CN102505003A - 一种畜禽用凝结芽孢杆菌高密度发酵方法及其制备的制剂和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公布了一种畜禽用凝结芽孢杆菌高密度发酵方法及其制备的制剂和应用。凝结芽孢杆菌菌种保藏编号：CICC No.20138。首先对凝结芽孢杆菌进行液体发酵，然后进行固体变温连续发酵，固体发酵后期进行通风，继续发酵兼干燥，干燥结束，获得凝结芽孢杆菌制剂初产品，经进一步粉碎过筛，获得高密度凝结芽孢杆菌菌剂终产品，终产品菌体数可达115.5×108cfu.g-1，芽孢率可达77.2％，本产品对仔猪有增重和预防腹泻的作用，使用添加浓度为0.05wt％。该菌剂菌体数远高于市场上同类菌剂菌体数(20×108cfu.g-1)，在畜禽养殖行业中具有广阔的市场竞争力。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种畜禽用凝结芽孢杆菌液固分段变温连续发酵的方法和制备得到的菌剂和应用。
背景技术
在我国，抗生素作为饲料添加剂使用已有几十年的历史，其促进了动物生产性能的充分发挥，预防了病菌的感染，对集约化畜牧业的发展做出了重大贡献。但近年来研究表明，抗生素普遍使用亦给人类带来了难以克服的弊端，如引起的内源性感染和二重感染、耐药性的产生、肠道正常菌群的破坏、畜禽产品及环境中的药物残留等问题。
微生态制剂作为一种新型的抗生素替代品，具有无毒副作用、无耐药性、无残留、显著减少畜禽有害气体排放等诸多优点，得到了养殖业的肯定，尤其乳酸菌类和芽孢杆菌类。但乳酸菌类抗逆性差，无法耐受饲料加工制粒过程中的高温，同时在常温运输和保藏过程中失活较快。芽孢杆菌类虽具有可以耐受高温、胃酸、胆碱的芽孢，但是不具备乳酸菌所具有的定殖肠道、维持肠道内正常的生态平衡和调节肠道pH等功能。
作为一种畜禽用微生态制剂，凝结芽孢杆菌既产乳酸又产芽孢，集乳酸菌类和芽孢菌类微生态制剂的优点于一身，具备其它微生态制剂无可比拟的饲喂功效。首先，凝结芽孢杆菌具备乳酸菌类微生态制剂的特点，可在肠道内定殖，补充有益菌群，调整消化道内环境和微生物区系平衡，在小肠壁形成生物屏障，预防和治疗消化机能紊乱和消化道感染，并可分泌乳酸等酸性物质，调节肠道pH、促进肠道的蠕动，提高消化、吸收功能；其次，凝结芽孢杆菌亦可形成芽孢，具备芽孢菌类微生态制剂的特点，能很好的耐受饲料加工过程中的高温、肠道胃酸、胆碱等，并大大降低运输保藏过程中的失活现象，同时在消化道中能产生多种消化酶、丰富的维生素和未知生长因子等，可起到辅助消化、促进生长的作用。众多研究结果表明：凝结芽孢杆菌可促进动物机体的消化吸收、改善动物机体免疫功能、提高动物抗病能力等作用，从而促进动物的生长，降低其死亡率、淘汰率和料肉比。突出的饲喂功能和良好的加工性能，使得凝结芽孢杆菌必将成为饲料微生态制剂行业中不可替代的重要成员。
目前，凝结芽孢杆菌在畜禽添加剂方面的应用报道日益增多，但有关其产业化方面的报道相对较少。分析其原因，主要是凝结芽孢杆菌在产业化过程中液体发酵水平低，发酵液经吸附、干燥和粉碎等后处理工艺后，菌体量损失率较高，造成终产品菌体量较低，直接影响了凝结芽孢杆菌菌剂的使用效果，因此，研究出一种高密度凝结芽孢杆菌菌剂的生产方法将会为我国的畜禽养殖业和绿色生态农业带来无限生机。
发明内容
本发明的目的是提供一种畜禽用高密度凝结芽孢杆菌菌剂及其制备的方法和应用。
一种畜禽用凝结芽孢杆菌高密度发酵的方法，所述的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulan)菌种保藏编号：CICC No.20138(购自中国工业微生物菌种保藏中心)，具体包括以下步骤：
1)液体发酵
所述的菌株的斜面种子经过摇瓶种子培养后接入到发酵罐液体发酵培养，液体发酵培养基配制：淀粉9.0-12.0g，鱼粉18.0-22.0g(粉碎至60目)，磷酸氢二钾2.0-3.2g，一水硫酸锰0.10-0.30g，七水硫酸镁0.60-0.90g，碳酸钙0.10-0.30g、氯化钠0.15-0.40g和硝酸钠0.10-0.30g，水加至1000mL，初始pH＝6.5-7.2；
发酵罐中培养基的装量占发酵罐体积的40-60％，种子液按照培养基体积的3-5％接种，发酵罐发酵参数为温度35-40℃、转速220-280r.min-1、通气量12.0-14.0L.min-1，发酵时间为33-39h；
本发明所述所用斜面种子活化培养基，摇瓶种子培养基和发酵罐培养基使用前均经过温热灭菌(121℃，30mins)。
2)固体发酵
按培养基25-33％的重量接入液体发酵种子液至固体发酵培养基，发酵温度34-36℃，发酵室内相对湿度控制不低于75％，连续发酵45-51h，定期翻匀一次(一般每隔12小时)，其中发酵34-38h后，调控温度为38-42℃，同时通风辅助干燥；
固体发酵培养基由麦麸构成，培养基含水量38-42％，该含水量包括接入的液体发酵种子液中的水分。
步骤1)液体发酵完成后菌体量达54.5-62.0×108cfu.mlL-1。
步骤2)固体发酵完成后菌体量达108.5-127.0×108cfu.g-1，芽孢率达71.3-74.4％。
步骤2)中麦麸制成培养基之前粉碎为30-50目，80℃条件下间歇干热处理1-3h。
一种畜禽用高密度凝结芽孢杆菌制剂是由上述的方法发酵制备而成的产物粉碎得到的。
菌制剂终产品菌体量达102.4-115.5×108cfu.g-1，芽孢率达72.7-77.2％。
所述的粉碎采用粉碎机，转速为20000-30000r.min-1，粉碎时间为7-13s，粉碎目数不低于60目。
所述的畜禽用高密度凝结芽孢杆菌制剂用于制备家畜增重和预防腹泻的制剂。具体可将所述的菌制剂添加到饲料中，喂饲家畜(一般使用对象为猪，尤其是断奶仔猪)。在饲料中添加浓度为0.05wt％。
本发明的有益效果在于，通过液固两步连续变温发酵兼干燥的技术方案大大提升了菌体量(127.0×108cfu.g-1)，菌体量为液体发酵菌体量(62.0×108cfu.mL-1)的2.05倍，同时通过固体发酵后期变温调控兼干燥的技术方案，使芽孢率从对照的63.7％提高到74.4％，加之固体发酵兼干燥全过程是低温进行，能耗小，增强了本发明在畜禽养殖行业的竞争力。
具体实施方式
以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。
实施例1
(1)液体发酵
a)斜面种子活化：将原始种子接种至试管普通营养琼脂斜面培养基，37℃过夜培养24h。普通营养琼脂斜面培养基(蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂20g，水加至1L，pH＝6.5-7.2)；
b)摇瓶种子培养基：将斜面种子接种一环至三环到普通营养肉汤培养基，37℃、200r.min-1过夜培养24h；普通营养肉汤培养基(蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，水加至1L，pH＝6.5-7.2)；
c)将上述种子液按照培养基体积的4％接种到20L发酵罐进行液体培养，培养基体积为发酵罐体积的50％；
发酵培养基配制：淀粉10.6g.L-1，鱼粉20.2g.L-1，磷酸氢二钾2.72g.L-1，一水硫酸锰0.169g.L-1，七水硫酸镁0.739g.L-1，碳酸钙0.20g.L-1、氯化钠0.234g.L-1和硝酸钠0.17g.L-1，溶剂为水，初始pH＝7.0；
发酵：按培养基体积的4％接种，接种至发酵罐发酵培养基，调控发酵罐发酵参数为温度37℃、转速250r.min-1、通气量13.3L.min-1，待发酵时间为36h，发酵结束，对发酵液进行取样，用无菌水进行梯度稀释，倾注法检测含菌量，重复三次，菌体量达62.0×108cfu.mL-1。检测培养基：葡萄糖20g，胰蛋白胨20g，酵母膏10g，琼脂18g，盐溶液10mL(1mL盐溶液中含有：七水硫酸镁5mg，一水硫酸锰1mg，碳酸钙2mg，氯化钠5mg)
本实施例所述所用斜面种子活化培养基，摇瓶种子培养基和发酵罐培养基使用前均经过高温灭菌，实施例2和3相同。
(2)固体发酵
a)培养基配置：麦麸(粉碎为40目左右，80℃间歇干热处理2h)，含水量40％，该含水量包括接入的液体发酵种子液中的水分。
b)发酵：按培养基重量的30％接液体发酵种子液至固体发酵培养基，温度维持在35℃，发酵室内相对湿度控制在75％以上，连续发酵48h，后12h进行通风干燥，待干燥结束，取样10g，检测菌体量和芽孢量，重复三次，菌体量和芽孢量分别为115.5×108cfu.g-1和73.5×108cfu.g-1。菌体量检测方法和检测培养基同实施例1(1)。芽孢量检测方法：取10g样品，置90mL无菌水中，80℃水浴热处理10mins，用无菌水进行梯度稀释，倾注法检测芽孢量，芽孢量检测培养基同实施例1(1)。
(3)固体发酵后期不同温度调控
实施例1(2)固体发酵后期(发酵36h后)，分别按30℃、40℃和45℃进行固体发酵兼干燥变温处理，以不变温度35℃发酵为对照，待发酵兼干燥结束后，分别取不同变温处理的样品10g，检测菌体量和芽孢量，计算芽孢率，重复三次，检测方法同实施例1(2)；结果表明：固体发酵后期(发酵36h后)，变温调控为40℃和45℃时，芽孢率分别为74.4％和75.9％，优于对照芽孢率63.7％；固体发酵后期(发酵36h后)变温调控为40℃时，菌体量和芽孢量均最高，分别为127.0×108cfu.g-1和94.5.0×108cfu.g-1。因此，固体发酵后期(发酵36h后)选择40℃进行变温调控。
表1固体发酵后期变温调控对菌剂菌体量和芽孢率的影响
(4)不同粉碎时间对菌剂菌体量的影响
从按实施例1(1)、实施例1(2)和实施例1(3)的最优选技术方案制备的产品中，分别取100g样品进行粉碎，粉碎转速为24000r.min-1。粉碎时间分别为0s、3s、7s、10s、13s和17s。待粉碎结束后，分别取不同粉碎时间的产品10g，检测菌体量，重复三次。菌体量检测方法和检测培养基同实施例1(1)。最后检测终产品芽孢数，计算芽孢率。结果表明：从粉碎细度看，粉碎时间10-17s，粉碎细度大于60目，满足生产要求；粉碎时间为17s时，菌体量为102.5×108cfu.g-1，损失率为19.3％，损失较大，因此，粉碎时间严格控制在17s内，最优选择粉碎时间为10s。粉碎10s后即获得终产品，终产品菌体数为115.5×108cfu.g-1，芽孢数为89.2×108cfu.g-1，芽孢率为77.2％。
表2不同粉碎时间对菌剂菌体量的影响
实施例2
(1)液体发酵
a)斜面种子活化：将原始种子接种至试管普通营养琼脂斜面培养基，37℃过夜培养24h。普通营养琼脂斜面培养基(蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂20g，加水至1L，pH＝6.5-7.2)；
b)摇瓶种子培养基：将斜面种子接种一环至三环到普通营养肉汤培养基，37℃、200r.min-1过夜培养24h；普通营养肉汤培养基(蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，加水至1L，pH＝6.5-7.2)；
c)将上述种子液按照培养基体积的3％接种到20L发酵罐进行液体培养，培养基体积为发酵罐体积的40％；
发酵培养基配制：淀粉9.0g.L-1，鱼粉(常规购买粉碎至60目)18.0g.L-1，磷酸氢二钾2.0g.L-1，一水硫酸锰0.10g.L-1，七水硫酸镁0.60g.L-1，碳酸钙0.10g.L-1、氯化钠0.15g.L-1和硝酸钠0.10g.L-1，溶剂为水，初始pH＝6.5；
发酵：按培养基体积的3％接种，接种至发酵罐发酵培养基，调控发酵罐发酵参数为温度35℃、转速220r.min-1、通气量12.0L.min-1，待发酵时间为33h，发酵结束，对发酵液进行取样，用无菌水进行梯度稀释，倾注法检测含菌量，重复三次，菌体量达54.5×108cfu.mL-1。
检测培养基同实施例1(1)。
(2)固体发酵兼变温调控
a)培养基配置：麦麸(粉碎为30目左右，80℃间歇干热处理1h)，含水量38％，该含水量包括接入的液体发酵种子液中的水分。
b)发酵：按培养基重量的25％接液体发酵种子液至固体发酵培养基，温度维持在34℃，发酵室内相对湿度控制在75％以上，连续发酵45h，发酵34h后调控温度为38℃进行固体发酵兼干燥，同时进行通风辅助干燥，待干燥结束，取样品10g，检测菌体量和芽孢量，重复三次。菌体量和芽孢量检测方法及检测培养基同实施例1(2)。结果表明：样品菌体量为122.5×108cfu.g-1、芽孢量为87.3×108cfu.g-1，芽孢率为71.3％。
(3)不同粉碎时间对菌剂菌体量的影响
从按实施例2(1)和实施例2(2)的技术方案制备的产品中分别取100g样品进行粉碎，粉碎转速为20000r.min-1。粉碎时间分别为0s、3s、7s、10s、13s、17s和20s。待粉碎结束后，检测细度，细度大于60目的最低粉碎时间处理的产品即为终产品，取终产品10g，检测菌体量和芽孢量，计算芽孢率，重复三次。菌体量、芽孢量检测方法和检测培养基同实施例1(2)。结果表明：从粉碎细度看，粉碎时间为13s或大于13s时，粉碎细度大于60目，满足生产要求，因此，粉碎13s后即获得终产品，终产品菌体量和芽孢量分别为112.0×108cfu.g-1和81.5×108cfu.g-1，芽孢率为72.7％。
实施例3
(1)液体发酵
a)斜面种子活化：将原始种子接种至试管普通营养琼脂斜面培养基，37℃过夜培养24h。普通营养琼脂斜面培养基(蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂20g，加水至1L，pH＝6.5-7.2)；
b)摇瓶种子培养基：将斜面种子接种一环至三环到普通营养肉汤培养基，37℃、200r.min-1过夜培养24h；普通营养肉汤培养基(蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，加水至1L，pH＝6.5-7.2)；
c)将上述种子液按照培养基体积的5％接种到20L发酵罐进行液体培养，培养基体积为发酵罐体积的60％；发酵培养基配制：淀粉12.0g.L-1，鱼粉(常规购买粉碎至60目)22.0g.L-1，磷酸氢二钾3.2g.L-1，一水硫酸锰0.30g.L-1，七水硫酸镁0.90g.L-1，碳酸钙0.30g.L-1、氯化钠0.40g.L-1和硝酸钠0.30g.L-1，水为溶剂，初始pH＝7.2；
发酵：按培养基体积的5％接种，接种至发酵罐发酵培养基，调控发酵罐发酵参数为温度40℃、转速280r.min、通气量14.0L.min，待发酵时间为39h，发酵结束，对发酵液进行取样，用无菌水进行梯度稀释，倾注法检测含菌量，重复三次，菌体量达57.2×108cfu.mL-1。检测培养基检测培养基同实施例1(1)；
(2)固体发酵兼变温调控
a)培养基配置：麦麸(粉碎为50目左右，80℃间歇干热处理3h)，含水量42％，该含水量包括接入的液体发酵种子液中的水分。
b)发酵：按培养基重量的33％接液体发酵种子液至固体发酵培养基，温度维持在36℃，发酵室内相对湿度控制在75％以上，连续发酵51h，发酵38h后调控温度为42℃进行固体发酵兼干燥，同时进行通风辅助干燥，待干燥结束，取样品10g，检测菌体量和芽孢量，重复三次。菌体量和芽孢量检测方法及检测培养基同实施例1(2)。结果表明：样品菌体量为108.5×108cfu.g-1芽孢量为78.4×108cfu.g-1，芽孢率为72.2％；
(3)不同粉碎时间对菌剂菌体量的影响
从按实施例3(1)和实施例3(2)的技术方案制备的产品中分别取100g样品进行粉碎，粉碎转速为30000r.min-1粉碎时间分别为0s、3s、7s、10s、13s、17s和20s。待粉碎结束后，检测细度，细度大于60目的最低粉碎时间处理的产品即为终产品，取终产品10g，检测菌体量和芽孢量，计算芽孢率，重复三次。菌体量、芽孢量检测方法和检测培养基同实施例1(2)。结果表明：从粉碎细度看，粉碎时间为7s或大于7s时，粉碎细度大于60目，满足生产要求，因此，粉碎7s后即获得终产品，终产品菌体量和芽孢量分别为102.4×108cfu.g-1和77.5×108cfu.g-1芽孢率为75.7％。
实施例4、凝结芽孢杆菌制剂对保育猪生产性能的影响
对按最优选实施例1技术方案制备的终产品进行临床试验，具体方案为：试验地点：湖南大有养殖发展有限公司长沙县江背种猪场；试验动物：杜洛克×长白×大白原种断奶仔猪；试验分组：将120头7kg左右的杜洛克×长白×大白原种断奶仔猪随机分成4组，每组30头。
以猪场饲喂的常规日粮为基础日粮(见表3)，对照组和试验组饲喂方案(见表4)；预试期5d，试验期28天，试验期间自由采食，自由饮水。计算试验起始平均体重，试验结束平均体重，平均日增重(ADG)，平均日采食量(ADFI)，饲料转化率(FCR)，每日观察记录腹泻情况，计算腹泻率。
结果表明：B、C和D处理的FCR分别为1.397、1.413和1.427，均小于CK处理FCR1.55；B、C和D处理的腹泻率分别为3.2％、3.8％和4.3％，均小于CK处理腹泻率13.2％，因此本发明产品按0.05wt％(B处理)和0.1％wt％(C处理)浓度添加到饲喂日粮对断奶仔猪具有增重和预防腹泻的作用，而且作用效果优于按0.20wt％浓度添加的经液体发酵直接制备的普通凝结芽孢杆菌制剂(D处理)。
表3基础饲粮原料组成及营养水平
表4试验设计
表5凝结芽孢杆菌制剂对保育仔猪生产性能的影响
本发明研究出了一种液固分段变温连续发酵制备高密度凝结芽孢杆菌菌剂的方法及使用方法。终产品菌体量可达115.5×108cfu.g-1，芽孢率可达77.2％，本发明产品对仔猪有增重和预防腹泻的作用。该菌剂菌体量远高于市场上同类菌剂菌体量(20×108cfu.g-1)，在畜禽养殖行业中具有广阔的市场竞争力。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进或变换都属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (10)
1.一种畜禽用凝结芽孢杆菌高密度发酵的方法，所述的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulan)菌种保藏编号：CICC No.20138，其特征在于，具体包括以下步骤：
1)液体发酵
所述的菌株的斜面种子经过摇瓶种子培养后接入到发酵罐液体发酵培养，液体发酵培养基配制：淀粉9.0-12.0g，鱼粉18.0-22.0g，磷酸氢二钾2.0-3.2g，一水硫酸锰0.10-0.30g，七水硫酸镁0.60-0.90g，碳酸钙0.10-0.30g、氯化钠0.15-0.40g和硝酸钠0.10-0.30g，水加至1000mL，初始pH＝6.5-7.2；
发酵罐中培养基的装量占发酵罐体积的40-60％，种子液按照培养基体积的3-5％接种，发酵罐发酵参数为温度35-40℃、转速220-280r.min-1、通气量12.0-14.0L.min-1，发酵时间为33-39h；
2)固体发酵
按培养基25-33％的重量接入液体发酵种子液至固体发酵培养基，发酵温度34-36℃，发酵室内相对湿度控制不低于75％，连续发酵45-51h，定期翻匀一次，其中发酵34-38h后，调控温度为38-42℃，同时通风辅助干燥；
固体发酵培养基由麦麸构成，培养基含水量38-42％，该含水量包括接入的液体发酵种子液中的水分。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)液体发酵完成后菌体量达54.5-62.0×108cfu.mL-1。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2)固体发酵完成后菌体量达108.5-127.0×108cfu.g-1，芽孢率达71.3-74.4％。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中麦麸制成培养基之前粉碎为30-50目，80℃条件下间歇干热处理1-3h。
5.一种畜禽用高密度凝结芽孢杆菌制剂，其特征在于，所述的菌制剂是由权利要求1-4任意一项所述的方法发酵制备而成的产物粉碎得到的。
6.根据权利要求5所述的菌制剂，其特征在于，菌制剂终产品菌体量达102.4-115.5×108cfu.g-1，芽孢率达72.7-77.2％。
7.根据权利要求6所述的菌制剂，其特征在于，所述的粉碎采用粉碎机，转速为20000-30000r.min-1，粉碎时间为7-13s，粉碎目数不低于60目。
8.权利要求5或6或7所述的畜禽用高密度凝结芽孢杆菌制剂的应用方法，其特征在于，用于制备能促进家畜增重和预防腹泻的制剂。
9.根据权利要求8所述的应用方法，其特征在于，将所述的菌制剂添加到饲料中，喂饲家畜。
10.根据权利要求9所述的应用方法，其特征在于，在饲料中添加浓度为0.05wt％。
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