CN102516360B

CN102516360B - 一种抑制β分泌酶酶切作用的多肽及其应用

Info

Publication number: CN102516360B
Application number: CN 201110406649
Authority: CN
Inventors: 刘瑞田; 杨世高; 王少伟
Original assignee: Tsinghua University
Current assignee: Tsinghua University
Priority date: 2011-12-08
Filing date: 2011-12-08
Publication date: 2013-11-06
Anticipated expiration: 2031-12-08
Also published as: CN102516360A

Abstract

本发明公开了一种抑制β分泌酶酶切作用的多肽及其应用。本发明提供的多肽，是如下1)或2)：1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的多肽；2)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与具有相同功能的由序列1衍生的多肽。本发明的实验证明，本发明的多肽，具有与APP上的β分泌酶酶切位点和Aβ42同时结合的能力；具有抑制β分泌酶酶切作用和抑制Aβ产生的作用；该多肽可以抑制Aβ42的细胞毒性，保护SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞免受Aβ42毒性的影响。

Description

一种抑制β分泌酶酶切作用的多肽及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种抑制β分泌酶酶切作用的多肽及其应用。

背景技术

阿尔茨海默病Alzheimer’s Disease，以下简称AD，俗称老年性痴呆，是由β-淀粉样蛋白单体分子(β-Amyloid 40/42(Aβ40/42，以下简称Aβ))聚集形成具毒性作用的聚集物引起的老年人主要以记忆力下降和脑部形成老年斑为特征的神经退行性疾病。医学统计表明，我国和欧美国家中60岁以上老年人有5～6％患有阿兹海默病。该病已被列为导致死亡的第四大疾病，仅次于心脏病、癌症和中风。我国现有60岁以上人口约一亿，按照60岁以上人口中老年性痴呆患病率为5％估算，全国可能有老年性痴呆患者约500万。该病已给家庭和社会带来巨大的负担。研究人员估计，如果防治措施得不到改善，原处于死亡病因第4位的老年性痴呆症将成为21世纪老年人健康的头号杀手，将会有三分之一的65岁以上老人患老年性痴呆症。目前，对AD的临床治疗只是应用一些神经营养和消炎类药物进行对症治疗，尚没有任何特异性治疗AD的药物面世。

基于A β的致病机理，目前对AD治疗制剂的研究主要从三个方面入手：通过抑制酶促反应降低Aβ产生、抑制Aβ的凝聚和加快Aβ的清除。Aβ主要由39-42个氨基酸残基组成，其中Aβ42聚集较快、细胞毒性较大，为主要的AD致病因素。它来自于分子量为110-135KD的前体蛋白(Amyloid Precursor Protein，APP)。APP经β分泌酶的作用产生Aβ的氨基端，经胞膜内γ分泌酶作用产生Aβ的羧基端。在正常情况下，在β分泌酶作用之前，α分泌酶在Aβ中间的Lys16-Leu17处将APP裂解为APPsα和嵌在膜上较短的羧基片段C83。APPsα具有生长调节和神经营养的作用，能延长神经元的存活，稳定和加强突触的结构，增强神经元的功能等。在机体异常的情况下，β、γ分泌酶活性增强，或α分泌酶活性降低，将会产生较多量的Aβ，而引起AD的发生。于是，降低β或γ分泌酶酶切作用或增强α分泌酶酶切作用的研究成为近十余年来AD研究领域的热点之一。目前，人们对这三类酶的分子生物学特性、作用机理和组成成分等的认识研究有了较大突破。γ分泌酶是由多个组分组成的多酶复合体，除能裂解APP产生Aβ外，还参与其他30余种具有重要生理功能的I型膜蛋白的产生。因此，单纯抑制这类酶的活性来减少Aβ的产生必将会影响其它许多相关蛋白的正常功能。同样地，抑制β分泌酶的抑制剂的有效性和副作用问题也一直没有得到解决。人们至今尚未找到可应用于临床的抑制β或γ分泌酶酶切作用的有效药物。

研究表明，β分泌酶酶切位点氨基酸保守性很强。2005年Arbel等人以APP肽链中β分泌酶酶切位点作为靶点，制备出抗该酶切位点的特异性抗体。该抗体可以与APP有效结合，阻止β分泌酶的酶切作用，从而降低细胞Aβ的产生。这表明某些物质与APP肽链中β分泌酶酶切位点的结合，可以阻遏β分泌酶的酶促作用，这将成为降低Aβ产生的有效途径之一。然而，抗体分子较大，不易通过血脑屏障，并且抗体本身具有较好的抗原性，易引起变态反应等副作用。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种抑制β分泌酶酶切作用的多肽及其应用。

本发明提供的多肽，是如下1)或2)：

1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的多肽；

2)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的多肽。

上述蛋白中，一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

在上述多肽中，2)所示的多肽为如下a、b、c中的任意一种：

a、由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的多肽；

b、由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的多肽；

c、由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的多肽。

本发明的另一个目的是提供一种抑制Aβ细胞毒性的制剂。

本发明提供的抑制剂，其活性成分为上述的多肽；所述细胞具体为SH-SY5Y细胞，所述Aβ具体为Aβ42。

本发明的第三个目的是提供一种抑制Aβ产生的制剂。

本发明提供的抑制剂，其活性成分为上述的多肽，所述Aβ具体为Aβ40或Aβ42。

本发明的第四个目的是提供一种制备治疗阿尔茨海默病的产品。

本发明提供的产品，其活性成分为上述的多肽；所述产品具体为药物。

上述多肽在抑制Aβ细胞毒性和/或制备抑制Aβ细胞毒性的制剂中的应用也是本发明保护的范围，所述Aβ具体为Aβ42；所述抑制Aβ42细胞毒性具体体现在提高细胞的活性；所述细胞具体为SH-SY5Y细胞。

上述多肽在抑制Aβ的产生和/或制备抑制Aβ产生的制剂中的应用也是本发明保护的范围；所述Aβ具体为Aβ40或Aβ42。

上述抑制Aβ产生也可以体现在体外抑制APP上β位点的酶解。

上述的多肽在制备治疗阿尔茨海默病的产品中的应用也是本发明保护的范围；所述产品具体为药物。

上述的多肽在制备治疗阿尔茨海默病的产品中的应用效果具体体现在如下：提高空间记忆能力、减少老年斑的数量和/或降低Aβ含量；所述Aβ具体为Aβ40或Aβ42

本发明的实验证明，本发明提供一种多肽，称为YS1，具有抑制β分泌酶酶切作用和抑制Aβ细胞毒性作用的多肽，该多肽具有与APP上的β分泌酶酶切位点和Aβ42同时结合的能力；该多肽可以抑制Aβ42的细胞毒性，保护SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞免受Aβ42毒性的影响。将该多肽注射到AD转基因小鼠(APPswe/PS1dE9双转基因)的脑侧室进行动物记忆实验，结果表明，该多肽可以明显改善小鼠的空间记忆能力，减少脑内老年斑的数量及Aβ40和Aβ42的产量。该多肽分子量小，易穿过血脑屏障，并且相比其它大分子蛋白如抗体等抗原性较差，副作用较小，在阿尔茨海默病的预防和治疗方面具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为YS1与APP上的β分泌酶酶切位点及Aβ结合的ELISA测定

图2为经置换、缺失或插入氨基酸的YS1与APP上的β分泌酶酶切位点及Aβ结合的ELISA测定

图3为YS1抑制Aβ42的细胞毒性

图4为Western-blot检测YS1抑制APP上β位点的酶切作用

图5为对图4中蛋白条带密度量化分析结果

图6为YS1抑制Aβ40的细胞外产生

图7为YS1抑制Aβ42的细胞外产生

图8为注射YS1多肽的AD转基因小鼠的水迷宫实验

图9为注射YS1多肽的AD转基因小鼠脑部老年斑的变化

图10为注射YS1多肽的AD转基因小鼠脑部老年斑面积的变化

图11为注射YS1多肽的AD转基因小鼠脑中可溶性Aβ40水平

图12为注射YS1多肽的AD转基因小鼠脑中可溶性Aβ42水平

图13为注射YS1多肽的AD转基因小鼠脑中不溶性Aβ40和42水平

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的PBS缓冲液均为PH值为7.2的缓冲液(配方为：5.84g NaCl，4.72g Na₂HPO₄，2.64g NaH₂PO₄.2H₂O，用水配成1升，调pH为7.2)；

下述实施例中所有的实验数据除了水迷宫记忆实验外都是通过至少3次独立的实验获得的，实验数据表示为平均数加减标准差。数据的统计分析是应用One-way ANOVA软件进行，对于多组重复记忆力测定数据的比较分析则应用重复数据的Two-way ANOVA。

实施例1、多肽YS1及其衍生物的获得

一、多肽YS1的获得

根据阿尔茨海默病AD的发病原理，治疗AD的根本方法应是减少β淀粉样蛋白(Aβ)的产生、抑制Aβ的聚集或加快Aβ的清除。应用噬菌体显示技术，以含有APP上β分泌酶酶切位点和Aβ部分氨基端序列为筛选底物，将1×10⁸种七肽进行了四轮淘选，应用噬菌体ELISA从中筛选出了多条可同时与APP上的β分泌酶酶切位点和Aβ42明显结合的多肽，通过比对多条肽链与APP上的β分泌酶酶切位点和Aβ42的结合特性以及对Aβ聚集和细胞毒性的影响，最终通过肽链间的组合选择出多肽YS1。

YS1的氨基酸序列为：Pro-Gln-Val-Gly-His-Leu(序列1，PQVGHL)。

多肽YS1为一六肽，由上海吉尔生化有限公司按常规方法合成制备(制备方法参见Weng C C，Peter D W.Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis：A PracticalApproach.Oxford：University Press，2000.1-8；Atherton E，Sheppard R C.Solid Phase Peptide Synthesis：A Practical Approach.Oxford：IRL Press，1989)，得到YS1多肽纯度为大于或等于95％，YS1保存于-20℃，避免反复冻融。

同时合成连接有6个组氨酸作为标签的多肽YS1。

二、多肽YS1衍生物的获得

多肽YS1衍生物为将YS1的氨基酸经置换、缺失或插入其它氨基酸得到的多肽，具体如下：

YS1-ΔH为将上述多肽YS1(序列1)缺失组氨酸得到的多肽，序列为Pro-Gln-Val-Gly-Leu(序列2，PQVGL)；

YS1-A为将上述多肽YS1(序列1)中插入丙氨酸得到的多肽，序列为Pro-Gln-Val-Gly-Ala-His-Leu(序列3，PQVGAHL)。

YS1-HL/PRT为将上述多肽YS1(序列1)中的组氨酸和亮氨酸置换成脯氨酸、精氨酸和苏氨酸得到的多肽，序列为Pro-Gln-Val-Gly-Pro-Rrg-Thr(序列4，PQVGPRT)；上述多肽衍生物均可人工合成。

同时合成连接有6个组氨酸作为标签的多肽YS1-ΔH、YS1-A和YS1-HL/PRT。

实施例2、多肽YS1的应用

一、多肽YS1及其衍生物与APP上的β分泌酶酶切位点及Aβ42的特异性结合

1、多肽YS1与APP上的β分泌酶酶切位点及Aβ42的特异性结合

分别将PBS缓冲液配制的APP上的β分泌酶酶切位点多肽(Glu-Val-Lys-Met-Asp-Glu-Phe)(上海吉尔多肽公司合成)、Aβ42(AmericanPeptide Co.，产品目录号为62-0-80B)及阴性对照多肽(Lys-Thr-Asp-Met-Lys-His-Met-Ala-Gly-Ala-Ala-Ala-Ala-Gly-Ala-Val-Val-Gly-Gly-Leu-Gly)以1μg/孔包被96孔氨基化酶标板，4℃过夜。以BSA封闭酶标板上未与多肽结合的空白位点，然后加入连接有6个组氨酸作为标签的由实施例1得到的YS1(1μg/孔)，室温(25℃)作用2h。洗涤后，加入能与组氨酸标签结合的偶联HRP的抗体(北京博奥森生物技术公司，产品目录号为bs-0899R)，室温作用1h。洗涤后，加入底物TMB，显色20分钟后，以多功能酶标仪测定450nm处的吸光度。

在相同的条件下重复三次，结果见图1，图中数据为三次的平均值，error bar为SD，

β位点多肽为YS1与β分泌酶酶切位点多肽结合，吸光度为0.2；

Aβ42为YS1与Aβ42结合，吸光度为0.17；

对照多肽为YS1与阴性对照多肽结合，吸光度为0.07；

可以看出，与阴性对照多肽相比，*，P＜0.01，表明YS1可与APP上的β分泌酶酶切位点和Aβ42同时结合。

2、多肽YS1衍生物与Aβ42特异结合

将由实施例1得到的多肽YS1衍生物YS1-ΔH、YS1-A和YS1-HL/PRT连接组氨酸标签，然后按照上述1的试验方法检测与β分泌酶酶切位点(β位点多肽)、阴性对照多肽(阴性对照)及Aβ42的特异性结合，各多肽每孔加入1μg/孔，用ELISA方法测定OD值。

结果见图2所示，YS1-ΔH、YS1-A和YS1-HL/PRT分别与β位点多肽结合后的OD450nm分别为0.18、0.18、0.16；

YS1-ΔH、YS1-A和YS1-HL/PRT分别与Aβ42结合后的OD450nm分别为0.16、0.14、0.15；

YS1-ΔH、YS1-A和YS1-HL/PRTY分别与对照多肽结合后的OD450nm分别为0.04、0.03、0.04；

表明YS1某个氨基酸经置换、缺失或在多肽中增加氨基酸后仍保留与APP上的β分泌酶酶切位点和Aβ42同时结合的能力(与阴性对照相比，P＜0.01)。

二、YS1体外抑制Aβ42的细胞毒性

用含10％胎牛血清的培养基(MEM，Invotrigen)将SH-SY5Y细胞(中国医学科学院肿瘤细胞库，产品号为SH-SY5Y)配成单个细胞悬液，以每孔10000个细胞接种到96孔细胞培养板，每孔体积100μL。细胞于37℃培养24小时，培养箱CO₂浓度为5％。每孔加入如下样品：

Aβ42+5μM由实施例1得到的YS1：Aβ42蛋白的终浓度是1μM，YS1的终浓度是5μM；

Aβ42+20μM由实施例1得到的YS1：Aβ42蛋白的终浓度是1μM，YS1的终浓度是20μM；

Aβ42：Aβ42蛋白的终浓度是1μM；

以PBS为对照。

上述细胞继续培养48小时后，每孔加MTT溶液(Sigma，产品目录号为M5655、溶剂为PBS，5mg/mL)10μL，37℃孵育3小时，终止培养，每孔加100μL晶体溶解液(10％SDS和5％异丁醇溶解在0.01M HCL中)，37℃孵育过夜，使结晶物充分溶解。在多功能酶联免疫检测仪上以570nm波长测定各孔光吸收值。减去本底后，以样品的吸光度除以不加样品的细胞的吸光度作为细胞的活性指标，并分析样品之间的差异显著情况。

结果如图3所示(*，P＜0.05；#，P＜0.01)，

Aβ42+5μM YS1的细胞相对活性为75.2％；

Aβ42+20μM YS1的细胞相对活性为86.0％

Aβ42的细胞相对活性为62.5％；

与单独的Aβ42样品相比，YS1的加入可显著提高细胞的活性，即表明YS1可显著抑制Aβ42的细胞毒性。

三、YS1体外抑制APP上β位点的酶解和Aβ的产生

应用Aβ40和Aβ42试剂盒(Invotrigen，USA，产品目录号分别为：KHB3441和KHB3482)测定细胞培养液中Aβ40和Aβ42的量，按照厂家说明书进行实验测试。简述如下：

将转染APP/Val717Phe基因的中国仓鼠卵巢细胞(7PA2，由美国哈佛大学医学院馈赠，Podlisny，M.B.，Selkoe，D.J.等(1995)J.Biol.Chem.270，9564-9570，公众可从清华大学获得。)在6孔板上培养(培养基为含有10％胎牛血清和G418(500μg/ml)DMEM)，至丰度为90％时，更换无血清培养基，加入PBS(0μM由实施例1得到的YS1)、终浓度为50μM由实施例1得到的YS1和200μM由实施例1得到的YS1，继续培养15小时后，收集细胞及培养液，分别对细胞中APP、C83和C99进行Western-blot检测，对培养液中的Aβ40和Aβ42水平进行ELISA检测，具体如下：

1)Western-blot测定7PA2细胞中APP、C83和C99水平

将7PA2细胞与细胞裂解缓冲液(含有150mM NaCl，50mM Tris，0.5％w/vNa-deoxycholate，1％v/v Nonidet P-40，0.1％SDS及蛋白酶抑制剂，pH 7.4)混合，冰上孵育10min。将细胞裂解液与等量的样品缓冲液混合，混匀后煮沸1分钟。加入到16％Tris-SDS凝胶样品孔中，进行电泳。浓缩胶60V，分离胶80V，使溴酚蓝至玻璃板下边缘1cm处。将含有样品的凝胶切下，将样品以80V湿法转移27min至0.45μm PVDF膜(Millipore，Billerica，MA，USA)。转移结束后将PVDF膜稍微冲洗，用8％脱脂奶粉37℃封闭2h；PBST洗膜1遍，加入以含有3％脱脂奶粉的TBST稀释的抗体A8717(兔源多抗，可以与APP、C83、C99结合，Sigma-Aldrich Corp.St.Louis，MO，USA)，室温作用1小时。再次冲洗膜，加入联接辣根过氧化物酶(HRP)的羊抗兔抗体(北京经纬博恒生物科技开发有限公司，产品目录号为B006，1∶5000)作用1小时。转移到膜上的蛋白条带应用化学发光检测盒(Pierce，Rockford，IL，USA，产品目录号为32209)进行检测。曝光3min，显影30s。

结果见图4和图5所示，图4为定性分析，图5为图4中条带相对于β肌动蛋白(Sigma-aldrich，产品目录号为A5316-.2ML)的光密度，图4和5显示，YS1的加入可以明显抑制APP上β位点的水解(APP从β位点水解后，可形成C99片段，从α位点水解则形成C83片段。C99降低说明从β位点水解APP的反应降低，C83升高说明从α位点水解APP的反应升高)，导致C99酶解产生的减少。相应地，APP上α位点的水解得到促进，导致C83酶解产生的增多。YS1的加入对APP的量没有显著影响。

2)ELISA测定7PA2细胞培养液中的Aβ40/Aβ42水平

(1)将Aβ检测盒中的ELISA板以200μl 2％脱脂奶粉封闭，置37℃ 2小时。

(2)加入100μl(1μg/ml)各细胞培养液，置37℃1小时。

(3)甩去样品溶液，以含0.05％的Tween-20PBS洗涤微孔板3次。

(4)分别加入100μl(1∶2000稀释)特异结合Aβ40或Aβ42的鼠源单抗(试剂盒中自带的)，置37℃ 1小时。

(5)洗涤同步骤(3)。

(6)加入100μl(1∶1000稀释)HRP标记的羊抗鼠二抗，置37℃ 1小时。

(7)洗涤同步骤(3)。

(8)加入100μl TMB显色，以1N的硫酸终止显色反应。

(9)应用酶标检测仪测定450nm处的光吸收值。

结果如图6所示(Aβ40标准品为试剂盒自带，Aβ40的标准曲线的函数为y＝625x-14.8，x为OD值，y为Aβ40的质量。)，可以看出，加入0μM YS1、50μM YS1、200μM的YS1细胞中的Aβ40含量分别为100％、91％、76％(以不加YS1的Aβ40量作为100％)；

结果如图7所示(Aβ42标准品为试剂盒自带，Aβ42的标准曲线的函数为y＝636.62x-7.15，x为OD值，y为Aβ42的质量。)，加入0μM YS1、50μM YS1、200μM YS1的细胞中的Aβ42含量分别为100％、78％、60％(以不加YS1的Aβ42量作为100％)；

可以看出，加入YS1多肽后细胞培养液中的Aβ40(见图6)和Aβ42(见图7)的水平都明显降低(与加入PBS对照相比，*，P＜0.05；#，P＜0.01)。

四、YS1改善AD病的效果体现

1、改善AD转基因小鼠的记忆能力

实验方法：

1)脑侧室注射：将8月龄大的转APP和PS1基因的AD雌性小鼠(转APP和PS1基因(APPswe/PS1dE9)小鼠购自Jackson Lab，Bar Harbor，ME，美国，产品目录号为：004462，繁殖后经过鉴定得到含有APP和PS1基因的小鼠为转APP和PS1基因(APPswe/PS1dE9)的AD小鼠)随机分为注射多肽YS1(AD+YS1)和PBS(AD)组，每组8只。同时以8只年龄相同的同窝野生型雌性小鼠(为非AD型，(转APP和PS1基因(APPswe/PS1dE9)小鼠购自Jackson Lab，Bar Harbor，ME，美国，产品目录号为：004462，繁殖后经过鉴定得到不含有APP和PS1基因的小鼠为野生型小鼠；WT)做为对照。共三组。

脑内注射前12h对小鼠禁食不禁水。首先将小鼠麻醉，麻醉剂量为：25g小鼠腹腔注射0.1mL浓度为10％的水合氯醛。将小鼠固定在立体定位仪上，参照标准图谱(Academic Publish)进行脑立体定位侧室注射给药。小鼠脑室注射定位参数为：前囱后1.8mm，中线旁开±1.8mm，硬膜下2.5mm。用无菌水溶解YS1至1mg/ml，注射速度0.2μl/min，注射剂量为5μL。注射完留针5min。每隔7天注射一次，共注射4次。于最后一次注射后5天，对小鼠进行水迷宫记忆能力检测。

2)记忆力训练：小鼠水迷宫训练之前放在室温25℃，湿度46％的环境适应3天。所有行为学检测试验中均采用随机双盲的方式。训练前，除去平台，在水槽中央轻轻放入，让其自由游动60s。测定每组小鼠游泳象限偏好，选择对面水槽的壁，作为该小鼠初始释放位置。第一次训练前让小鼠站在平台(平台直径10厘米)上15s，让它记忆一下池(直径1.1米)中台的空间位置。平台放在第二象限中部，并且平台的上表面距水面1.5厘米。池水中加入奶粉，以增加动物的视觉反差，利于图像记录。将小鼠面朝池壁，轻轻放入水中，让其在水槽中游泳。小鼠在台上站立2s就停止计时，认为上台，训练时间每次最长为90s。期间应用软件(购自中国医科院药物所)记录其轨迹以及从入水到爬上平台的时间，即潜伏期。如果小鼠在90s内找到平台则让其在平台上停留10s。如果小鼠在90s内找不到平台，则在90s后由实验人员引导其上平台，并让其在平台上停留10s。连续训练5天，每天训练2次，两次之间的间隔为3-4h。以录像和软件系统记录实验结果，并以重复量数二因子变异数分析(two-way ANOVA，repeated measures)处理实验结果。

实验结果如图8所示，随着训练时间的增长，野生组小鼠(WT)找到平台的潜伏期逐渐缩短，4天后即达平衡状态。注射YS1的AD小鼠(AD+YS1)找到平台的潜伏期在训练到第4天时和5天时，与注射PBS对照的AD小鼠(AD)相比具有显著差异(与注射PBS AD小鼠组相比，*，P＜0.05)，表明注射YS1后的AD小鼠空间记忆能力明显好于注射PBS的对照组。

2、YS1降低AD转基因小鼠脑内老年斑的数量

应用ThS荧光染色实验测定YS1对AD转基因小鼠脑内老年斑的影响：

1)将上述1得到的三组AD+YS1、AD、WT组小鼠心脏灌流，取脑组织，应用组织冷冻液及液氮进行冷冻处理。并保存于-80℃。用时以冷冻切片机进行切片，切片厚度16μm，每隔9个切片取一个进行染色观察。

2)应用1mg/ml ThS(以70％乙醇配制)浸染切片10min，然后以70％乙醇冲洗3次。

3)应用荧光显微镜采集图像(Olympus BX60，激发波长488nm，4×物镜)。

检测结果见图9所示，a为AD对照鼠脑皮层；b为注射YS1多肽的AD鼠脑皮层；c为AD对照鼠海马；d为注射YS1多肽的AD鼠海马。可以看出，注射PBS的AD小鼠脑皮层(a)和海马(d)中的老年斑数量明显多于注射多肽YS1 AD小鼠脑皮层(b)和海马中(e)老年斑数量(c，f分别为野生型小鼠的皮层和海马)。

应用软件系统(visiopharm)测定注射多肽(AD+YS1，n＝8)及对照小鼠(AD，n＝8)海马和皮层(每只动物每个部位检测10-12张切片)的老年斑面积。

统计学分析结果如图10所示，注射多肽组(AD+YS1)的海马和皮层的老年斑面积所占比例(视野中老年斑面积占整个视野的比例)分别为3.3％和7.85％；注射PBS组(AD)的海马和皮层的老年斑面积所占比例分别为10.9％和13.2％；

表明，注射多肽YS1的小鼠老年斑面积占切片面积的比例明显减少(与注射PBS组相比，*，P＜0.01)。

3、YS1降低AD转基因小鼠脑内Aβ40和Aβ42水平

将上述1得到的三组AD+YS1、AD、WT组小鼠的脑组织在含有蛋白酶抑制剂的PBS(pH7.2，蛋白酶抑制剂，Calbiochem公司，产品目录号为：539131，100倍稀释)中匀浆。然后以15000rpm离心30min，收集上清。沉淀加入5M的盐酸胍(以tris-HCl缓冲液配制，pH8.0)。然后离心处理，收集上清。溶于和不溶于PBS的Aβ40和Aβ42水平由试剂盒(Invotrigen，USA，产品目录号分别为：KHB3441和KHB3482)按照上述三所示的方法测定。(Aβ40和Aβ42供标准品为试剂盒自带。Aβ40和Aβ42的标准曲线的函数分别为y＝625x-14.8；y＝636.62x-7.15。x为OD值，y为Aβ40或Aβ42的质量)Aβ水平按照每克脑组织含有的Aβ量(ng或mg)表示，结果见图11-13，

图11中，注射YS1多肽的AD转基因小鼠(AD+YS1)、注射PBS多肽的AD转基因小鼠(AD)脑中可溶性Aβ40的含量分别为30.8ng/g脑蛋白和119.1ng/g脑蛋白(与注射PBS组相比，*，P＜0.01)。

图12中注射YS1多肽的AD转基因小鼠(AD+YS1)、注射PBS多肽的AD转基因小鼠(AD)脑中可溶性Aβ42的含量分别为1.03ng/g脑蛋白和2.35ng/g脑蛋白(与注射PBS组相比，*，P＜0.05)。

图13中为注射YS1多肽的AD转基因小鼠(AD+YS1)、注射PBS多肽的AD转基因小鼠(AD)脑中不溶性Aβ40含量分别为6.1mg/g脑蛋白和9.5mg/g脑蛋白(与注射PBS组相比，*，P＜0.05)，不溶性Aβ42含量分别为7.0mg/g脑蛋白和11.2mg/g脑蛋白(与注射PBS组相比，*，P＜0.05)。

结果表明AD小鼠注射YS1后脑内PBS可溶性Aβ40(图11)和Aβ42(图12)水平及不溶性Aβ40和Aβ42水平(图13)都明显降低。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

研究显示，YS1在体外可以明显降低Aβ产生，且可以抑制Aβ的细胞毒性。应用AD转基因动物进行的体内实验结果表明，YS1可以明显改善小鼠的空间记忆能力，减少脑内老年斑的数量及Aβ40和Aβ42的产生。YS1分子量很小，易穿过血脑屏障发挥疗效，并且抗原性较差，副作用较小，是一条极具AD治疗潜力的多肽。

Claims

1.一种多肽，是由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的多肽。

2.一种抑制Aβ细胞毒性的制剂，其活性成分为权利要求1所述的多肽；所述细胞具体为SH-SY5Y细胞，所述Aβ为具体Aβ42。

3.一种抑制Aβ产生的制剂，其活性成分为权利要求1所述的多肽，所述Aβ具体为Aβ40或Aβ42。

4.一种制备治疗阿尔茨海默病的产品，其活性成分为权利要求1所述的多肽；所述产品具体为药物。

5.权利要求1所述多肽在制备抑制Aβ42细胞毒性的制剂中的应用；所述Aβ为具体Aβ42；所述细胞具体为SH-SY5Y细胞。

6.权利要求1所述多肽在制备抑制Aβ产生的制剂中的应用；所述Aβ具体为Aβ40或Aβ42。

7.权利要求1所述的多肽在制备治疗阿尔茨海默病的产品中的应用；所述产品具体为药物。