CN102539780A - 一种量子点纳米荧光探针联合蛋白芯片寻找小分子化学药靶点的方法 - Google Patents

Abstract

本发明将量子点与小分子化学药进行连接，形成一种“量子点-小分子化学药”荧光探针，然后将这种荧光探针直接与蛋白芯片共孵育，经过洗涤后，根据蛋白芯片上量子点受光激发而发出的荧光来确定药物与芯片上固定的已知蛋白质之间特异性的结合位点(即靶点)，进而通过计算机软件分析这些结合位点的蛋白。本发明可简便、快速地寻找小分子化学药以及对细胞产生药效的靶蛋白，可为高通量地筛选小分子化学药新药提供高效的技术手段。

Description

一种量子点纳米荧光探针联合蛋白芯片寻找小分子化学药靶点的方法

技术领域

本发明提供了一种量子点纳米技术结合蛋白芯片技术寻找小分子化学药作用靶点的方法，属于材料、化学合成、化工、药学和生物的交叉领域，具体涉及一种通过纳米技术和蛋白芯片技术相结合寻找小分子化学药作用靶点的方法，尤其是通过量子点纳米粒子的荧光在蛋白芯片上寻找小分子化学药作用的靶蛋白的方法。

背景技术

多年来人们研究表明，大多数药物是通过干涉细胞中的酶或受体的功能来实现其要药效的，酶或受体都是蛋白质，在它们的表面有很多可被小分子占住的空位，当小分子如同锁的钥匙一样结合在酶或受体上的空位时，这些小分子即称配体。当一种药物与配体具有相同或相似的形状，则这种药物便可以结合到酶或受体上，结合药物酶或受体将向细胞发送一个信号，使细胞发生一系列的生理反应。结合药物的酶或受体即为药物作用的直接靶点(靶蛋白)。当药物能结合的靶点是多个时，这种药物可能就有副作用。

蛋白芯片具有高通量分析的特点，在揭示药物作用的分子机理方面可显示巨大的优越性。蛋白质芯片是将蛋白质高密度地固定在芯片上，这些蛋白质可高度特异性地与靶分子结合。当药物直接与芯片上的蛋白质发生作用，即可达到高通量而且快速地分析药物作用的靶点，这是分析药物作用靶点最直接的方法。对于小分子化学药体系，可以在芯片上固定多达17，000个人体蛋白，然后与小分子化学药进行孵育，从而初步确定小分子化学药作用靶点。但利用生物芯片研究药物作用机制时，当前使用较多的是基因芯片，如国内与人采用小鼠8192点基因芯片研究了中药复方对MRL/pr狼疮小鼠肾脏基团表达及Th1/TH2细胞因子比列的调节作用，实验采用有机荧光染料Cy3和Cy5来检测杂交结果。实验表明，这种采用基因芯片研究药物作用机制的方法在国内外均有较多的文献报道，但这种方法不能明确药物直接作用的受体。

此外，目前芯片上杂交信号的检测大多是通过分析标记在探针上的Cy3和Cy5的荧光来实现的，尤其是基因芯片广泛采用这种荧光信号检测。然而，这种荧光染料有较大缺陷，如荧光量子产率低；光学稳定性差；对检测系统的光学部分要求严格；激发光谱与发射有较大重叠，给检测带来困难；难以对不通荧光探针用同一激发光激发。

虽然蛋白质芯片就是已比较成功地用于高通量的药物筛选(我国蛋白质芯片就是 成功应用于高通量药物筛选.)但未见有将量子点纳米技术结合蛋白质芯片技术来寻找小分子化学药靶点的实验报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种寻找小分子化学药有作用靶点的简便方法。本发明公开了上诉寻找小分子化学药作用靶点的方法，尤其是公开量子点与小分子化学药连接以形成一种“量子点-小分子化学药”纳米荧光探针，并将这种探针用于蛋白芯片以寻找药物作用靶点的方法。

本发明是通过以下就是方案实现的：本发明将量子点纳米粒子与小分子化学药进行连接，形成一种“量子点-小分子化学药”荧光探针，然后将这种荧光探针直接与蛋白芯片共孵育，经过洗涤后，根据蛋白芯片上的量子点受光激发而发出的荧光来确定药物与芯片上固定的已知生物之间特异性的结合位点，进而通过计算机软件分析这些结合位点的的蛋白。

以下对本发明的制备方法和应用进一步说明，具体如下：

本发明通过共价键、配位键、氢键、静电吸附中的任意一种或任意几种的组合作用将量子点与小分子化学药进行连接。获得的产物通过分离纯化以除去游离的杂质成分，然后将获得的探针与蛋白芯片进行孵育。

或者采用硅烷偶联剂分子将量子点与小分子化学药进行连接然后将获得的探针与蛋白芯片进行孵育。所述的硅烷偶联剂包括CH2＝CHSi(OC2H5)3，CH2＝CHSi(OCH3)2，CH2＝CHSi(OC2H4OCH3)3，CH2＝C(CH3)COOC3H6Si(OCH3)3，HSC3H6Si(OCH3)3，H2NC3H6Si(OC2H5)3，H2NC2H4NHC3H6Si(OCH3)3，H2NCONHC3H6Si(OC2H5)3，CH3Si(OC2H5)3，(CH3)3SiNHSi(CH3)3，H2NC2H5Si(OC2H5)3中的任意一种。

本发明所采用的量子点，其表面被含疏基、羧基、氨基、胫基中的一种或任意几种组合基团的化合物所修饰；当量子点修饰的化合物含羧基，同时小分子化学药含氨基时，或者当量子点修饰的化合物含氨基，同时小分子化学药含羧基时，先采用1-乙基-3(3-二甲基胺基丙基)碳二亚胺盐酸盐活化羧基，然后通过羧基与氨基的反应将量子点与小分子化学药进行连接，将获得的探针与蛋白芯片进行孵育。

上述连接过程是在水相、有机相或水与有机溶剂的混合液中进行的。

所述的蛋白质芯片，其点样区的蛋白质是受体、抗体或特异性蛋白质，尤其是指与待测药物作用机理相关的受体、抗体或特异性蛋白质。

所述的小分子化学药，是指通过化学合成的方法得到的从动物、植物或矿物中提取的任意一化合物或任意两种或国中化合物的混合物。这些化合物具有抗癌或抗肝炎作用、心脑血管药理作用、抗爱滋病、抗衰老、治疗糖尿病、治疗前列腺疾病、抗老年痴呆、抗菌、治疗消化道疾病、抗风湿或类风湿疾病、治疗骨质疏松或更年期综合证作用中的任意一种或任意几种作用。

为克服现有技术的不足，本发明一量子点纳米粒子替代传统的荧光染料(Cy3和Cy5)来标记小分子化学药，进而与蛋白芯片共孵育，以获得药物作用的直接靶点。量子点是指半导体纳米微晶，尺度为十几纳米微晶，尺度为十几纳米、几纳米或更小。与Cy3和Cy5等传统的荧光染料相比，量子点局具有很高的量子点产率和光稳定性，发射光谱狭窄，激光波长度，可以使用同一波长的激发光同时进行多通道检测。理论上，可将成千上万种具有不同荧光颜色和荧光信号强度的量子点分别标记成千上万个不同小分子化学药，并在同一张蛋白芯片上进行孵育。将量子点代替传统荧光分子与蛋白芯片技术相结合，则不仅能显著提高杂交信号的稳定性，增强杂交信号的强度，而且还可以达到双高通量检测的效果。本发明对于阐明小分子化学药作用靶点和对小分子化学药进行筛选具有重要的实际意义。

本发明具有实际性特点和显著进步，量子点纳米粒子优越的光学性质克服了传统有机荧光染料的不足，将量子点与小分子化学药连接，并与蛋白质芯片孵育，可直接获得小分子化学药作用的靶点，在研究小分子化学药筛选方面具有广阔的应用前景。

具体实施方法

实施例1：

向50ml浓度约为10nM的CdSe(590)(自制)(590是指CdSe的发射光谱的峰位位于590nm)纳米粒子水溶液中加入300μl含27％(v/v)无水乙醇的正硅酸乙酯的混含液以及20μl氨水，反应2-3天后，获得仍然澄清透明的溶液，取部分样品冷冻干燥后经过X-射线衍射(XRD)和X-射线能谱(XPS)分析，结果表明CdSe表明已包被二氧化硅，即形成了CdSe/SiO2。(在制备CdSe/SiO2时应控制正硅酸乙酯、无水乙醇以及氨水德用量，否则会引起粒子聚集)。

将CdSe/SiO2加入到无水乙醇与硅烷偶连剂H2NCH5Si(OC2H5)3溶液中(反应体系中，CdSe/KH550-10：1.5，无水乙醇/水＝10)，于60℃反应2h，得到表面连接硅烷偶连剂的CdSe/SiO2纳米粒子。然后加入适量戊二醛，并于室温下搅拌反应3-4h，然后加入小分子化学药(CdSe与小分子化学药的摩尔比列为1∶10)，于4℃反应过夜。分离游离的小分子化学药，即获得由共价结合的方法得到的“CdSe/SiO2-小分子化学药”的纳米复合粒子。红外光谱和紫外吸收光谱检测表明，反应获得的样品的红外光谱和紫外吸收光谱均有小分子化学药的特征峰，但峰均比较弱，表明CdSe/SiO2表面已连接了一定量的小分子化学药。该反应条件控制较苛刻，否则会引起粒子明显聚集。

实施例2：

将小分子化学药溶于PH7的PBS缓冲溶液中，加入1-乙基-3(3-二甲基胺基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)，室温反应1h，然后加入表明修饰疏基乙胺的量子点CdSe/ZnS(590)(自制)纳米粒子水溶液，室温反应过夜，通过氨基与羧基的共价反应将量子点与药物连接。反应液中，CdSe/ZnS约为50nM，CdSe/ZnS、小分子化学药和EDC的摩尔比列为1∶100∶120.通过凝胶柱分离除去游离的小分子化学药和EDC，即获得“CdSe/ZnS-小分子化学药”的连接产物。该产物在488mm波长的光激发下发射与CdSe/ZnS相同的荧光，即红色荧光。HPLC实验表明，“CdSe/ZnS-小分子化学药”的保留时间约慢1min，表明丹小分子化学药已经连接在CdSe/ZnS上。

实施例3：

“量子点-小分子化学药”纳米探针与蛋白质芯片共孵育：本工作选用试剂盒中的蛋白质芯片，这种芯片虽然不是针对本实验特别设计的，但其表面固定多种特异性抗原，它们在正常细胞与肿瘤细胞表面尤其是肿瘤细胞表面表达水平较高。实验按试剂盒方法操作，“量子点-小分子化学药”纳米探针溶液与芯片在37℃下孵育30-40min后，洗涤，激光共聚焦扫描分析。结果发现，芯片上有少量荧光点，说明小分子化学药有可能作用于多种肿瘤细胞表面抗原。

Claims (9)

1.一种量子点纳米荧光探针联合蛋白芯片寻找小分子化学药作用靶点的方法，其特征在于采用以下步骤：将量子点与小分子化学药进行连接，形成一种“量子点-小分子化学药”荧光探针，然后将这种荧光探针直接与蛋白芯片共孵育，经过洗涤后，根据蛋白芯片上的量子点受光激发而发出的荧光来确定药物与芯片上固定的已知蛋白之间特异性的结合位点，进而通过计算机软件分析这些结合位点的蛋白。

2.根据权利要求1所述一种量子点纳米荧光探针联合蛋白芯片寻找小分子化学药作用靶点的方法，其特征在于：通过共价键、配位键、氢键、静电吸附中的任意一种或任意几种的组合作用将量子点与小分子化学药进行连接；获得的产物通过分离纯化以除去游离成分，得到“量子点-小分子化学药”纳米荧光探针，然后将这种探针与蛋白芯片进行孵育。

3.根据权利要求1所述一种量子点纳米荧光探针联合蛋白芯片寻找小分子化学药作用靶点的方法，其特征在于：采用聚乙二醇(PEG)分子将量子点与小分子化学药进行连接，然后将获得的探针与蛋白芯片进行孵育，其中采用的聚乙二醇(PEG)将被官能团修饰，官能团包括其表面被含羟基、羧基、氨基、胫基中的一种或任意几种组合，采用聚乙二醇(PEG)的分子量包括600到10000。

4.根据权利要求1-3中任一所述“量子点-小分子化学药”荧光探针的制备，其特征在于：所述的量子点，其表面被含羟基、羧基、氨基、胫基中的一种或任意几种组合基团的化合物所修饰；当量子点修饰的化合物含羧基，同时小分子化学药中有含氨基时，或者当量子点修饰的化合物含氨基，同时小分子化学药含羧基时，采用1-乙基-3(3-二甲基胺基丙基)碳二亚胺盐酸盐活化羧基，然后通过羧基与氨基的反应将量子点与小分子化学药进行连接，将获得的探针与蛋白芯片进行孵育。

5.根据权利要求1-3中所述一种量子点纳米荧光探针联合蛋白芯片寻找小分子化学药作用靶点的方法，其特征在于：所述连接过程是在水相、有机相或水与有机溶剂的混合液中进行的。

6.根据权利要求1-3所述一种量子点纳米荧光探针联合蛋白芯片寻找小分子化学药作用靶点的方法，其特征在于：所述的蛋白质芯片其点样区的蛋白质是受体、抗体或特异蛋白质，尤其是指与待测药物作用机理相关的受体、抗体或特异蛋白质。

7.根据权利要求1-3所述一种量子点纳米荧光探针联合蛋白芯片寻找小分子化学药作用靶点的方法，其特征在于：所述的量子点是半导体纳米材料包括ZnS，CdS，HgS，ZnSe，CdSe，HgSe，CdTe，ZnO，PbSe，He，CaAs，InP，InAs，InCaAs，Cds/ZnS，CdS/Ag2S，CdS/PbS，CdS/Cd(OH)2，CdS/HgS，CdS/HgS/CdS，ZnS/CdS，ZnS/CdS/ZnS，ZnS/HgS/ZnS/CdS，CdSe/CdS，CdSe/ZnS，CdSe/ZnSe，CdSe/CuSe，CdSe/HgTe，CdSe/HgTe，CdSe/HgSe，CdSe/HgSe/CdSe，CdTe/HgS，CdTe/HgTe，InAs/InP，InAs/CdSe，InAs/ZnSe，MgS，MgSe，MgTe，CaS，CaSe，CaTe，SrS，SrSe，SeTe，BaS，BaSe，BaTe，CdS:Mn，ZnS:Mn，CdS:Cu，ZnS:Cu，CdS:Tb，ZnS:Tb中的任意一种或任意几种纳米粒子的组合。

8.根据权利要求7所述的纳米粒子的组合，其特征在于由所述任意一种量子点为核，二氧化硅为壳的核壳型纳米复合粒子。

9.根据权利要求1-3所述一种量子点纳米荧光探针联合蛋白芯片寻找小分子化学药作用靶点的方法，其特征在于：所述的小分子化学药，是指单一化合物。