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CN102533960B - 一种单细胞基因组分析方法及试剂盒 - Google Patents

一种单细胞基因组分析方法及试剂盒 Download PDF

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CN102533960B
CN102533960B CN201010619689.8A CN201010619689A CN102533960B CN 102533960 B CN102533960 B CN 102533960B CN 201010619689 A CN201010619689 A CN 201010619689A CN 102533960 B CN102533960 B CN 102533960B
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chromosomal
unicellular
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cell
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刘晓羽
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BGI Shenzhen Co Ltd
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Abstract

本发明公开了一种单细胞基因组分析方法和试剂盒。所述方法包括：a、获取完整细胞基因组DNA；b、进行单细胞全基因组扩增；c、对扩增产物进行定量检测及定性检测，所述定性检测是指，采用Housekeeping Gene检测方法，对单细胞全基因组的扩增产物进行检测。所述试剂盒含有所述单细胞的Housekeeping Gene的特异性引物。本发明的方法可以全面完整地分析单细胞基因组的遗传变异信息，并对于全新物种的单细胞基因组研究提供了有效的研究策略；而引入的定性及定量检测筛选步骤，可去除大量不合格的扩增样品，从而控制下游上机测序文库的质量，能从很大程度上避免不必要的浪费。

Description

一种单细胞基因组分析方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及分子细胞生物学，具体涉及一种能够高效进行单细胞基因组，特别是高等生物单细胞基因组研究的技术和试剂盒。
背景技术
个体的不同组织之间，同一组织的不同部位间存在异质性。同样细胞之间也存在异质性，即使是体外培养遗传背景完全相同的细胞群体。
为了更好地研究细胞生物学，非常需要开发应用于单个细胞研究的技术方法，来揭示细胞异质性的规律。因此有学者提出“单细胞分析(SCA)”概念，从“组学(Omics)”角度进行阐述。在单细胞分析中，首要研究的就是单细胞基因组。
目前，微量DNA和单细胞基因组研究已被广泛应用于考古学、微生物生态学、医学检测、法医学检测、临床诊断以及各种科学研究中(Zhang L.，CuiX.，Schmitt K.，Hubert R.，Navidi W.，Arnheim N.(1992)Whole genomeamplification from a single cell：Implication for genetic analysis，Proc Natl AcadSci USA：5847-5851)。而常用的DNA分析方法多为比较基因组杂交技术(Comparative Genomic Hybridization，CGH)、聚合酶链反应(PolymeraseChain Reaction，PCR)、基因芯片(DNA Microarray)、限制性片段长度多态性分析(Restricted Fragment Length Polymorphisms，RFLP)、单链构象多态性分析(SSCP)、指纹技术和荧光原位杂交技术(Fluorescence in SituHybridization，FISH)等。一方面，这些技术只能对单细胞基因组的部分区域或已知位点进行研究；另一方面，这些技术对于全新物种的基因组研究缺乏有效的分析策略。而对单细胞基因组进行测序可以有效避免上述技术的不足。
单细胞基因组DNA量为皮克级水平，而目前的测序技术要求起始DNA量为微克级水平，需要经过全基因组扩增(WGA)使之达到足够量。已知的全基因组扩增方法包括PEP-PCR，DOP-PCR等基于PCR的方法，以及多重链置换扩增(MDA，Multiple Displacement Amplification)。但由于上述方法受到的干扰因素较多，无法保证100％的成功率，因此在测序前，必须对经过全基因组扩增后的DNA产物进行检测和筛选，以去除未扩增成功的样本，保证后续单细胞基因组测序的合格率。
单细胞基因组测序最早实现的是微生物单细胞。微生物的基因组相对较小，并且较易分离。2006年，Church及其同事对E.coli和Prochlorococcus单细胞基因组进行了鸟枪法测序。随新一代测序技术(NGS)的发展，也已有人将其应用于微生物单细胞基因组研究。2009年，Chisholm及其同事对Prochlorococcus单细胞基因组用454-FLX和Illumina Genome Analyzer测序仪进行分析，实现了Prochlorococcus单细胞基因组的De novo组装(SebastienRodrigue，Rex R.Malmstrom，Aaron M.Berlin，Bruce W.Birren，Matthew R.Henn，Sallie W.Chisholm(2009)Whole Genome Amplification and De novo Assemblyof Single Bacterial Cells，Plos ONE 4(9)：e6864.)。
相对于微生物来说，哺乳动物等高等生物的基因组要大得多。目前关于哺乳动物等高等生物的单细胞基因组测序的研究和报道很少。而对高等动植物的单细胞基因组进行分析和研究，能够高效、方便地应用于临床诊断和治疗(如产前诊断、胚胎植入前遗传诊断、多点图谱制作、精子和卵子的分型、遗传病诊断等)、医学研究(如自闭症、神经系统疾病和自体免疫性疾病的研究、基因组变异率研究、干细胞研究等)、考古学研究、法医学检测中。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种能够应用于高等生物并高效进行单细胞基因组研究的分析方法。
本发明的另一目的在于提供一种可用于上述方法的单细胞基因组分析试剂盒。
为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
本发明公开了一种单细胞基因组分析方法，所述方法包括步骤：
a、分离并裂解单细胞，得到完整的细胞基因组DNA；
b、进行单细胞全基因组扩增；
c、对扩增产物进行定量检测及定性检测，所述定性检测是指，采用Housekeeping Gene检测方法，对单细胞全基因组的扩增产物进行检测，结果显示为扩增产物在相应物种的染色体上均匀分布的样品为符合要求的样品。
具体的，所述方法还包括步骤d、检测合格的样品进行DNA文库构建并测序。
在本发明优选的实施方式中，所述步骤b中单细胞全基因组扩增采用多重置换扩增MDA或DOP-PCR全基因组扩增。
所述步骤c中，采用Housekeeping Gene检测是指，采用HousekeepingGene的特异性引物，以全基因组扩增产物为模板进行PCR扩增。
在本发明一个优选的实施方式中，所述单细胞为人单细胞，所述Housekeeping Gene为位于1号染色体的PRDX6、位于2号染色体的RPL37a、位于4号染色体的ADD1、位于6号染色体的HLA-A、位于11号染色体的RAD9A、位于13号染色体的ARHGEF7、位于14号染色体的EIF2B2、位于16号染色体的PSMD7、位于19号染色体的BCAT2、及位于21号染色体的ATP5O中的至少一种。
优选的，上述Housekeeping Gene检测的特异性引物分别为：
PRDX6-S：5′CTTGCTTCACTCCATCAGA 3′   Seq ID No.1
PRDX6-A：5′CATCATCGGAAAACAGAC 3′    Seq ID No.2
RPL37a-S：5′AGTTTAGGTCAGCCTCTTAG 3′ Seq ID No.3
RPL37a-A：5′GGACTTTACCGTGACAGC 3′   Seq ID No.4
ADD1-S：5′TACCAGCCTGACTAGGTACAG 3′  Seq ID No.5
ADD1-A：5′GTCCTCCCAAGTCGGTGT 3′     Seq ID No.6
HLA-A-S1：5′GGATTACATCGCCCTGAAC 3′  Seq ID No.7
HLA-A-A1：5′CGTCTCCTTCCCGTTCTC 3′   Seq ID No.8
RAD9A-S1：5′GGTGAAGGCTGAACCAAG 3′   Seq ID No.9
RAD9A-A1：5′CTGAGGCTCAATGAGAAAT 3′  Seq ID No.10
ARHGEF7-S：5′AGTAGCCTTTCTCGTTTG 3′  Seq ID No.11
ARHGEF7-A：5′CACCACCTCCCTCCAATAGT 3′Seq ID No.12
EIF2B2-S：5′GCACCTTCCTACATCTAC 3′   Seq ID No.13
EIF2B2-A：5′TAAGAGGCTCCAAAATCAAC 3′ Seq ID No.14
PSMD7-S：5′AAAGTCGCCACAGGCAAGC 3′   Seq ID No.15
PSMD7-A：5′CGTAGCACCACAGCAAG 3′     Seq ID No.16
BCAT2-S1：5′GGAATCAGAGCCCACGAGT 3′  Seq ID No.17
BCAT2-A1：5′TATCCTTGACCGCACGAC 3′   Seq ID No.18
ATP5O-S1：5′GCACCACCAAGCCCTAAC 3′   Seq ID No.19
ATP5O-A1：5′TCTCCGCGATGGACACTC 3′   Seq ID No.20。
本发明进一步公开了一种单细胞基因组分析试剂盒，所述试剂盒含有所述单细胞的Housekeeping Gene的特异性引物，用于对单细胞全基因组扩增产物进行检测。
优选的，所述单细胞为人单细胞，所述Housekeeping Gene为上述的位于1号染色体的PRDX6、位于2号染色体的RPL37a、位于4号染色体的ADD1、位于6号染色体的HLA-A、位于11号染色体的RAD9A、位于13号染色体的ARHGEF7、位于14号染色体的EIF2B2、位于16号染色体的PSMD7、位于19号染色体的BCAT2、及位于21号染色体的ATP5O中的至少一种。特异性引物分别为上述Seq ID No.1-20所述的引物。
进一步地，所述试剂盒还含有用于对单细胞进行全基因组扩增的试剂成分，所述单细胞全基因组扩增采用多重置换扩增MDA或DOP-PCR。
由于采用了以上技术方案，使本发明具备的有益效果在于：
利用本发明的方法和试剂盒能够高效地对高等动植物的单细胞基因组进行分析和研究，一方面，可以有效避免传统的DNA分析方法只能对单细胞基因组的部分区域进行研究的不足，全面完整地分析单细胞基因组的遗传变异信息，操作简便，省时高效；另一方面，本技术对于全新物种的单细胞基因组研究提供了有效的研究策略；而引入的定性及定量检测筛选步骤，可去除大量不合格的扩增样品，从而控制下游上机测序文库的质量，能从很大程度上避免不必要的浪费。并且本发明采用新一代测序技术(NGS)，对高等动植物的单细胞基因组进行分析和研究，能够高效、方便地应用于临床诊断和治疗(如产前诊断、胚胎植入前遗传诊断、多点图谱制作、精子和卵子的分型、遗传病诊断等)、医学研究(如自闭症、神经系统疾病和自体免疫性疾病的研究、基因组变异率研究、干细胞研究等)、考古学研究、法医学检测中。
附图说明
图1为本发明实施例1的人细胞系单细胞基因组测序数据在每条常染色体的覆盖率情况。
图2为本发明实施例1的人细胞系单细胞基因组测序数据在每条常染色体的平均测序深度情况。
图3为本发明实施例1的以1号染色体为例，评价人细胞系单细胞基因组测序的深度分布情况。以染色体10k长度为单位统计测序平均深度，进行作图。由图可见，染色体不同区域的测序深度有很大差异。
图4为本发明实施例1的人细胞系单细胞基因组测序数据中，覆盖率与测序深度间的关系图。随测序深度增加，覆盖率亦增加，但斜率变缓，逐渐到达一个平台期。测序深度7X，覆盖率可达90％；深度10X，覆盖率可达95％.
图5为本发明实施例2的电泳结果图。其中各泳道分别代表：1：PbGDPS-SSU；2：PbGDPS-LSU；3：PeActin 9；4：PbGDPSp 1；5：Pe4Cme Probe；6：Pe4-lex-5ex；7：PbfMuta 1；8：Pe6p
图6为以1号染色体上20kb为窗口，计算每个窗口Tag数(标签的数目)再将窗口数对应Tag数作图。一般在某个Tag数范围其窗口数最多，因此可形成一个峰。将人单细胞基因组数据与人细胞群体数据一起分析作图，发现单细胞数据的Tag数峰值位置明显偏离细胞群体数据，说明单细胞基因组经扩增后存在bias。
图7为人细胞系单细胞基因组数据中，以1号染色体为例，以10k为窗口统计平均深度，选取2.5％的最高深度的窗口，及2.5％的最低深度的窗口，统计它们的GC％分布情况，与整条染色体的GC％对比。发现高深度区域的GC％显著高于整体水平，低深度区域的GC％显著低于整体水平。说明单细胞基因组测序深度受GC影响。
具体实施方式
本发明公开了一种能够高效用于高等生物单细胞基因组研究的技术。本发明的方法主要包括以下步骤：
(1)分离单细胞：
可以采用例如物理机械、化学、生物的方法，如微流控、流式细胞仪、口吸分离、梯度稀释、低熔点琼脂糖固定等方法，分离得到包含完整基因组的单个细胞。
(2)裂解细胞：
对分离得到的单个细胞，可以采用例如去污剂法、煮沸法、碱变性法、溶菌酶法、有机溶剂法等方法，裂解细胞核，得到完整的细胞基因组DNA。
(3)单细胞全基因组扩增(WGA)：
目前全基因组扩增有2种策略：即基于PCR的扩增和线性DNA扩增，前者如DOP-PCR、PEP-PCR、T-PCR，后者如OmniPlex WGA、多重置换扩增(MDA)。在本发明具体的实施方式中，优选采用多重置换扩增MDA或DOP-PCR。
进行单细胞全基因组扩增，以达到新一代测序技术所要求的DNA起始量。MDA中可使用完全由随机核苷酸组成的引物，引物长度可以是5-20个核苷酸，引物的GC含量可根据模板的性质进行选择。例如以人基因组DNA为模板进行MDA，可选用GC含量为40％-42％的随机引物。所述模板性质主要限为模板DNA的GC含量，引物的GC含量选择与模板接近或相同为宜。全基因组扩增的偏向性受GC含量影响，例如对人基因组DNA为模板进行MDA扩增，用一般GC为50％的随机引物，扩增拷贝数多的区域均为高GC的区域，如图七。
(4)全基因组扩增产物定量：
可以采用例如凝胶电泳检测、Agilent 2100Bioanalyzer检测、Quant-iTTMdsDNA BR Assay Kit检测等方法对单细胞全基因组的扩增产物进行定量，结果显示为无降解、符合新一代测序技术所要求的DNA起始量的样品才可以继续DNA文库构建以及上机测序。而新一代测序技术要求的DNA起始量因不同建库策略而有所不同，一般DNA小片段建库要求DNA起始量大于1微克。
(5)全基因组扩增产物检测：
采用Housekeeping Gene检测方法，对单细胞全基因组的扩增产物进行检测，结果显示为扩增产物在相应物种的染色体上均匀分布的样品才可以继续DNA文库构建以及上机测序。该步骤为单细胞全基因组扩增产物的筛选步骤，这一步筛选可去除大量不合格的扩增样品，从而控制下游上机测序文库的质量，能从很大程度上避免不必要的浪费。
(6)DNA文库构建及上机测序：
采用常规的全基因组DNA文库构建或外显子序列捕获技术进行DNA文库构建，比如可采用本领域技术人员熟知的方法进行，如Illumina文库构建方法可参考http://www.illumina.com/support/documentation.ilmn。质检合格后(文库质检包括qPCR检测和Agilent 2100Bioanalyzer检测。Agilent 2100Bioanalyzer检测要求文库的片段大小与预期大小相差在±10bp以内，且没有拖带；qPCR检测文库的浓度，要求根据文库浓度计算的总量达到上机的要求)，采用新一代测序技术进行单细胞基因组测序，如Illumina HiSeq 2000测序系统、Illumina Genome Analyzer II测序系统、AB SOLiDTM 4.0测序系统、Roche GSFLX Titanium System等。
(7)生物信息分析：
通过生物信息分析，对单细胞基因组的测序信息进行分析和研究，以得到相关基因的单核苷酸多态性位点(SNP)、少数碱基的插入和缺失(InDel)、DNA拷贝数变异(CNV)、结构变异(SV)等单细胞基因组的遗传变异信息。
本发明的方法，通过对高等生物单细胞基因组DNA进行全基因组扩增，且在扩增后引入定量及定性检测步骤，检测通过的样品才能进入下一步文库构建及测序，其中测序采用新一代测序技术(NGS)进行检测分析。利用本发明的方法能够高效地对高等动植物的单细胞基因组进行分析和研究，一方面，可以有效避免传统的DNA分析方法只能对单细胞基因组的部分区域进行研究的不足，全面完整地分析单细胞基因组的遗传变异信息，操作简便，省时高效；另一方面，本技术对于全新物种的单细胞基因组研究提供了有效的研究策略；而引入的定性及定量检测筛选步骤，可去除大量不合格的扩增样品，从而控制下游上机测序文库的质量，能从很大程度上避免不必要的浪费。
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。
实施例一：
人细胞系单细胞基因组研究
(1)分离及裂解单细胞：将永生化的人淋巴细胞系单细胞加到培养皿上的PBS液滴中，适度稀释(即根据细胞系细胞的浓度进行稀释，直到在显微镜200X视野内观察到细胞数目在10-20个之间)，在显微镜下口吸分离单个细胞，所得单细胞放至含有1.5-2uL ALB(Alkaline Lysis Buffer，具体配方为：50mMDTT，200mM KOH)的PCR管中，置于-20℃至-80℃至少30min。
将存有单细胞的PCR管以62℃-68℃优选65℃加热8-12min，裂解细胞，释放染色体DNA。
(2)全基因组扩增(WGA)：
可以采用下述多重置换扩增MDA或DOP-PCR全基因组扩增中的任一种方式进行。
①多重置换扩增(MDA)：
按产品说明书记载配制试剂：
●Buffer D1(Qiagen REP LI-g Mini Kit)：
重构Bufffer DLB        9uL
Nuclease-free water    32uL
其中，向Buffer DLB中加入500uL nuclease-free water，摇匀并短暂离心，避免管壁上沾有液滴而使混合不均，得到重构BufferDLB。Buffer DLB对pH值敏感，应避免与空气中的CO2中和。重构后的Buffer DLB可在-20℃保存6个月。
●Buffer N1(Qiagen REP LI-g Mini Kit)
Stop solution          12uL
Nuclease-free water    68uL
在上述步骤(1)裂解细胞后的产物中加入2.5uL Buffer D1，置于室温3-5min，使DNA变性。加入5uL Buffer N1中和缓冲液，终止变性反应，室温放置。
MDA反应可以采用下述两种产品中的其中一种进行：
NEB公司phi29DNA聚合酶产品：
Figure BDA0000042446440000081
上述体系可根据总体积大小的需要使各成分按相同比例增加或减少。Qiagen公司REPLI-g Mini Kit：
Figure BDA0000042446440000082
上述体系可根据总体积大小的需要使各成分按相同比例增加或减少。
向已有单细胞DNA模板的PCR管中(上述经加入Buffer D1变性，并加入Buffer N1终止变性反应后的产物)加入上述两个反应体系中的其中任一个，混合均匀，瞬时离心，防止管壁上沾有液滴而使混合不均。
于PCR仪上，30℃恒温孵育10-16小时。之后65℃使Phi29聚合酶失活。
②DOP-PCR全基因组扩增：
使用Sigma公司的GenomePlex Single Cell Whole Genome AmplificationKit。在含有单细胞DNA的PCR管(上述步骤(1)的产物)中加水至9ul，及1ul 10x Single Cell Lysis & Fragmentation Buffer，混匀，99℃4min打断细胞基因组DNA。之后按照说明书操作，构建OmniPlex文库，以及线性、等温的起始扩增和PCR扩增。
或使用Rubicon Genomics公司的PicoPlex WGA Kit。按照说明书进行操作。
(3)使用Quant-iTTM dsDNA BR Assay Kit测量WGA扩增产物的浓度，按照试剂盒说明书进行操作。若所得扩增物的含量超过2ug，则继续进行DNA文库构建以及上机测序。
(4)DNA文库构建及上机测序：采用常规全基因组DNA文库构建或外显子序列捕获(Exon Capture)技术进行DNA文库构建，质检合格后，采用IlluminaHiSeq 2000测序系统进行单细胞基因组测序。
(5)生物信息分析：
对人细胞系单细胞用Hiseq2000系统进行全基因组深度测序。共35Gb数据可比对上NCBI人参考序列，平均测序深度13.3X(“测序深度”指在基因组中每个碱基被测序到的次数)，其在每条常染色体上的覆盖率和平均深度见图一和图二，在1号常染色体上的深度分布见图三，在人类基因组的覆盖率与测序深度间的关系见图四。
亦可分析得到细胞系单细胞基因组的遗传变异信息，如单核苷酸多态性位点(SNP)、少数碱基的插入和缺失(InDel)、DNA拷贝数变异(CNV)、结构变异(SV)等。
实施例二：
人Housekeeping gene引物对单细胞WGA产物PCR检测
从人体组织或血液分离的单细胞，经裂解和WGA处理(具体处理过程参照实施例1进行)，产物进行Housekeeping Gene的PCR检测。
所选取的Housekeeping Gene及其对应引物信息如下：
Figure BDA0000042446440000091
Figure BDA0000042446440000101
上述Housekeeping Gene记载于Eli Eisenberg and Erez Y.Levanon，(2003)Human housekeeping genes are compact.Trends inGenetics.19(7)：362-365.。本发明人研究发现，相对于其它染色体上的其它Housekeeping Gene，上述选取的Housekeeping Gene及其引物能够方便准确地用于人细胞WGA扩增产物的定性检测。
PCR体系中含：耐热并具3’外切活性的DNA聚合酶；单细胞WGA产物(模板)；dNTP mix；Mg2+；一价阳离子；引物。具体反应体系如下：
Taq DNA聚合酶    0.1U/ul，
模板DNA          15ng，
dNTP mix         0.2hmol/ul，
Mg2+             1.5nmol/ul，
10x扩增缓冲液    2ul，
引物             10pmol。
PCR反应条件：
95℃3min
95℃30s
55℃30-40s  }30-35cycle
72℃30-50s
72℃10min
4℃∞
上述10对引物，分别对应1、2、4、6、11、13、14、16、19、21号染色体，以8对引物出现目的条带为合格标准，对50份人血液单细胞WGA样品进行PCR检测，有34份样品合格。所有50份人血液单细胞WGA样品均后续进行ExonCapture建库，建库流程采用Agilent SureSelect系统，构建完的文库用IlluminaHiseq2000系统进行测序。
PCR合格的34份样品中，目标区域测序覆盖率均达60％以上，成功率达100％；而PCR不合格的16份样品中，目标区域测序覆盖率达60％以上者仅为1份，成功率仅为6.25％。具体统计如下：
Figure BDA0000042446440000111
其中标记*号的样品为PCR检测合格的样品。
在本发明中，对于除1、2、4、6、11、13、14、16、19、21号染色体外的其余染色体，本发明人也对应每条染色体分别选取了一个HousekeepingGene并设计引物用于进行上述的人细胞WGA扩增产物的定性检测。所选取的Housekeeping Gene及其对应染色体如下表所示。
Figure BDA0000042446440000121
多次验证的结果显示，上述表格中对应于除1、2、4、6、11、13、14、16、19、21号染色体外其余染色体的各Housekeeping Gene，利用所设计的引物，以上述相同的单细胞WGA产物为模板进行PCR检测，所得到的检测结果并不能如上述所选取的分别对应1、2、4、6、11、13、14、16、19、21号染色体的Housekeeping Gene及其引物那样，能真实反应出实际测序的准确性。这可能与单细胞WGA扩增的复杂性有关。
由于从单一细胞释放的染色体DNA极其微量，进行单细胞全基因组扩增时，环境中细微的污染很可能使扩增得到的产物并非目标产物。上述结果显示，采用本发明的Housekeeping Gene检测，特别是所选取的针对人的上述Housekeeping Gene及其对应引物，能够对WGA产物进行准确地定性检测。定性检测符合要求的产物再进行下一步建库和测序，能够控制下游上机测序文库的质量，提高测序的成功率，很大程度上避免了不必要的浪费。
实施例三：
白花蝴蝶兰(P.amabilis)花粉细胞基因组研究
将本技术应用于白花蝴蝶兰(P.amabilis)花粉细胞基因组研究。旨在使基因组扩增后，样品量足够构建Solexa DNA文库，最终上机测序。
考虑到植物的花粉粒中有3到5个单细胞，所以先在倒置显微镜下逐个把花粉粒分离，加与花粉粒等体积的4％纤维素酶和2％果胶酶混合液，置于垂直混合仪上避光常温混匀6小时，裂解破细胞壁。完成后将同一花粉粒的裂解体系加到培养皿上的PBS液滴中，在镜下分离单个细胞，所得单细胞放至含有1.5uL ALB(alkaline lysis buffer)的PCR管中。
随后进行MDA(multiple displacement amplification)反应，65℃裂解花粉细胞10min。加2.5uL buffer D1置于常温3min，使DNA变性。随后加入5uLbuffer N1终止变性。MDA反应体系可采用Qiagen Mini Kit或NEB的phi29DNA聚合酶产品。
30℃孵育16小时，65℃使酶失活。
扩增完成后使用Quant-iTTM技术检测MDA浓度。结果显示MDA产物浓度大于35ng/ul的，用于进行下一步housekeeping gene检测。
随后用下述兰花特定基因检测(housekeeping gene检测)扩增效果，
Figure BDA0000042446440000131
其中引物PbGDPS与兰花的香味成份和散发味道有关，PeActin与植物的抗旱抗高盐环境有关。
配制PCR体系如下：
Template(10～20ug/mL)        1.5uL
EX-Taq                       0.3uL
10X EX-taq Buffer            2uL
10mM dNTP                    0.5uL
5uM forward primer           1uL
5uM reverse primer           1uL
ddH2O                        13.7uL
TOTAL VOLUME                 20uL
PCR反应条件：
94℃                         5min
30cycles
94℃                         30s
55℃                         45s
72℃                         1min
72℃                         7min
4℃                          ∞
最后配制浓度为1.2％的琼脂糖凝胶，以100v电压电泳45min。若目的条带都有出现，则认为样品扩增的效果很好。电泳结果图像如图5所示，该电泳图像显示扩增效果符合预期。
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以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
Figure IDA0000042446520000011
Figure IDA0000042446520000021
Figure IDA0000042446520000031
Figure IDA0000042446520000041
Figure IDA0000042446520000051
Figure IDA0000042446520000061
Figure IDA0000042446520000071
Figure IDA0000042446520000081

Claims (5)

1.一种单细胞基因组分析方法，所述方法包括步骤：
a、分离并裂解单细胞，得到完整的细胞基因组DNA；
b、进行单细胞全基因组扩增；
c、对扩增产物进行定量检测及定性检测，所述定性检测是指，采用Housekeeping Gene的特异性引物，以全基因组扩增产物为模板进行PCR扩增，对单细胞全基因组的扩增产物进行检测；所述单细胞为人单细胞，所述Housekeeping Gene为位于1号染色体的PRDX6、位于2号染色体的RPL37a、位于4号染色体的ADD1、位于6号染色体的HLA-A、位于11号染色体的RAD9A、位于13号染色体的ARHGEF7、位于14号染色体的EIF2B2、位于16号染色体的PSMD7、位于19号染色体的BCAT2、及位于21号染色体的ATP5O；所述Housekeeping Gene检测的特异性引物分别为：
结果显示为至少8对引物出现条带的样品为符合要求的样品。
2.根据权利要求1所述的一种单细胞基因组分析方法，其特征在于：所述方法还包括步骤d、检测合格的样品进行DNA文库构建并测序。
3.根据权利要求1或2所述的一种单细胞基因组分析方法，其特征在于：所述步骤b中单细胞全基因组扩增采用多重置换扩增MDA或DOP-PCR全基因组扩增。
4.一种单细胞基因组分析试剂盒，其特征在于：所述试剂盒含有所述单细胞的Housekeeping Gene的特异性引物，用于对单细胞全基因组扩增产物进行检测；所述单细胞为人单细胞，所述Housekeeping Gene为位于1号染色体的PRDX6、位于2号染色体的RPL37a、位于4号染色体的ADD1、位于6号染色体的HLA-A、位于11号染色体的RAD9A、位于13号染色体的ARHGEF7、位于14号染色体的EIF2B2、位于16号染色体的PSMD7、位于19号染色体的BCAT2、及位于21号染色体的ATP5O；所述Housekeeping Gene检测的特异性引物分别为：
Figure FDA0000441643280000021
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还含有用于对单细胞进行全基因组扩增的试剂成分，所述单细胞全基因组扩增采用多重置换扩增MDA或DOP-PCR。
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