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CN102533634A - Cho细胞无血清无蛋白化学培养基 - Google Patents

Cho细胞无血清无蛋白化学培养基 Download PDF

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CN102533634A
CN102533634A CN2012100401949A CN201210040194A CN102533634A CN 102533634 A CN102533634 A CN 102533634A CN 2012100401949 A CN2012100401949 A CN 2012100401949A CN 201210040194 A CN201210040194 A CN 201210040194A CN 102533634 A CN102533634 A CN 102533634A
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CN
China
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serum
free
substratum
small peptide
hcl
Prior art date
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Pending
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CN2012100401949A
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English (en)
Inventor
陈文永
唐碧云
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JIANGYIN JIANQIAO BIOLOGICAL TECHNOLOGY CO LTD
Original Assignee
JIANGYIN JIANQIAO BIOLOGICAL TECHNOLOGY CO LTD
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Abstract

本发明涉及一种CHO细胞无血清无蛋白化学培养基，其特征在于包括5.029-50.294g/L的无机盐、0.554-5.536g/L的氨基酸、0.006-0.06g/L的维生素以及2.612-26.123g/L微量元素，以及0.005-0.05mg/L生物短肽A和0.25-2.5mg/L生物短肽B，其中生物短肽A的氨基酸排序为脯氨酸-甘氨酸-赖氨酸-半胱氨酸-组氨酸-丝氨酸；生物短肽B为赖氨酸-半胱氨酸-酪氨酸-苏氨酸-半胱氨酸-亮氨酸。该培养基pH7.1-7.5、渗透压为280-320mOsm/kg、没有细菌和真菌生长，能为CHO系列细胞，能提供细胞生长、细胞蛋白表达等的无血清培养环境的澄清溶液。

Description

CHO细胞无血清无蛋白化学培养基
技术领域
    本发明涉及一种生物技术领域，是一种专门针对CHO细胞的无血清无蛋白化学培养基。
背景技术
    无血清无蛋白化学培养基是一种不需要动物血清的人工合成纯化学成分培养基，通过增加明确的微量化学成分及生物短肽作为无血清细胞培养基的组分，代替无血清细胞培养基中的蛋白成分，支持培养细胞在无血清无蛋白化学培养基中的悬浮生长。从而可以避免动物血清在细胞培养过程中带来的污染和血清不明成分对下游生产造成的不确定影响。
    中国专利申请号200610024459公开了一种无血清动物细胞培养基及其制备方法，中国专利申请号200910265976公开了一种无血清动物细胞培养基干粉、液体培养基及其制备方法，该两项专利技术公开的产品虽然为无血清动物细胞培养基，但是培养基成分并非无蛋白、纯化学成分。
CHO细胞（中国仓鼠卵巢细胞）来源于中国仓鼠卵巢。CHO-K1细胞最早培养于1968年[Kao.F.T and Park T.T .proc.Natl Acad.sci USA 60:1275-1281(1968)].目前已有多种不同亚株及突变株。该细胞株广泛用于生物蛋白药物生产。该细胞株可以从ATCC或其他商业组织获取。
发明内容
    本发明的目的是提供一种CHO细胞无血清无蛋白化学培养基，其血清蛋白成份由成份明确的微量元素及生物短肽代替,可以在无血清或其它细胞生长因子条件下支持细胞悬浮生长，具有组分明确、无血清无蛋白的优点。
CHO细胞无血清无蛋白化学培养基，其特征在于包括5.029-50.294g/L的无机盐、0.554-5.536g/L的氨基酸、0.006-0.06g/L的维生素以及2.612-26.123g/L微量元素，以及0.005-0.05 mg/L生物短肽A和0.25-2.5mg/L生物短肽B，其中生物短肽A的氨基酸排序为脯氨酸-甘氨酸-赖氨酸-半胱氨酸-组氨酸-丝氨酸；生物短肽B为赖氨酸-半胱氨酸-酪氨酸-苏氨酸-半胱氨酸-亮氨酸。
其中无机盐起到渗透压调节剂的作用，本发明所采用的无机盐以及其在培养基的用量如下：
CaCl2(无水) 58.3-582.9
CuSO4·5H2O 0.0006-0.006
FeSO4·7H2O 0.21-2.1
Fe(NO3)2·9H2O 0.025-0.25
KCl 155.3-1553
MgSO4(无水) 24.41-244.1
MgCl2(无水) 14.29-142.9
NaCl 3490.7-34907
NaHCO3 1218.9-12189
NaH2PO4·H2O 31.6-316
Na2HPO4(无水) 35.5-354.9
ZnSO4·7H2O 0.22-2.2
氨基酸为所培养的细胞提供必要的营养组份，本发明所采用的氨基酸以及其在培养基的用量如下：
丙氨酸 2.225-22.25
精氨酸·HCl 73.5-735
天冬氨酸 3.34-33.4
天冬酰胺·H2O 3.75-37.5
半胱氨酸·HCl·H2O 8.76-87.6
胱氨酸·2HCl 15.6-156
谷氨酸 3.67-36.7
谷氨酰胺 182.1-1821
甘氨酸 9.17-91.7
组氨酸·HCl·H2O 15.7-157
异亮氨酸 27.18-271.8
亮氨酸 29.5-295
赖氨酸·HCl 45.6-456
蛋氨酸 8.6-86
苯丙氨酸 17.7-177
脯氨酸 8.62-86.2
丝氨酸 13.1-131
苏氨酸 26.7-267
色氨酸 4.5-45
酪氨酸·2Na·2H2O 27.9-279
缬氨酸 26.4-264
维生素是细胞代谢所必需的，是无血清培养基的主要添加物之一：
生物素 0.002-0.02
泛酸钙 1.09-10.9
叶酸 1.32-13.2
烟酰胺 1.0-10
吡哆醛.Hcl 1.01-10.1
吡哆醇.Hcl 0.015-0.15
核黄素 0.11-1.1
硫胺素.Hcl 1.1-11
维生素B12 0.35-3.5
微量元素是细胞代谢所必需的，是无血清培养基的主要添加物之一，且有的元素需要由血清来提供，本发明所采用的微量元素以及其在培养基的用量如下：
氯化胆碱 4.48-44.8
葡萄糖 1572.35-15723.5
次黄嘌呤（钠盐） 1.19-12
i-肌醇 6.25-62.5
亚油酸 0.021-0.21
硫辛酸 0.053-0.53
腐胺·2HCl 0.04-0.4
丙酮酸（钠盐） 27.5-275
胸苷 0.18-1.8
pluronic F68 1000-10000
甲醇胺 0.005-0.05
精胺 0.005-0.05
硫代甘油 0.001-0.1
硫酸镍 0.001-0.01
硫酸锰 0.001-0.01
硫酸钡 0.0010-0.01
硝酸银 0.0010-0.01
氯化铝 0.0010-0.01
有益效果本发明制备的CHO细胞无血清无蛋白化学培养基，pH7.1-7.5、渗透压为280-320 mOsm/kg、没有细菌和真菌生长，能为CHO系列细胞，能提供细胞生长、细胞蛋白表达等的无血清培养环境的澄清溶液。
附图说明
    图1是实施例1制备的CHO细胞无血清无蛋白化学培养基培养CHO K1细胞24h后的细胞图；显微镜放大25倍数，从图中可见，细胞生长良好，细胞保持圆润饱满。
    图2是CHO K1细胞在实施例1制备的CHO细胞无血清无蛋白化学培养基的生长曲线图；CHO细胞在0到126小时内生长分裂良好，说明该培养基适合CHO细胞生长。
    图3是CHO K1细胞在实施例1制备的CHO细胞无血清无蛋白化学培养基的存活率曲线图。CHO细胞在0到90小时内的存活率保持在95%以上，说明该培养基能在无血清无蛋白条件下为CHO细胞提供良好的生成环境。
具体实施方式
本发明的所有原料采购Simgma细胞培养级的原料，并按相关要求储存。生物短肽A和生物短肽B为固体多肽合成（R. B. Merrifield (1963). "Solid Phase Peptide Synthesis. I. The Synthesis of a Tetrapeptide". J. Am. Chem. Soc. 85 (14): 2149–2154.），其纯度不少于99.9%。
实施例1
CHO细胞无血清无蛋白化学培养基干粉，培养基的组份如下：
无机盐：CaCl2(无水) 116.6mg ,CuSO4·5H2O 0.0013mg,FeSO4·7H2O 0.417mg,Fe(NO3)2·9H2O 0.05mg, KCl 311.8mg,MgSO4(无水) 48.84mg，MgCl2(无水) 28.64mg,NaCl 6995.5mg, NaHCO3 2438mg, NaH2PO4·H2O 62.5mg,Na2HPO4(无水) 71.02mg, ZnSO4·7H2O 0.43mg；
氨基酸： 丙氨酸4.45mg,精氨酸·HCl 147.5mg,天冬氨酸6.65mg, 天冬酰胺·H2O 7.5mg, 半胱氨酸·HCl·H2O 17.56mg, 胱氨酸·2HCl 31.29mg, 谷氨酸7.35mg, 谷氨酰胺365mg, 甘氨酸18.75mg, 组氨酸·HCl·H2O 31.48mg, 异亮氨酸54.47mg, 亮氨酸59.05mg, 赖氨酸·HCl 91.25mg, 蛋氨酸 17.24mg, 苯丙氨酸35.48mg, 脯氨酸17.25mg, 丝氨酸26.25mg，苏氨酸53.45mg，色氨酸9.02mg，酪氨酸·2Na·2H2O 55.79mg，缬氨酸52.85mg；
维生素：生物素0.0035mg，泛酸钙2.24mg，叶酸2.65mg，烟酰胺2.02mg，吡哆醛·HCl 2mg，吡哆醇·HCl 0.03mg，核黄素0.22mg，硫胺素·HCl 2.17mg，维生素B12 0.68mg，
微量元素：氯化胆碱8.98mg，葡萄糖3151mg，次黄嘌呤（钠盐）2.39mg，i-肌醇12.6mg，亚油酸0.042mg，硫辛酸0.105mg，腐胺·2HCl 0.081mg，丙酮酸（钠盐）55mg，胸苷0.365mg,pluronic F68 2000mg，甲醇胺0.01mg, 精胺0.01mg, 硫代甘油0.02mg, 硫酸镍0.002mg, 硫酸锰0.002mg, 硫酸钡0.002mg, 硝酸银0.002mg, 氯化铝0.002mg； 
生物短肽：生物短肽A（脯氨酸-甘氨酸-赖氨酸-半胱氨酸-组氨酸-丝氨酸）0.01mg, 生物短肽B（赖氨酸-半胱氨酸-酪氨酸-苏氨酸-半胱氨酸-亮氨酸） 0.5mg；
加入950ml纯水溶解并混匀，用HCL或NaOH调pH到7.5，定容到1000ml。用0.22um负压过滤，无菌保存。
实施例2
本发明实施例1获得的CHO细胞无血清无蛋白化学培养基培养的理化性质参数以及检测方法如表1所示，检测结果如表2所示。
表1
检测项目 检测方法
外观 肉眼观察
pH值 取待检测培养基样品5ml，待回温至室温25℃后用pH计检测数据
渗透压 取待检测培养基样品10μl，待回温至室温25℃后用渗透压仪监测数据
细菌和真菌 取待检测培养基样品10ml于100mm培养皿中置于37°二氧化碳培养箱，每天持续在显微镜下观察样品澄清度等情况
表2
Figure 2012100401949100002DEST_PATH_IMAGE002A
本发明获得的CHO细胞无血清无蛋白化学培养基培养的细胞培养项目以及培养方法如表3所示，培养了24h后的细胞生长密度如表4所示。
表3
培养项目 培养方法
细   胞 悬浮CHO K1细胞，在对数生长期以2×105cells/ml的密度传代到100ml摇瓶，20ml细胞悬液/瓶
培 养 液 CHO细胞无血清无蛋白化学培养基
培养条件 36.5℃二氧化碳培养箱中摇床摇动培养，转速：140 r/min
表4
                 时间（h）             项目 0 26 48 72 96 120 144
细胞密度（×105cells/ml） 3 7.9 8.5 13.8 15.8 17 9.8
细胞存活率(%) 99.8 100 99.8 99.9 61 0 0
可见，实施例1制备的CHO细胞无血清无蛋白化学培养基，为pH7.5、渗透压为320 mOsm/kg、没有细菌和真菌生长，能为CHO系列细胞，提供细胞生长、细胞蛋白表达等的无血清无蛋白培养环境的澄清溶液。
实施例3
CHO细胞无血清无蛋白化学培养基，无机盐质量（单位：毫克）如下：
CaCl2(无水)              58.3
CuSO4·5H2O              0.0006
FeSO4·7H2O              0.21
Fe(NO3)2·9H2O           0.025
KCl                      155.3
MgSO4(无水)              24.41
MgCl2(无水)              14.29
NaCl                     3490.7
NaHCO3                   1218.9
NaH2PO4·H2O             31.6
Na2HPO4(无水)            35.5
ZnSO4·7H2O              0.22
氨基酸的质量（单位：毫克）如下：
丙氨酸                    2.225
精氨酸·HCl               73.5
天冬氨酸                  3.34
天冬酰胺·H2O             3.75
半胱氨酸·HCl·H2O        8.76
胱氨酸·2HCl              15.6
谷氨酸                    3.67
谷氨酰胺                  182.1
甘氨酸                    9.17
组氨酸·HCl·H2O          15.7
异亮氨酸                  27.18
亮氨酸                    29.5
赖氨酸·HCl               45.6
蛋氨酸                    8.6
苯丙氨酸                  17.7
脯氨酸                    8.62
丝氨酸                    13.1
苏氨酸                    26.7
色氨酸                    4.5
酪氨酸·2Na·2H2O         27.9
缬氨酸                    26.4
所采用的维生素质量（单位：毫克）如下：
生物素                    0.002
泛酸钙                    1.09
叶酸                     1.32
烟酰胺                    1.01
吡哆醛.Hcl                1.009
吡哆醇.Hcl                0.015
核黄素                    0.11
硫胺素.Hcl                1.09
维生素B12                0.35
所采用的微量元素质量（单位：毫克）如下：
氯化胆碱                 4.48
葡萄糖                   1572.35
次黄嘌呤（钠盐）         1.19
i-肌醇                   6.25
亚油酸                   0.021
硫辛酸                   0.053
腐胺·2HCl               0.04
丙酮酸（钠盐）           27.5
胸苷                     0.18
pluronic F68            999.9
甲醇胺                   0.005
精胺                     0.005
硫代甘油                 0.0099
硫酸镍                   0.001
硫酸锰                   0.001
硫酸钡                   0.0010
硝酸银                   0.0010
氯化铝                   0.0010
生物短肽A                0.005
生物短肽B                0. 25，
    将以上组份加入950ml纯水溶解并混匀，用HCL或NaOH调pH到7.5，定容到1000ml。用0.22um负压过滤，无菌保存。制备的CHO细胞无血清无蛋白化学培养基，为pH7.1、渗透压为280 mOsm/kg、没有细菌和真菌生长，能为CHO系列细胞，提供细胞生长、细胞蛋白表达等的无血清无蛋白培养环境的澄清溶液。
实施例3
CHO细胞无血清无蛋白化学培养基，采用的无机盐质量（单位：毫克）如下：
CaCl2(无水)              582.9
CuSO4·5H2O              0.006
FeSO4·7H2O              2.1
Fe(NO3)2·9H2O           0.25
KCl                      1553
MgSO4(无水)              244.1
MgCl2(无水)              142.9
NaCl                     34907
NaHCO3                   12189
NaH2PO4·H2O             316
Na2HPO4(无水)            354.9
ZnSO4·7H2O              2.2；
采用的氨基酸质量（单位：毫克）如下：
丙氨酸                    22.25
精氨酸·HCl               735
天冬氨酸                  33.4
天冬酰胺·H2O             37.5
半胱氨酸·HCl·H2O        87.6
胱氨酸·2HCl              156
谷氨酸                    36.7
谷氨酰胺                  1821
甘氨酸                    91.7
组氨酸·HCl·H2O          57
异亮氨酸                  271.8
亮氨酸                    295
赖氨酸·HCl               456
蛋氨酸                    86
苯丙氨酸                  177
脯氨酸                    86.2
丝氨酸                    131
苏氨酸                    267
色氨酸                    45
酪氨酸·2Na·2H2O         279
缬氨酸                    264；
本发明所采用的维生素质量（单位：毫克）如下：
生物素                    0.02
泛酸钙                    10.9
叶酸                     13.2
烟酰胺                    10.1
吡哆醛.Hcl                10.1
吡哆醇.Hcl                0.15
核黄素                    1.1
硫胺素.Hcl                11
维生素B12                3.5；
本发明所采用的微量元素质量（单位：毫克）如下：
氯化胆碱                  44.8
葡萄糖                    15723.5
次黄嘌呤（钠盐）          12
i-肌醇                   62.5
亚油酸                    0.21
硫辛酸                    0.53
腐胺·2HCl                0.4
丙酮酸（钠盐）            275
胸苷                     1.8
pluronic F68             10000
甲醇胺                    0.05
精胺                     0.05
硫代甘油                  0.1
硫酸镍                    0.01
硫酸锰                    0.01
硫酸钡                    0.01
硝酸银                    0.01
氯化铝                    0.01
生物短肽A                0.05
生物短肽B                2.5  
将以上组份加入950ml纯水溶解并混匀，用HCL或NaOH调pH到7.5，定容到1000ml。用0.22um负压过滤，无菌保存。制备的CHO细胞无血清无蛋白化学培养基，为pH7.2、渗透压为300 mOsm/kg、没有细菌和真菌生长，能为CHO系列细胞，提供细胞生长、细胞蛋白表达等的无血清无蛋白培养环境的澄清溶液。 

Claims (2)

1.CHO细胞无血清无蛋白化学培养基，其特征在于包括5.029-50.294g/L的无机盐、0.554-5.536g/L的氨基酸、0.006-0.06g/L的维生素以及2.612-26.123g/L微量元素，以及0.005-0.05 mg/L生物短肽A和0.25-2.5mg/L生物短肽B，其中生物短肽A的氨基酸排序为脯氨酸-甘氨酸-赖氨酸-半胱氨酸-组氨酸-丝氨酸；生物短肽B为赖氨酸-半胱氨酸-酪氨酸-苏氨酸-半胱氨酸-亮氨酸。
2.根据权利要求1所述的CHO细胞无血清无蛋白化学培养基，其特征在于所述无机盐以及其在每升培养基的毫克数如下：
CaCl2(无水)   58.3-582.9
CuSO4·5H2O   0.0006-0.006
FeSO4·7H2O   0.21-2.1
Fe(NO3)2·9H2O    0.025-0.25
KCl 155.3-1553
MgSO4(无水)   24.41-244.1
MgCl2(无水)   14.29-142.9
NaCl   3490.7-34907
NaHCO3 1218.9-12189
NaH2PO4·H2O  31.6-316
Na2HPO4(无水) 35.5-354.9
ZnSO4·7H2O   0.22-2.2；
本发明所采用的氨基酸以及其在每升培养基的毫克数如下：
丙氨酸 2.225-22.25
精氨酸·HCl   73.5-735
天冬氨酸   3.34-33.4
天冬酰胺·H2O 3.75-37.5
半胱氨酸·HCl·H2O   8.76-87.6
胱氨酸·2HCl  15.6-156
谷氨酸 3.67-36.7
谷氨酰胺   182.1-1821
甘氨酸 9.17-91.7
组氨酸·HCl·H2O  15.7-157
异亮氨酸   27.18-271.8
亮氨酸 29.5-295
赖氨酸·HCl   45.6-456
蛋氨酸 8.6-86
苯丙氨酸   17.7-177
脯氨酸 8.62-86.2
丝氨酸 13.1-131
苏氨酸 26.7-267
色氨酸 4.5-45
酪氨酸·2Na·2H2O 27.9-279
缬氨酸 26.4-264；
本发明所采用的维生素以及其在每升培养基的毫克数如下：
生物素 0.002-0.02
泛酸钙 1.09-10.9
叶酸   1.32-13.2
烟酰胺 1.01-10.1
吡哆醛.Hcl 1.009-10.1
吡哆醇.Hcl 0.015-0.15
核黄素 0.11-1.1
硫胺素.Hcl 1.09-11
维生素B12 0.35-3.5；
本发明所采用的微量元素以及其在每升培养基的毫克数如下：
氯化胆碱   4.48-44.8
葡萄糖 1572.35-15723.5
次黄嘌呤（钠盐）  1.19-12
i-肌醇 6.25-62.5
亚油酸 0.021-0.21
硫辛酸 0.053-0.53
腐胺·2HCl 0.04-0.4
丙酮酸（钠盐）    27.5-275
胸苷   0.18-1.8
pluronic F68  999.9-10000
甲醇胺 0.005-0.05
精胺   0.005-0.05
硫代甘油   0.0099-0.1
硫酸镍 0.001-0.01
硫酸锰 0.001-0.01
硫酸钡 0.0010-0.01
硝酸银 0.0010-0.01
氯化铝 0.0010-0.01。
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