CN102539755A - 一种检测分泌物中甲型流感病毒抗原的试纸条及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测分泌物中甲型流感病毒抗原的试纸条及其制备方法，该试纸条由样品垫、含有彩色胶乳颗粒标记物的玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜、吸水纸顺次搭接粘贴在底板上构成，所述硝酸纤维素膜包括包被有甲型流感病毒抗体的检测区和包被有羊抗兔抗体的控制区，所述彩色胶乳颗粒标记物包括微信号放大系统和彩色胶乳标记兔IgG抗体，所述微信号放大系统为彩色胶乳颗粒-亲和素-生物素-甲型流感病毒抗体。本发明在双抗体夹心检测体系中，添加了生物素-亲和素微信号放大系统，扩大了目标抗体的信号，增加检测灵敏度，避免因信号太弱而出现假阴或者漏检。
Description
技术领域
本发明属于医学检验领域，尤其涉及一种检测分泌物中甲型流感病毒抗原的试纸条及其制备方法。
背景技术
根据统计，全球每年的流感病例为6亿-12亿，其中重症流感为300万-500万例，死亡25万人-50万人，重症流感的病死率可达8％-10％。目前美国每年流感导致的死亡人数超过车祸和艾滋病造成的死亡人数，在我国和发展中国家已成为严重危害人类健康的头号大敌。我国是流感的高发区，流感的流行或局部暴发基本上每年都有，每年有1亿多人遭受流感的困扰，到医院就医者超过50万人。
流行性感冒，通常称为“流感”，是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病，具有很强的传染性，主要通过咳嗽和打喷嚏传播，一般春季和冬季爆发。分为A型(甲型)流感病毒、B型(乙型)流感病毒和C型(丙型)流感病毒。甲型流感病毒具有极强的变异性，乙型病毒次之，而丙型病毒则非常稳定。
现阶段检测流感病毒感染的方法主要包括病毒培养法、RT-PCR法以及胶体金免疫层析法。病毒培养是病毒检测的金标准，但这种检测方法周期很长，一般要3～7天的时间，灵敏度不高；RT-PCR能够4-8小时内对样本实现检测，且灵敏度和特异性很高，但是并不适于在机场、口岸、火车站、医院等人口密度大、人流量大、不易让人群长时间聚集的公共场所；胶体金免疫层析法由于不需要辅助的设备，方便的储运及操作简便非常适合在基层场所使用，但现阶段灵敏度不高，容易造成漏检，尚不能够区分病毒感染亚型。最近出现的一种新的彩色胶乳检测技术，灵敏度比胶体金要高10-100倍，并且可以通过调成不同的颜色，可以进一步推广到实现不同项目的同时检测。
中国专利CN200910087632.5公开了一种属于病原体基因快速诊断领域的检测甲型H1N1流感病毒的专用引物和包括该引物的检测甲型H1N1流感病毒的试剂盒以及该引物所对应的靶序列。本发明的专用引物所对应的靶序列，该试剂盒利用基因反转录和等温扩增技术原理，对甲型H1N1病毒核酸进行快速检测，检测结果可肉眼判定，也可利用电泳进行分析。但是该方法耗时长，费用大，不利于大面积推广和民用化。
中国专利CN200910085475.4公开了一种流感病毒rRT-PCR检测引物和探针及检测流感病毒的方法，包括甲型流感病毒特异性引物和探针、两组新甲型H1N1流感病毒H1特异性引物和探针、新甲型流感病毒特异性引物和探针等，4种共12条寡核苷酸引物和探针序列，同时公开了待检样本处理、rRT-PCR反应体系及反应条件、结果分析。该方法的不足也是由于费用昂贵、需要专业的仪器和操作人员需要经过专业培训。故该方法也不适用于普及和民用化。
申请号为CN200910040975公布了一种用于检测甲型流感病毒及甲型H1N1流感病毒的核酸纳米金生物传感器，是通过玻璃纤维上涂有纳米金标记寡核苷酸探针以及在硝酸纤维素膜上固定两种寡核苷酸探针来检测目标物。但是检测时间基本需要在半个小时以上。
同样的，专利号为CN200810022489.7的专利公布了一种借助液相芯片检测流感和H5N1亚型禽流感病毒的方法、申请号为CN201110223913.6的专利公布了甲型/乙型流感病毒核酸双重荧光PCR检测试剂盒、申请号为CN201010171355.9的专利公布了人甲、乙型流感及新甲型H1N1流感病毒一管多检方法及试剂盒、申请号为201110149333.7公布了双重荧光定量RT-PCR检测试剂盒及应用，这些方法都存在费用高、需要专业仪器、检测周期长的问题，不利于流感检测在家庭、在基层及更广泛人群中推广使用。
如上所述，基于彩色胶乳检测技术，再添加亲和素-生物素信号扩大系统，结合抗体制备技术，在克服胶体金灵敏度不足的同时也可以实现甲型流感病毒抗体的检测。
该试剂条兼备简便、快速、准确的特点，适合基层单位初筛和家庭使用，弥补现阶段层析试剂盒灵敏度不高及不能实现分型的缺陷，将能够最大限度地降低人群聚集感染的风险、在疫情现场减低疾病造成的危害。联检的设计可以节省每一次检测的一次性耗材。这些设计特点符合国家医疗保障制度在基层的推广的政策和环保的倡议。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术中存在的流感病毒检测费用昂贵、检测周期长、用纳米胶体金灵敏度稍低的缺陷，而提供一种新的检测分泌物中甲型流感病毒抗原的试纸条。
为实现上述目的，本发明采取了以下技术方案：
一种检测分泌物中甲型流感病毒抗原的试纸条，其特征在于，所述试纸条由样品垫、含有彩色胶乳颗粒标记物的玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜、吸水纸顺次搭接粘贴在底板上构成，所述硝酸纤维素膜包括包被有甲型流感病毒抗体的检测区和包被有羊抗兔抗体的控制区，所述彩色胶乳颗粒标记物包括微信号放大系统和彩色胶乳标记兔IgG抗体，所述微信号放大系统为彩色胶乳颗粒-亲和素-生物素-甲型流感病毒抗体。所述的检测分泌物中甲型流感病毒抗原的试纸条，其特征在于平行包被了甲型流感病毒抗体，可以检测甲型流感病毒抗原。
优选地，所述彩色胶乳颗粒-亲和素-生物素-甲型流感病毒抗体复合物的用量为32.5-60μg/cm2；所述检测区上包被的甲型流感病毒抗体用量为0.144-0.28μg/mm；所述彩色胶乳标记兔IgG抗体的用量为20-40μg/cm2；所述羊抗兔抗体为羊抗兔IgG抗体，所述羊抗兔抗体的用量为0.18-0.44μg/mm。
优选地，所述彩色胶乳颗粒-亲和素-生物素-甲型流感病毒抗体复合物的用量为55-60μg/cm2，所述检测区上包被的甲型流感病毒抗体用量为0.20-0.23μg/mm，所述彩色胶乳标记兔IgG抗体的用量为28-32μg/cm2，所述羊抗兔抗体的用量为0.30-0.36μg/mm。
本发明还提供了上述试纸条的制备方法，包括以下步骤：
(1)按常规方法制备甲型流感病毒抗体以及彩色胶乳标记兔IgG抗体；
(2)制备微信号放大系统
a、制备彩色胶乳标记亲和素
将待标记亲和素预先在0.001～0.01mol/L的NaCl溶液中透析过夜，离心，调节彩色胶乳液的pH值至7～8，标记亲和素以形成彩色胶乳标记亲和素；
b、按常规方法制备生物素化甲型流感病毒抗体，所述生物素与甲型流感病毒抗体的质量比为1∶9；
c、完成微信号放大系统
将步骤a得到的彩色胶乳标记亲和素和步骤b得到的生物素化甲型流感病毒抗体混合，所述彩色胶乳标记亲和素与生物素化甲型流感病毒抗体的用量比例为：1ml彩色胶乳标记亲和素溶液中加入100μl生物素化甲型流感病毒抗体，连接得到彩色胶乳-亲和素-生物素-甲流感病毒抗体，洗涤，即得微信号放大系统；
(3)按稀释参数20cm2/ml～40cm2/ml，将步骤(2)的彩色胶乳-亲和素-生物素-甲型流感病毒抗体和彩色胶乳-兔IgG抗体喷洒到玻璃纤维膜上，干燥备用；
(4)用包被缓冲液稀释甲型流感病毒抗体，使其浓度为0.9mg/ml～1.4mg/ml，按膜液量0.16μl/mm～0.2μl/mm，将其细致均匀的喷到硝酸纤维素膜上，干燥备用；
用包被缓冲液稀释羊抗兔抗体，使其浓度为1.0mg/ml～2.0mg/ml，按膜液量0.18μl/mm～0.22μl/mm，将其细致均匀的喷到硝酸纤维素膜上，干燥备用；
(5)将样品垫、步骤(3)的玻璃纤维膜、步骤(4)的硝酸纤维素膜、吸水纸按序粘贴于底板上，即得。
优选地，所述步骤(3)中彩色胶乳-亲和素-生物素-甲型流感病毒抗体复合物的用量为32.5-60μg/cm2，所述步骤(4)中硝酸纤维素膜上包被的甲型流感病毒抗体的用量为0.144-0.28μg/mm，所述彩色胶乳标记兔IgG抗体的用量为20-40μg/cm2，所述羊抗兔抗体的用量为0.18-0.44μg/mm。
优选地，所述步骤(3)中彩色胶乳-亲和素-生物素-甲型流感病毒抗体复合物的用量为55-60μg/cm2，所述步骤(4)中硝酸纤维素膜上包被的甲型流感病毒抗体用量为0.20-0.23μg/mm，所述彩色胶乳标记兔IgG抗体的用量为28-32μg/cm2，所述羊抗兔抗体的用量为0.30-0.36μg/mm。
为了解决信号扩大不足的问题，本发明基于固相免疫层析原理，采用彩色胶乳颗粒标记技术、微信号放大技术(亲和素-生物素体系和双抗体夹心反应体系)检测人体分泌物中的甲型流感病毒抗原。若样品中含有甲型流感病毒抗原，经玻璃纤维膜上的微信号级联系统将信号放大，使甲型流感病毒抗原与彩色胶乳颗粒-亲和素-生物素-甲型流感病毒抗体复合物结合，并扩散到硝酸纤维素膜上进一步层析，当遇到包被在硝酸纤维素膜上检测区的T线(甲型流感病毒抗体包被线)处的配对抗体时，复合物则又和包被抗体结合，被捕获在包被处，当被捕获的复合物达到一定数量时，则形成肉眼可见的T线，说明样品中含有甲型流感病毒抗原，若不出现，说明样品为阴性或含量低于试纸条的最低检测限。控制区(C线)作为试纸条的质控标准，阳性和阴性样品检测时均会出现。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明在现有检测试纸条的基础上，采用了新的彩色胶乳检测技术代替传统的胶体金检测技术，并添加了生物素-亲和素微信号级联放大系统，优化了制备参数，得到了最优化的检测分泌物中甲型流感病毒抗原的试纸条因而，在检测甲型流感病毒抗原的过程中，扩大了目标抗体的信号，增加检测灵敏度，避免因信号太弱而出现假阴或者漏检；
(2)本发明的试纸条具有操作安全(无放射物污染)、简便(简单操作一步完成)、适合单人/份检测(放免、酶免不适合单人/份或少量样品检测)和快速(15分钟左右即可有结果)等优点，可实现对甲型流感病毒抗原现场和家庭自检。
附图说明
图1为本发明的检测分泌物中甲型流感病毒抗原的试纸条的结构示意图；
图2为利用本发明试纸条检测甲型流感病毒抗原的阳性结果示意图；
图3为利用本发明试纸条检测甲型流感病毒抗原的阴性结果示意图；
附图标记：1.样品垫；2.玻璃纤维膜；3.硝酸纤维素膜；4.吸水纸；5.甲型流感病毒检测区；6.质控区；7.底板。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例来详细说明本发明。
实施例1本发明检测分泌物中甲型流感病毒抗原的试纸条
如图1所示，为本发明所述的一种检测分泌物中甲型流感病毒抗原的试纸条。包括样品垫1、与所述样品垫1一端紧密相连的含有彩色胶乳颗粒标记物的玻璃纤维膜2、与所述玻璃纤维膜2另一端紧密相连的硝酸纤维素膜3、以及与所述纤维素膜3的另一端紧密相连的吸水纸4，所述样品垫1、玻璃纤维膜2、硝酸纤维素膜3和吸水纸4均设置于底板7上，所述硝酸纤维素膜3包括包被有甲型流感病毒抗体的检测区5和包被有羊抗兔抗体的控制区6，所述彩色胶乳颗粒标记物包括微信号放大系统和彩色胶乳标记兔IgG抗体，所述微信号放大系统为彩色胶乳颗粒-亲和素-生物素-甲型流感病毒抗体。
本发明的试剂条，所述彩色胶乳颗粒-亲和素-生物素-甲型流感病毒抗体复合物在玻璃纤维膜2上的用量为58μg/cm2；彩色胶乳标记兔IgG抗体在玻璃纤维膜2上的用量为30μg/cm2；甲型流感病毒抗体的原始浓度为3.00mg/ml，包被到硝酸纤维膜3的检测区5的浓度为1.2mg/ml，包被用量为0.216μg/mm；羊抗兔IgG抗体包被在控制区时的用量为0.33μg/mm。
实施例2实施例1试纸条的制备方法
在本发明中采用彩色胶乳颗粒标记。彩色胶乳微球是通过微球表面的羧基或者氨基，在EDC、戊二醛等交联剂或偶联剂的作用下，与蛋白的氨基或羧基发生缩合反应，形成稳定的交联物。利用蛋白的抗原性发生抗原抗体反应，利用微球所具有的颜色起示踪的作用，达到反应的目的。
一种检测分泌物中甲型流感病毒抗原的试纸条的制备步骤如下：
1.制备甲型流感病毒抗体
利用常规方法用重组的甲型流感抗原或灭活的甲型流感抗原免疫小鼠，甲型流感抗原免疫的小鼠与骨髓瘤细胞融合后，用ELISA方法鉴别，鉴别出来的杂交瘤在腹水中培养，筛选阳性克隆，分离纯化甲型流感病毒抗体。ELISA鉴定甲型流感病毒抗体的活性和效价，纯化备用。
2、制备微信号放大系统
a、制备彩色胶乳标记亲和素：将待标记亲和素(亲和素由美国Thermo公司提供)预先在0.005mol/L pH7.0的NaCl溶液中4℃透析过夜，以除去多余的盐离子，然后4℃100 000g离心1h，去除聚合物；以0.1mol/L的PBS调节彩色胶乳液(德国默克(MERCK))的pH值至7～8，标记亲和素以形成彩色胶乳标记亲和素；
b、制备生物素化甲型流感病毒抗体：先用6-氨基己糖与生物素(生物素由美国Thermo公司提供)连接制得长臂生物素，再使其与甲型流感抗原结合，所述生物素与甲型流感病毒抗体的质量比为1∶9，然后在碳二亚胺的作用下将其与N-羟基丁二酰胺进行缩和，生成长臂生物素N-羟基丁二酰亚胺酯(N-hydroxy-succinimido-6-biotinyl amido hexanoae，BCNHS)，即为生物素化甲型流感病毒抗体。通过透析除去游离生物素。
c、完成微信号放大系统的：将步骤a得到的彩色胶乳标记亲和素和步骤b得到的生物素化甲型流感病毒抗体直接混合，所述彩色胶乳标记亲和素与生物素化甲型流感病毒抗体的用量比例为：1ml彩色胶乳标记亲和素溶液中加入100μl生物素化甲型流感病毒抗体，连接得到彩色胶乳-亲和素-生物素-甲型流感病毒抗体复合物，经过洗涤、离心处理后，即得微信号放大系统。
3、彩色胶乳标记兔IgG抗体
在pH6.5～7.0范围内，兔IgG与彩色胶乳颗粒蛋白(最低用量为8.0μg/ml)标记形成彩色胶乳标记兔IgG抗体(蛋白探针)。
4、将彩色胶乳-亲和素-生物素-甲型流感病毒抗体、以及彩色胶乳标记兔IgG抗体喷洒到玻璃纤维膜2上，稀释参数(稀释参数是每ml溶液喷洒多少面积的工艺参数)为25cm2/ml～35cm2/ml，所述彩色胶乳颗粒-亲和素-生物素-甲型流感病毒抗体复合物在玻璃纤维膜2上的用量为58μg/cm2；彩色胶乳标记兔IgG抗体在玻璃纤维膜2上的用量为30μg/cm2，并在温度20～40℃，湿度10％-30％，将玻璃纤维膜2干燥12个小时以上，备用。
5、用包被缓冲液(主要成分是0.01M pH7.2PBS、5％蔗糖、1％甲醇、5％甘氨酸、0.05％NaN3)稀释甲型流感病毒抗体，使其浓度为1.0mg/ml，按膜液量0.18μl/mm，将其分别细致均匀的喷到硝酸纤维素膜3上，甲型流感病毒抗体的原始浓度为3.00mg/ml，包被到硝酸纤维膜3的检测区5的浓度为1.2mg/ml，包被用量为0.216μg/mm，其中硝酸纤维素膜3孔径为5.0μm～10.0μm，置于20～40℃，湿度10％～30％条件下烘干处理12个小时以上，备用；用包被缓冲液稀释羊抗兔IgG抗体，使其浓度为1.5mg/ml，按膜液量0.20μl/mm，将其细致均匀的喷到硝酸纤维素膜3上，置于20～40℃，湿度10％～30％条件下烘干处理12个小时以上，封袋，备用；
同时，用包被缓冲液稀释羊抗兔抗体，使其浓度为1.5mg/ml，按膜液量0.33μg/mm，将其细致均匀的喷到硝酸纤维素膜上，干燥备用；
6、将样品垫1、玻璃纤维膜2、硝酸纤维素膜3和吸水纸4依序粘贴于底板7上，即得本发明所述的试纸条。
本发明所述的检测分泌物中甲型流感病毒抗原的试纸条经过包装可以直接使用，或者安装到试剂盒里，配合小滴管，充当试剂卡使用。
实施例3利用实施例1中的试纸条检测分泌物中甲型流感病毒抗原的方法
本实施例利用实施例1的试纸条对分泌液样本中的甲型流感病毒抗原进行检测。
包括以下步骤：
(1)采集样本：使用无菌PP(聚丙烯)杆的聚酯海绵拭子采集样本。鼻腔分泌物采集方法：收集鼻腔分泌物时，将拭子插入鼻腔中分泌物最多处，轻轻转动并向鼻腔内部推动拭子，直至鼻甲(离鼻孔约2.0cm～2.5cm)受阻处，贴鼻腔壁旋转拭子三次，取出拭子；咽喉分泌物采集：将拭子从口腔完全插入咽喉中，以咽喉壁、上颚扁桃的发红部位为中心，适度用力擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，应避免触及舌部，取出拭子；
(2)采集唾液样品后，在样本提取管内垂直加入400μl(约10滴)样本提取液，将采样后的拭子插入样本提取管中溶液内，紧靠试管内壁旋转约10次，使标本尽可能溶解在溶液中，沿提取管内壁挤压拭子的棉签头，使液体尽可能留在管内，取出并弃去拭子。标本采集后尽快采用病毒采样液或本试剂盒提供的样本提取液进行处理。如不能立即处理，标本应立即置于干燥、消毒并严格密封的塑料管内储存，2℃～8℃下可保存8小时，-70℃可长期保存；
(3)沿铝箔袋切口部位撕开，取出试条平放，吸取5μl样本垂直滴加于试条箭头胶所示的加样区；由于毛细管作用，样品将沿着试纸条向玻璃纤维素膜2和硝酸纤维素膜3移动，待样品完全通过玻璃纤维素膜2以及硝酸纤维素膜3，结果开始显示；
(4)15分钟后观察显示结果(30分钟后显示的结果无效)，判读并记录检测结果(图2和图3)，若硝酸纤维素膜3的检测区5出现一条肉眼可见的深色线(T线)，即表明样品中含有大量甲型流感病毒抗原，即说明受检验者的肌体已经被甲型流感病毒感染(甲型流感病毒阳性，请同时参考图2)；若硝酸纤维素膜3的检测区5未出现一条肉眼可见的深色线，即表明样品中未含有大量的流感病毒抗原，说明受检验者未被病毒感染(阴性，请同时参考图3)；当样品通过硝酸纤维素膜3的检测区5移动至控制区6时，无论样品中有没有甲型流感病毒抗原，控制区6都会有一条深色线(C线)；若控制区6无色线出现，说明试纸条已经过期或操作有误；
(5)测试结束后，将使用后的试纸条、样本提取管和口腔取样器按生物医疗废弃物进行处理。
结果
注：为了表示方便，在下列表格中A代表甲型流感病毒抗原
评价试剂与参比试剂比较(免疫层析法)：检测样本包括在广东省疾病预防控制中心481例、广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心300例、广州市妇女儿童医疗中心(广州市儿童医院)300例、广州市疾病预防控制中心300例、中国人民解放军第302医院345例、广州市第八人民医院202例，合计1928例。
注：“+/+”表示评价试剂结果与参比试剂结果相同，均为阳性；“+/-”表示评价试剂结果为阳性，参比试剂结果为阴性；“-/+”表示评价试剂结果为阴性，参比试剂结果为阳性；“-/-”评价试剂检测结果与参比试剂结果相同，均为阴性。以下两产品层析法对比相同。
评价试剂和参比试剂与PCR方法比较：广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心300例、广州市妇女儿童医疗中心(广州市儿童医院)300例和广东省疾病预防控制中心166例临床样本，合计766例。
注：“+/+”表示评价(参比)试剂结果与PCR法结果相同，均为阳性；“+/-”表示评价(参比)试剂结果为阳性，PCR法结果为阴性；“-/+”表示评价(参比)试剂结果为阴性，PCR法结果为阳性；“-/-”评价(参比)试剂检测结果与PCR法结果相同，均为阴性。以下PCR方法比较相同。
鼻拭子样本的检测：广东省疾病预防控制中心(广东省卫生检验中心)128例、广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心300例和广州市第八人民医院的202例，三家合计630例。
咽拭子样本的检测：广州市疾病预防控制中心(广州市卫生检验中心)300例、广东省疾病预防控制中心(广东省卫生检验中心)的323例、广州市儿童医院的300例和中国人民解放军第302医院的345例，四家合计1268例。
注：“+/+”表示评价试剂与参比试剂检测结果同为阳性；“+/-”表示评价试剂为阳性，参比试剂为阴性；“-/+”表示评价试剂为阴性，参比试剂为阳性；“-/-”表示评价试剂与参比试剂同为阴性
实施例4本实施例检测分泌物中甲型流感病毒抗原的试纸条
本实施例所述的一种检测分泌物中甲型流感病毒抗原的试纸条。包括样品垫1、与所述样品垫1一端紧密相连的含有彩色胶乳颗粒标记物的玻璃纤维膜2、与所述玻璃纤维膜2另一端紧密相连的硝酸纤维素膜3、以及与所述纤维素膜3的另一端紧密相连的吸水纸4，所述样品垫1、玻璃纤维膜2、硝酸纤维素膜3和吸水纸4均设置于底板7上，所述硝酸纤维素膜3包括包被有甲型流感病毒抗体的检测区5和包被有羊抗兔抗体的控制区6，所述彩色胶乳颗粒标记物包括微信号放大系统和彩色胶乳标记兔IgG抗体，所述微信号放大系统为彩色胶乳颗粒-亲和素-生物素-甲型流感病毒抗体。
本实施例的试剂条，所述彩色胶乳颗粒-亲和素-生物素-甲型流感病毒抗体复合物在玻璃纤维膜2上的用量为40μg/cm2；彩色胶乳标记兔IgG抗体在玻璃纤维膜2上的用量为20μg/cm2；甲型流感病毒抗体的原始浓度为3.00mg/ml，包被到硝酸纤维膜3的检测区5的浓度为1.2mg/ml，包被用量为0.150μg/mm；羊抗兔IgG抗体包被在控制区时的用量为0.20μg/mm。
本实施例的所述试剂条的制备方法与实施例2基本相同。
采用广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心200例、和广东省疾病预防控制中心200例临床样本，共400例临床确诊样本，用实施例1和实施例4所述的诊断试纸条以及杭州创新公司甲型检测试剂盒进行对比检测，评比结果如下。
实施例1、4及市售产品的灵敏度和特异性结果如下：
从上表可以看出，实施例1方案在灵敏度及特异性方面明显优于实施例4方案，并且与杭州创新公司同类产品相比较灵敏度较高，更有利于甲型流感病毒的检出。
以上是针对本发明的可行实施例的具体说明，但该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明技艺精神所为的等效实施或变更，均应包含于本发明的专利范围中。
Claims (9)
1.一种检测分泌物中甲型流感病毒抗原的试纸条，其特征在于，所述试纸条由样品垫、含有彩色胶乳颗粒标记物的玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜、吸水纸顺次搭接粘贴在底板上构成，所述硝酸纤维素膜包括包被有甲型流感病毒抗体的检测区和包被有羊抗兔抗体的控制区，所述彩色胶乳颗粒标记物包括微信号放大系统和彩色胶乳标记兔IgG抗体，所述微信号放大系统为彩色胶乳颗粒-亲和素-生物素-甲型流感病毒抗体。
2.根据权利要求1所述的检测分泌物中甲型流感病毒抗原的试纸条，其特征在于，所述彩色胶乳颗粒-亲和素-生物素-甲型流感病毒抗体复合物的用量为32.5-60μg/cm2。
3.根据权利要求1所述的检测分泌物中甲型流感病毒抗原的试纸条，其特征在于，所述检测区包被的甲型流感病毒抗体用量为0.144-0.28μg/mm。
4.根据权利要求1所述的检测分泌物中甲型流感病毒抗原的试纸条，其特征在于，所述彩色胶乳标记兔IgG抗体的用量为20-40μg/cm2。
5.根据权利要求1所述的检测分泌物中甲型流感病毒抗原的试纸条，其特征在于，所述羊抗兔抗体为羊抗兔IgG抗体，所述羊抗兔抗体的用量为0.18-0.44μg/mm。
6.根据权利要求1所述的检测分泌物中甲型流感病毒抗原的试纸条，其特征在于，所述彩色胶乳颗粒-亲和素-生物素-甲型流感病毒抗体复合物的用量为55-60μg/cm2，所述检测区包被的甲型流感病毒抗体用量为0.20-0.23μg/mm，所述彩色胶乳标记兔IgG抗体的用量为28-32μg/cm2，所述羊抗兔抗体的用量为0.30-0.36μg/mm。
7.一种制备权利要求1-6任一项所述的检测分泌物中甲型流感病毒抗原的试纸条的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)按常规方法制备甲型流感病毒抗体以及彩色胶乳标记兔IgG抗体；
(2)制备微信号放大系统
a、制备彩色胶乳标记亲和素
将待标记亲和素预先在0.001～0.01mol/L的NaCl溶液中透析过夜，离心，调节彩色胶乳液的pH值至7～8，标记亲和素以形成彩色胶乳标记亲和素；
b、按常规方法制备生物素化甲型流感病毒抗体，所述生物素与甲型流感病毒抗体的质量比为1∶9；
c、完成微信号放大系统
将步骤a得到的彩色胶乳标记亲和素和步骤b得到的生物素化甲型流感病毒抗体混合，所述彩色胶乳标记亲和素与生物素化甲型流感病毒抗体的用量比例为：1ml彩色胶乳标记亲和素溶液中加入100μl生物素化甲型流感病毒抗体，连接得到彩色胶乳-亲和素-生物素-甲型流感病毒抗体，洗涤，即得微信号放大系统；
(3)按稀释参数20cm2/ml～40cm2/ml，将步骤(2)的彩色胶乳-亲和素-生物素-甲型流感病毒抗体和彩色胶乳-兔IgG抗体喷洒到玻璃纤维膜上，干燥备用；
(4)用包被缓冲液稀释甲型流感病毒抗体，使其浓度为0.9mg/ml～1.4mg/ml，按膜液量0.16μl/mm～0.2μl/mm，将其细致均匀的喷到硝酸纤维素膜上，干燥备用；
用包被缓冲液稀释羊抗兔抗体，使其浓度为1.0mg/ml～2.0mg/ml，按膜液量0.18μl/mm～0.22μl/mm，将其细致均匀的喷到硝酸纤维素膜上，干燥备用；
(5)将样品垫、步骤(3)的玻璃纤维膜、步骤(4)的硝酸纤维素膜、吸水纸按序粘贴于底板上，即得。
8.根据权利要求7所述的制备检测分泌物中甲型流感病毒抗原的试纸条的方法，其特征在于，所述步骤(3)中彩色胶乳-亲和素-生物素-甲型流感病毒抗体复合物的用量为32.5-60μg/cm2，所述步骤(4)中硝酸纤维素膜上包被的甲型流感病毒抗体的用量为0.144-0.28μg/mm，所述彩色胶乳标记兔IgG抗体的用量为20-40μg/cm2，所述羊抗兔抗体的用量为0.18-0.44μg/mm。
9.根据权利要求7所述的制备检测分泌物中甲型流感病毒抗原的试纸条的方法，其特征在于，所述步骤(3)中彩色胶乳-亲和素-生物素-甲型流感病毒抗体复合物的用量为55-60μg/cm2，所述步骤(4)中硝酸纤维素膜上包被的甲型流感病毒抗体用量为0.20-0.23μg/mm，所述彩色胶乳标记兔IgG抗体的用量为28-32μg/cm2，所述羊抗兔抗体的用量为0.30-0.36μg/mm。
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