CN102491898B

CN102491898B - 由葵花粕中同时提取绿原酸和葵花蛋白的方法

Info

Publication number: CN102491898B
Application number: CN201110362727.0A
Authority: CN
Inventors: 刘鹭; 胡鲜宝; 吕加平; 李红娟; 张书文; 孔凡丕
Original assignee: Institute of Food Science and Technology of CAAS
Current assignee: Institute of Food Science and Technology of CAAS
Priority date: 2011-11-16
Filing date: 2011-11-16
Publication date: 2014-04-09
Anticipated expiration: 2031-11-16
Also published as: CN102491898A

Abstract

本发明公开了一种由葵花粕中同时提取绿原酸和葵花蛋白的方法。该方法，包括：1)将脱脂葵花粕粉碎后用乙醇水溶液进行醇提，收集上清液得到绿原酸粗提液，收集沉淀得到已提取过绿原酸的葵花粕；2)将绿原酸粗提液上样于大孔吸附树脂静态吸附，吸附完毕后上样于所述大孔吸附树脂中进行动态吸附，收集洗脱时间在65-125分钟的洗脱液，浓缩干燥后得到绿原酸冻干粉；3)将步骤2)所得已葵花粕粉碎后用氯化钠水溶液进行盐提，收集上清液进行离心后用酸度调节剂调节pH值后进行沉淀，收集沉淀得到葵花蛋白。该方法工艺简便，提取率高，产物纯度高，具有重要的应用价值。

Description

由葵花粕中同时提取绿原酸和葵花蛋白的方法

技术领域

本发明涉及一种由葵花粕中同时提取绿原酸和葵花蛋白的方法。

背景技术

绿原酸(CGA)又名咖啡鞣酸，是植物在有氧呼吸过程中产生的一种由咖啡酸(caffiec acid)与奎尼酸(quinic acid)组成的酯类物质，分子式C₁₆H₁₈O₉，分子量345.30。绿原酸具有较强的药理活性，具有预防II型糖尿病和心血管疾病的功能。据报道，绿原酸有抗病毒、抗细菌和抗真菌作用，并且毒副作用较低。绿原酸主要存在于杜仲叶，金银花和向日葵中，据报道向日葵栽培品种中绿原酸含量为1.1％～4.5％，平均为2.8％，我国有丰富的葵粕资源，对葵粕中绿原酸进行研究，不仅可以促进向日葵资源的综合开发利用，而且解决了向日葵产区葵粕积压问题。

目前，国内对葵花粕绿原酸醇提工艺的研究报道，多限于分析各单因素对绿原酸提取率的影响，以正交试验方法确定其最佳工艺条件。虽然传统的正交试验方法能够同时考虑几种影响因素，寻找最佳因素水平组合，却不能找出因素和相应值间的确切的函数表达式，即回归模型，从而无法找到全部影响因素的最佳组合和响应值的最优值。

葵花粕经醇法提出绿原酸溶液后，经冷冻干燥，即可得到葵粕绿原酸粗提物，但是其中仍然含有大量的蛋白、糖、脂肪等杂质，不仅产品的纯度较低(此时绿原酸含量为16.6％左右)，而且直接影响了产品的稳定性和应用范围。因此，十分有必要对其进行纯化精制。目前绿原酸纯化方法主要有以上所提到的超滤法、大孔吸附树脂、聚酰胺柱层析法、乙酸乙酯法、絮凝沉淀分离、水提石灰乳沉淀法、醇提铅盐沉淀法及超临界流体萃取法等。其中大孔树脂吸附精制法具有效率高、质量稳定、成本低及简单等优点，是目前绿原酸纯化的主流。尽管对绿原酸类物质的分离纯化的报道不在少数，但多限于杜仲叶、金银花等的分离研究，而关于葵花粕绿原酸类物质的纯化研究很少。纯化试验旨在通过研究影响大孔吸附树脂纯化效果的树脂种类、上样液浓度、洗脱剂和洗脱流速等因素的影响，筛选出最佳效果的大孔吸附树脂，并对大孔吸附树脂富集、纯化葵粕绿原酸的工艺条件与参数进行研究，探索工艺流程，确立纯化的可行方法。

葵花蛋白是一种优质蛋白，但由于葵花粕中含有绿原酸等蛋白抑制因子，能和蛋白质结合，使蛋白的色泽发暗，并且降低的葵花蛋白的营养价值和利用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种由葵花粕中同时提取绿原酸和葵花蛋白的方法。

本发明提供的由葵花粕中同时提取绿原酸和葵花蛋白的方法，包括如下步骤：

1)将脱脂葵花粕粉碎后用乙醇水溶液进行醇提，收集上清液得到绿原酸粗提液，收集沉淀得到已提取过绿原酸的葵花粕；

2)将步骤1)所得绿原酸粗提液上样于大孔吸附树脂中进行静态吸附，吸附完毕后将所得静态吸附的洗脱液上样于所述大孔吸附树脂中进行动态吸附，用乙醇水溶液进行洗脱，收集洗脱时间在65-125分钟的动态吸附的洗脱液，浓缩干燥后得到绿原酸冻干粉；

3)将步骤1)所得已提取过绿原酸的葵花粕粉碎后用氯化钠水溶液进行盐提，收集上清液进行离心后用酸度调节剂调节pH值后进行沉淀，收集沉淀得到葵花蛋白。

上述方法步骤1)粉碎步骤中，粉碎后的目数为20-100目，优选50目；所述乙醇水溶液的体积百分浓度为10-90％，优选60％；所述醇提步骤中，温度为20-80℃，优选75℃，时间为30-1200分钟，优选60分钟；所述粉碎后的脱脂葵花粕与乙醇水溶液的用量比为1∶(1-25)，优选1∶15。

所述步骤2)中，所述大孔吸附树脂的型号为如下任意一种：NKA-II、D101、HPD-826、HPD-400、AB-8、BS-75、BS-45、BS-30、HPD100和H103，优选NKA-II型大孔吸附树脂；所述大孔吸附树脂柱中的填充介质为NKA-II型大孔吸附树脂；所述大孔树脂柱的径高比为(2-4)∶60，优选2∶60；所述大孔树脂柱的径高比中，径为该树脂柱的内径，高为树脂柱内的大孔树脂填充高度；

所述静态吸附步骤中，吸附时间为0-24小时，但不包括0小时，优选2小时；所述绿原酸粗提液的进样浓度为3.9-11.4mg/mL，优选8.64mg/mL，进样pH值为2.5-6.8，优选3.62；

所述大孔吸附树脂动态吸附步骤中，所述乙醇水溶液的体积百分浓度为15-95％，优选95％，吸附时间为1-15小时，优选8小时；所述乙醇水溶液的用量为所述大孔吸附树脂体积的1倍-4倍，优选2倍；洗脱速率为1.0mL/min-2.0mL/min，优选1.5mL/min。

所述步骤3)中，所述粉碎步骤中，粉碎后的目数为20-150目，优选60目；所述氯化钠水溶液的浓度为0.5-2.5mol/L，优选1.5mol/L mol/L；所述离心步骤中，转速为1000-5000r/min，优选3000r/min，时间为5-10分钟，优选7分钟；所述酸度调节剂为浓度为0.5-5％的盐酸水溶液、柠檬酸或硫酸溶液，优选浓度为1％的盐酸水溶液；所述调节pH值步骤中，pH值的终值为3.5-9.5，优选7.5；所述盐提步骤中，温度为20-50℃，优选35℃；粉碎后的所述步骤1)所得已提取过绿原酸的葵花粕与所述氯化钠水溶液的用量比为0.3-0.7g∶1mL，优选0.3g∶1mL。

所述由葵花粕中同时提取绿原酸和葵花蛋白的方法，还包括如下步骤：在所述步骤1)之后，所述步骤2)之前，将所述步骤1)所得绿原酸粗提液进行过滤、浓缩、静置和离心。其中，所述过滤步骤中，滤孔直径为50-300目，优选200目；所述浓缩步骤中，温度为50-70℃，优选55℃，浓缩倍数为2-5倍，优选4倍；所述静置步骤中，温度为0-4℃，优选0℃，时间为12-24小时，优选12小时；所述离心步骤中，转速为3000-5000r/min，优选3000r/min，时间为5-10分钟，优选7分钟。

所述由葵花粕中同时提取绿原酸和葵花蛋白的方法，还包括如下步骤：在所述步骤3)之后，将所述用酸度调节剂进行沉淀后的沉淀物进行脱盐和干燥，得到所述葵花蛋白。

按照上述方法制备得到的绿原酸和葵花蛋白，也属于本发明的保护范围。

本发明提供的同时提取绿原酸和葵花蛋白的方法，在对葵花粕进行充分的绿原酸提取之后，以提取绿原酸后的葵花粕为原料，进行葵花蛋白的提取，考虑到提取绿原酸后的葵花粕有绿原酸残留，同样也会对提取后的蛋白产生影响，因此，采用通过氯化钠辅助，在低pH值和氯化钠辅助的条件下进行葵花蛋白的提取，从而得到优质的葵花蛋白。该方法工艺简便，提取率高，具有重要的应用价值。

附图说明

图1为UV法测CGA标准曲线。

图2为HPLC法测CGA标准曲线。

图3为线性拟合图。

图4为指数拟合图。

图5为三次多项式拟合图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述材料如无特别说明均能从公开商业途径而得。

实施例1

1)将脱脂葵花粕粉碎后(粉碎后的目数为50目)用体积百分浓度为60％的乙醇水溶液在75℃进行醇提60分钟，收集上清液得到绿原酸粗提液，收集沉淀得到已提取过绿原酸的葵花粕；其中，粉碎后的脱脂葵花粕与乙醇水溶液的质量比为1∶15；

2)将步骤1)所得绿原酸粗提液过200目的滤筛，以去除步骤1)所得绿原酸粗提液中的部分杂质后于55℃将该粗提液浓缩4倍后，再于0℃静置12小时，于转速为3000r/min的条件下离心7分钟后，将pH值为3.6、浓度为8.64mg/mL的绿原酸粗提液上样于大孔吸附树脂中进行静态吸附2小时，吸附完毕后将所得静态吸附的洗脱液上样于相同的大孔吸附树脂中进行动态吸附，用体积百分浓度为95％的乙醇水溶液洗脱8小时，收集洗脱时间在65-125分钟的动态吸附的洗脱液，浓缩干燥后得到绿原酸冻干粉；

该步骤中，所用大孔吸附树脂均为NKA-II型大孔吸附树脂，填充介质为NKA-II型大孔吸附树脂；径高比为3∶60，规格为60cm×3cm；

动态吸附步骤中，所用乙醇水溶液的用量为大孔吸附树脂体积的2倍，洗脱速率为1.5mL/min。

该步骤所得绿原酸的纯度为36.2％，纯化前粗提液的浓度仅为16.6％，经过纯化后，纯度提高了近一倍。通过计算，绿原酸的回收率(即产率)为79.6％。

3)将步骤1)所得已提取过绿原酸的葵花粕过60目筛粉碎后用浓度1.5mol/L的氯化钠水溶液于35℃进行盐提，其中，粉碎后的步骤1)所得已提取过绿原酸的葵花粕与氯化钠水溶液的用量比为0.3g∶1mL；再收集上清液后于转速为3000r/min的条件下离心7分钟后取上清液，用酸度调节剂质量百分浓度为1％的盐酸水溶液调节pH值至7.5后进行沉淀，收集沉淀后进行脱盐和干燥，得到本发明提供的葵花蛋白，纯度为85％，产率为68％。

其中，该实施例中绿原酸纯度、回收率(也即产率)的检测方法如下：

1)标准曲线的建立称取绿原酸(CGA)标准品5mg，用95％乙醇定容到50mL，摇匀后，取0.5，0.75，2.0，1.25，2.0，2.5mL分别置于10mL容量瓶中，并且用质量百分浓度为95％的乙醇水溶液稀释到刻度。以质量百分浓度为95％的乙醇水溶液为参比液，在327nm处测定各浓度的吸光值A。以绿原酸标准品浓度为横坐标，以其吸光度为纵坐标绘图，得回归方程。根据朗伯比尔定律，在一定浓度范围内吸光度值与样品浓度成正比，由图1可知，CGA浓度在0.01-0.03mg/mL时有良好的线性关系，并求得线性回归方程为Y＝0.0169X+0.0002，R2＝0.9952。

2)回收率的测定在样品制备液中加入一定浓度的绿原酸标准溶液，在已经测定的最大吸收波长处测定吸光度OD，根据回归方程计算回收率。R＝R1/R2(式中：R回收率，R1实测量，R2加入量)采用加样回收法。取适量已知含量的样品，分别精密加入一定量的绿原酸对照品，依法操作测定，同法重复试验5次，测得绿原酸的平均回收率。由表1可知UV法的平均加样回收率为1.16％，可见UV法具有较好的准确度。

表1、UV法CGA回收率表

3)绿原酸高效液相色谱检测方法的建立

(1)液相色谱条件色谱柱：C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：由质量百分浓度为0.5％的乙酸水溶液和乙腈以体积比90∶10混匀而得)；流速：1.0mL/min；柱温：35℃；检测波长：327nm；进样量：10μL。

(2)标准曲线方程的建立称取绿原酸标准品0.02g(精确至0.0001g)于100.0mL容量瓶中，加流动相溶解并定容至刻度，混匀，此标准使用液在4℃冰箱中储存，分别吸取此标准使用液，用流动相稀释并在容量瓶中定容的浓度为别为2.0、10.0、20.0、40.0、80.0μg/mL标准系列，以绿原酸标准品浓度为横坐标，以其吸光度为纵坐标绘图(如图2所示)，得回归方程。通过计算得HPLC法测定葵花粕中CGA线性回归方程为：Y＝0.09946+0.22857X，R＝0.99984，方程显著性水平是0.0001。

(3)回收率试验采用与前述步骤2)相同的方法测定回收率。可知CGA在2-80μg/mL的浓度范围内是线性相关的，并且具有良好的线性关系。通过表2可知HPLC法的平均加样回收率为95.8％，说明HPLC法是准确和可信的。

表2、HPLC法CGA回收率表

4)拟合曲线的建立

为了分析HPLC法和UV法测定结果之间的关系，采用了线形拟合、指数拟合和多项式拟合的方法，线性拟合见图3，拟合方程为：Y＝0.9738X-3.8567，R2＝0.9849，其中X轴为UV测定结果，Y轴为HPLC测定结果。指数拟合见图4，其拟合方程为Y＝y0+Ae-x/t，y0＝-2.01327E7，A＝2.01327E7t＝-2.06734E7，R2＝0.98357。多项式拟合见图5，其方程为Y＝A+BX+CX2+DX3，A＝1.386，B＝0.4082，C＝0.0132，D＝-8.434，R2＝0.9856。从上述拟合结果可以看出，HPLC法和UV法所测得结果存在差异，并且在一定的范围内，UV所测得结果要大于HPLC所测得的结果，其主要原因是在UV测量的过程中，除了绿原酸以外其他的酚类物质在327nm处也有吸收，从而为UV测定带来了误差，为了提高UV测定法的准确性，采用Origin8.0对这两种方法进行拟合，结果表明多项式拟合的相关系数(R2＝0.9856)略高于线性拟合(R2＝0.9849)以及指数拟合(R2＝0.98357)，由此选定Y＝1.386+0.4082X+0.0132X2-8.438X3为最佳拟合方程。

5)拟合方程的验证

在以CGA标准品为检测样品建立了拟合方程后，利用UV法对醇提液中的CGA进行测定，经拟合方程校正CGA的含量，并通过HPLC对计算结果进行验证，结果表明在一定的浓度范围内(5.5-33μg/mL)，样品经拟合方程校正的浓度值与HPLC法所测得的结果相近，t检验的结果表明，在0.05水平下，两组数据之间没有显著差异(p＝0.6722)。

紫外分光光度法是一般常规试验室常采用的检测方法。但是提取液中成分复杂多样，存在各种杂质的干扰，造成测定结果误差很大。高效液相色谱法以其高效、高速、高灵敏度等优点在检测应用中逐渐增多，但缺点是利用HPLC检测需要时间较长，并且成本较高。国内一些学者虽然对紫外可见分光光度法和高效液相色谱法对绿原酸的含量的测定有过研究和比较，但是却没有对UV测定进行校正，本发明给出UV法测定CGA含量的拟合方程，方程表明，在一定浓度范围内(5.5-33μg/mL)，该方程准确可靠，从而可以实现UV法快速、准确地测量大批量样品中的CGA含量。在实际操作中，建议将CGA浓度控制在推荐的范围内，如果浓度过低或过高，需要适当的浓缩或稀释，以确保试验结果的准确性。

表4、多项式拟合结果验证

注：SD为拟合结果与HPLC测定结果的标准偏差；RSD＝SD/HPLC测定结果。

Claims

1.一种由葵花粕中同时提取绿原酸和葵花蛋白的方法，包括如下步骤：

1）将脱脂葵花粕粉碎后用乙醇水溶液进行醇提，收集上清液得到绿原酸粗提液，收集沉淀得到已提取过绿原酸的葵花粕；所述步骤1）粉碎步骤中，粉碎后的目数为20-100目；所述乙醇水溶液的体积百分浓度为60%；所述醇提步骤中，温度为75℃，时间为60分钟；所述粉碎后的脱脂葵花粕与乙醇水溶液的质量比为1：15；

2）将步骤1）所得绿原酸粗提液上样于大孔吸附树脂中进行静态吸附，吸附完毕后将所得静态吸附的洗脱液上样于所述大孔吸附树脂中进行动态吸附，用乙醇水溶液进行洗脱，收集洗脱时间在65-125分钟的动态吸附的洗脱液，浓缩干燥后得到绿原酸冻干粉；所述大孔吸附树脂柱中的填充介质为NKA-II型大孔吸附树脂；所述大孔树脂柱的径高比为2：60；所述静态吸附步骤中，吸附时间为2小时；所述绿原酸粗提液的进样浓度为8.64mg/mL，进样pH值为3.62；所述大孔吸附树脂动态吸附步骤中，所述乙醇水溶液的体积百分浓度为95%，吸附时间为8小时；所述乙醇水溶液的用量为所述大孔吸附树脂体积的2倍；洗脱速率为1.5mL/min；

3）将步骤1）所得已提取过绿原酸的葵花粕粉碎后用氯化钠水溶液进行盐提，收集上清液进行离心后用酸度调节剂调节pH值后进行沉淀，收集沉淀得到葵花蛋白；所述粉碎后的目数为20—150目；所述氯化钠水溶液的浓度为1.5mol/L；所述调节pH值步骤中，pH值的终值为7.5；所述盐提步骤中，温度35℃；粉碎后的所述步骤1）所得已提取过绿原酸的葵花粕与所述氯化钠水溶液的用量比为0.3g：1mL。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1）粉碎步骤中，粉碎后的目数为50目。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤3）中，粉碎后的目数为60目；所述离心步骤中，转速为1000-5000r/min，时间为5-10分钟；所述酸度调节剂为1%的盐酸水溶液。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述由葵花粕中同时提取绿原酸和葵花蛋白的方法，还包括如下步骤：在所述步骤1）之后，所述步骤2）之前，将所述步骤1）所得绿原酸粗提液进行过滤、浓缩、静置和离心取上清液。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述将步骤1）所得绿原酸粗提液进行过滤、浓缩、静置和离心步骤中，所述过滤步骤中，滤孔直径为50-300目；所述浓缩步骤中，温度为50-70℃，浓缩倍数为2-5倍；所述静置步骤中，温度为0-4℃，时间为12-24小时；所述离心步骤中，转速为3000-5000r/min，时间为5-10分钟。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述将步骤1）所得绿原酸粗提液进行过滤、浓缩、静置和离心步骤中，所述过滤步骤中，滤孔直径为200目；所述浓缩步骤中，温度为55℃，浓缩倍数为4倍；所述静置步骤中，温度为0℃，时间为12小时；所述离心步骤中，转速为3000r/min，时间为7分钟。

7.根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于：所述由葵花粕中同时提取绿原酸和葵花蛋白的方法，还包括如下步骤：在所述步骤3）之后，将所述用酸度调节剂进行沉淀后的沉淀物进行脱盐和干燥，得到所述葵花蛋白。