体外的肿瘤细胞带来如至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的杀伤。可用于此类测定或分析的合适的肿瘤细胞，其例子在例4中给出，但一般来说，任何表达EpCAM的肿瘤细胞均可应用。例如，本发明的3-17I抗体已经表现出当存在人源PBMCs时，对体外的乳腺癌细胞株BT-474带来至少30％、40％、50％或者60％杀伤的能力；表现出当存在人源PBMCs时，对体外乳腺癌细胞株MDA-MB-453带来至少30％、40％、50％、60％或70％杀伤的能力以及当存在人源PBMCs时，对体外乳腺癌细胞株MDA-MB-231带来至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％杀伤的能力。这种水平的杀伤是本发明的抗体所优选的。这种水平的杀伤明显高于当前正在做临床试验的最好的抗-EpCAM抗体(也就是MT201)所表现出来的杀伤水平，参见例4。
本发明的抗体在达到这种ADCC水平所需要的抗体的低浓度下优选为也同样表现的特别有效。此外，例4中描述了一种合适的体外试验。因此，对于肿瘤细胞，如乳腺癌细胞，达到半数最大细胞裂解(EC50)所需的抗体浓度体外试验中优选低于30ng/ml、25ng/ml、20ng/ml、15ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、2ng/ml、1ng/ml、0.5ng/ml或0.25ng/ml或0.20ng/ml或0.15ng/ml。例如，本发明的3-17I抗体所表现出的EC50，对于MDA-MB-453细胞来说低至0.08ng/ml，对于B7474细胞来说低至0.12ng/ml以及对于MDA-MB-231细胞来说低至15ng/ml，所有的这些EC50显著低于MT201在平行试验中所测定的EC50值。此外，与现有技术抗体的MT201相比，这些结果显示出本发明的优选抗体具有明显的优势。
本发明的抗体优选具有诱导体外肿瘤细胞，如表达EpCAM的肿瘤细胞，如乳腺癌细胞或胃癌细胞等的CDC的能力。在例4中描述了一种适于在体外检测CDC的试验。因此，本发明的抗体当存在人类血清时，对于体外的肿瘤细胞可以至少带来如70％、80％、90％、95％或甚至达到100％的杀伤。可用于此类测定或分析的合适的肿瘤细胞的例子在例4中给出，但一般来说，任何表达EpCAM的肿瘤细胞均可应用。例如，本发明的3-17I抗体当存在人类血清时，对体外的乳腺癌细胞株MT-3已经表现出带来至少70％、80％、90％或95％杀伤的能力，实际上表现出了大约100％的杀伤；当存在人类血清时，对体外的胃癌细胞株KATO III已经表现出带来至少70％、80％、90％或者95％杀伤的能力，实际上表现出了大约100％的杀伤。这种水平的杀伤对于本发明的抗体来说是优选的，并且与当前正在做临床试验的最好的抗-EpCAM抗体(也就是MT201)所表现出来的杀伤水平相当，参见例4。
本发明的抗体在达到这种CDC水平所需要的抗体的低浓度下优选为也同样表现的特别有效。此外，例4中描述了一种合适的体外试验。因此，对于肿瘤细胞，如表达EpCAM的肿瘤细胞，如乳腺癌细胞或胃癌细胞等，达到半数最大细胞裂解(EC50)所需的抗体浓度在体外优选低于60ng/ml、50ng/ml、40ng/ml、30ng/ml、25ng/ml、20ng/ml、15ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、2ng/ml、1ng/ml、0.75ng/ml、0.5ng/ml、0.4ng/ml或0.3ng/ml。例如，本发明的3-17I抗体所表现出的EC50，对于KATO III细胞来说低至0.28ng/ml，对于MT-3细胞来说低至0.38ng/ml，所有的这些EC50显著低于MT201在平行试验中所测定的EC50值。此外，与现有技术抗体的MT201相比，这些结果显示出本发明的优选抗体具有明显的优势。
因此，本发明的抗体至少与在先技术的抗体MT201相比，表现出提高的ATCC和CDC活性，而MT201被认为是在这一方面特别有效。这种作用说明本发明的抗体可用于发动患者的免疫系统与肿瘤细胞战斗(即无需其他活性成分就可对治疗有用)。将ATCC诱导到如此高的水平以及如此高的效能的能力很显然是一个很有利的特性。
因此，本发明的优选的抗体具有诱导ADCC和/或CDC的能力。ADCC和/或CDC的活性可在体内或体外进行测定。
因此，本发明的优选的抗体表现出抗肿瘤的活性。这种抗肿瘤活性可在体外或体内进行测定。
本发明的抗体优选具有抑制肿瘤细胞，如乳腺癌细胞生长的能力。所述抑制能力可由体外或体内来证明。
优选的，上面所述的能力和性能与合适的对照组水平相比，处于可测到的水平或显著性水平，更加优选的处于有统计学意义的水平。合适的显著性水平会在本说明书的其他部分提及。更加优选的，一种或多种上面所述的能力和性能其检测到的水平，当与现有技术的抗体所观察到的能力相比时，可以测定的程度有所改善，或更加优选的，显著改善。
有些抗体能够进入到与其结合的细胞内部。因此，在本发明的几个实施例中，所述抗体能够被内在化。这种特性在应用免疫偶联物的时候具有特别的优势，因为与抗体分子结合的任何其他制剂都会随抗体分子而被内在化。在其他实施例中并未见到显著的内在化。
在下面说明书中的组合物、免疫偶联物、药物、组合、复合物、试剂盒、第一和第二医学用途以及本发明中所有的方法中，术语“抗体”和“免疫偶联物”，或者它的抗原结合区域或片段，除非另行特别说明或解释清楚该科学术语，都涉及一系列的抗-EpCAM抗体，也指具体的3-17I、7-F17、12-C15、16-G5、17-C20或24-G6抗体。
本说明书中使用的术语“抗体”和“免疫球蛋白”，较宽泛的指代任何包含人类抗原结合结构域的免疫结合试剂或分子，包括多克隆和单克隆抗体。由于重链中的恒定区的类型不同，所有抗体均属于五种主要类型中的一种：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，本发明的抗体可属于这些类型中的任一种。这些中的几种进一步分成亚型或同种型，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等等。所述重链的与不同类型的免疫球蛋白相对的恒定区分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同类型的免疫球蛋白的亚型结构和空间构型均已众所周知。
一般地，在本发明所使用的全部抗体，而非抗原结合域中，IgG和/或IgM是优选的，因为它们是生理状况下最常见的抗体，还因为它们最容易在实验室环境中制备。然而在有些实施例中，IgA抗体是优选的。
哺乳动物抗体的“轻链”，根据其恒定区的氨基酸序列以及其可变区的骨架区的某些氨基酸，属于两种明显不同的类型：kappa(κ)以及lambda(λ)中的一种。本发明的抗体使用κ或λ轻链恒定区在本质上没有倾向性。
本领域技术人员应该理解的是，由术语“抗体”所指代的免疫结合试剂会扩展到所有人源抗体及其抗原结合片段，包括整个抗体、二聚体、三聚体及多聚体的抗体；双特异性抗体；嵌合抗体；重组体和改造抗体，及其片段。
术语“抗体”因此用于指代任何具有抗原结合区的抗体样的分子，该术语包括抗体片段，所述抗体片段包含抗原结合域如Fab′、Fab、F(ab′)2、单域抗体(DABs)、TandAbs二聚体、Fv、scFv(单链Fv)、dsFv、ds-scFv、Fd、线性抗体、微抗体、双功能抗体(diabodies)、双特异性抗体片段、双体(bibody)、三体(tribody)(分别为scFv-Fab融合体、双特异性或三特异性)；sc-双功能抗体；κ(λ)体(scFv-CL融合体)；BiTE(双特异性T细胞结合子，scFv-scFv相连以吸引T细胞)；DVD-Ig(双可变区抗体，双特异性型)；SIP(小免疫蛋白，一种微抗体)；SMIP(“小型模块化免疫药学”scFv-Fc二聚体；DART(二硫键稳定的双链抗体“双亲和再靶向”)；包含一个或多个CDRs等的小抗体模拟物。
用于制备和使用多种基于抗体的构建体和片段的技术在本领域中众所周知(参见Kabat等，1991，在说明书中被特别用来做参考)。特别是双链抗体，在EP 404,097和WO93/11161中被进一步描述；而线性抗体在Zapata等(1995)中被进一步描述。
抗体能够通过常规技术打成片段。例如，F(ab′)2片段可通过用胃蛋白酶处理抗体而制得。产生的F(ab′)2片段可以进行处理，以减少二硫键而制得Fab′片段。木瓜蛋白酶消化可促使Fab片段的形成。Fab、Fab′和F(ab′)2、scFv、Fv、dsFv、Fd、dAbs、TandAbs、ds-scFv、二聚体、微抗体、双功能抗体、双特异性抗体片段及其他片段可同样通过重组技术进行合成或能通过化学合成。用于制备抗体片段的技术在本领域中众所周知并有描述。例如，Beckman等，2006；Holliger & Hudson，2005；Le Gall等，2004；Reff & Heard，2001；Reiter等，1996；和Young等，1995中的每一篇文献进一步描述并使得能够制备有效抗体片段。
抗体或者抗体片段可通过天然产生或能够完全或部分合成制备。因此所述抗体可通过任何适当的来源获得，例如重组体来源和/或通过转基因动物或转基因植物而生产，或在采用IgY技术的蛋中生产。因此，所述抗体分子可通过体外或体内方法制备得到。
优选的，所述抗体或抗体片段包括一个含有三个CDR结构域的抗体轻链可变区(VL)，以及一个含有三个CDR结构域的重链可变区(VH)。所述VL和VH大体构成了抗原结合位点。
“Fv”片段是包含完整抗原识别和结合位点的最小的抗体片段。此区域含有一个重链和一个轻链可变区，通过紧密而非共价的方式联合成二聚体。在这种构型中，每个可变区的三个高变区(CDRs)相互作用，从而在VH-VL二聚体的表面限定出抗原结合位点。共同地，6个高变区(CDRs)使抗体具有抗原结合特异性。
然而，本领域中的文献充分表明，对于一个抗体来说，其轻链可变区的三个CDRs以及重链可变区的三个CDRs的存在对抗原结合并非是必要的。因此，比上述典型的抗体片段小的构型被认为是有效的。
例如，骆驼抗体(Hamers-Casterman等，1993；Arbabi Ghahroudi等，1997)含有除轻链外的广泛的抗原结合所有需要的组成部分。同样的，只含有VH结构域的单域抗体(Ward等，1989；Davies和Riechmann，1995)或只含有VL结构域的单域抗体(van den Beucken等，2001)的结果表明，这些结构域能以可接受的高亲和力与抗原结合。因此，三个CDRs能够有效地结合抗原。
同样所知的是，单CDR或者两个CDRs，能够有效地结合抗原。作为第一个例子，单CDR能够插入到异种蛋白中，使异种蛋白具有抗原结合的能力，可以通过将VH CDR3区插入一种异种蛋白，如GFP中，使该异种蛋白具有抗原结合的能力(Kiss等，2006；Nicaise等，2004)而作为例证。
进一步为人所知的是，两个CDRs能够有效地结合抗原，甚至能够表现出比母抗体更好的特性。例如，有文献表明(Qiu等，2007)，母抗体中的两个CDRs(一个VH CDR1和一个VL CDR3结构域)保留了母分子的抗原识别特性，但具有更强的穿透肿瘤的能力。将这些CDR结构域用合适的连接子序列(如，来自VH FR2)连接，以与天然母抗体相似的方式定位所述CDRs，甚至可以带来更好的抗原识别。因此，本领域技术人员知道的是，通过适当的骨架区维持母抗体上的构型，有可能构造出包含两个CDR结构域(优选的，一个来自于VH结构域，一个来自于VL结构域，更加优选的，这两个CDR结构域中有一个为CDR3结构域)定位的抗原结合的抗体模拟物。
因此，虽然本发明优选的抗体可能包含6个CDR区(三个来自于轻链，三个来自于重链)，但是含有少于6个CDR区以及少至含有一个或两个CDR结构域的抗体也同样包括在本发明中。另外，含有只有重链或轻链的CDRs的抗体也同样处于可预期之中。
本发明中与EpCAM结合的优选的抗体至少包括包含三个CDRs的重链可变区，并且至少包括包含三个CDRs的轻链可变区，其中，所述重链可变区包括：
(c)VH CDR3，含有如SEQ ID NO：7的氨基酸序列或一个与其大体上同源的序列；或者
(a)可变重链(VH)CDR1，含有如SEQ ID NO：5的氨基酸序列或一个与其大体上同源的序列，
(b)VH CDR2，含有如SEQ ID NO：6的氨基酸序列或一个与其大体上同源的序列，以及
(c)VH CDR3，含有如SEQ ID NO：7的氨基酸序列或一个与其大体上同源的序列。
本说明书中例示了6种抗体克隆：3-17I、7-F17、12-C15、16-G5、17-C20和24-G6，所有这些均可与EpCAM结合，所有这些具有相同的重链CDR结构域(a)，(b)和(c)。也已鉴定了7种具有相同的重链CDR结构域并与EpCAM结合的其他的抗体克隆。因此，这些重链CDR结构域被认为对于结合EpCAM是重要的。由于抗体的CDR3结构域在抗原特异性方面经常非常重要，因此本发明特别优选具有基于SEQ ID NO：7的VH CDR3结构域的抗体。
用于与特定重链CDR结构域结合的优选的轻链CDR结构域在本说明书的其他地方描述，然而，其他包含用于与本发明的重链可变区结合的3个CDRs的轻链可变区也同样处于可预期之中。可用于与本发明的重链可变区联合的合适的轻链可变区，以及引起与EpCAM结合的抗体的合适的轻链可变区，本领域技术人员能够轻易地进行鉴定。
例如，本发明的重链可变区能够与单一轻链可变区，或者轻链可变区的所有成分，以及与生成的用于结合EpCAM的抗体相结合。
如果需要的话，类似的方法可用于鉴别与本发明优选的轻链可变区联合使用的可选的重链可变区。
在某些实施例中，抗体或抗体片段包含一个重链恒定区，如一个IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgE、IgM或IgD恒定区的全部或者一部分。优选的，重链恒定区是一个IgG1重链恒定区，或者是其一部分。此外，抗体或抗体片段能够包含全部的或者一部分的κ轻链恒定区或者λ轻链恒定区，或者其一部分。这种恒定区的全部或部分可以是天然产生的，或者可以是全部或部分合成的。对于这些恒定区的合适的序列在本领域中众所周知并有记录。当重链和轻链中恒定区的所有部分包括在本发明的抗体中，本说明书的这些抗体代表性地指代“全长”抗体或“全部”抗体。
含有Fc区的抗体对于特定的用途，特别是体内治疗用途是优选的，其中Fc区介导如ADCC和CDC的效应子功能。
在本说明书中，术语“大体上同源”用于与一个氨基酸或核酸序列相连，该氨基酸或核酸序列含有与说明书中披露的氨基酸或核酸序列至少70％或75％，优选的至少80％，以及更加优选的至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或者99％的序列一致性。本发明的大体上同源的序列因此包括与本发明的序列的单个或多个碱基或者氨基酸改变(添加，替换，插入或者缺失)。在氨基酸水平，在一个或多个骨架区中和/或一个或多个构成本发明的序列的CDRs中，优选的大体上同源的序列包含最多5个，如只有1、2、3、4或5个，优选的，1、2或3个，更加优选的1或2个改变的氨基酸。所述改变的可以为保守或者非保守氨基酸。优选的，所述改变为保守氨基酸的替换。在本发明的有些实施例中，某些残基被规定为X，然后，在大体上同源的序列所指代处，大体上同源的序列的氨基酸替换可以在除X残基外的其他残基上，如在除X残基外的1，2或3个残基上，或者替换可以在X残基处，如在1，2，或3个X残基处。
大体上同源的核酸序列同样包括与披露的核酸序列(或者它们的互补序列)杂交的核苷酸序列，如，在至少中等严格条件下，与编码一个或多个本发明的轻链或重链CDRs，本发明的轻链或重链可变区，或者本发明的抗体的核苷酸序列杂交(或者与它们的互补序列杂交)。
术语“大体上同源”同样包括以大体上相同的方法，执行与本发明的蛋白或核酸分子大体上相同的功能的本发明的氨基酸和核苷酸序列的修饰物或化学等同物。例如，任何大体上同源的抗体(或编码它的大体上同源的核酸)应该保留如上面所述的结合EpCAM的能力。优选的，任何大体上同源的抗体应该保留抗体的功能性能力，如本说明书中其他地方所明确的，例如至少与人源和猴源EpCAM结合的能力。优选的，任何大体上同源的抗体，应该保留特异性结合到与所述的抗体能识别的EpCAM相同的表位的能力，例如，与本说明书中所描述的，被本发明的CDR结构域所识别的或被本发明的VH和VL结构域所识别的相同的表位。与相同的表位/抗原结合可以轻易地通过本领域已知的并已被描述过的方法进行检测，如，采用结合分析法，如，竞争性分析法。保留其他功能特性也能够轻易地通过本领域已知的并已被描述过的方法进行检测。
因此，本领域技术人员应该理解的是，结合分析法能用于测试“大体上同源”的抗体是否与本发明的抗体和抗体片段具有相同的结合特异性，如，结合分析法如ELISA分析法或BIAcore分析法能够很容易地明确这种“大体上同源”的抗体是否能够与EpCAM结合。如下面所述，竞争性结合分析法可用于检测“大体上同源”的抗体是否保留了特异性结合到与本发明的抗体所识别的EpCAM大体上相同的表位上的能力，或者是否具有与本发明的各种抗体中的一种或多种(如3-17I)竞争的能力。下面所描述的方法仅仅是合适的竞争性分析法的一个例子。本领域技术人员应该知道其他合适的方法和变形。
一个示例性的竞争性分析法包括在受试抗体(如，大体上同源的抗体)处于不同浓度下，评估本发明的一种抗体在多种有效浓度下与EpCAM的结合能力。由受试抗体诱导的结合抑制量就可被测算出。受试抗体在逐渐增加的浓度下表现出与本发明的抗体增加的竞争性(如，受试抗体浓度增加导致本发明的抗体与EpCAM结合的量相应减少)，则可作为结合到大体上相同的表位的证据。优选的，受试抗体显著地降低了本发明的抗体与EpCAM结合的量。优选的，受试抗体至少能够将与EpCAM结合的本发明的抗体的量降低约95％。ELISA和流式细胞分析法比较适合用于分析在这种竞争性试验中的结合抑制情况，但是其他合适的技术对本领域技术人员也是熟知的。
本发明的蛋白大体上同源的序列包括，但不仅限于，保守氨基酸的替换，或者比如不影响抗体的VH、VL或CDR结构域的改变，如，包括使用了不同连接子序列的scFv抗体，或者增加了不影响与抗原结合的标签序列或其他组分的抗体，或者将一类或一种形式的抗体分子或片段转换成另一种类型或形式的抗体分子或片段的改变(如，从Fab到scFv的转换，或者反过来也一样)，或者一个抗体分子向抗体分子的一个特定类型或亚型的转换(如，一种抗体分子向IgG或其亚型，如IgG1或者IgG3的转换)。
如本说明书中所使用的，“保守氨基酸的替换”，指的是用具有相似侧链的另一个氨基酸残基替换一个氨基酸残基。具有相似侧链的氨基酸残基家族在本领域中已经被确定，包括碱性侧链(如，赖氨酸、精氨酸、组胺酸)，酸性侧链(如，天冬氨酸、谷氨酸)，无电荷极性侧链(如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，非极性侧链(如，甘氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)，β-分支侧链(如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳香族侧链(如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组胺酸)。
同源性可以用任何方便的方法进行测定。然而，为了测定序列之间同源性的程度，用于计算序列匹配排列程度的计算机程序可以得到应用，如Clustal W(Thompson等，1994)。如果需要的话，Clustal W算法可以与BLOSUM 62得分矩阵(Henikoff和Henikoff，1992)和10的空位开放罚分和0.1的空位扩展罚分合并应用，这样可以获得两个序列之间最高的顺序匹配度，其中，一个序列总长的至少50％会在校正时涉及到。其他可以用于定位序列的方法为Needleman和Wunsch(1970)的定位法，并由Smith和Waterman(1981)进行了修正，从而可以获得两个序列间最高的顺序匹配度，并且两个序列之间的相同氨基酸的数量也可得到测定。其他用于计算两个氨基酸序列之间一致性百分率的方法一般为本领域所公认，包括，例如，由Carillo和Lipton(1988)所描述的方法和由Computational Molecular Biology，Lesk，e.d.Oxford University Press，New York，1988，Biocomputing：Informatics and GenomicsProjects所描述的方法。
一般地，计算机程序会被用于进行这些计算。用于比较和排列序列对的程序，如ALIGN(Myers和Miller，1988)、FASTA(Pearson和Lipman，1988；Pearson，1990)和空位的BLAST(Altschul等，1997)，BLASTP，BLASTN或者GCG(Devereux等，1984)也可用于这个目的。此外，欧洲生物信息学研究中心的Dali服务器提供基于结构的蛋白序列排列服务(Holm，1993；1995；1998)。
通过提供一个参考点，按照本发明的序列含有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或者99％的同源性，序列一致性等可采用默认参数的ALIGN程序进行测定(例如在法国蒙彼利埃IGH的GENESTREAM网络服务商网上有提供)。
“最少中等严格杂交条件”意味着，需要选定条件以促进溶液中两个互补的核酸分子之间的选择性杂交。对于全部或者部分核酸序列分子均有可能发生杂交。杂交的部分典型为最少15(如，20、25、30、40或50)个核苷酸长度。本领域技术人员应该清楚，核酸双螺旋或杂交体的稳定性，由Tm决定，在含有钠的缓冲液中，Tm值与钠离子浓度和温度有关(Tm＝81.5℃-16.6(Log10[Na+])+0.41(％(G+C)-600/1)，或者类似的等式)。相应地，洗涤条件下决定杂交体稳定性的参数为钠离子浓度和温度。为了识别与已知核酸分子相似但不相同的分子，1％的错配率可认为能够带来Tm 1℃的降低。例如，如果核酸分子被认为具有＞95％的一致性，最终洗涤温度会下降约5℃。基于这些考虑，本领域技术人员可以很容易地选择合适的杂交条件。在优选实施例中，选择严格的杂交条件。通过示例的方法，下面的条件可用来实现精确的杂交：在5×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)/5×Denhardt溶液/1.0％SDS，根据上述公式算得Tm为-5℃时进行杂交，然后在60℃下用0.2×SSC/0.1％SDS进行洗涤。适当严格的杂交条件包括在42℃下用3×SSC进行洗涤的步骤。通过进一步示例，“杂交”的序列为在非严格条件下(如，6×SSC，50％甲酰胺，室温下)结合，在低严格条件下洗涤(如，2×SSC，室温下，更加优选的为2×SSC，42℃)或者在更高严格的条件下(如，2×SSC，65℃)(其中SSC＝0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠，pH 7.2)的序列。
然而，需要理解的是，也可通过使用可替换的缓冲液、盐及温度来达到相等的严格性。关于杂交条件的其他指示可以参见：Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley &Sons，N.Y.，1989，6.3.1-6.3.6及Sambrook等，Molecular Cloning，a Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989，Vol.3。
一般来说，优选采用在高严格性条件下杂交的序列，因为除了简并密码以外，其他序列都会在高严格性条件下杂交。
在其他优选实施例中，与原抗-EpCAM抗体，如3-17I、7-F17、12-C15、16-G5、17-C20或者24-G6相比，提供了具有增强的或更出色的性能的二代抗体。例如，二代抗体可能具有不同的结合亲和力或者良好的动力学常数(如结合率和/或解离率)、良好的交叉反应性谱、与肿瘤细胞良好的靶向能力，如诱导ADCC或CDC的改进的能力，或对体内肿瘤改进的治疗效果，或更高的生产水平。
鉴别有效的二代抗体的比较很容易进行和量化，如，使用一种或多种本说明书所详细描述的或在本领域中的各种测定方法。在二代抗体中，那些具有增强的生物学性质，或者与本发明的抗-EpCAM抗体相比，其活性至少为约2倍、5倍、10倍、20倍，优选的，至少为约50倍的二代抗体，正如3-17I抗体(或者7-F17、12-C15、16-G5、17-C20或24-G6抗体)所示例的，也包括在本发明中。
本发明中的抗体、结合蛋白和核酸分子一般为“分离的”或“纯化的”分子，因为它们与原位存在于人类或动物机体或源自人类或动物机体的组织样品的任何这类成分都不同。然而，这些序列可以与在人类或动物机体上发现的序列相对应或大体上同源。因此，对于本说明书中所使用的关于核酸分子或序列和蛋白或多肽，如，抗体，术语“分离”或“纯化”指的是从它们的天然环境中分离，或纯化得到，或大体上摆脱了它们的天然环境的这类分子，如，从人类或动物机体中分离或纯化而得(如果确实能自然发生的话)，或者指的是通过一个技术过程制备的这类分子，也就是，包括重组和合成而制备的分子。
因此，当用于核酸分子上时，这些术语可以指代大体上不含有与其天然地联系在一起的物质的核酸，这类物质如其他核酸/基因或多肽。这些术语也可指代一类核酸分子，该类核酸分子大体上不含有与通过重组DNA技术制备时的细胞物质或培养基，或大体上不含有通过化学合成时的化学前驱物，或其他化学物质。分离或纯化的核酸也可大体上不含有与核酸所起源于的核酸的天然侧部序列(也就是，位于核酸5′和3′端的序列)，或者不含有通过，例如，基因工程的方法制作而成核酸侧部的序列(如，标签序列或其他没有治疗作用的序列)。
因此，当用于本发明的蛋白或多肽分子，如轻链CDRs 1、2和3，重链CDRs 1、2和3，轻链可变区、重链可变区和结合蛋白或者抗体上，包括全长抗体上时，术语“分离”或“纯化”代表性地指代的是大体上不含与细胞物质或其他从中衍生出来的蛋白的蛋白。在有些实施例中，特别是在对人类或动物施用蛋白的实施例中，这些分离或纯化的蛋白大体上不含用重组技术制备时的培养基，或者用化学合成时的化学前驱物或其他化学物质。这些分离或纯化的蛋白也可与如上面所述的分离的核酸分子的侧部序列无关。
本说明书中使用的术语“核酸序列”或“核酸分子”指的是由天然存在碱基，糖和糖间(骨架)连接组成的核苷或核苷单体的序列。该术语同样包括包含非天然存在单体或其一部分的修饰的或替换的序列。本发明的核酸序列可以是脱氧核糖核酸序列(DNA)或者核糖核酸序列(RNA)，还可包括含腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶的天然存在碱基。所述序列也可包含修饰的碱基。这种修饰碱基的例子包括氮和脱氮腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶；以及黄嘌呤和次黄嘌呤。核酸分子可以是双链或单链。核酸分子可以是完全或部分合成或重组的。
在优选实施例中，本发明的抗体为人源抗体，更优选为完全人源的抗体。在这一点上，人源抗体在用于人类治疗时，总体上最少具有三个潜在优势。首先，人类免疫系统不会将抗体识别为异物。第二，在人类循环中的半衰期会与天然存在的人类抗体相似，使得可以使用更小的剂量，施用的次数不那么频繁。第三，由于效应部分为人源，它会与人类免疫系统的其他部分有更好的相互作用，比如，通过补体依赖的细胞毒效应(CDC)或抗体依赖的细胞介导的细胞毒效应(ADCC)而更有效地摧毁靶细胞。
然而，虽然人源抗体一般被认为会表现出这些优势，但是众所周知的是，开发具有足够高亲和力和适当的功能特性的人源抗体，使其能够用于成功的人类治疗中，这绝不是简单的事情。本领域因此仍然缺乏可安全有效地治疗人类的抗-EpCAM，开发这种试剂也是一种挑战。
本说明书中使用的术语“人源”与抗体分子和结合蛋白有关，首先指代的是一类抗体和结合蛋白，该类抗体和结合蛋白具有可变区(如，VH、VL、CDR或FR区)以及，可选的，恒定抗体区，分离于或来源于人体组成部分中或者来源于人体中，如，在人类生殖细胞或体细胞中发现的序列或与之相对应。3-17I抗体(以及7-F17，12-C15，16-G5，17-C20或24-G6抗体)是这种人源抗体分子的一个例子，其中可变区区已经从人源谱系中分离出来。
本发明的“人源”抗体和结合蛋白进一步包括不由人源序列编码的氨基酸残基，如，随机引入的突变或体外的位置定向突变，例如由体外克隆或PCR而引入的突变。这种突变的特别示例为涉及保守替换的突变，或抗体或结合蛋白较小数目残基的其他突变，如，最多5个，如在抗体或结合蛋白中的5、4、3、2或1个残基，优选的如，直到5个，如组成抗体或结合蛋白的一个或多个CDRs的残基中的5、4、3、2或1个。某些这种“人源”抗体的示例包括已经采用标准修饰技术，以减少潜在的能产生免疫性的位点的总量的一些抗体和可变区。
因此，本发明的“人源”抗体包括来源于人体内发现的序列并与之有关的序列，但可能不会天然存在于体内的人源抗体生殖细胞组成部分内。此外，本发明的人源抗体和结合蛋白包括含有自人源序列中鉴定的人源共有序列，或与人源序列大体上同源的序列。
此外，本发明的人源抗体和结合蛋白并不限于VH、VL、CDR或FR区构成的组合，VH、VL、CDR或FR区本身即发现于人源抗体分子中的组合。因此，本发明的人源抗体和结合蛋白能够包括这些不必要天然存在于人体中的区的组合，或者能与之相对应。
在优选实施例中，人源抗体为完全人源的抗体。如本说明书所使用的“完全人源”的抗体，是指包含如上面所述的“人源”可变区结构域和/或CDRs的抗体，没有大体上非人源抗体序列或没有任何非人源的抗体序列。例如，包含人源可变区结构域和/或CDRs“没有大体上非人源抗体序列”的抗体指的是抗体、结构域和/或CDRs，其中最多5个，如只有约5、4、3、2或1个氨基酸为不是由人源抗体序列编码的氨基酸。因此，“完全人源”的抗体不同于“人源化”的抗体，“人源化”的抗体基于的是大体上非人源的可变区结构域，如，小鼠可变区结构域，其中有些氨基酸被加以改变，以更好地与在人源抗体上典型存在的氨基酸相对应。
本发明中“完全人源”的抗体可以是人源可变区结构域和/或CDRs，没有任何其他大体上的抗体序列，如单链抗体。可选的，本发明的“完全人源”的抗体可以是整合在或有效附着于一个或多个人源抗体恒定区上的人源可变区结构域和/或CDRs。一些优选的完全人源的抗体为具有IgG恒定区的所有部分的IgG抗体。
在其他实施例中，本发明的“人源”抗体可以是部分人源的嵌合抗体。本说明书中所使用的“部分人源的嵌合”抗体，指的是一类抗体，包含有效附着在，或移植到全部或部分非人类物种，如大鼠或小鼠的恒定区上的“人源”可变区结构域和/或CDRs。这种部分人源的嵌合抗体可用于，比如，临床前研究中，其中优选使用与在临床前测试中使用的动物相同物种的恒定区。这些部分人源的嵌合抗体也可用于，比如说，在体(ex vivo)诊断中，其中非人源物种的恒定区可以提供抗体检测方面另外的选择。
本说明书中使用的术语“片段”指的是生物学相关的片段，比如，帮助抗原结合的片段，比如，构成抗原结合位点的一部分，和/或帮助抑制或减少EpCAM抗原的作用。有些优选的片段包括本发明抗体的重链可变区(VH结构域)和/或轻链可变区(VL结构域)。其他优选的片段包括一个或多个本发明抗体的重链CDRs(或一个或多个本发明的VH结构域)，或一个或多个本发明抗体的轻链CDRs(或一个或多个本发明的VL结构域)。有些优选的片段至少有5个氨基酸的长度，最少包括一个CDR区，优选为CDR3区，更加优选为重链CDR3区。
在有些实施例中，本发明的抗体包括一个任意所限定序列的片段(比如包含如SEQ IDNOs：21、36、49、62、75或者88的片段)，如，含有本发明的VH和/或VL结构域的抗体，或含有本发明的一个或多个CDRs的抗体或结合蛋白，然后这些区/结构域一般在抗体或结合蛋白内分离，这样每个区/结构域便可发挥它的生物学功能，如此促进抗原结合的能力便得以保留。因此，VH和VL结构域优选通过合适的支架序列/连接子序列而被分开，CDRs优选通过合适的骨架区，如在天然存在的抗体和/或有效的工程抗体中发现的骨架区而被分开。因此，本发明的VH、VL和单个CDR的序列优选通过合适的骨架或支架提供，或合并在其中，以使抗原结合。这些骨架序列或区可对应于天然存在的骨架区，FR1、FR2、FR3和/或FR4，以形成相应的合适的支架，或者可对应于一致的骨架区，例如可通过比较各种天然存在的骨架区而进行鉴定。或者，非抗体支架或骨架，如T细胞受体骨架也可被应用。
能够用于骨架区的合适的序列在本领域中已为人所熟知并有记录，这些中的任一种均可应用。用于骨架区的优选的序列为组成本发明的VH和/或VL结构域的一个或多个(如一个、两个、三个或四个)骨架区，即，一个或多个在SEQ ID NOs：21、36、49、62、75或者88中所披露的骨架区，或者在表1-6中披露的骨架区，或者与其大体上同源的骨架区，特别是能够维持抗原特异性的骨架区，例如能产生与抗体大体上相同或相同的3D结构的骨架区。在有些优选实施例中，所有的4个可变轻链(SEQ ID NOs：15、16、17和18)和/或可变重链(SEQ ID NOs：11、12、13和14)，如果适当的话，含如SEQ ID NO：21的FR区(同样见表1)，或大体上与之同源的FR区，包括在本发明的抗体中。其他优选的可变轻链骨架区的组合也在表2-6中示出。
此外，虽然本发明的优选抗体由本发明的VH、VL或者CDRs构成，但应该注意的是，本发明的抗体同样包含本发明的VH、VL或者CDRs的一个或多个与不属于本发明的其他VH、VL或者CDRs的联合，只要在说明书中列出的本发明的抗体的EpCAM结合特性或抗-EpCAM特性依然存在即可。
本说明书中使用的术语“重链互补决定区”(“重链CDR”)指的是抗体分子中重链可变区(VH结构域)内的超变量区。重链可变区有三个CDRs，从氨基末端到羧基末端分别称为重链CDR1，重链CDR2和重链CDR3。重链可变区同样具有四个骨架区(从氨基末端到羧基末端分别为FR1、FR2、FR3和FR4)。这些骨架区将CDRs分开。
本说明书中使用的术语“重链可变区”(VH结构域)指的是抗体分子重链的可变区。
本说明书中使用的术语“轻链互补决定区”(“轻链CDR”)指的是抗体分子中轻链可变区(VL结构域)内的超变量区。轻链可变区有三个CDRs，从氨基终点到羧基终点分别称为轻链CDR1，轻链CDR2和轻链CDR3。轻链可变区同样具有四个骨架区(从氨基终点到羧基终点分别为FR1，FR2，FR3和FR4)。这些骨架区将CDRs分开。
本说明书中使用的术语“轻链可变区”(VL结构域)指的是抗体分子轻链的可变区。
应该注意的是，本说明书在必要的地方，为了明确CDRs的定位，遵照了Kabat命名法(Kabat等，1991，被本说明书特别用于作为参考)。
本领域技术人员应该知道，本发明的蛋白和多肽，例如轻链和重链CDRs、轻链和重链可变区、抗体、抗体片段以及免疫偶联物，可以用本领域中熟知并被描述过的几种方法中的任一种进行制备，但是最优选采用重组的方法进行制备。
编码本发明抗体的轻链和重链可变区的核酸片段可以通过任何合适的方法，比如，通过克隆或合成的方法得到或制备。这种序列可以，比如说，采用在本领域中熟知并被描述过的方法，通过从，比如，人源生殖细胞系的基因中克隆合适的序列，然后对生殖细胞系的序列进行任何必要地修饰，以获得本发明的序列而制得。另外一种更有效的方法为将合适的轻链或重链可变区序列合成为重叠引物，并使用引物延伸法获得全序列。这种全序列然后可由PCR法进行扩增，其引物含有合适的限定位点，以进一步克隆和处理，比如，将其克隆到合适的表达载体中。每个可变区含有5-7个重叠引物通常就已足够，从而使这种技术非常高效和精确。
当编码本发明的抗体的轻链和重链可变区的核酸片段已经得到之后，这些片段可通过标准重组DNA技术进一步处理，例如将可变区片段转变成含有合适的恒定区结构域的全长抗体分子，或转变成本说明书其他地方提及的抗体片段的特殊类型，如，Fab片段，scFv片段，等等。典型的，或作为这种进一步处理程序的一部分，编码本发明的抗体分子的核酸片段一般会被并入一个合适的表达载体，以利于本发明的抗体的生产。
可能的表达载体包括但不仅限于粘粒、质粒或修饰病毒(如，复制缺陷的逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)，前提是载体能与使用的宿主细胞共存。表达载体“适合于宿主细胞的转化”，意味着表达载体包含本发明的核酸分子和基于表达所使用的宿主细胞而选择的调控序列，该调控序列有效地连接到核酸分子上。有效地连接意味着核酸分子与调控序列连接的方式使得核酸能够表达。
本发明因此还包括一个含有本发明的核酸分子的重组表达载体，或其片段，以及用于转录和翻译本发明的核酸分子所编码的蛋白序列的必要的调控序列。
合适的调控序列可以起源于多种来源，包括细菌、真菌、病毒、哺乳动物或者昆虫的基因(例如，参见在Goeddel，1990中所描述的调控序列)。合适的调控序列的选择取决于如下面所提及的选择的宿主细胞，并可轻易地通过本领域的常规技术中的一种而实现。这种调控序列的示例包括：转录启动子和增强子或RNA聚合酶结合序列，一种核醣体结合序列，包括翻译起始信号。另外，取决于选择的宿主细胞和应用的载体，其他序列，如复制起点、附加的DNA限定位点、增强子，以及具有转录诱导性的序列，都可以包含在表达载体内。
本发明的重组表达载体也可包含一个选择性标记基因，所述选择性标记基因利于转化的或转染了本发明的重组分子的宿主细胞的选择。选择性标记基因的示例为编码如新霉素和潮霉素这些对某些药物表现出抗性的蛋白的基因，编码β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、萤火虫萤光素酶或者免疫球蛋白或其一部分，如优选为IgG的免疫球蛋白的Fc部分的基因。选择性标记基因的转录通过选择性标记蛋白的浓度变化进行监控，这些选择性标记蛋白可以为β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶或者萤火虫萤光素酶。如果这种选择性标记基因编码具有抗生素抗性，如新霉素抗性的蛋白，那么转化株细胞可以用G418进行筛选。含有选择性标记基因的细胞能够存活下来，而其他细胞则会死掉。这使得能够对本发明的重组表达载体的表达情况进行描绘和测定，特别是能够测定在表达和表现型中一个突变所带来的影响。应该领会的是，选择性标记物可被引入与目标核酸分开的载体上。
重组表达载体也可包含编码融合部分的基因，其中融合部分可以使重组蛋白表达增加；使重组蛋白溶解性增加；通过在亲和纯化中作为配基，从而帮助靶重组蛋白纯化(例如可存在能够纯化和/或鉴别合适的“标签”，如，His标签或myc标签)。例如，可以在靶重组蛋白中加入蛋白水解位点，使得重组蛋白可以从融合部分中分离下来，然后对融合蛋白进行纯化。典型的融合表达载体包括pGEX(Amrad Corp.，Melbourne，澳大利亚)，pMal(NewEngland Biolabs，Beverly，MA)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，NJ)，其分别与谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白或者蛋白质A融合进入重组蛋白中。
重组表达载体可被引入到宿主细胞中，生成转化的宿主细胞。术语“由...转化”，“由...转染”，“转化”和“转染”其意思是包括了通过本领域中已知的多种可能的技术中的一种，将核酸(比如，载体)引入到细胞中的过程。本说明书中使用的术语“转化的宿主细胞”也指的是包括了已经用本发明的重组表达载体转化的能够糖基化的细胞。原核细胞能通过，例如，电穿孔或氯化钙介导的转化而由核酸进行转化。例如，核酸可以通过常规技术如磷酸钙或氯化钙共沉淀，DEAE-葡聚糖介导的转染，脂质转染，电穿孔或显微注射等方法被引入到哺乳动物细胞中。对于宿主细胞进行转化和转染的合适的方法可以在Sambrook等，1989，以及其他实验教科书找到。
合适的宿主细胞包括很多种真核宿主细胞和原核细胞。例如，本发明的蛋白可以在酵母细胞或哺乳动物细胞中表达。其他合适的宿主细胞可以参见Goeddel，1990。此外，本发明的蛋白可以在原核细胞，如大肠杆菌(Zhang等，2004)中表达。
适合于开展本发明的酵母和真菌宿主细胞包括，但不限于酿酒酵母、毕赤酵母属或克鲁维酵母菌属和多种曲霉属的物种。在酿酒酵母中表达载体的示例包括pYepSec1(Baldari.等，1987)、pMFa(Kurjan和Herskowitz，1982)、pJRY88(Schultz等，1987)以及pYES2(Invitrogen Corporation，San Diego，CA)。酵母和真菌的转化方案已经为本领域普通技术人员所熟知(参见Hinnen等，1978；Ito等，1983，以及Cullen等1987)。
适合于开展本发明的哺乳动物细胞包括，除其他外：COS(如，ATCC No.CRL 1650或1651)、BHK(如，ATCC No.CRL 6281)、CHO(ATCC No.CCL 61)、HeLa(如，ATCC No.CCL2)、293(ATCC No.1573)、NS-1细胞、NS0(ATCC CRL-11177)、HEK-293(人源肾细胞，ATCCnumber CRL-11268)以及Per.C6
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(Crucell，Leiden，Netherlands)。用于引导哺乳动物细胞表达的合适的表达载体一般包括一个启动子(如，来源于病毒物质，如多瘤病毒、腺病毒2、巨细胞病毒和猿猴病毒40)，以及其他的转录和翻译控制序列。哺乳动物表达载体的示例包括pCDM8(Seed，B.，1987)和pMT2PC(Kaufman等，1987)。
考虑到本说明书所提供的知识，启动子、终止子，以及将合适类型的表达载体转运进入植物、鸟类和昆虫细胞中的方法也都能够很容易地实现。例如，在一个实施例中，本发明的蛋白可以在植物细胞中表达(参见Sinkar等，1987，这篇文章对毛根农杆菌载体的使用进行了综述；也可参见Zambryski等，1984，这篇文章对于植物细胞中的表达载体的使用进行了描述，其中包括，PAPS2022、PAPS2023和PAPS2034等)。
适合于开展本发明的昆虫细胞包括家蚕属(Bombyx)、Trichoplusia或者Spodotera等物种的细胞和细胞系。可用于在培养的昆虫细胞(SF 9细胞)中表达蛋白的杆状病毒载体包括pAc系列(Smith等，1983)以及pVL系列(Luckow和Summers 1989)。有些适合于表达本发明的重组蛋白的杆状病毒-昆虫细胞表达系统已经在PCT/US/02442中进行了描述。
或者，本发明的蛋白也可在非人源的转基因动物如大鼠、兔、绵羊和猪中表达(Hammer等，1985；Palmiter等，1983；Brinster等，1985；Palmiter和Brinster 1985以及U.S.PatentNo.4,736,866)。
本发明的蛋白也可采用蛋白化学领域熟知的技术，如固态合成(Merrifield(1964)；Frische等，1996)或均相溶液合成(Houbenweyl，1987)，通过化学合成的方法进行制备。
含有与其他分子，如蛋白偶联的本发明的抗体和蛋白的N-末端或者C-末端融合蛋白，可通过重组技术融合制备。生成的融合蛋白包含与本说明书中描述的选择的蛋白或标识物蛋白，或标签蛋白融合的本发明的抗体或蛋白。本发明的抗体和蛋白也可通过已知技术与其他蛋白偶联。例如，蛋白可以采用如WO 90/10457中所描述的N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶基二硫代-丙酸酯)或N-琥珀酰亚胺-5硫代乙酸酯等异双功能含硫醇的连接子进行偶联。可用于制备融合蛋白或偶联物的蛋白示例包括细胞结合蛋白，如免疫球蛋白、激素、生长因子、凝集素、胰岛素、低密度脂蛋白、胰高血糖素、内啡肽、转铁蛋白、铃蟾肽、脱唾液酸糖蛋白谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、血细胞凝聚素(HA)以及截短型myc。
如果不考虑制备第一个抗-EpCAM抗体核酸片段的方式的话，更合适的抗体核酸片段可以很容易地通过标准分子生物学技术制备得到。为了证实任何变异体、突变体或二代抗-EpCAM抗体核酸片段是否适合于用在本发明中，需要对核酸片段进行测定，以证实根据本发明的抗-EpCAM抗体的表达。优选的，变异体、突变体或二代核酸片段也需要进行测定，以验证标准条件下的杂交水平，更加优选的，标准严格的杂交条件下的杂交水平。可仿效的合适的杂交条件包括在约50℃下，7％十二烷基硫酸钠(SDS)，约0.5M NaPO4，约1mM EDTA进行杂交；并在42℃下用1％SDS进行洗涤。
由于多种抗体可以很容易地制备，本发明的治疗方法可按如下进行：向动物或患者提供至少第一个核酸片段或分子，这些核酸片段或分子可在患者体内表达出至少是本发明的第一个抗-EpCAM抗体的治疗有效量。“表达抗-EpCAM抗体的核酸片段或分子”其形式一般至少为一个表达构建体或载体，其形式也可以为包含在病毒或重组宿主细胞内的表达构建体或载体。本发明优选的基因治疗载体一般为病毒载体，例如包含在重组逆转录病毒、单纯疱疹病毒(HSV)、腺病毒、腺伴随病毒(AAV)、巨细胞病毒(CMV)等。
另一方面提供了一种包括一个或多个本发明的核酸片段或分子的表达构建体或表达载体。表达构建体或载体优选为重组体。所述构建体或载体优选进一步包括用于由本发明的核酸分子编码的蛋白序列的转录和翻译中必要的调控序列。
另一方面提供了一种包括一个或多个本发明的表达构建体或表达载体的宿主细胞或病毒。同样提供的还有含有一个或多个本发明的核酸分子的宿主细胞或病毒。表达本发明的抗体的宿主细胞或者病毒形成了另一方面。
本发明的另一方面提供了生产本发明的抗体的一种方法，包括培养本发明的宿主细胞的步骤。优选的方法包括以下步骤：(i)在适合表达这些编码的抗体或蛋白质的条件下培养宿主细胞，该宿主细胞含有一个或多个重组表达载体，或含有一个或多个本发明的核酸序列；以及有选择的(ii)从宿主细胞中或从生长培养基/上清中分离或获得抗体或蛋白。这类制备方法也可能包含对抗体或蛋白产品进行纯化的步骤和/或将抗体或产品制作成包括至少一个附加的成分，如在药学可接受载体或赋形剂的组成物。
在有些实施例中，本发明的抗体或蛋白由多于一个的多肽链组成(比如，某些片段，如Fab片段)，然后所有的多肽优选在宿主细胞中表达，可以在相同的也可以在不同的表达载体上，这样完整的蛋白，如，本发明的结合蛋白，便能够在宿主细胞中组装并可从中分离或纯化。
本发明的抗体也可用于生产与EpCAM结合的另外的抗体。这些用途包括比如说在一个母抗体的氨基酸序列中添加、缺失、替换或插入一个或多个氨基酸，以形成一个新的抗体，其中所述母抗体属于说明书其他部分所限定的本发明的抗体中的一种，并测定生成的新抗体，以识别出能够与EpCAM结合的抗体。这些方法可用于形成多样化的新抗体，所有这些都能测试它们与EpCAM结合的能力。优选的，所述添加、缺失、替换或插入一个或多个氨基酸发生在一个或多个CDR结构域中。
这种对母抗体的修饰或突变可以使用本领域中熟知并被记录的技术以任何合适的方式进行，例如采用随机或定向突变的方法进行。如果采用的是定向突变，那么识别适于发生突变的残基的策略则利用结合蛋白-抗原复合物，如，Ab-Ag复合物的晶体结构的分辨率，以识别出抗原结合方面的关键残基(Davies和Cohen，1996)。随后，对那些残基可以进行突变，以提高相互作用。还有一种选择，一个或多个氨基酸残基可以简单的被指定为进行定向突变，然后评估对于与EpCAM结合的影响。
随机突变在任何合适的方式，如，易错PCR、链更替或增变基因大肠杆菌株中进行。
因此，一种或多种本发明的VH结构域可以与单个VL结构域或者任何合适来源的VL结构域所有组成成分结合，生成的新抗体进行测试，以识别对EpCAM有特异性的抗体。相反地，一种或多种本发明的VL结构域可以与单个VH结构域或者任何合适来源的VH结构域所有组成成分结合，生成的新抗体进行测试，以识别结合EpCAM的抗体。
类似地，一种或多种，或者优选的所有三个本发明的VH和/或VL结构域的CDRs，可以被插入单个VH和/或VL结构域或所有合适的VH和/或VL结构域中，生成的新抗体进行测试，以识别能与EpCAM结合的抗体。
CDRs，特别是轻链和/或重链的CDR3的靶向突变，已经表现为是一种提高抗体亲和力的有效的技术，也是优选的。优选的，对CDR3或者称为“热点”的特殊区中的3-4个氨基酸块可进行靶向突变。
“热点”指的是在体内发生体细胞高突变的序列(及其下面Neuberger和Milstein，1995)。热点序列可以被规定为在某些密码子中共有的核苷序列。共有序列指四核苷酸，RGYW，其中R可以为A或G，Y可以为C或T，W可以为A或T(Neuberger和Milstein，1995)。此外，由核苷酸AGY编码的丝氨酸残基，相对于那些由对应于一个潜在的热点序列的TCN所编码的丝氨酸残基，主要出现在可变结构域的CDRs区中。
因此，本发明的每个抗体的重链和轻链的CDRs的核苷酸序列可进行扫描，以检测热点序列和AGY密码子的存在。轻链和重链CDR区中所识别的热点便可任选地，使用International ImMunoGen Tics数据库(IMGT，http://imgt.cines.fr/textes/vquest/)，与重链和轻链的生发序列进行比对(Davies等，1990)。如果一个序列与生殖细胞系的相同，则意味着没有发生体细胞突变；因此可引入随机突变，模拟体内发生的体细胞事件，或者也可以，如，在热点和/或AGY密码子处采用位置定向突变。与之相对，不同的序列表明已经发生了一些体细胞突变。如果在体内体细胞突变是最佳的，则其仍有待决定。
优选的突变热点指的是那些编码暴露的氨基酸的热点，优选指的是编码构成抗原结合位点部分的氨基酸的热点。其他优选的突变热点为编码非保守氨基酸的部分。编码CDRs内埋藏或保守氨基酸的热点优选不发生突变。这些残基一般对于总体结构很关键，由于它们被埋藏在内，不太可能与抗原发生相互作用。
对于氨基酸和蛋白结构域执行上面所描述的处理的方法对本领域技术人员来说是熟知的。例如，所述处理可以很便利地通过基因工程的方法在核酸水平开展，其中对编码合适的结合蛋白及其结构域的核酸分子进行修饰，使得生成的表达蛋白其氨基酸序列进而能够以合适的方式得到修饰。
由这些方法制造的新抗体优选具有改进的功能特性，如比母抗体相比具有更高的或增强的与EpCAM的亲和力(至少具有相等的亲和力)，并且可以按照与本说明书其他地方描述的本发明的抗体相同的方式进行处理和应用(如，用于治疗、诊断、在组合物中等)。可选地，或者另外，新抗体具有一个或多个如本说明书其他地方描述的改进的功能特性。
由这些方法生产，获得或能够获得的新抗体构成了本发明的另一方面。
可以通过任何合适的方法去测定一个或多个抗体与EpCAM结合的能力，这些都是本领域已知并被描述过的方法。EpCAM样品，例如从各种物种中获得的重组EpCAM，都可以购买到(如从R&D Systems Inc，Minneapolis，MN，USA)或者很容易地通过本领域已知的EpCAM分子的序列信息而生成(参见示例)，并且这些都可很容易地用于测定结合性，例如可通过常规方法，如ELISA、BIAcore，等，其中例如EpCAM附着于固相载体上，抗体与其结合的能力可通过标准技术进行测定。或者，也可通过蛋白质印迹测定与EpCAM的结合情况。包含EpCAM的细胞外结构域的EpCAM样品特别适合于这些目的。
或者，如采用流式细胞术或者IHC，能够表达高水平EpCAM的细胞(如胃癌细胞株如Kato III、乳腺癌细胞株如MT-3、BT474、MDA-MB-453及MDA-MB-231)或者被设计成表达高水平的EpCAM的细胞，可用于评价抗体的与EpCAM结合的情况。
在示例中描述了合适的ELISA，蛋白质印迹以及BIAcore测定法。在任何测定法中，抗体与EpCAM结合的能力，如与特殊物种的EpCAM结合的能力，一般指的是与合适的对照，如不与EpCAM结合的抗体相比，抗体表现出的与EpCAM的可测量的以及优选的显著结合的能力。对于被认为是不能与EpCAM结合的抗体，例如不能与某个特殊物种的EpCAM结合的抗体，然后一般来说这种抗体显示出不显著的或检测不到的或无法测量到的与EpCAM的结合，例如无法测定或显著高于或不同于合适的对照，如不与EpCAM结合的抗体的水平。
在本说明书所提及的任何统计分析中，与相对应的空白对照相比，其统计上的显著性差异概率值优选要＜0.1，优选＜0.05，更加优选＜0.01。测定统计学意义的合适的方法在本领域中已为人所熟知并有记录，这些中的任一种均可应用。
本发明进一步提供了包含最少一种本发明的抗体或抗体片段的组合物，也可以包括稀释液。这种组合物可以是药学可接受的组合物或用于实验室研究的组合物。对于用于药物组合物来说，它们优选采用非肠道施用方式，如静脉施用或还可以是皮下施用。
本发明提供了本发明的人源抗体和抗体片段的多种方法和用途。在所有方法中，除非特别说明，术语“一”和“一个”用于指代所列举的方法的步骤中的“最少一个”，“至少第一个”，“一个或多个”或“多个”。这种指代方式与治疗方法中的施用步骤尤其相关。因此，本发明不仅可应用不同的剂量，还可应用不同数量的剂量，如注射法，直到和包括多重注射。可以在抗-EpCAM治疗抗体施用前，施用后或施用中应用组合治疗。
本发明的抗体或免疫偶联物由于其具有多种有用的体外方法和用途，使其具有重要的生物学意义。首先提供的是在结合EpCAM上的方法和用途，一般包括至少将本发明第一种抗-EpCAM抗体，或其抗原结合片段与含有EpCAM(或有可能含EpCAM)的组合物有效地接触。本发明的抗体，或其免疫偶联物，便因此能够用于结合分析中。适当有用的结合分析法因此包括那些本领域所常用的，如免疫印迹、蛋白质印迹、斑点印迹、RIAs、ELISAs、免疫组织化学、荧光激活的细胞分类(FACS)、免疫沉淀反应、亲和层析等。
还提供了检测EpCAM方面的方法和用途，一般包括在能够有效形成EpCAM/抗体复合物及检测形成的复合物的条件下，用最少含有本发明第一种抗体或免疫偶联物，或其抗原结合片段与有可能含EpCAM的组合物进行接触。该检测方法和用途可用于例如，诊断肿瘤的生物学样品上，以及同样提供的基于此的诊断试剂盒。
本发明的方法和用途特别适用于某些动物和患者，这些动物和患者指的是，具有，或有可能发展到的任何与EpCAM有关，或EpCAM在其中发挥生物学作用的疾病或状况，例如与EpCAM存在或过表达或EpCAM活性异常有关的疾病，例如抑制EpCAM活性便有可能产生有益效果的疾病。优选的示例为癌症或癌，优选为包括在乳腺、结直肠、前列腺、卵巢、膀胱、胆囊、胰脏、肺、胃的组织或器官(如胃、食道)、肝脏(如肝细胞癌)、肾脏(如肾细胞癌)、皮肤癌、头和颈部癌(如神经胶质瘤)、唇、嘴、阴道和子宫颈处的癌症中的一种或几种。本说明书中任何提及“肿瘤”之处也同样指代“癌症”或“癌”。转移性癌症也能够治疗，因为可以减少其从原发肿瘤处的转移。尤其是，残留在术后患者体内的所谓的微量残存疾病(MRD)，也可接受应用抗-EpCAM抗体的免疫疗法。
如果患者的肿瘤处于可检测到的水平，优选为其EpCAM的表达处于可检测到的高水平，那么这类患者有可能非常适合于采用本发明的抗-EpCAM抗体的治疗。此外，得有肿瘤的患者，如果其没有表达出非常高水平的Her-2，因而不适于接受赫赛汀(Herceptin)疗法的话，可能特别适合于这种抗-EpCAM的疗法。可以采用本领域中熟知的合适的方法检测肿瘤的表达水平。
本发明因此进一步提供了在治疗上述疾病上的方法和用途，包括向患有这类疾病的动物或患者给予治疗有效剂量的本发明的抗-EpCAM抗体，或这种抗-EpCAM抗体的抗原结合片段或免疫偶联物。
另一方面，本发明提供了本发明的抗体或这类抗体的抗原结合片段或免疫偶联物在制造成组合物或药剂后，用于治疗，成像或诊断上的应用。
另一方面还提供了本发明的抗体或这类抗体的抗原结合片段或免疫偶联物在治疗，诊断或成像上的应用。
此外，本发明提供了一种组合物，包含本发明的抗体或该类抗体的抗原结合片段或免疫偶联物，还包含一种或多种药学可接受的赋形剂、载体、稀释液、缓冲液或稳定剂。
本说明书中描述的体内的方法一般在哺乳动物中开展。任何哺乳动物都可应用，例如人类和任何家畜、家养或实验动物。具体实例包括小鼠、大鼠、猪、猫、狗、绵羊、兔、牛和猴。然而，优选的，哺乳动物为人。
因此，在本说明书使用的术语“动物”或“患者”包括任何哺乳动物，例如人类和任何家畜，家养或实验动物。具体实例包括小鼠、大鼠、猪、猫、狗、绵羊、兔、牛和猴。然而，优选的，动物或患者是一个人类使用对象。
本发明将使用未偶联的抗体或裸抗体及其片段的抗癌方法，以及使用含有本发明的抗体或其抗原结合片段的免疫偶联物的癌症靶向方法相结合，有效附着在治疗试剂或诊断试剂上。对于科学术语，除非特别声明或解释，本说明书中的术语“抗体及其片段”，因此指代的是“未偶联的或裸”抗体或片段，不与另外的试剂相连，特别是治疗或诊断试剂。这些限定不排除对抗体的修饰，例如，仅通过示例的方式，改善抗体的生物半衰期，亲和力，亲和性或其它特性的修饰，或者对含其它效应子的抗体组合物的修饰。
本发明的抗癌治疗方法和用途同样包括了未偶联抗体或裸抗体和免疫偶联物这两者的用途。在基于免疫偶联物的抗癌治疗方法中，本发明的抗体，或其抗原结合片段，优选可以有效地附着于第二种抗癌试剂上(抗-EpCAM抗体本身为第一种抗癌试剂)。所附着的抗癌试剂可以是具有直接或间接抗癌效果的试剂。
前面的治疗方法和用途一般涉及到对动物或患者全身如通过皮肤、肌肉、静脉注射等给予有药效的组合物。然而，只要能使治疗试剂在肿瘤位置处集中，任何施用途径都是可以接受的。因此，其他合适的施用途径包括口、鼻或呼吸和局部施用。
本说明书中所使用的“施用”，指的是提供或运送抗-EpCAM抗体的治疗剂，其量和时间周期能够有效地达到发挥治疗目的，如抗肿瘤效果的程度。蛋白治疗剂的被动施用一般作为优选方案，部分由于其单一性和可再现性。
然而，术语“施用”在本说明书中用于指代将本发明的抗-EpCAM抗体传递给或否则提供给肿瘤的任何及所有的方式。“施用”因此包括以一种有效的方式提供能够生产本发明的抗-EpCAM抗体的细胞，以带来向肿瘤转运的效果。在这样的实施例中，可以将细胞制定或包装在选择性渗透膜，构造或可植入性设备中，一般能够去除以停止治疗。本发明的外生的抗-EpCAM抗体一般仍然可作为优选，因为这种抗体代表了一种无创性方法，使得剂量可以被精确地监测和控制。
本发明的治疗方法和用途同样可扩展到提供编码本发明的抗-EpCAM抗体的核酸上，其方式能够有效地使它们在肿瘤附近表达，或者使它们能够集中在肿瘤附近。任何基因治疗技术都可应用，如裸DNA递送、重组基因和载体、基于细胞的递送，包括患者细胞的体外处理等。
本发明的抗-EpCAM抗体也可用于递送其他治疗或诊断肿瘤的试剂。在这样的实施例中，其他的治疗或诊断试剂一般有效地附着在本发明的抗-EpCAM抗体上。
本说明书使用的术语“治疗”或“处理”包括预防性治疗，可以防止疾病的发生。术语“治疗”和“处理”包括与疾病斗争或治疗疾病，但同样包括控制、减少或缓和疾病或一种到多种与此有关的症状。本发明的抗体也可用于预报应用，如用于预报EpCAM水平会发生改变的疾病。因此，本发明的抗体可用于预测癌症。
本发明中使用的“治疗有效量”指的是本发明的抗-EpCAM抗体，或其免疫偶联物达到有效地特异杀灭至少一部分肿瘤细胞时的量；达到有效地特异性诱导至少一部分肿瘤细胞发生细胞凋亡时的量；达到有效地特异性诱导至少一部分肿瘤坏死时的量；和/或在对动物或患者施用后诱导肿瘤退化或缓解时的量。优选在取得这些效果的同时，对于正常的健康组织的细胞，只表现出很弱的结合或无结合，或者只表现出微弱的杀伤或无杀伤；对于动物或患者的正常的健康组织，只表现出可忽略的或可控制的副作用效果。
本说明书在关于杀伤或诱导细胞凋亡的部分，或在诱导肿瘤细胞坏死的部分，或在诱导肿瘤退化或缓解的部分中使用的术语“优先地”和“特异地”，便因此指的是本发明的抗-EpCAM抗体或其免疫偶联物，其功能是实现大体上只限于肿瘤位置处的肿瘤破坏和/或肿瘤坏死，并不会明显大体上扩展并导致对于动物或患者的正常、健康组织的破坏和/或组织坏死。健康细胞和组织的结构和功能因此能够通过本发明的使用而得以基本不受损伤。
本发明的抗-EpCAM抗体或治疗偶合物优选连接到一种或多种放射治疗试剂、化学治疗试剂、抗血管生成试剂、细胞凋亡诱导剂、抗微管蛋白药物、抗细胞的或细胞毒试剂、类固醇、细胞因子、趋化因子、ATP酶抑制剂、其他抗体(如双特异性抗体或双抗体)或凝聚剂(凝血因子)。
本发明因此提供了一系列的偶联抗体及其片段，其中抗-EpCAM抗体有效地附着在至少一种其他治疗或诊断试剂上。术语“免疫偶联物”很宽泛地用于限定抗体与其他有效试剂之间的有效结合，并不仅仅指代何种形式的有效结合，特别是不限于化学“结合”。特别涉及到重组融合蛋白。只要递送或靶向试剂能够与目标结合，以及这些治疗或诊断试剂在递送时保持足够的功能，那么这种附着的方式就是合适的。
本发明同样包括了通过糖类部分将试剂附着在抗体上。既可与O连接又可与N连接的糖基化会自然地发生在抗体上。如果需要的话，重组抗体可以被修饰，以再创造或创造附加的糖基化位点，这个很容易通过向抗体的一级序列中插入设计的合适的氨基酸序列(如Asn-X-Ser、Asn-X-Thr、Ser或者Thr，其中X不是Pro)而实现。
当前优选用于本发明的抗-EpCAM抗体或者治疗偶合物的试剂和相关的方法及用途为补充或增强抗体的效果和/或被选择用于特殊的肿瘤类型或患者。“用于补充或增强抗体效果的治疗试剂”包括放射治疗试剂、化学治疗试剂、抗血管生成试剂、细胞凋亡诱导剂、抗微管蛋白药物、抗细胞的或细胞毒试剂、类固醇、凝聚剂、细胞因子、趋化因子、ATP酶抑制剂、其他抗体(如双特异性抗体或双抗体)，此处其中的任何一种或多种在使用上都是优选的。
当前优选的抗血管生成试剂包括血管抑素、内皮抑素、任意一种血管生成素、血管抑制素、血管能抑制素和乳腺丝抑蛋白。
本说明书中使用的“抗微管蛋白药”，指的是能够抑制细胞有丝分裂，优选通过直接或间接抑制对细胞有丝分裂必要的微管蛋白活性，优选为微管蛋白聚合或者解聚作用的任何试剂、药物、前药或其组合物。当前优选的抗微管蛋白药物包括秋水仙碱、紫杉酚、长春碱、长春新碱、长春地辛(vindescine)以及一种或多种考布他汀类(combretastatins)。
将优选的试剂与本发明的抗-EpCAM抗体附着或结合生成了“免疫偶联物”，其中这种免疫偶联物常常具有增强的和甚至是协同的抗肿瘤特性。
抗体-药物偶联物(ADC)如和auristatins、卡奇霉素、类美坦素或者烷化剂偶联后也适用于本发明。
使用抗细胞和细胞毒剂会导致本发明的抗-EpCAM抗体“免疫毒素”，然而使用凝血因子会导致本发明的抗-EpCAM抗体“凝固配体(coaguligands)”。
使用最少两种治疗剂也同样包括在本发明中，如一种组合物，包含一种或多种放射治疗试剂、化学治疗试剂、抗血管生成试剂、细胞凋亡诱导剂、抗微管蛋白药物、抗细胞和细胞毒试剂、类固醇、细胞因子、趋化因子、ATP酶抑制剂、其他抗体(如双特异性抗体或双抗体)和凝血因子。
在有些应用中，本发明的抗-EpCAM抗体治疗剂可以与细胞毒类试剂，细胞抑制剂或其他能够杀灭细胞或抑制细胞生长或细胞分裂的抗细胞类试剂有效结合。合适的抗细胞试剂包括化学治疗试剂，也包括细胞毒素和细胞抑制剂。细胞抑制剂一般能够扰乱靶细胞的天然细胞周期，优选使细胞不处于细胞周期中。
示范性的化学治疗试剂包括：激素，如类固醇；细胞因子；抗代谢物，如阿糖胞苷、氟尿嘧啶、氨甲蝶呤或者氨基蝶呤；蒽环类；丝裂霉素C；长春碱类；抗生素；秋水仙胺；依托泊苷；光神霉素；以及抗肿瘤烷化剂，如苯丁酸氮芥或者苯丙氨酸氮芥。有些优选的抗细胞试剂为DNA合成抑制剂如正定霉素、多柔比星/阿霉素等。总体来说，紫杉酚/紫杉醇、多烯紫杉醇、顺铂、吉西他滨、考布他汀和多柔比星/阿霉素是目前优选的抗癌试剂。
在细胞因子和趋化因子中，目前优选的试剂为IL-2，IL-12，TNF-α，干扰素-α(IFN-α)、IFN-β、IFN-γ、GM-CSF和LEC(肝脏表达的趋化因子)。V型ATP酶抑制剂也是目前优选的，例如水杨酰胺(salicylihalamide)、伴刀球霉素或巴佛洛霉素，例如蛋白合成抑制剂，如psymberin、鸡矢素(pederin)、irciniastatin A。
在某些治疗应用中，由于大部分毒素与其他可能的试剂相比具有更强的传递细胞杀伤效应的能力，毒素部分是优选的。因此，对于本发明的抗-EpCAM抗体构建体，有些优选的抗细胞试剂为植物，真菌或者细菌来源的毒素。示例性毒素包括表鬼臼毒素；细菌内毒素或细菌内毒素的脂质A部分；核糖体失活蛋白，例如皂草素或白树毒素；a-八叠球菌；曲霉素；局限曲菌素；核糖核酸酶，例如胎盘核糖核酸酶；白喉毒素和假单胞菌外毒素。当前优选的示例为篦麻毒蛋白、白树毒素、相思豆毒素、白喉、假单胞菌和百日咳毒素。
有些优选的毒素为A链毒素，比如篦麻毒蛋白A链。最优选的毒素部分经常为经过处理修饰或除去糖类残基后的篦麻毒蛋白A链，称之为“脱糖基化A链”(dgA)。脱糖基化篦麻毒蛋白A链可作为优选，因为其具有极高的毒性，较长的半衰期，另外因为生产制造它以达到临床等级和规模在经济上比较可行。重组和/或截短的篦麻毒蛋白A链也同样可用。
本发明的抗-EpCAM抗体治疗剂可以包括能够促进凝聚的组分，例如，促凝剂。在这里，靶向抗体可用直接地或间接地，例如，通过另一个抗体，连接到能够直接或间接地促进凝聚的因子上。
用于这种用途的优选的凝血因子可以是组织因子(TF)和TF衍生物，比如截短型TF(tTF)、二聚、三聚、聚合/多聚TF，以及刺激因子VII能力缺陷的突变体TF。其他合适的凝血因子包括维生素K-依赖的凝聚剂，比如因子II/IIa、因子VII/VIIa、因子IX/IXa和因子X/Xa；缺乏Gla修饰的维生素K依赖的凝血因子；拉塞尔蝰蛇毒素因子X激活剂；血小板激活化合物，比如血栓烷A2和血栓烷A2合酶；以及纤维蛋白裂解抑制剂，比如α2-抗纤溶酶。总体上，截短型组织因子(tTF)在目前是优选的。
免疫偶联物和免疫毒素的制备方法一般为本领域技术人员所熟知(参见，例如，U.S.Patent No.4,340,535)。下面的每个专利都被进一步与本说明书组合，以参考其在免疫毒素产生，纯化和使用方面的进一步补充本发明的目的：U.S.PatentNo.6,004,554；5,855,866；5,965,132；5,776,427；5,863,538；5,660,827和6,051,230。
各种化学治疗和其他药学试剂都能够成功地与本发明的抗-EpCAM抗体治疗剂相偶联。示例性的与抗体偶联的抗肿瘤试剂包括多柔比星、道诺霉素、氨甲蝶呤和长春碱。而且，其他试剂比如新抑癌素，巨毛霉素，三亚胺和α-鹅膏菌素的附着方式已经被描述(参见U.S.Patent No.5,660,827；5,855,866；和5,965,132；每个都在本说明书中涉及到。)
制备凝固配体也很容易进行。一种或多种凝血因子与本发明的抗-EpCAM抗体之间的可行的连接方式可以是直接连接，例如那些已在上面关于免疫毒素时描述过。或者，可行的连接方式可以为间接的附着，比如抗体可以有效附着于第二结合区，优选有效附着于与凝血因子结合的抗体或抗体的抗原结合区上。凝血因子应该与本发明的抗-EpCAM抗体在与其功能性凝集位点分开，特别是在使用共价键与分子结合的位点上。
双特异性或三特异性抗体也可用于本发明的方法中。在这类抗体中，一个臂与EpCAM结合，也可作为本发明的抗体。在有些优选的示例中，双特异性或三特异性抗体的其他臂的特异性为抗-CD3、-CD16、-CD28、-NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46或者抗-VEGF，以阻断肿瘤血管生成。制备双特异性抗体的方法在本领域中是熟知的，并已被描述过。
在制备免疫偶联物、免疫毒素和凝固配体时，可以应用重组表达。编码所选的本发明的抗-EpCAM抗体，以及治疗试剂、毒素或者凝聚剂的核酸序列，在框内附着在一个表达载体中。重组表达便因此会带来核酸的翻译并生产出所需要的免疫偶联物。化学交联剂和亲和素：生物素桥也可将治疗剂与本发明的抗-EpCAM抗体连接在一起。
本发明的组合物和方法可用于与其他治疗剂和诊断剂结合。在生物学试剂方面，优选采用诊断或治疗试剂用于与依照本发明的抗-EpCAM抗体“结合”，术语“结合”简洁地用于涵盖一系列的实施例。术语“结合”，除非另行特别声明或对该科学术语进行解释，否则均适用于多种形式的结合组合物、药品、复合物、试剂盒、方法，以及第一和第二医学用途。
本发明“结合”的实施例因此包括，例如，本发明的抗-EpCAM抗体是一个裸抗体，并与没有有效附着其上的试剂或治疗试剂联合应用。在这种情况下，试剂或治疗试剂可以非靶向性或靶向性的形式而得到应用。在“非靶向性形式”中，试剂，尤其是治疗试剂，一般会按照它们在本领域中的标准用法而得到应用。在“靶向性形式”中，试剂一般会有效附着在一个独特的抗体或能够将试剂或治疗试剂递送至血管生成疾病位置或肿瘤处的靶向区上。这种既可以是诊断剂又可以是治疗剂的生物学试剂，其靶向性形式的应用在本领域中也同样非常标准。
在本发明的其他“组合”的实施例中，本发明的抗-EpCAM抗体为免疫偶联物，其中抗体本身与试剂或治疗试剂有效连接或结合在一起。有效的附着方式包括在本说明书中描述过的以及本领域所知道的所有形式的直接或间接的附着方式。
“结合”的用法，尤其是在将本发明的抗-EpCAM抗体与治疗剂联合应用这方面，同样包括了结合的组合物、药物、复合物、试剂盒、方法，以及第一和第二医学用途，其中治疗试剂为前药的形式。在这些实施例中，能够将前药转化成药物的功能形式的激活成分有可能再次与本发明的抗-EpCAM抗体有效地结合。
在有些优选实施例中，治疗组合物、结合物、药物、复合物、试剂盒、方法，以及第一和第二医学用途可以为“前药组合物”。本领域普通技术人员应该明白的是，术语“前药组合物”，除非另行声明，均指的是本发明的抗体有效附着在能够将前药转化成活性药的成分上，而并非指抗体附着在前药本身上。然而，并没有要求本发明的前药实施例一定需要用作前药组合物。因此，前药能够以它们在本领域中应用的任何方式来应用，包括以ADEPT和其他形式。
因此，在描述的结合组合物、药物、复合物、试剂盒、方法，以及第一和第二医学用途中，优选按照诊断试剂，更加优选为治疗试剂，组合物包括抗-EpCAM抗体，可以是裸抗体，也可为免疫偶联物，其中在本发明的体内实施例中，其操作时会涉及到在之前，同时会随后给予裸抗体或者免疫偶联物和生物、诊断或治疗试剂；只要在某些偶联或非偶联的形式中，对于某种形式的抗体，以及某种形式的生物、诊断或治疗试剂，其总体供应能够实现即可。
针对本发明在肿瘤上的效果，前面的和其他的说明仅仅是为了解释操作，所附着试剂的类型等的结合模式。这种描述的方法不应该被理解为对本发明的抗-EpCAM抗体的有益特性公开不充分或者过于简化。因此需要理解的是，这类抗体本身具有抗肿瘤活性，这类抗体的免疫偶联物会保留这些活性，并将这些特性与所附着的试剂相结合；进一步，抗体与任何附着试剂的结合效应会明显被增强和/或放大。
本发明因此提供了组合物、药物组合物、治疗试剂盒和药用复合物，含有，可选为至少第一种的组合物或容器中，治疗有效量的至少第一种本发明的抗-EpCAM抗体，或者这种抗EpCAM抗体的抗原结合片段或免疫偶联物；以及治疗有效量的至少第二种生物试剂，成分或系统。
“至少第二种生物试剂、成分或系统”通常为治疗或诊断的试剂，成分或系统，但不必须是。例如，至少第二种生物学试剂、成分或系统可以包括用于对抗体进行修饰的成分和/或用于将其他试剂附着在抗体上的成分。某些优选的第二种生物试剂、成分或系统为前药或制造和使用前药的成分，包括用于制造前药本身的成分，以及在这类前药或ADEPT实施例中使本发明的抗体发挥作用的成分。
在至少第二种生物试剂，、成分或系统包括了治疗或诊断试剂的时候，这些治疗剂和/或诊断剂的典型代表为与癌症治疗或诊断相关的试剂。
因此，在某些实施例中“至少第二种抗癌试剂”会被包括在治疗试剂盒或复合物中。术语“至少第二种抗癌试剂”被用于与作为第一种抗癌试剂的本发明的抗-EpCAM抗体相对应。本发明的抗体可因此与化学治疗试剂、放射治疗试剂、细胞因子、抗血管生成试剂、细胞凋亡诱导剂或者抗癌免疫毒素或者凝固配体相结合，有些示例在本说明书的其他地方提及。
其他示例性的抗癌试剂包括，比如，新霉素、鬼臼毒素、TNF-α、αvβ3拮抗剂、钙离子载体、钙流诱导剂，及其任何衍生物或前药。当前优选的抗微管蛋白药物包括秋水仙碱、紫杉酚、长春碱、长春新碱、长春地辛、考布他汀或其衍生物或前药。
对于本发明的组合物、试剂盒和/或药物，结合的有效量的治疗试剂可含在单个容器或容器工具中，或含在不同的容器或容器工具中。复合物一般会混合在一起，以联合应用。用于静脉注射施用的试剂一般可作为优选。成像用的成分也可包括在内。试剂盒也可包含使用至少第一种抗体和一种或多种包括在内的其他生物试剂的说明书。
一般来说，至少第二种抗癌试剂(或者任何其他的第二种试剂)可大体上与本发明的抗-EpCAM抗体同时向动物或患者施用；比如通过单一的药物组合物或通过两种药物组合物一起施用。
或者，至少第二种抗癌试剂(或任何其他第二种试剂)在向动物或患者施用的时候，其施用时间与给予本发明的抗-EpCAM抗体时间相继。在本说明书中使用的“时间相继”，指的是“错开”，也就是至少第二种抗癌试剂向动物或患者施用的时间与给予本发明的抗-EpCAM抗体的时间区分开。一般地，两种试剂的施用时间有效地分开，以使二者发挥它们各自的治疗效果，比如，它们按照“生物有效的时间间隔”来施用。至少第二种抗癌试剂(或者其他的第二种试剂)可以在给予本发明的抗-EpCAM抗体之前隔着一个生物有效期而向动物或患者施用，或者在给予本发明的抗-EpCAM抗体之后隔着一个生物有效期再施用。
相应地，本发明提供了治疗患有肿瘤的动物或患者的方法，包括：
(a)使动物或患者接受第一步治疗，大体上降低肿瘤负担；然后
(b)继而给予至少第一种本发明的抗-EpCAM抗体，或者其抗原结合片段，或其免疫偶联物；可选择的，其中的抗体或片段可以与第二种治疗试剂有效连接。
优选的，第一步治疗包括手术切除和化学疗法干预。
在某些其他实施例中，本发明的抗体和免疫偶联物可以与一种或多种诊断试剂，特别是用于诊断癌症的诊断试剂相结合。一系列的诊断组合物，试剂盒和方法因此而包括在本发明中。
另一方面为对使用对象的诊断或成像的方法，包括对使用对象给予在本说明书中所限定的合适量的本发明的抗体或其他蛋白，并在使用对象体内检测本发明的抗体或其他蛋白是否存在和/或存在的量和/或位置。
适合按照上面所述的用途和方法进行成像或诊断的疾病包括在本说明书其他部分描述的任何疾病，优选为任何的癌症。
在一个实施例中，本发明提供了一种方法，用于诊断疾病，如动物中的癌症，包括以下步骤：
(a)将从所述动物中取出的待测样品与本发明的抗体或其免疫偶联物接触。
在进一步的实施例中，本发明提供了一种方法，用于诊断疾病，如动物中的癌症，包括以下步骤：
(a)将从所述动物中取出的待测样品与本发明的抗体或其免疫偶联物接触；
(b)在待测样品中测量或检测抗体-抗原复合物的存在和/或存在量和/或位置；以及，可选择的
(c)将待测样品中抗体-抗原复合物的存在和/或存在量与对照相比。
在上述方法中，所述接触步骤要在能够形成抗体-抗原复合物的条件下进行。本领域技术人员可以很容易地确定合适的条件。
在上面的方法中，任何合适的待测样品均可使用，比如可能受疾病影响的活检细胞，组织或器官，或者组织切片。
在某些上述方法中，待测样品中任何量的抗体-抗原复合物的存在都意味着疾病的存在。优选的，为了表明诊断结果为阳性，与合适的对照样品中的量相比，待测样品中抗体-抗原复合物的量需要变大或增加，优选显著变大或增加。更加优选的是，显著变大或增加的水平具有统计学意义，优选为概率值＜0.05。测定统计学意义的合适的方法在本领域中已为人所熟知并有记录，这些中的任一种均可应用。
本领域技术人员可以很容易地选择合适的对照样品，例如，在诊断一种具体疾病时，合适的对照可以为从未患有这种疾病的使用对象中获得的样品。合适的对照“值”也可以很容易地测定，无需在每次测试中均设定对照“样品”，例如，可以参考本领域已知的正常使用对象的范围。
为了在诊断或成像的应用中使用，本发明的抗体可以用可检测的标记物进行标记，比如射线透不过物质或放射性同位素，如3H、14C、32P、35S、123I、125I、131I；放射性发射源(如，α，β或γ发射源)；荧光的(荧光团)或化学发光的(发色团)化合物，比如异硫氰酸荧光素、若丹明或者荧光素；酶类，比如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或者辣根过氧化物酶；成像试剂；或金属离子；或化学部分，比如生物素，可以通过结合到具体的同源可检测的部分，如标记的亲和素/链霉亲和素上而被检测到。将标记物附着到结合蛋白，如抗体或抗体片段上的方法，对于本领域是已知的。这种可检测的标记物使得可以在受试样品中检测结合蛋白-抗原复合物的存在，存在量或其位置。
优选的用于体内的可检测标记物包括：X射线可检测混合物，比如铋(III)、金(III)、镧(III)或者铅(II)；放射性离子，比如铜67、镓67、镓68、铟111、铟113、碘123、碘125、碘131、汞197、汞203、铼186、铼188、铷97、铷103、锝99m或钇90；核磁自旋共振同位素，比如钴(II)、铜(II)、铬(III)、镝(III)、铒(III)、轧(III)、钬(III)、铁(II)、铁(III)、锰(II)、钕(III)、镍(II)、钐(III)、铽(III)、钒(II)或者镱(III)；或者若丹明或荧光素。
本发明同样包括诊断或成像试剂，包括本发明的抗体，通过直接或间接的方式附着于一个能产生可检测信号的标记物上。合适的标记物在本说明书的其他地方提及。
癌症治疗也可通过如下方法进行：
(a)形成肿瘤的影像，其方式在于：向患有肿瘤的动物或患者给予诊断量的至少第一种可检测到的标记的本发明的抗-EpCAM抗体，包括一个诊断试剂，有效附着于本发明的抗-EpCAM抗体上，从而形成可检测到的肿瘤影像；另外
(b)随后向相同的动物或患者给予治疗上最优剂量的至少第一种的本发明的抗-EpCAM裸抗体，或者使用这种抗体的治疗试剂-抗体构建体，从而导致抗肿瘤的效果。
本发明进一步包括了试剂盒，含有一种或多种本发明的抗体、免疫偶联物或者组合物，或一种或多种编码本发明的抗体的核酸分子，或一种或多种含有本发明的核酸序列的重组表达载体，或一种或多种含有本发明的重组表达载体或者核酸序列的宿主细胞或病毒。优选的，所述试剂盒按照本说明书中描述的方法和用途进行使用，比如，本说明书所描述的治疗、诊断或成像的方法，或者按照本说明书中描述的体外分析或方法进行使用。在这种试剂盒中的抗体优选为本说明书其他部分描述的抗体偶联物，例如，可以与可检测到的部分偶联或可以是免疫偶联物。所述试剂盒优选包含对试剂盒组分用途，如在诊断方面的说明书。所述试剂盒优选按照本说明书其他部分的描述用于诊断或治疗疾病，如癌症，也可以包括使用试剂盒组分诊断或治疗这种疾病的说明书。
本说明书所限定的本发明的抗体也可作为分子工具用于体外或体内应用和分析中。由于抗体具有抗原结合位点，这些可以作为具体结合对的成员，这些分子可用于需要具体结合对成员的任何试验中。
因此，本发明另一方面提供了一种试剂，包括本说明书所限定的本发明的抗体，以及将这种抗体用作分子工具的用途，例如在体外或体内分析中的用途。
Figure BPA00001503212300391
Figure BPA00001503212300401
Figure BPA00001503212300431
Figure BPA00001503212300441
Figure BPA00001503212300451
抗体7-F17的重链序列(核苷酸和氨基酸)(VH结构域、重CDR1、重CDR2、重CDR3、重FR1、重FR2、重FR3和重FR4)和连接子序列与在表1中列出的序列相同。
Figure BPA00001503212300461
Figure BPA00001503212300471
Figure BPA00001503212300481
抗体12-C15的重链序列(核苷酸和氨基酸)(VH结构域，重CDR1，重CDR2，重CDR3，重FR1，重FR2，重FR3，重FR4和IgG重链)，连接子序列与在表1中列出的序列相同。
Figure BPA00001503212300491
Figure BPA00001503212300501
抗体16-G5的重链序列(核苷酸和氨基酸)(VH结构域、重CDR1、重CDR2、重CDR3、重FR1、重FR2、重FR3、重FR4和IgG重链)和连接子序列与在表1中列出的序列相同。
Figure BPA00001503212300511
Figure BPA00001503212300521
Figure BPA00001503212300531
抗体17-C20的重链序列(核苷酸和氨基酸)(VH结构域、重CDR1、重CDR2、重CDR3、重FR1、重FR2、重FR3、重FR4和IgG重链)和连接子序列与在表1中列出的序列相同。
Figure BPA00001503212300532
Figure BPA00001503212300541
Figure BPA00001503212300551
抗体24-G6的重链序列(核苷酸和氨基酸)(VH结构域、重CDR1、重CDR2、重CDR3、重FR1、重FR2、重FR3和重FR4)和连接子序列与在表1中列出的序列相同。
附图说明
本发明现在会通过下列非限制性的实例，并参考附图，进行更详细地描述，其中：
图1示出了克隆3-17I的scFv形式中，重链(VH)和轻链(VL)可变区的核苷酸和氨基酸序列。ScFv基因通过Nco/NotI位点克隆进入pHOG21质粒载体(3.7Kb)中。用于初始基因克隆的限定位点(NcoI，HindIII，MluI和NotI)加有下划线。位于VH和VL之间的连接序列以斜体字示出。
图2示出了3-17I IgG，MOC31 IgG和MT201 IgG与天然的EpCAM+ Kato III细胞系结合的流式细胞术分析结果。抗-绿色荧光蛋白(GFP)抗体被用作阴性对照。MFI＝中数荧光强度。
图3A，3B和3C示出了3-17I IgG(图3A)，MT201 IgG(图3B)和MOC31 IgG(图3C)在非还原和还原状态下与人源(Hu)和食蟹猴(Cy)EpCAM-Fc变体结合的蛋白质印迹结合分析结果。M＝分子量标记物。
图4A，4B和4C示出了3-17I IgG(图4A)、MT201IgG(图4B)和MOC31IgG(图4C)与人源和食蟹猴EpCAM-Fc变体的ELISA结合分析结果。MAXI-Sorb板覆盖有人源和食蟹猴的EpCAM-Fc，其浓度为1μg/l。抗体从133nM到32fM，按照2倍的稀释加入。
图5A和5B示出了3-17I IgG与重组人源EpCAM抗原(图5A)或者与重组食蟹猴EpCAM抗原(图5B)结合的BIAcore分析结果。示出的结合曲线所对应的3-17I IgG浓度为7.8、3.9、2.0、0.98、0.49和0.24nM。
图6A，6B和6C示出了3-17I IgG在存在人源PBMCs时，可以诱导MDA-MB-453(图6A)、MDA-MB-231(图6B)和BT-474(图6C)细胞的ADCC效应。此外，这些数据证明3-17I Ig与阳性对照抗体，MT201 IgG相比，具有良好的ADCC活性。
图7A和7B示出了3-17I IgG在存在人源血清时，可以在细胞系KATO III(图7A)和MT-3(图7B)中诱导CDC效应。此外，这些数据清楚地证明了与阳性对照抗体，MT201IgG相比，3-17I IgG在诱导CDC上具有优势。
图8A和8B示出了scFv表达载体。图8A示出了scFv表达载体pHOG21。ApR，氨苄青霉素抗性基因；ColE1，DNA复制的起点；fIIG，噬菌体f1的基因间隔区；c-myc，编码由单克隆抗体9E10所识别的抗原表位的序列；His6，编码6个组氨酸残基的序列；pelB，编码细菌果胶酸裂解酶的信号肽的序列；P/O，野生型lac启动操纵子。图8B示出了C-末端编码区域的核苷酸和氨基酸序列。
图9示出了12-C15 IgG、16-G5 IgG和17-C20 IgG与人源EpCAM-Fc的ELISA结合分析结果。MAXI-Sorb板覆盖有人源EpCAM-Fc，其浓度为1μg/ml。抗体从133nM到65pM，按照2倍的稀释加入。
图10A和10B示出了3-17I scFv、7-F17scFv、17-C20scFv和24-G6scFv与人源EpCAM-Fc(图10A)和食蟹猴EpCAM-Fc(图10B)的ELISA结合分析结果。MAXI-Sorb板覆盖有人源或者食蟹猴的EpCAM-Fc，其浓度为5μg/ml。抗体从667nM到3.2nM，按照2倍的稀释加入。
具体实施方式
例1：新型抗体
考虑到对于能够用于癌症治疗的进一步肿瘤特异性抗体的需要，鉴定了一种人源抗体，可以特异性地识别结肠癌细胞系，比如HT29。这种抗体能够特异性地结合EpCAM。一种单链形式的该抗体被克隆进含有c-myc和6×His标记的表位的pHOG21质粒中(图8)。TG1细菌被转化，scFv受IPTG的诱导而表达。纯化的scFv的结合情况使用Easycyte流式细胞仪进行流式细胞术进行确认。
序列
对于制造克隆的抗体，其重链和轻链的核苷酸序列进行了排序。这种抗体被命名为3-17I(scFv)。3-17I(scFv)轻链和重链的核苷酸序列和氨基酸序列在图1和表1中示出。3-17I轻链和重链的CDR区在表1中示出。
这种抗体也同样制作出了其IgG形式。其IgG形式属于IgG1同种型，包含两条重链和两条轻链。每条重链包含一个如SEQ ID NO：3的VH结构域和一个IgG1恒定区。每条轻链包含一个如SEQ ID NO：4的VL结构域和一个kappa轻链恒定区。IgG形式的该种抗体其组分被克隆进入载体中，所述载体基于由Lars Norderhaug等，JIM 204(1997)77-87所公布的载体，并使用这篇引文所描述的方法。该载体含有一个标准的CMV启动子。一种IgG前导序列(mgwsciilflvatatgvhs)被引入到每个载体内。VH和VL结构域被克隆进入含有人源IgG1和κ基因的基因组副本(内含子+外显子)的分开的载体，分别插入到由PCR所引入的BsmI和BSiWI位点处。IgG1载体含有一个潮霉素抗性基因，而κ载体含有一个新霉素抗性基因。HEK293/T细胞被瞬时转染，经过5-6天后，IgG通过蛋白质-A进行纯化，随后使用分子筛分离出单体IgG部分。
3-17I IgG抗体完整的重链和轻链其氨基酸序列在下面示出。
3-17I IgG重链(氨基酸序列)(SEQ ID NO：24)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANY
AQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGLLWNYWGQGTLVTVSS
Figure BPA00001503212300571
Figure BPA00001503212300572
恒定区在粗斜体部分
3-17I IgG轻链(氨基酸序列)(SEQ ID NO：25)
EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLIIYGASTTASGIPARF
SASGSGTDFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNNWPPAYTFGQGTKLEIK
恒定区在粗斜体部分。
能够与EpCAM结合，具有与3-17I相同的重链序列但不同轻链序列的12个相关抗体也同样被鉴定出。这些相关抗体中的5个(7-F17、12-C15、16-G5、17-C20和24-G6)的序列在表2-6中列出。
例2：3-17I IgG与KatoIII细胞的结合
流式细胞分析法被用于分析3-17I IgG与EpCAM阳性细胞的结合情况。抗-EpCAM嵌合体(鼠源可变区/人源恒定区)以及全人源的抗体，分别为MOC31和MT201，被用作阳性对照。
所使用的MT201 IgG和MOC31 IgG抗体的完整重链和轻链的氨基酸序列在下面示出。恒定区在粗斜体部分。
MT201 IgG重链(氨基酸序列)
EVQLLESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNK
YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDMGWGSGWRPYYYYGMD
VWGQGTTVTVSS
Figure BPA00001503212300582
MT201 IgG轻链(氨基酸序列)
ELQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSQSISSYLNWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDR
FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDSATYYCQQSYDIPYTFGQGTKLEIK
Figure BPA00001503212300583
Figure BPA00001503212300584
这些序列是从MT201的氨基酸序列中推导而出的，而MT201的氨基酸序列在WO98/46645和Raum等，Cancer Immunol Immunother(2001)50：141-150中被称之为HD69。
MOC31 IgG重链(氨基酸序列)
QVKLQQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGE
STYADDFKGRFAFSLETSASAAYLQINNLKNEDTATYFCARFAIKGDYWGQGTTVTVSS
Figure BPA00001503212300585
Figure BPA00001503212300591
MOC31 IgG轻链(氨基酸序列)
DIVLTQSPFSNPVTLGTSASISCRSTKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASG
VPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLEIPRTFGGGTKLEIK
Figure BPA00001503212300592
Figure BPA00001503212300593
这些序列是从MOC31的氨基酸序列中推导而出的，而MOC31的氨基酸序列由Beiboer等，Journal of Molecular Biology，volume 296，Issue 3，2000年2月25日，第833-849页所提供。
抗绿色荧光蛋白(GFP)抗体被用作阴性对照。为进行流式细胞仪检测，Kato III细胞(ATCC编号(胃癌细胞，ATCC编号HTB-103))在标准条件下生长，从培养瓶中收集细胞，PBS洗两遍，在含0.2％BSA和0.09％NaN3的PBS中重悬，最后加入到V型96孔板(GreinerBio-One，Frickenhausen，德国)中，每孔1×105个细胞。细胞在400×g下离心5分钟，然后在4℃时在50μL的每个不同抗体的稀释液中孵育45分钟(所有稀释液均由含0.2％BSA和0.09％NaN3的PBS制备)。在用含0.2％BSA和0.09％NaN3的PBS洗涤后，细胞用10μg/mL的RPE-偶联的山羊抗人IgG(AbDSerotec，D üsseldorf，德国)在4℃下染色30分钟。染色后的细胞洗涤，在200μL含0.2％BSA和0.09％NaN3的PBS中重悬，转移至U型96孔板内(Corning，Schiphol-Rijk，荷兰)，用于在EasyCyte流式细胞仪中(Guava Technologies，Hayward，CA，美国)进行分析。图2所示的结果清楚地表明，抗体3-17I特异性地与天然EpCAM+KatoIII细胞系作用，其亲和力可与MOC31的相比。比较起来，抗体MT201与EpCAM-阳性的Kato III细胞其结合力表现得明显更弱一些。
例3：3-17I IgG的结合特性
为测定3-17I与EpCAM结合的能力，使用了蛋白质印迹分析法、ELISA和BIAcore试验。
蛋白质印迹分析法
为分析抗体3-17I，MT201及MOC31与人源和食蟹猴的EpCAM的结合特异性和交叉反应性，在还原和非还原状态下使用了十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹分析法。所有抗体均为IgG形式，并由瞬时转染的HEK-293细胞生产。抗体继而在蛋白质A琼脂糖(GE Healthcare Uppsala，瑞典)中纯化，紧接着在两个偶联的分子筛柱，Superdex 200和Superdex 75中进行分级分离。得到的IgG产品表现为单体的纯度＞95％。重组人源和食蟹猴EpCAM抗原也在HEK-293细胞中生产，并在蛋白质A琼脂糖柱上一步纯化。所测得的抗原制备物纯度高于90％。两种EpCAM的构建体均由与来自IgG1的人源Fc区融合的EpCAM的细胞外结构域组成。
人源EpCAM序列源自NCBI数据库NP-002345，而食蟹猴的来自CS611076。人源EpCAM/Fc融合区和食蟹猴EpCAM/Fc融合区的氨基酸序列在下面示出：
氨基酸序列-人源EpCAM/Fc融合体
Figure BPA00001503212300601
Figure BPA00001503212300611
重组人源和食蟹猴EpCAM-Fc抗原的样品在向SDS-PAA凝胶上样(1μg/孔)之前，可以为还原态或非还原态。每个样品进行一式两份试验。在电印迹之后，膜用含5％脱脂奶粉(Merck product no 1.15363.0500)的PBS(封闭液)封闭1小时。膜然后用含浓度为1μg/ml的IgGs 3-17I(图3A)，MT201(图3B)或MOC 31(图3C)的封闭液进行孵育。为检测膜结合IgG的情况，滤膜在山羊抗-人κ-HRP抗体(Southern Biotech，cat no 2060-05)，1∶5000稀释的封闭液中孵育1小时。
在所有的孵育过程之间，滤膜都要在PBS-T(PBS中加有0.05％的吐温-20；Medicago#09-9410-100)中洗3次，每次5分钟。所有的孵育过程，如果没有另行说明的话，都在室温下进行1小时。
对蛋白质印迹进行染色使用的是DAB(Thermo Scientific#1856090)底物，并按照制造商的建议进行稀释。
为了进行对照，SDS-PAA凝胶用考马斯亮蓝染液(Expedeon#ISB01L)染色，以验证EpCAM变体的上样量。通过检测膜上的EpCAM-Fc与山羊抗-人IgG-HRP偶联物(SouthernBiotech cat no 2040-05)的结合以及DAB染色情况(数据未示出)，可以验证转膜是否成功。对于EpCAM-Fc期望的大小，在非还原态和还原态下分别约为110kDa和55kDa。
蛋白质印迹分析表明抗体3-17I在非还原状态下与人源和食蟹猴EpCAM两者结合的同样好。与之相对的，对于所有的还原态EpCAM抗原，均没有检测到3-17I IgG的结合。抗体MOC31表现出了不同的抗原结合方式。与3-17I IgG不同的是，在非还原和还原状态下它均能与人源EpCAM结合。它同样可以识别食蟹猴抗原，但仅限于非还原状态下。此外，食蟹猴抗原染色的更弱的条带亮度表明，与和人源抗原结合相比，其与食蟹猴EpCAM结合力更弱。抗体MT201 IgG仅在非还原状态下表现出与人源EpCAM的结合。这种抗体没有检测到与食蟹猴抗原的结合。
这些结果表明，与3-17I相比，MOC31和MT201二者结合于人源EpCAM的不同表位上。在将3-17I和MOC-31进行比较时，这种证据尤其强烈。
ELISA和交叉反应性
为测定3-17I，MT201和MOC31与人源和食蟹猴EpCAM的特异性和亲和力，开展了一系列的ELISA试验。所有IgG1形式的抗体以及人源和食蟹猴EpCAM抗原，其生产和纯化均按前面所述方法进行(参见例1和2和例3前部分)。
抗体克隆12-C15 IgG，16-G5 IgG和17-C20 IgG与人源EpCAM的特异性可通过ELISA试验进行测定。ScFv形式的抗体克隆7-F17，17-C20和24-G6，其与人源和食蟹猴EpCAM的特异性和亲和力由ELISA试验测定。
对IgG形式的抗体进行ELISA时，MAXI-sorb板覆盖有溶于PBS中的1μg/ml(100μl/孔)的人源或者食蟹猴EpCAM，4℃下过夜。该板用含3％BSA的PBS封闭2小时。待测IgG按照两倍的稀释加入，从133nM一直到32fM，并于室温下孵育1小时。为检测结合的IgG，山羊抗-人κ-HRP抗体(Southern Biotech，cat no 2060-05)以1∶5000的稀释水平加入封闭液中，室温下孵育1小时。
对scFv形式的抗体进行ELISA时，MAXI-sorb板覆盖有溶于PBS中的5μg/ml(100μl/孔)的人源或者食蟹猴EpCAM，4℃下过夜。该板用含4％脱脂奶粉(Merck product no1.15363.0500)的PBS封闭2小时。待测scFvs按照两倍的稀释加入，从667nM一直到3.2nM，并用0.125μg的小鼠抗-cMyc IgG(克隆9E10 Diatec)于室温下孵育1小时。为检测结合的scFv，兔抗-小鼠-HRP抗体(Dako，cat no P0260)以1∶3000的稀释水平加入封闭液中，室温下孵育1小时。
在所有的孵育过程之间，板都要在PBS-T(0.05％的吐温-20；Medicago#09-9410-100)中洗三次。所有的孵育过程，除非另行说明，都在室温下进行一小时。
IgG形式的抗体的ELISA试验采用1-步ABTS试剂盒(Thermo Scientific prod#37615)以及25分钟的孵育时间。吸光度在SLT SPECTRA酶标仪上测定。对于取得的ELISA数据，采用Prism软件(GraphPad，San Diego，CA)，以单址模型的非线性拟合来评估其亲和力。
ScFv形式的抗体的ELISA试验采用TMB底物试剂盒(Thermo Scientific，prod#34021)以及10分钟的孵育时间。该反应可以通过加入H2SO4而被终止。吸光度在SLT SPECTRA酶标仪上测定。对于取得的ELISA数据，采用Prism软件(GraphPad，San Diego，CA)，以单址模型的非线性拟合来评估其亲和力。
结论：
ELISA数据显示，3-17I IgG与人源和食蟹猴EpCAM表现出同等好的结合情况(图4A)。与之相对的，MOC31抗体在与人源和食蟹猴抗原的结合方式上表现出显著的差异(图4C)，因此表明其与食蟹猴EpCAM的亲和力显著偏低。有趣的是，抗体MT201与人源EpCAM仅表现出相对较弱的结合力，没有检测到这种抗体与食蟹猴抗原的结合情况(图4B)。
抗体克隆12-C15、16-G5和17-C20的IgG形式也能与人源EpCAM结合(图9)。抗体克隆7-F17，17-C20和24-G6的scFv形式与人源和食蟹猴EpCAM结合，表现出对人源和食蟹猴EpCAM二者的亲和力，并且和3-17I的scFv形式与人源和食蟹猴EpCAM二者的亲和力相当(图10A和10B)。
亲和力
3-17I与人源和食蟹猴EpCAM的结合情况可以在BIAcore T100(BIAcore，Inc，Piscataway，NJ)上采用表面等离子共振法(SPR)进行分析。与人源Fc(IgG1)融合的人源或者食蟹猴EpCAM的细胞外结构域，以100RU的密度偶联到一个CM5芯片(BIAcore，Inc，Piscataway，NJ)上。SPR研究采用的是标准技术，37℃，流速为50μl/min。数据采用BIAcore软件的1∶1 Langmuir结合模型进行分析。
动力学分析的结果表明，3-17I IgG与人源和食蟹猴EpCAM结合时，几乎具有相同的结合率(kon)和解离率(koff)值，因此使得平衡常数(KD)接近1nM(参见图5A和图5B和表8)。
表8.在BIAcore中3-17I IgG与人源和食蟹猴EpCAM结合的动力学分析
  kon(1/Ms)   koff(1/s)   KD(M)
  EpCAM，人源   3.0×107   0.030   1.0×10-9
  EpCAM，食蟹猴   2.5×107   0.023   9.3×10-10
因此，由BIAcore分析仪测定的本发明的3-17I IgG抗体的结合亲和力，在与人源和猴源EpCAM二者结合时均约为1nM。由BIAcore测定的MOC31 IgG与人源EpCAM的结合亲和力在本领域中的描述均类似，也就是KD＝3nM(Roovers等，1998，Brit.J.Cancer，78：1407-1416)。然而，可以从上面的ELISA数据中看出，MOC31 IgG与猴源EpCAM的结合亲和力显著低于3-17I。由BIAcore测定的MT201 IgG与人源EpCAM的结合亲和力在本领域中的描述大大降低，也就是KD＝175nM(Naundorf等，2002，Int.J.Cancer，100：101-110)。
例4：3-17I IgG介导的ADCC和CDC
为测定3-17I IgG通过ADCC和/或CDC介导对靶细胞杀伤的能力，开展了功能分析试验。这些研究的结果表明3-17I IgG确实可以介导ADCC和CDC。此外，这些数据清楚地表明，与MT201 IgG相比，3-17I IgG在诱导ADCC和CDC时都均具有优势。
ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用)
3-17I IgG诱导ADCC的能力使用了三种不同的乳腺癌细胞系MDA-MB-231，MDA-453和BT-474进行分析，这三种细胞系覆盖了超过100倍差异的EpCAM表面密度(Prang等，2005)。由于MT201 IgG被Prang等人报道可以诱导所有这些细胞系的ADCC，故被用做阳性对照抗体。MDA-MB-453(乳腺癌细胞，ATCC number HTB-131)，MDA-MB-231(乳腺癌细胞，ATCC number HTB-26)以及BT-474(乳腺癌细胞，ATCC number HTB-20)细胞系从美国菌种保藏中心(ATCC，Rockville，MD)获得。
MDA-MB-453和BT-474细胞培养在RPMI-1640培养基中，MDA-MB-231细胞培养在Leibovitz氏培养基中。所有的培养基都含有10％胎牛血清(FCS)，青霉素和链霉素。所有的细胞培养基和附加物均从PAA(Pasching，奥地利)处获得。在正常条件下培养的靶细胞，由胰蛋白酶-EDTA收集，离心沉淀，二次重悬于RPMI-1640培养基中。含有2.5×106个细胞的1ml与钙黄绿素-AM(Invitrogen，Carlsbad，California)混合，使其最终浓度为10μM，然后在垂直回转轮(7rpm)上，37℃下孵育30分钟。细胞用含10％FCS的RPMI-1640洗三遍，细胞密度调整为3×105个/ml。
对一个健康志愿者的血液采用Ficoll-Hypaque梯度离心法制备外周血单核细胞(PBMC)。分离出的PBMC用含10％FCS的RPMI-1640培养基洗涤并重悬，密度为6×106个细胞/ml。每种靶细胞和效应细胞的50μl细胞悬液加入到96孔微量滴定板的相同孔中，使得效应细胞(E)与靶细胞(T)的比值(E∶T)为20∶1。
抗体稀释液加入20μl的体积，对于每个浓度做一式四份。微量滴定板然后放在37℃下孵育4小时，在3小时45分钟后向有些孔加入20μl 0.9％TritonX-100，以实现靶细胞的全部裂解。每个样品的100μl上清液继而转移到一个黑色微量滴定板中，在TECAN M200酶标仪上分析其荧光(激发光：488nm，发射光：518nm)。从所有其他样品的荧光强度中减去不含抗体的样品的荧光强度。含有抗体的样品的裂解百分率，可以基于用TritonX-100处理后实现100％细胞裂解的样品的荧光强度来估算。使用Prism软件(GraphPad，SanDiego，CA，USA)的三-参数配合模型，通过非线性回归分析，可以生成剂量-反应曲线。
图6A，6B和6C中显示的结果清楚地表明，在存在人源PBMCs时，3-17I IgG可以诱导MDA-MB-453(图6A)，MDA-MB-231(图6B)和BT-474(图6C)所有这三个细胞系的ADCC。这些细胞系的EC50值分别估算为0.08ng/ml、15ng/ml和0.12ng ml。所实现的最高杀伤率分别为75％、92％和61％。对照组、抗体MT201，表现出差的多的ADCC活性，对于细胞系MDA-MB-453和BT-474来说，其EC50值分别为7ng/ml和382ng/ml，最高杀伤率分别为56％和33％。对于抗体MT201，没有观察到对MDA-MB-231细胞的杀伤，也未观察到最低水平的EpCAM表达。这些数据清楚地表明，与MT201 IgG相比，3-17I IgG在诱导ADCC时具有优势。
CDC(补体依赖的细胞毒作用)
3-17I IgG诱导补体依赖的细胞毒作用(CDC)的能力采用两种细胞系KATO III和MT-3进行分析。三个相关的抗体克隆，12-C15 IgG、16-G5 IgG和17-C20 IgG也采用KATO III细胞系检测它们的诱导CDC的能力。由于MT201 IgG被Prang等人(2005)报道可以诱导这些细胞系的CDC，故被用做阳性对照抗体。KATO III(胃癌细胞，ATCC number HTB-103)和MT-3(乳腺癌细胞，DSMZ number ACC 403)细胞系分别从美国菌种保藏中心(ATCC，Rockville，MD)和DSMZ(Braunschweig，德国)处获得。KATO III和MT-3细胞在分别加入20％和10％的胎牛血清(FCS)的RPMI-1640培养基中维持培养。所有的培养基中都加有青霉素和链霉素。所有的细胞培养基和附加物均从PAA(Pasching，奥地利)处获得。
在正常条件下培养的靶细胞离心沉淀，并二次重悬于RPMI-1640培养基中。含有12.5×106个细胞的5ml与钙黄绿素-AM(Invitrogen，Carlsbad，California)混合，使其最终浓度为10μM，然后在垂直回转轮(7rpm)上，37℃下孵育30分钟。细胞用含10％热去活的胎牛血清(hiFCS)的RPMI-1640洗三遍，细胞密度调整为4×106/ml。25μl的靶细胞重悬液与25μl人源血清和50μl溶于含10％hiFCS的RPMI-1640中的抗体稀释液混合。对于使用3-17I抗体的实验，孔中的最终抗体浓度在0.8ng/ml至50μg/ml之间变动。对于使用抗体克隆12-C15IgG，16-G5IgG和17-C20IgG的实验来说，孔中的最终抗体浓度在0.19μg/ml至1.5μg/ml之间变动。每个试验进行一式四份。向有些孔中加入20μl的0.9％TritonX-100，以使靶细胞完全裂解，然后将板在37℃下孵育1小时。向孔中加入100μl含10％hiFCS的RPMI-1640以增加容量，细胞继而离心沉淀。100μl上清液被转移到一个黑色微量滴定板中，在TECANM200酶标仪上分析其荧光(激发光：488nm，发射光：518nm)。从所有其他样品的荧光强度中减去不含抗体的样品的荧光强度。含有抗体的样品的裂解百分率，可以基于用TritonX-100处理后实现100％细胞裂解的样品的荧光强度来估算。使用Prism软件(GraphPad，San Diego，CA，美国)的三-参数配合模型，通过非线性回归分析，可以生成剂量-反应曲线。
图7A和7B所示出的结果清楚地表明，3-17I IgG在存在人源血清时，可以在细胞系KATO III(图7A)和MT-3(图7B)中诱导CDC。在KATO III细胞系中，抗体克隆12-C15IgG、16-G5IgG和17-C20IgG的CDC活性也得以展示出。
虽然抗体3-17I IgG和MT201两者均能通过补体诱导出靶细胞的100％裂解，然而杀伤效果是在完全不同的抗体浓度下取得的。3-17I IgG的EC50值对于KATO III和MT-3细胞来说，分别估算为0.28ng/ml和0.38ng/ml，而对照抗体，MT201在高于250倍的浓度下才表现出CDC，其对相同的两个细胞系来说，EC50值分别为76ng/ml和89ng/ml。这些数据清楚地表明，与MT201 IgG相比，3-17I IgG在诱导CDC时具有优势。
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Claims (43)

1.一种能与EpCAM结合的抗体，包括至少一个含有三个CDRs的重链可变区，以及一个含有三个CDRs的轻链可变区，其特征在于，所述重链可变区包括：
(c)一个VH CDR3，具有如SEQ ID NO：7所列的氨基酸序列，或者与其大体上同源的序列，其中所述大体上同源的序列是指，与所提供的CDR序列相比，含有1个、2个或3个氨基酸替换的序列，或者其中所述大体上同源的序列是指在所提供的CDR序列上含有保守氨基酸的替换的序列。
2.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，一种或多种所述重链可变区CDRs从含有如下结构的组中选出：
(a)可变重链(VH)CDR1，含有如SEQ ID NO：5所列的氨基酸序列或者与其大体上同源的序列，以及
(b)VH CDR2，含有如SEQ ID NO：6所列的氨基酸序列或者与其大体上同源的序列，
其中所述大体上同源的序列是指与所提供的CDR序列相比，含有1个、2个或3个氨基酸的替换的序列，或者其中所述大体上同源的序列是指在所提供的CDR序列上含有保守氨基酸的替换的序列。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的抗体，其特征在于，一种或多种所述轻链可变区CDRs从含有如下结构的组中选出：
(d)可变轻链(VL)CDR1，含有如SEQ ID NO：8所列的氨基酸序列或者与其大体上同源的序列，
(e)VL CDR2，含有G A S T X5 A X7(SEQ ID NO：37)的氨基酸序列，或者与其大体上同源的序列，其中X5和X7可以是任意氨基酸，以及
(f)VL CDR3，含有Q X2 Y N X5 W P P X9 X10 T(SEQ ID NO：89)的氨基酸序列或者与其大体上同源的序列，其中X2、X5、X9和X10可以是任意氨基酸，
其中所述大体上同源的序列是指与所提供的CDR序列相比，含有1个，2个或3个氨基酸的替换的序列，或者其中所述大体上同源的序列是指在所提供的CDR序列上含有保守氨基酸的替换的序列。
4.根据权利要求3所述的抗体，其特征在于，在(e)的所述VL CDR2中：
X5为R或者T，优选为T和/或
X7为T或者S，优选为S；和/或
其中在(f)的所述VL CDR3中：
X2为Q或H或K，优选为Q；
X5为N或者D，优选为N；
X9为G或T或S或M或A，优选为A；和/或
X10为F或W或Y，优选为Y。
5.根据权利要求3或权利要求4所述的抗体，其特征在于，(e)的所述VLCDR2含有如SEQ ID NO：9或者SEQ ID NO：29所列的氨基酸序列，或者与其大体上同源的序列，和/或(f)的所述VL CDR3含有如SEQ ID NO：10、30、43、56、69或82所列的氨基酸序列，或者与其大体上同源的序列。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的抗体，包括重链CDR结构域(a)，(b)，和(c)每一个中的一个和/或轻链CDR结构域(d)、(e)和(f)每一个中的一个。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的抗体，其特征在于，所述三个轻链可变区CDRs为SEQ ID NOs：8、9和10，或者SEQ ID NOs：8、29和30，或者SEQ ID NOs：8、29和43，或者SEQ ID NOs：8、29和56，或者SEQ ID NOs：8、29和69，或者SEQ ID NOs：8、29和82，或者大体上与其同源的序列。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的抗体，其特征在于，所述重链可变区含有如SEQ ID NO：3所列的氨基酸序列，或者一个与其具有至少70％、80％、90％、95％或者98％的序列一致性的序列。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的抗体，其特征在于，所述轻链可变区含有如SEQ ID NO：4、27、40、53、66或者79所列的氨基酸序列，或者一个与其具有至少70％、80％、90％、95％或者98％的序列一致性的序列。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的抗体，其特征在于，所述抗体含有如SEQ ID NO：21、36、49、62、75或者88所列的氨基酸序列，或者一个与其具有至少70％、80％、90％、95％或者98％的序列一致性的序列。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的抗体，其特征在于，所述抗体均能与人源和猴源EpCAM结合。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的抗体，包含具有如SEQ ID NO：5所列氨基酸序列的VH CDR1、具有如SEQ ID NO：6所列氨基酸序列的VHCDR2、具有如SEQ ID NO：7所列氨基酸序列的VH CDR3、具有如SEQ IDNO：8所列氨基酸序列的VL CDR1、具有如SEQ ID NO：9所列氨基酸序列的VL CDR2以及具有如SEQ ID NO：10所列氨基酸序列的VL CDR3，或者一个能与所述抗体竞争结合EpCAM的抗体。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的抗体，其特征在于，所述抗体是完全人源的抗体。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的抗体，其特征在于，所述抗体包含抗体重链恒定区和/或抗体轻链恒定区的全部或者一部分。
15.根据权利要求14所述的抗体，其特征在于，所述抗体是IgG抗体。
16.根据权利要求14或15所述的抗体，其特征在于，所述抗体包含一个重链和一个轻链，所述重链含有如SEQ ID NO：24所列的氨基酸序列或者与其具有至少70％、80％、90％、95％或者98％序列一致性的序列，所述轻链含有如SEQ ID NO：25、51、64或者77所列的氨基酸序列，或者与其具有至少70％、80％、90％、95％或者98％序列一致性的序列。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的抗体，其特征在于，所述抗体是一个抗体的抗原结合片段。
18.根据权利要求17所述的抗体，其特征在于，所述抗体的所述抗原结合片段为一个Fab′、Fab、F(ab′)2、单域抗体、TandAbs二聚体、Fv、scFv、dsFv、ds-scFv、Fd、线性抗体、微抗体、双功能抗体、双特异性抗体片段、双体、三体、sc-双功能抗体、κ(λ)体、BiTE、DVD-Ig、SIP、SMIP、DART或者含有一个或多个CDRs的小抗体模拟物。
19.一种免疫偶联物，含有附着于至少第二种诊断或治疗试剂的根据权利要求1-18中任一项所述抗体。
20.根据权利要求19所述的免疫偶联物，其特征在于，所述抗体附着于一个放射治疗试剂、化学治疗试剂、抗血管生成试剂，细胞凋亡诱导剂、抗微管蛋白药、抗细胞或细胞毒试剂、类固醇、细胞因子、趋化因子、ATP酶抑制剂、另一种抗体或者凝聚剂。
21.根据权利要求20所述的免疫偶联物，其特征在于，所述抗体附着于另一个抗体上，并且所述免疫偶联物包含一个双特异性抗体或双功能抗体。
22.一种结合蛋白，含有根据权利要求1-21中任一项所述抗体。
23.一种组合物，含有根据权利要求1-18中任一项所述的至少第一种抗体或其免疫偶联物。
24.根据权利要求23所述的组合物，其特征在于，所述组合物为药学可接受的组合物。
25.根据权利要求23或权利要求24所述的组合物，其特征在于，所述组合物进一步包括至少第二种治疗试剂。
26.一种核酸分子，包含编码权利要求1-18中任一项所述的抗体的核苷酸序列区。
27.根据权利要求26所述的核酸分子，其特征在于，所述核苷酸序列区包含如SEQ ID NO：1所列的核苷酸序列，并且可选的，还含有如SEQ ID NO：2、26、39、52、65或者78所列的核苷酸序列，或与其具有至少70％序列一致性的序列。
28.一种表达载体，含有如权利要求26或权利要求27所述的核酸分子。
29.一种宿主细胞或者病毒，含有如权利要求26或权利要求27所述的核酸分子或者如权利要求28所述的表达载体。
30.一种试剂盒，在至少一个容器中包括：
(a)根据权利要求1-18中任一项所述的抗体；
(b)根据权利要求19-21中任一项所述的免疫偶联物；
(c)根据权利要求23-25中任一项所述的组合物；
(d)根据权利要求26或权利要求27所述的核酸分子；
(e)根据权利要求28所述的表达载体；
(f)根据权利要求29所述的宿主细胞；或者
(g)根据权利要求29所述的病毒。
31.一种制造抗体的方法，包括：
(a)在能够有效表达编码抗体的条件下，培养含有如权利要求26或者权利要求27所述核酸分子，或者含有如权利要求28所述表达载体的宿主细胞；以及
(b)从所述宿主细胞中获得表达的抗体。
32.一种结合EpCAM的方法，包括将含有EpCAM的组合物与如权利要求1-18中任一项所述的抗体，或其免疫偶联物相接触。
33.一种检测EpCAM的方法，包括在能够有效形成EpCAM/抗体复合物的条件下，将可能含有EpCAM的组合物与如权利要求1-18中任一项所述的抗体，或其免疫偶联物相接触，然后检测形成的复合物。
34.一种在动物中诊断癌症的方法，包括：
(a)在能够有效形成EpCAM/抗体复合物的条件下，将动物或从所述动物体内取出的测试样品与如权利要求1-18中任一项所述的抗体，或其免疫偶联物接触。
35.根据权利要求34所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括：
(b)在待测样品中测量或检测抗体-抗原复合物的存在和/或存在量和/或位置；以及，可选择的
(c)将待测样品中抗体-抗原复合物的存在和/或存在量与对照相比。
36.一种治疗癌症的方法，包括向一种动物施用如权利要求1-18中任一项所述的抗体，或其免疫偶联物，其量能够达到有效治疗所述动物癌症的水平。
37.根据权利要求36所述的方法，进一步包括向所述动物施用第二种治疗试剂。
38.根据权利要求34-37中任一项所述的方法，其特征在于，所述动物是人类使用对象。
39.根据权利要求1-18中任一项所述的抗体，或其免疫偶联物，用于治疗，成像或者诊断。
40.根据权利要求39所述的抗体或免疫偶联物，用于癌症的治疗，成像或者诊断。
41.将如权利要求1-18中任一项所述的抗体或其免疫偶联物，生产用于治疗癌症的药物的用途。
42.根据权利要求39或者权利要求40所述的抗体或者免疫偶联物，或者根据权利要求36-38中任一项所述的方法，或者根据权利要求41所述的用途，其特征在于，所述癌症源自于一个组，该组包括：乳房、结直肠、前列腺、卵巢、膀胱、胆囊、胰脏、肺、胃组织或器官，优选为胃或食道、肝脏，优选为肝细胞癌、肾，优选为肾细胞癌、皮肤癌、头和颈，优选为神经胶质瘤、唇、嘴、阴道和子宫颈的癌症。
43.根据权利要求39或者权利要求40或者权利要求42所述的抗体或免疫偶联物，或者根据权利要求36-38中任一项所述的方法，或者根据权利要求41所述的用途，进一步包括第二种治疗试剂的用途。
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