CN102504603B - 一种多聚物与生物染色剂的偶合物及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种多聚物与生物染色剂的偶合物及其制备方法和用途，偶合物具有G-X-B结构，多聚物G为葡聚糖类、果聚糖类、聚甘露糖醛酸类、聚古罗糖醛酸类、杂聚多糖类、单或杂聚多糖硫酸酯类、单或杂聚糖醛酸多糖类、单或杂聚糖醛酸硫酸酯类、亲水性醇类高聚物、聚赖氨酸、聚谷氨酸或聚天冬氨酸；连接基团X为含1-10个碳原子的有机基团，生物染色剂及其衍生物B为甲苯胺蓝、亚甲蓝、依文思蓝、中性红、健那绿或亮焦油紫。本发明所述偶合物能通过间接淋巴染色法使健康的新西兰大白兔双侧颈部、颌下和颏下淋巴管及淋巴结染色，且不在舌体扩散，且各组实验动物均无明显毒副反应发生，内脏器官组织学检查也未见明显的病理学改变。
Description
技术领域
本发明涉及医学领域，尤其涉及一种多聚物与生物染色剂的偶合物及其制备方法和用途。
背景技术
肿瘤治疗方法主要为放疗、化疗、靶向治疗和外科手术。肿瘤治疗的目的主要是获得较高生存率，要达到此结果在手术中不仅要彻底的切除原发灶，更重要的一点是要防止肿瘤转移。其中肿瘤细胞能够通过淋巴系统转移已得到众多实验证明[Steven et al：Carcinogenesis 2006；27(9)：1729]。如果前哨淋巴结不发生转移，其它淋巴结发生转移的可能性很小，即使有跳跃性转移，其几率也少于1％[Shoaib et al：Cancer 2001；91(10)：2077]。为防止肿瘤的转移，手术中经常寻找前哨淋巴并有选择地切除和清扫[王永胜：中华乳腺病杂志2007；1(1)：5；李国杰等：医学信息(手术学分册)2007；20(6)：535]。在手术前做出有无淋巴结转移的正确判断，术中确定淋巴管和淋巴结的正确位置是实行淋巴清除的关键。因此解决各部位的淋巴走行非常重要。利用影像学技术观察和获得前哨淋巴管和淋巴结分布是解决以上问题的重要方法。
淋巴造影是一种检查淋巴结病变、有可能鉴别良性反应性淋巴结肿大和淋巴结肿瘤的较简单、安全和可靠的诊断方法。目前临床使用的常用造影剂主要为小分子造影剂，能够清楚地观察血管和病变组织，如CT造影剂碘帕醇、碘海醇、碘普胺、碘美普尔、碘喷托、碘佛醇等，核磁共振造影剂钆双胺和钆喷酸。另外经典的活体染料如Patent蓝、亚甲蓝和Evant蓝亦被广泛用于淋巴结观察。利用小分子造影剂直接和间接淋巴造影虽然能够使其富集于淋巴结而被检测到[冷新等：实用临床医药杂志2008；12(4)：110；叶川等：现代妇产科进展2006；15(5)：372-374]，但仍不能特异性观察淋巴管。
淋巴管壁孔径明显大于血管壁孔径。因此必须制备大分子造影剂和染色剂以能够特异性地检测淋巴管和淋巴结。近年来发展了大分子造影剂如右旋糖酐-DTPA-Gd[Desser et al：J Magn Reson Imaging 1994；4：467]，但仅少数报道用于淋巴管的检测[Yan et al：Pharm Res 2010；27：1884]，用于手术中的辅助淋巴检测的染料试剂更是没有报道。
发明内容
针对现有技术中对应用于淋巴造影使用的造影剂和染色剂存在的缺陷和不足，本发明提供了一种多聚物与生物染色剂的偶合物，也提供所述偶合物的制备方法及其在淋巴管和淋巴结显影中的用途。本发明提供的偶合物水溶性好，能够在体内渗透，能特异性检测淋巴管和淋巴结；而且显影时间长，可提供充足的临床手术和观察时间；而且所述偶合物没有明显的肾脏毒性和肝脏毒性。
为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现：
一种多聚物与生物染色剂的偶合物，它具有以下通式(I)所示的结构：
G-X-B
(I)
其中：G为多聚物，X为连接基团，B为生物染色剂及其衍生物；
所述多聚物为葡聚糖类、果聚糖类、聚甘露糖醛酸类、聚古罗糖醛酸类、杂聚多糖类、单或杂聚多糖硫酸酯类、单或杂聚糖醛酸多糖类、单或杂聚糖醛酸硫酸酯类、亲水性醇类高聚物、聚赖氨酸、聚谷氨酸或聚天冬氨酸；
所述生物染色剂及其衍生物为甲苯胺蓝、亚甲蓝、依文思蓝、中性红、健那绿或亮焦油紫；
所述连接基团为含1-10个碳原子的有机基团。
对技术方案的进一步改进：所述的葡聚糖类多聚物为右旋糖酐，聚甘露糖醛酸类为聚甘露糖醛酸丙酯硫酸酯钠盐，聚古罗糖醛酸类为聚古罗糖醛酸丙酯硫酸酯钠盐，杂聚糖醛酸硫酸酯类为藻酸双酯钠。
对技术方案的进一步改进：所述连接基团为羰基、丙二酰基、丁二酰基、顺丁烯二酰基、反丁烯二酰基、戊二酰基、己二酰基或二乙烯三胺五乙酰基。
对技术方案的进一步改进：所述的多聚物分子量范围为4,000-2000,000。
对技术方案的进一步改进：所述的生物染色剂及其衍生物优选为甲苯胺蓝和/或依文思蓝。
对技术方案的进一步改进：所述的连接基团优选为丁二酰基。
对技术方案的进一步改进：所述偶合物水溶液中的渗透压为20-100mmol/L，粒径为100-1000nm。
本发明还提供了所述的多聚糖与生物染色剂偶合物的制备方法，所述方法为：以二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、六甲基磷酰三胺、二甲亚砜或甲基吡咯烷酮为溶剂，在0-30℃条件下，在1-5摩尔比的三乙胺、吡啶、二异丙基乙基胺、N-甲基吗啡啉、碳酸氢钠、氢氧化钠或4-N，N-二甲基氨基吡啶催化下，1摩尔比的生物染色剂与1-5摩尔比的羰基二咪唑、丙二酰氯、丁二酰氯、顺丁烯二酰氯、顺丁烯二酸酐、反丁烯二酰氯、丁二酸单酰氯、丁二酸酐、戊二酰氯、戊二酸单酰氯、己二酰氯、己二酸单酰氯或二乙烯三胺五乙酸酐反应，制备生物染色剂酰化物；
将生物染色剂酰化物用二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、六甲基磷酰三胺、二甲亚砜或甲基吡咯烷酮溶解，在0.1-1摩尔比的N，N-二环己基碳二亚胺、N，N-二异丙基碳二亚胺、苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐、双(2-氧代-3-恶唑烷基)次磷酰氯、羰基二咪唑、3-(二乙氧基磷酰氧基)-1，2，3-苯并三嗪-4-酮、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N，N-四甲基脲六氟磷酸酯、苯并三氮唑-N，N，N，N-四甲基脲六氟磷酸盐催化下，0.1-1摩尔比的生物染色剂酰化物与按糖单元计1摩尔比的多聚物反应制备多聚物与生物染色剂的偶合物。
本发明还提供了所述的多聚物与生物染色剂偶合物在制备用于淋巴造影的造影剂中的应用。
对技术方案的进一步改进：所述多聚物与生物染色剂偶合物为冻干粉针剂或水针剂。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：本发明制得的右旋糖酐与甲苯胺蓝偶合物、右旋糖酐与依文思蓝偶合物、藻酸双酯钠与甲苯胺蓝偶合物、藻酸双酯钠与依文思蓝偶合物、聚赖氨酸与甲苯胺蓝偶合物和聚赖氨酸与依文思蓝偶合物的水溶性好，能够在体内渗透；利用本发明所述偶合物制备的造影剂分子量大于目前临床使用的小分子造影剂，能特异性检测淋巴管和淋巴结，而且显影时间长，可提供充足的临床手术和观察时间；而且所述偶合物没有明显的肾脏毒性和肝脏毒性。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细的说明。
实施例1、甲苯胺蓝酰化物的制备
取甲苯胺蓝(2.00g，6.54mmol)，丁二酸酐(0.65g，6.54mmol)，4-二甲氨基吡啶(DMAP)(0.80g，6.54mmol)于100ml两口瓶，减压干燥1小时。氮气保护下加入干燥的二甲基甲酰胺(DMF)50ml，室温搅拌反应10小时，TLC检测反应完全。向反应液中加入500ml乙酸乙酯，充分搅拌，过滤，真空干燥得蓝色固体甲苯胺蓝酰化物2.02g，收率83.5％。
实施例2、依文思蓝酰化物的制备
取依文思蓝(2.00g，2.08mmol)，丁二酸酐(0.42g，4.19mmol)，4-二甲氨基吡啶即DMAP(0.52g，4.19mmol)于100ml两口瓶，减压干燥1小时。氮气保护下加入干燥的DMF 50ml，室温搅拌反应10小时，TLC检测反应完全。向反应液中加入500ml乙酸乙酯，充分搅拌，过滤，真空干燥得蓝色固体依文思蓝酰化物1.8g，收率80.1％。
除甲苯胺蓝和依文思蓝外，所述生物染色剂还可以为亚甲蓝、中性红、健那绿或亮焦油紫等其它用于细胞或组织染色的染料。
实施例3、右旋糖酐与甲苯胺蓝偶合物的制备
取制得的所述甲苯胺蓝酰化物(2.00g，4.92mmol)，右旋糖苷40(2.40g，按葡萄糖单元计14.81mmol)，EDC·HCl(1.42g，7.39mmol)，HOBt(1.00g，7.39mmol)，4-二甲氨基吡啶(1.20g，9.86mmol)于100ml三口瓶中，真空干燥0.5小时。冰浴下加二甲基亚砜(DMSO)50ml，超声溶解，室温搅拌反应12小时，TLC检测，反应完全。向反应液中加500ml乙酸乙酯，搅拌0.5小时，过滤，真空干燥得右旋糖酐与甲苯胺蓝偶合物3.32g产率为75％。
实施例4、右旋糖酐与依文思蓝偶合物的制备
取羰基二咪唑(CDI)(0.54g，3.35mmol)溶于30ml DMSO中，加入依文思蓝酰化物(1.80g，1.67mmol)，反应液在室温下搅拌过夜。然后加入右旋糖酐(1.63g，10.07mmol)，氮气保护下80℃反应24小时。TLC检测，反应完全，将反应液倒入200ml的乙酸乙酯中，充分搅拌，过滤。滤饼用乙酸乙酯洗三遍。真空干燥得右旋糖酐与依文思蓝偶合物2.12g，产率为81％。
本发明制得的右旋糖酐与甲苯胺蓝的偶合物和右旋糖酐与依文思蓝的偶合物有明显的水溶性，水溶液中的渗透压介于20-100mmol/L，粒径介于100-1000nm。
实施例5、藻酸双酯钠与甲苯胺蓝偶合物的制备
取CDI(0.79g，4.91mmol)溶于50ml DMSO中，加入甲苯胺蓝酰化物(2.05g，4.93mmol)，反应液在室温下搅拌过夜。然后加入藻酸双酯钠(12.51g，14.79mmol)。氮气保护下80℃反应24小时。TLC检测，反应完全，将反应液倒入500ml的乙酸乙酯，充分搅拌，过滤。滤饼用乙酸乙酯洗三遍。真空干燥得藻酸双酯钠与甲苯胺蓝偶合物11.64g，产率为80％。
实施例6、藻酸双酯钠与依文思蓝偶合物的制备
取CDI(0.54g，3.36mmol)溶于50ml DMSO中，加入依文思蓝酰化物(1.80g，1.68mmol)，反应液在室温下搅拌过夜。然后加入藻酸双酯钠(12.51g，14.79mmol)。氮气保护下80℃反应24小时。TLC检测，反应完全，将反应液倒入200ml的乙酸乙酯，充分搅拌，过滤，滤饼用乙酸乙酯洗三遍。真空干燥得藻酸双酯钠与依文思蓝偶合物4.73g，产率为78％。
实施例7、聚赖氨酸与甲苯胺蓝偶合物的的制备
取CDI(0.79g，4.91mmol)溶于20ml DMSO中，加入甲苯胺蓝酰化物(2.05g，4.93mmol)，反应液在室温下搅拌过夜。然后加入聚赖氨酸(1.91g，14.67mmol)。氮气保护下80℃反应24小时。TLC检测，反应完全，将反应液倒入500ml的乙酸乙酯，充分搅拌，过滤。滤饼用乙酸乙酯洗三遍。真空干燥得聚赖氨酸与甲苯胺蓝偶合物3.09g，产率为78％。
实施例8、聚赖氨酸与依文思蓝偶合物的制备
取CDI(0.54g，3.36mmol)溶于10ml DMSO，加入依文思蓝酰化物(1.80g，1.68mmol)，反应液在室温下搅拌过夜。然后加入聚赖氨酸(1.91g，14.67mmol)。氮气保护下80℃反应24小时。TLC检测，反应完全，将反应液倒入200ml的乙酸乙酯，充分搅拌，过滤，滤饼用乙酸乙酯洗三遍。真空干燥得聚赖氨酸与依文思蓝偶合物4.73g，产率为78％。
实施例9、右旋糖酐与甲苯胺蓝的偶合物间接显影观察
取健康的新西兰大白兔30只，体重为2.4～3.6kg。随机分成三组，每组10只。用氯胺酮(80mg/kg、1.6ml)及地西泮(5mg/kg、1ml)肌肉注射麻醉家兔。将家兔固定在兔手术台上，行双侧颈部备皮，术区用2.5％碘伏消毒，用1.0％的利多卡因局部皮下注射麻醉。于颈部正中做纵行切口长约10cm，于颈浅筋膜处分离皮下组织，充分显露出颈内动静脉及双侧颈部、颌下和颏下淋巴结，操作中保护颈中及颈深筋膜。前两组分别行双侧舌背近舌缘粘膜下注射1.0％(0.14mmol/L)的右旋糖酐与甲苯胺蓝偶合物和1.0％(32.6mmol/L)的甲苯胺蓝各0.1ml，注射区均不做按摩。以染色淋巴管到达的第1站淋巴结为前哨淋巴结(sentinel lymph node，SLN)，观察颈部淋巴管及SLN的染色时间和褪色时间，并测量各染料在舌体组织的扩散范围。各组动物于SLN染色后，分别在着色10分钟(均在染色淋巴管褪色之前)及1小时各切取2只家兔双侧颈部SLN，并固定于10.0％甲醛中行组织病理学检查；其余动物缝合切口，分别于1天、2天后观察SLN的染色情况，之后饲养4周后处死切取双侧颈部淋巴结、心脏、肺脏、肝脏及肾脏送病理学检查。各组动物在实验前和饲养4周后，各抽取静脉血检测血常规、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、尿素氮和肌酐。第三组均暂时阻断双侧颈内动脉，用留置针行颈总动脉分别注射右旋糖酐与甲苯胺蓝的偶合物和甲苯胺蓝溶液各1ml，观察舌体组织染色过程及双侧颈部淋巴结染色情况，并各切取舌体、淋巴结、肌肉组织、颌下腺行病理组织学检查。两种染料均能通过间接淋巴染色法使淋巴管及淋巴结染色。
行舌体粘膜下注射后，右旋糖酐与甲苯胺蓝的偶合物组到达SLN所需的时间为(21.667±0.193)秒，甲苯胺蓝组为(3.219±0.335)秒，记录数据经统计分析可知，右旋糖酐与甲苯胺蓝的偶合物组与甲苯胺蓝组比较有明显延长，差异有统计学意义，P＝0.000。右旋糖酐与甲苯胺蓝的偶合物组淋巴管从染色到明显褪色的时间为(19.700±1.337)分钟，甲苯胺蓝组为(14.300±0.949)分钟，记录数据经统计分析可知两者差异有统计学意义，P＝0.000。右旋糖酐与甲苯胺蓝的偶合物组注射后5分钟在舌体扩散的范围为(10.500±1.080)mm，而甲苯胺蓝组为(20.000±1.054)mm，5分钟之后两者范围无明显扩大，两者差异有统计学意义，F＝0.15，P＝0.000。2天后甲苯胺蓝组淋巴结已完全褪色，而右旋糖酐与甲苯胺蓝的偶合物组4周后仍明显染色。
实施例10、偶合物对实验动物的毒副实验
观察期间各组实验动物均无明显毒副反应发生，各项实验室检查实验前后数据差异无统计学意义，P＞0.05，送检的内脏器官组织学检查也未见明显的病理学改变(表1)。对比注射部位，甲苯胺蓝组深染组织在4周后已明显褪色，右旋糖酐与甲苯胺蓝的偶合物组注射部位仍明显染色，但染料在粘膜下组织的扩散直径4周≤2mm。差异无统计学意义，P＞0.05，送检的内脏器官组织学检查也未见明显的病理学改变。对比注射部位，甲苯胺蓝组深染组织在4周后已明显褪色，右旋糖酐与甲苯胺蓝的偶合物组注射部位仍明显染色，但染料在粘膜下组织的扩散直径4周≤2mm。
表1：右旋糖酐与甲苯胺蓝的偶合物的主要的实验结果比较
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
Claims (7)
1.一种多聚物与生物染色剂的偶合物，其特征在于它具有以下通式(I)所示的结构：
G-X-B
(I)
其中：G为多聚物， X为连接基团，B为生物染色剂及其衍生物；
所述多聚物为葡聚糖类、果聚糖类、聚甘露糖醛酸类、聚古罗糖醛酸类、杂聚多糖类、单或杂聚多糖硫酸酯类、单或杂聚糖醛酸多糖类、单或杂聚糖醛酸硫酸酯类；所述的多聚物分子量范围为4,000-2000,000；
所述生物染色剂及其衍生物为甲苯胺蓝、亚甲蓝、依文思蓝、中性红、健那绿或亮焦油紫；
所述连接基团为羰基、丙二酰基、丁二酰基、顺丁烯二酰基、反丁烯二酰基、戊二酰基、己二酰基或二乙烯三胺五乙酰基；
所述偶合物水溶液中的渗透压为20-100 mmol/L，粒径为100-1000 nm。
2.根据权利要求1所述的一种多聚物与生物染色剂的偶合物，其特征在于所述的葡聚糖类多聚物为右旋糖酐，聚甘露糖醛酸类为聚甘露糖醛酸丙酯硫酸酯钠盐，聚古罗糖醛酸类为聚古罗糖醛酸丙酯硫酸酯钠盐，杂聚糖醛酸硫酸酯类为藻酸双酯钠。
3.根据权利要求1所述的一种多聚物与生物染色剂的偶合物，其特征在于所述的生物染色剂及其衍生物优选为甲苯胺蓝和/或依文思蓝。
4.根据权利要求1所述的一种多聚物与生物染色剂的偶合物，其特征在于所述的连接基团优选为丁二酰基。
5.一种根据权利要求1所述的多聚糖与生物染色剂偶合物的制备方法，其特征在于所述方法为：以二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、六甲基磷酰三胺、二甲亚砜或甲基吡咯烷酮为溶剂，在0-30oC条件下，在1-5摩尔比的三乙胺、吡啶、二异丙基乙基胺、N-甲基吗啡啉、碳酸氢钠、氢氧化钠或4-N,N-二甲基氨基吡啶催化下，1摩尔比的生物染色剂与1-5摩尔比的羰基二咪唑、丙二酰氯、丁二酰氯、顺丁烯二酰氯、顺丁烯二酸酐、反丁烯二酰氯、丁二酸单酰氯、丁二酸酐、戊二酰氯、戊二酸单酰氯、己二酰氯、己二酸单酰氯或二乙烯三胺五乙酸酐反应，制备生物染色剂酰化物；
将生物染色剂酰化物用二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、六甲基磷酰三胺、二甲亚砜或甲基吡咯烷酮溶解，在0.1- 1摩尔比的羰基二咪唑或EDC·HCl、HOBt和4-二甲氨基吡啶三种联用的催化下，0.1- 1摩尔比的生物染色剂酰化物与按糖单元计1摩尔比的多聚物反应制备多聚物与生物染色剂的偶合物。
6.根据权利要求1所述的多聚物与生物染色剂偶合物在制备用于淋巴造影的造影剂中的应用。
7.根据权利要求6所述的多聚物与生物染色剂偶合物在制备用于淋巴造影的造影剂中的应用，其特征在于所述多聚物与生物染色剂偶合物为冻干粉针剂或水针剂。
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