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CN102482674B - 制备具有高唾液酸含量的重组糖蛋白的方法 - Google Patents

制备具有高唾液酸含量的重组糖蛋白的方法 Download PDF

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CN102482674B CN201180003414.4A CN201180003414A CN102482674B CN 102482674 B CN102482674 B CN 102482674B CN 201180003414 A CN201180003414 A CN 201180003414A CN 102482674 B CN102482674 B CN 102482674B
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Abstract

本申请涉及制备具有高唾液酸含量的重组糖蛋白的方法。具体而言，对于UDP-GlcNAc 2-表异构酶/ManNAc激酶(GNE/MNK)酶(该酶中，通过仅用亮氨酸取代263位的精氨酸、或通过进一步用谷氨酰胺取代266位的精氨酸诱导了点突变)而言，该酶的表异构酶活性维持不变，不受CMP-唾液酸浓度的影响，并且，过表达该酶的细胞的胞内单磷酸胞苷(CMP)-唾液酸含量得以提高。特别是，由于在产生糖蛋白(如促红细胞生成素和促血小板生成素)的宿主细胞中(在该宿主细胞中，人α-2，3-唾液酸转移酶基因、CMP-唾液酸转运体基因和诱导有点突变的GNE/MNK基因同时得到过表达)，细胞中的胞内CMP-唾液酸含量和糖蛋白中的唾液酸提高，因此，在产生唾液酸化重组糖蛋白的宿主细胞中，上述3种基因的过表达可用于制备唾液酸含量提高的糖蛋白。

Description

制备具有高唾液酸含量的重组糖蛋白的方法
技术领域
本申请涉及制备具有高唾液酸含量的重组糖蛋白的方法。
背景技术
唾液酸(Sia，NeuAc，NeuGc)是对神经氨酸(Neu)的酰基衍生物的通称。唾液酸最早由Blix在1936年从牛唾液腺的粘蛋白中分离出，它是包含9个碳并具有COOH基团的酸性糖。根据取代基团的不同，已经报道了50种唾液酸(Angata，T.和Varki，A.，Chem.Rev，102，439-469，2002)，已知这50种唾液酸在不同的物种和组织中特异地分布。在高等动物中，通过各自的特异性唾液酸转移酶的反应，唾液酸经α-糖苷键连接至糖蛋白、糖脂及寡糖聚糖的Gal、GlcNAc、GalNAc和唾液酸。
由于糖缀合聚糖的唾液酸位于聚糖结构的末端，而该末端存在于细胞膜表面上，已预期唾液酸直接参与细胞与胞外环境之间的接触，并且近期已知通过去除唾液酸缩短了体液中的血细胞或糖蛋白的寿命。例如，当去除红细胞膜上的唾液酸(脱唾液酸化作用(asialylation))时，半乳糖暴露于细胞表面上并结合至枯否细胞(Kupffer cell)表面上的受体凝集素，该凝集素特异地结合至半乳糖。由此，通过受体介导的胞吞作用，半乳糖被从循环系统中去除，而已去除唾液酸的脱唾液酸糖蛋白也被肝细胞表面上的凝集素结合，并被以类似于红细胞的上述方式从循环系统中去除。此外，对于α-抗胰蛋白酶、胆碱酯酶、绒毛膜促性腺激素、CTLA4Ig、第八因子(Factor VIII)、γ-谷氨酰转移酶、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和促黄体生成激素(LH)这些唾液酸化糖蛋白，据报道与未结合唾液酸的糖蛋白相比，结合有唾液酸的糖蛋白半衰期显著延长(Ngantung FA.等，2006，Biotechnol.Bioeng，95(1)，106，106-119)。
特别地，在唾液酸化糖蛋白中，促红细胞生成素(EPO)是诱导红细胞生成的糖蛋白激素，重组促红细胞生成素正被用作贫血的治疗剂。野生型促红细胞生成素含有3个N-聚糖和1个O-聚糖。由于1个N-聚糖最多可结合4个唾液酸且1个O-聚糖最多可结合2个唾液酸，1个促红细胞生成素分子有可能一共结合14个唾液酸。结合有聚糖的唾液酸阻断了存在于肝中的脱唾液酸糖蛋白受体的结合，从而防止了肝中促红细胞生成素的分解。
促血小板生成素(TPO)是类似于EPO的激素，主要由肝和肾产生，TPO调节骨髓中的血小板生成。TPO由332个氨基酸组成，分子量大约为80～100kDa，具有6个N-聚糖和24个O-聚糖。起始的155个氨基酸与EPO非常类似，就如EPO的糖蛋白而言，聚糖的唾液酸含量显著地影响了该蛋白的体内稳定性。通过用唾液酸酶从EPO中去除全部唾液酸后，观察到EPO体内活性显著下降而证实了上述事实(Takeuchi M等，1989，Proc Natl Acad Sci，7819-22)。对于EPO而言，聚糖的结构具有四天线、四唾液酸化及核心岩藻糖基化的形式，就重组人TPO而言，各种聚糖结构具有二天线或异源的形式(Inous N等，1999，Glycoconjugate Journal，16，707-718)。
因此，糖蛋白的唾液酸含量提高越多，糖蛋白在体内的半衰期就变得越长(Fukuda，M.N.等，1989，Blood，73，84-89；Sinclair，A.M.等，2005，J.Pharm.Sci.，94，1626-1635)。因此，唾液酸含量的提高对于治疗性糖蛋白的品质和生物等效性而言是必需的。
因此，本发明人等研究了通过提高唾液酸化糖蛋白(如促红细胞生成素和促血小板生成素)的唾液酸含量来增强内在活性的方法。结果，本发明人等通过在产生人促红细胞生成素或促血小板生成素的细胞中同时过表达CMP-唾液酸转运体(CMP-SAT)、α-2，3-唾液酸转移酶和诱导有点突变的UDP-GlcNAc 2-表异构酶/ManNAc激酶(GNE/MNK)，并鉴定出促红细胞生成素和促血小板生成素的唾液酸含量相比于野生型的唾液酸含量显著提高而完成了本发明。
发明内容
本发明一个目的是提供制备具有高唾液酸含量的重组糖蛋白的方法。
为实现所述目的，本发明提供了制备唾液酸含量提高的糖蛋白的方法，所述方法包括：
1)制备包含编码UDP-GlcNAc 2-表异构酶/ManNAc激酶(GNE/MNK)的基因、编码α-2，3-唾液酸转移酶的基因以及编码单磷酸胞苷(CMP)-唾液酸转运体的基因的表达载体，所述GNE/MNK具有SEQ ID NO：1所表示的氨基酸序列中的263位氨基酸或266位氨基酸被取代的氨基酸序列，所述α-2，3-唾液酸转移酶具有SEQ ID NO：4所表示的氨基酸序列，所述CMP-唾液酸转运体具有SEQ ID NO：5所表示的氨基酸序列；
2)将步骤1)中的所述表达载体转染入产生唾液酸化糖蛋白的宿主细胞中以制备转染子；以及
3)孵育步骤2)中的所述转染子以从所述转染子中纯化出重组糖蛋白。
本发明也提供了通过所述方法制备的唾液酸含量提高的糖蛋白。
本发明还提供了制备胞内CMP-唾液酸含量提高的细胞的方法，所述方法包括：
1)制备包含编码GNE/MNK的基因、编码α-2，3-唾液酸转移酶的基因以及编码CMP-唾液酸转运体的基因的表达载体，所述GNE/MNK具有SEQ ID NO：1所表示的氨基酸序列中的263位氨基酸或266位氨基酸被取代的氨基酸序列，所述α-2，3-唾液酸转移酶具有SEQ ID NO：4所表示的氨基酸序列，所述CMP-唾液酸转运体具有SEQ ID NO：5所表示的氨基酸序列；以及
2)将步骤1)中的表达载体转染入宿主细胞中以制备转染子。
本发明也提供了制备胞内CMP-唾液酸含量提高的细胞的方法，所述方法包括：
1)制备包含编码GNE/MNK的基因的表达载体，所述GNE/MNK具有SEQ ID NO：1所表示的氨基酸序列中的263位氨基酸或266位氨基酸被取代的氨基酸序列；以及
2)将步骤1)中的所述表达载体转染入宿主细胞中以制备转染子。
本发明也提供了通过所述方法制备的胞内CMP-唾液酸含量提高的细胞。
在产生糖蛋白的宿主细胞中，同时过表达人α-2，3-唾液酸转移酶基因、CMP-唾液酸转运体基因和诱导有点突变的GNE/MNK基因。所述诱导有点突变的GNE/MNK基因仅用亮氨酸取代263位的精氨酸，或进一步用谷氨酰胺或色氨酸取代266位的精氨酸。因此，由于宿主细胞中的胞内CMP-唾液酸含量及促红细胞生成素和促血小板生成素中的唾液酸增加，在产生唾液酸化重组糖蛋白的宿主细胞中过表达上述3种基因可用于制备相比于野生型糖蛋白而言唾液酸含量提高的糖蛋白。
附图说明
从与附图结合的下列详细描述中，将更清楚地理解本发明的上述和其它目的、特征和其它优点，其中：
图1为表示所制备的用于在微生物中过表达诱导有突变的UDP-GlcNAc 2-表异构酶/ManNAc激酶(GNE/MNK)酶的表达载体的图；
图2为表示随CMP-唾液酸浓度的GNE/MNK表异构酶活性的图表(A)和表示根据各点突变诱导的表异构酶的相对比活性的图表(B)；
图3为表示所制备的用于在中国仓鼠卵巢细胞中过表达α-2，3-唾液酸转移酶的表达载体的图；
图4为表示所制备的用于在中国仓鼠卵巢细胞中过表达CMP-唾液酸转运体的表达载体的图；
图5为表示所制备的用于在中国仓鼠卵巢细胞中过表达诱导有点突变的GNE/MNK基因的表达载体的图；
图6为表示通过RT-PCR鉴定转染入中国仓鼠卵巢细胞中的点突变的GNE/MNK基因的表达的图；
图7为表示过表达了点突变的GNE/MNK基因的胞内CMP-唾液酸含量的图表；
图8为表示转染入中国仓鼠卵巢细胞中的α-2，3-唾液酸转移酶基因(A)和点突变的GNE/MNK基因(B)的表达的图；
图9为表示转染了点突变的GNE/MNK基因、人α-2，3-唾液酸转移酶基因和CMP-唾液酸转运体基因的中国仓鼠卵巢细胞中的CMP-唾液酸转运体的转录产物成倍增长的图表；
图10为表示转染了点突变的GNE/MNK基因、人α-2，3-唾液酸转移酶基因和CMP-唾液酸转运体基因的中国仓鼠卵巢细胞中的胞内CMP-唾液酸含量的图表；
图11为表示转染了点突变的GNE/MNK基因、人α-2，3-唾液酸转移酶基因和CMP-唾液酸转运体基因的中国仓鼠卵巢细胞中通过等电聚焦(IEF)迁移到负电荷处的促红细胞生成素亚型的图；
图12为表示转染了点突变的GNE/MNK基因、人α-2，3-唾液酸转移酶基因和CMP-唾液酸转运体基因的中国仓鼠卵巢细胞中的重组促红细胞生成素的唾液酸含量的图表；以及
图13为表示由阴离子交换HPLC得到的促红细胞生成素的N-连接型聚糖的唾液酸化图谱的图。
具体实施方式
在下文中，将对本发明进行详细描述。
本发明提供了制备唾液酸含量提高的糖蛋白的方法。
上述方法优选包括、但不限于以下步骤：
1)制备包含编码UDP-GlcNAc 2-表异构酶/ManNAc激酶(GNE/MNK)的基因、编码α-2，3-唾液酸转移酶的基因以及编码单磷酸胞苷(CMP)-唾液酸转运体的基因的表达载体，所述GNE/MNK具有SEQ ID NO：1所表示的氨基酸序列中的263位氨基酸或266位氨基酸被取代的氨基酸序列，所述α-2，3-唾液酸转移酶具有SEQ ID NO：4所表示的氨基酸序列，所述CMP-唾液酸转运体具有SEQ ID NO：5所表示的氨基酸序列；
2)将步骤1)中的所述表达载体转染入产生唾液酸化糖蛋白的宿主细胞中以制备转染子；以及
3)孵育步骤2)中的所述转染子以从所述转染子中纯化出重组糖蛋白。
所述糖蛋白优选为选自于由促红细胞生成素、促血小板生成素、α-抗胰蛋白酶、胆碱酯酶、绒毛膜促性腺激素、CTLA4Ig、第八因子、γ-谷氨酰转移酶、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和促黄体生成激素(LH)所组成的组中的一种，更优选为促红细胞生成素或促血小板生成素，但不限于此。
在上述方法中，在步骤1)中的GNE/MNK中，优选、但不限于由亮氨酸取代其263位的精氨酸。在所述GNE/MNK中，优选、但不限于由谷氨酰胺或色氨酸取代其266位的精氨酸。在所述GNE/MNK中，更优选由亮氨酸取代其263位的精氨酸且优选由谷氨酰胺或色氨酸取代其266位的精氨酸，但不限于此。
在上述方法中，步骤2)中的宿主细胞优选为选自于由酵母细胞、哺乳动物细胞和昆虫细胞所组成的组中的一种，但不限于此。
所述哺乳动物细胞优选为选自于由中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、HT-1080、人类淋巴母细胞、SP2/0(小鼠骨髓瘤细胞)、NS0(小鼠骨髓瘤细胞)、幼仓鼠肾细胞(BHK)、人胚肾细胞(HEK)、PERC.6(人视网膜细胞)所组成的组中的一种，更优选为CHO，但不限于此。
在具有263位氨基酸或266位氨基酸被取代的氨基酸序列的GNE/MNK中，表异构酶活性优选得以维持但并不限于此，而不受CMP-唾液酸浓度的影响。
传统地，由患有遗传性代谢途径疾病(如唾液酸尿症(sialuria))的患者的遗传分析结果，报道了在UDP-GlcNAc 2-表异构酶/ManNAc激酶(GNE/MNK)基因中出现了由263位的精氨酸氨基酸突变为亮氨酸、或由266位的精氨酸氨基酸突变为谷氨酰胺或色氨酸的点突变(R263L、和R266Q或R266W)，该位点为表异构酶的变构位点。由于CMP-唾液酸在正常状态细胞中积聚，表异构酶的反馈抑制由于所述点突变而消失，鉴定出唾液酸过度合成并超出需求地积聚(Seppala，R.等，1999，Am.J.Hum.Genet.，64，1563-1569)。然而，由于一直没有通过利用表异构酶的反馈抑制来提高糖蛋白(如促红细胞生成素和促血小板生成素)的唾液酸含量的研究，本发明人等意在研究出通过利用GNE/MNK基因的点突变来提高结合有唾液酸的糖蛋白的唾液酸含量的方法。
本发明人等意在通过对UDP-GlcNAc 2-表异构酶/ManNAc激酶(GNE/MNK)的点突变鉴定出对该酶的表异构酶活性的影响，UDP-GlcNAc 2-表异构酶/ManNAc激酶参与唾液酸的合成代谢途径。因此，本发明人等通过用亮氨酸取代野生型GNE/MNK基因263位的精氨酸、通过用谷氨酰胺或色氨酸取代GNE/MNK基因266位的精氨酸、或通过用亮氨酸取代野生型GNE/MNK基因263位的精氨酸并用谷氨酰胺或色氨酸取代GNE/MNK基因266位的精氨酸诱导点突变(参见图1)，并将其插入表达载体中以在大肠杆菌中过表达。纯化过表达的GNE/MNK酶后，测定表异构酶活性。结果，对于诱导了点突变的各类GNE/MNK，显示其表异构酶活性维持不变，而不受CMP-唾液酸浓度提高的影响，这一点不同于野生型GNE/MNK(参见图2)。因此，发现相比于正常状态细胞，表达点突变的GNE/MNK酶的细胞可合成并积聚更多的CMP-唾液酸。
为了鉴定由点突变的GNE/MNK过表达引起的CMP-唾液酸含量的变化，本发明人等制备了点突变的GNE/MNK(R263L或R263L-R266Q)的表达载体(参见图5)，将该表达载体转染入中国仓鼠卵巢细胞中并在该细胞中过表达所述表达载体，所述中国仓鼠卵巢细胞为产生重组促红细胞生成素的宿主细胞。结果，通过聚合酶链式反应(PCR)鉴定了所述宿主细胞中的点突变的GNE/MNK基因的过表达(参见图6)，在聚糖末端唾液酸化中用作底物的CMP-唾液酸的胞内含量相比于野生型宿主细胞显示出提高(参见图7)。
本发明人等意在研究由α-2，3-唾液酸转移酶、CMP-唾液酸转运体和点突变的GNE/MNK的过表达引起的糖蛋白唾液酸含量的变化，所述α-2，3-唾液酸转移酶为将唾液酸连接至N-连接型聚糖的半乳糖残基的酶。因此，本发明人等制备了所述α-2，3-唾液酸转移酶、CMP-唾液酸转运体和点突变的GNE/MNK的表达载体(参见图3、图4和图5)，将所述表达载体转染入中国仓鼠卵巢细胞中并在该细胞中过表达所述表达载体，所述中国仓鼠卵巢细胞为产生重组促红细胞生成素或促血小板生成素的宿主细胞。结果，通过PCR鉴定了所述全部3种基因的过表达(参见图8和图9)，并且胞内CMP-唾液酸含量显示出提高(参见图10)。为了根据从所述细胞中纯化的促红细胞生成素的分子电荷总量鉴定亚型，在导入了所述3种基因的细胞系中进行等电聚焦(IEF)分析，由于唾液酸含量的提高，所有亚型都迁移至负极(参见图11)。此外，相比于野生型细胞，产生的重组促红细胞生成素和促血小板生成素的唾液酸含量显示出显著的提高(参见图12)。另外，为了更准确地分析促红细胞生成素的N-连接型聚糖中唾液酸的结合形式，作为通过阴离子交换HPLC进行的N-连接型聚糖唾液酸化图谱分析的结果，本发明人鉴定出，在导入了所述3种基因的细胞系中，中性唾液酸化聚糖和单唾液酸化聚糖的比例显著降低，而四唾液酸化聚糖的比例大幅提高(图13)。因此，已发现通过将α-2，3-唾液酸转移酶、CMP-唾液酸转运体和点突变的GNE/MNK导入产生重组促红细胞生成素或促血小板生成素的细胞中，胞内CMP-唾液酸含量提高，促红细胞生成素和促血小板生成素的唾液酸含量也由此提高。
因此，通过在产生唾液酸化重组糖蛋白的宿主细胞中过表达α-2，3-唾液酸转移酶、CMP-唾液酸转运体和点突变的GNE/MNK，将α-2，3-唾液酸转移酶、CMP-唾液酸转运体和点突变的GNE/MNK用于制备唾液酸含量提高的糖蛋白。
此外，本发明提供了通过所述方法制备的唾液酸含量提高的糖蛋白。
所述唾液酸含量提高的糖蛋白优选为选自于由促红细胞生成素、促血小板生成素、α-抗胰蛋白酶、胆碱酯酶、绒毛膜促性腺激素、CTLA4Ig、第八因子、γ-谷氨酰转移酶、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和促黄体生成激素(LH)所组成的组中的一种，更优选为促红细胞生成素或促血小板生成素，但不限于此。
所述唾液酸含量提高的糖蛋白优选、但不限于唾液酸/糖蛋白的摩尔比为7。
在产生促红细胞生成素或促血小板生成素的宿主细胞中同时过表达人α-2，3-唾液酸转移酶、CMP-唾液酸转运体和GNE/MNK，在该GNE/MNK中，通过用亮氨酸取代263位的精氨酸、或通过用亮氨酸取代263位的精氨酸并用谷氨酰胺或色氨酸取代266位的精氨酸诱导了点突变。由于在所述产生促红细胞生成素或促血小板生成素的宿主细胞中，胞内CMP-唾液酸含量以及促红细胞生成素和促血小板生成素的唾液酸含量提高，通过过表达所述3种基因制备的唾液酸化糖蛋白可以有用地用作唾液酸含量提高的糖蛋白。
此外，本发明提供了制备胞内CMP-唾液酸含量提高的细胞的方法。
所述方法包括、但不限于以下步骤：
1)制备包含编码GNE/MNK的基因、编码α-2，3-唾液酸转移酶的基因以及编码CMP-唾液酸转运体的基因的表达载体，所述GNE/MNK具有SEQ ID NO：1所表示的氨基酸序列中的263位氨基酸或266位氨基酸被取代的氨基酸序列，所述α-2，3-唾液酸转移酶具有SEQ ID NO：4所表示的氨基酸序列，所述CMP-唾液酸转运体具有SEQ ID NO：5所表示的氨基酸序列；以及
2)将步骤1)中的表达载体转染入宿主细胞中以制备转染子。
进一步地，所述方法包括、但不限于以下步骤：
1)制备包含编码GNE/MNK的基因的表达载体，所述GNE/MNK具有SEQ ID NO：1所表示的氨基酸序列中的263位氨基酸或266位氨基酸被取代的氨基酸序列；以及
2)将步骤1)中的表达载体转染入宿主细胞中以制备转染子。
在上述方法中，优选、但不限于由亮氨酸取代步骤1)中263位的精氨酸。在所述GNE/MNK中，优选、但不限于由谷氨酰胺或色氨酸取代266位的精氨酸。在所述GNE/MNK中，优选由亮氨酸取代263位的精氨酸并优选由谷氨酰胺或色氨酸取代266位的精氨酸，但不限于此。
在上述方法中，步骤2)中的宿主细胞优选为选自于由酵母细胞、哺乳动物细胞和昆虫细胞所组成的组中的一种，但不限于此。
所述哺乳动物细胞优选为选自于由中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、HT-1080、人类淋巴母细胞、SP2/0(小鼠骨髓瘤细胞)、NS0(小鼠骨髓瘤细胞)、幼仓鼠肾细胞(BHK)、人胚肾细胞(HEK)、PERC.6(人视网膜细胞)所组成的组中的一种，更优选为CHO，但不限于此。
CMP-唾液酸为唾液酸的活性形式，应在细胞中维持高水平以提高糖蛋白的唾液酸含量。
在将α-2，3-唾液酸转移酶、CMP-唾液酸转运体和点突变的GNE/MNK的表达载体转染入产生重组促红细胞生成素或促血小板生成素的宿主细胞中国仓鼠卵巢细胞中后，与野生型宿主细胞相比，其胞内CMP-唾液酸含量显著提高。在将点突变的GNE/MNK的表达载体转染入产生促红细胞生成素的中国仓鼠卵巢细胞中后，相比于野生型宿主细胞，其胞内CMP-唾液酸含量显著提高。在天然型GNE/MNK中，已知当唾液酸的胞内前体CMP-唾液酸的浓度提高时，由于通过反馈抑制机制抑制了天然型UDP-GlcNAc 2-表异构酶的活性，最终阻止了唾液酸的合成。如上所述，通过取代GNE/MNK的特定氨基酸序列，由于唾液酸合成途径中的活性得以维持并且由CMP-唾液酸引起的反馈抑制机制不起作用，因而胞内的CMP-唾液酸得以充分维持。
因此，通过在产生唾液酸化重组糖蛋白的宿主细胞中过表达α-2，3-唾液酸转移酶、CMP-唾液酸转运体和点突变的GNE/MNK；或通过过表达点突变的GNE/MNK，可将α-2，3-唾液酸转移酶、CMP-唾液酸转运体和点突变的GNE/MNK有用地用于制备胞内CMP-唾液酸含量提高的细胞。
此外，本发明提供了通过所述方法制备的CMP-唾液酸含量提高的细胞。
在将α-2，3-唾液酸转移酶、CMP-唾液酸转运体和GNE/MNK(该GNE/MNK通过用亮氨酸取代263位的精氨酸、或通过用亮氨酸取代263位的精氨酸且用谷氨酰胺或色氨酸取代266位的精氨酸诱导了点突变)的表达载体转染入产生重组促红细胞生成素或促血小板生成素的宿主细胞中国仓鼠卵巢细胞中后，与野生型宿主细胞相比，其胞内CMP-唾液酸含量显著提高。在将点突变的GNE/MNK的表达载体转染入产生促红细胞生成素的中国仓鼠卵巢细胞中后，与野生型宿主细胞相比，其胞内CMP-唾液酸含量显著提高。如上所述，通过取代GNE/MNK的特定氨基酸序列，胞内的CMP-唾液酸得以充分维持。
因此，通过在产生唾液酸化重组糖蛋白的宿主细胞中过表达α-2，3-唾液酸转移酶、CMP-唾液酸转运体和点突变的GNE/MNK；或通过过表达点突变的GNE/MNK所制备的细胞可有用地用作胞内CMP-唾液酸含量提高的细胞。
实施例
下文将参考以下实施例和实验实施例来更加详细地描述本发明。
然而，以下实施例和实验实施例仅为说明性目的提供，并不应以任何方式限定本发明的范围。
实施例1：UDP-GlcNAc 2-表异构酶/ManNAc激酶(GNE/MNK)基因的点突变诱导
<1-1>GNE/MNK基因263位氨基酸或266位氨基酸的取代
通过利用正向引物(5′-ATGGAGAAGAACGGGAATAACCGG-3′，SEQ ID NO：6)和反向引物(5′-CTAGTGGATCCTGCGGGTCGTGTAG-3′，SEQ ID NO：7)经PCR从褐家鼠(Rattus norvegicus)的肝组织(从KoreaAdvanced Institute of Science and Technology获得)中扩增野生型GNE/MNK基因(SEQ ID NO：1)，然后，通过表1中所示的诱导点突变的引物和QuickChange Site-Directed Mutagenesis试剂盒(Stratagene)，利用用于点突变的正向引物(5′-GGAGATGGTTCTAGTGATGCGAAG-3′，SEQ ID NO：8)和反向引物(5′-CCTCTACCAAGATCACTACGCCTTC-3′，SEQ ID NO：9)，用亮氨酸取代263位的精氨酸(SEQ ID NO：2)；或用谷氨酰胺或色氨酸取代266位的精氨酸。
<1-2>GNE/MNK基因263位氨基酸或266位氨基酸的取代
根据上述实施例<1-1>的方法，利用正向引物(5′-ATGGAGAAGAACGGGAATAACCGG-3′，SEQ ID NO：6)和反向引物(5′-CTAGTGGATCCTGCGGGTCGTGTAG-3′，SEQ ID NO：7)经PCR扩增野生型GNE/MNK基因(SEQ ID NO：1)，然后，通过表1中所示的诱导点突变的引物，使用用于点突变的另一正向引物(5′-GGAGATGGTCTAGTGATGCAGAAG-3′，SEQ ID NO：10)和反向引物(5′-CCTCTACCAAGATCACTACGTCTTC-3′，SEQ ID NO：11)，用亮氨酸取代263位的精氨酸并用谷氨酰胺取代266位的精氨酸(SEQ IDNO：3)；或用亮氨酸取代263位的精氨酸并用色氨酸取代266位的精氨酸。
表1用于诱导唾液酸尿症样点突变的引物序列
Figure BDA0000136898090000121
<1-3>诱导有点突变的GNE/MNK的微生物中的表达载体的制备
使用5′端添加了NdeI限制性酶切位点、3′端添加了XhoI限制性酶切位点的正向引物(5′-AATTCATATGATGGAGAAGAACGGGAATAACCGG-3′，SEQ ID NO：12)和反向引物(5′-AATCTCGAGGTGGATCCTGCGGGTCGTC-3′，SEQ ID NO：13)。由此通过PCR在实施例<1-1>和实施例<1-2>中制备的诱导有突变的GNE/MNK基因和野生型GNE/MNK基因的末端形成NdeI位点或XhoI位点。通过将诱导有突变的GNE/MNK基因或野生型GNE/MNK基因连接至pET-21a的NdeI/XhoI位点(pET-21a是用于在微生物中进行蛋白过表达和组氨酸标签的载体)，制备如图1中所示的pET-21-rEK(野生型)表达载体、pET-21-rEK-R263L(263位的精氨酸被亮氨酸取代的基因)表达载体、pET-21-rEK-R266Q(266位的精氨酸被谷氨酰胺取代的基因)表达载体、pET-21-rEK-R266W(266位的精氨酸被色氨酸取代的基因)表达载体、pET-21-rEK-R3LR6Q(263位的精氨酸被亮氨酸取代且266位的精氨酸被谷氨酰胺取代的基因)表达载体和pET-21-rEK-R3LR6W(263位的精氨酸被亮氨酸取代且266位的精氨酸被色氨酸取代的基因)表达载体。
<1-4>诱导有突变的GNE/MNK的活性测定
将实施例<1-3>中制备的包含野生型GNE/MNK基因或诱导有突变的GNE/MNK基因的载体导入大肠杆菌BL21中用于蛋白过表达。注射0.3mM IPTG并以200rpm在20℃下孵育6h，由此过表达GNE/MNK。通过离心收集过表达的细胞，并使用声波细胞破碎仪进行裂解。离心后，在室温下用Ni-NTA琼脂糖(Qiagen)孵育裂解细胞的上清液1h。接下来，通过用洗脱缓冲液(pH 8.0，50mM Na2HPO4，0.1mM MEDTA，300mMNaCl和100mM咪唑)进行洗脱来纯化大鼠GNE/MNK。在纯化的大鼠GNE/MNK中，测定其表异构酶活性。将45mM Na2HPO4(pH 7.5)、1mMUDP-GlcNAc和洗脱液的混合物在37℃下反应30min，并通过煮沸终止反应。使用Morgan-Elson法测定产生的N-乙酰甘露糖胺的浓度。离心后，将反应上清液与0.8M硼酸盐缓冲液混合并在100℃下反应3min。然后，将其与DMAB溶液(在具有1.25％10M HCl的乙酸中的1％(w/v)的4-二甲氨基苯甲醛)混合并在37℃下孵育30min。通过光谱测定法在578nm测定最终混合物的吸光度。为了鉴定CMP-唾液酸对表异构酶的活性调控，对各种浓度的CMP-唾液酸进行处理并反应，假定初始活性为100，CMP-唾液酸活性的变化取决于CMP-唾液酸浓度的变化。
结果，如图2所述，对于诱导有点突变的大鼠GNE/MNK，尽管CMP-唾液酸的浓度提高，表异构酶活性显示维持不变，这一点与野生型的情况不同。由此鉴定出了各点突变的表异构酶的相对活性(图2)。
实施例2：表达载体的制备
<2-1>α-2，3-唾液酸转移酶的表达载体的制备
使用5′端添加了BamHI限制性酶切位点、3′端添加了HindIII限制性酶切位点的正向引物(5′-ATGGGACTCTTGGT-3′，SEQ ID NO：14)和反向引物(5′-TCAGATGCCACTGCTTAG-3′，SEQ ID NO：15)，经聚合酶链式反应(PCR)从人成纤维细胞系(HF细胞系)中扩增人α-2，3-唾液酸转移酶。如图3中所示，为了将所扩增的基因导入作为宿主细胞的中国仓鼠卵巢细胞中，将所扩增的基因连接到表达载体pcDNA3.1/Zeo(+)的BamHI/HindIII位点以制备表达载体pcSTz(图3)。
<2-2>单磷酸胞苷(CMP)-唾液酸转运体的表达载体的制备
使用5′端添加了NheI限制性酶切位点、3′端添加了EcoRI限制性酶切位点的正向引物(5′-CAGCTAGCGCCACCATGGCTCAGG-3′，SEQ IDNO：16)和反向引物(5′-TCCGAATTCTCACACACCAATGACTC-3′，SEQID NO：17)，经PCR从中国仓鼠卵巢细胞(EC2-1H9：从Korea ResearchInstitute of Bioscience and Biotechnology获得)中扩增单磷酸胞苷(CMP)-唾液酸转运体。由此将NheI酶切位点或EcoRI酶切位点添加到所述基因的两个末端。如图4中所示，将所扩增的基因连接到pcDNA3.1/Zeo(+)的NheI/EcoRI位点以制备表达载体pcCSATz(图4)。
<2-3>诱导有点突变的GNE/MNK的表达载体的制备
通过使用5′端添加了NotI限制性酶切位点、3′端添加了XhoI限制性酶切位点的引物，经PCR将NotI限制性酶切位点或XhoI限制性酶切位点添加到诱导有点突变的GNE/MNK基因的两个末端。如图5中所示，将所扩增的诱导有点突变的GNE/MNK基因连接到pREP4/Hig.B(+)表达载体的NotI/XhoI位点以制备表达载体pREP4-rEK-R263L和pREP-rEK-R263L-R266Q(pREP-rEK-R3LR6Q)(图5)。
实施例3：由诱导有点突变的GNE/MNK基因的过表达引起的唾液酸含量变化的鉴定
<3-1>将诱导有点突变的GNE/MNK基因的表达载体导入中国仓鼠卵巢细胞中
通过使用LipofectamineTMLTX和PLUSTM试剂(Invitrogen)，将在实施例<2-3>中产生的载体分别转染入中国仓鼠卵巢细胞中，所述中国仓鼠卵巢细胞为产生重组促红细胞生成素的宿主细胞。将在培养基(包含400μg/ml潮霉素B、10％dFBS、1％抗生素-抗真菌素、20nM MTX的MEM-α培养基)中培养的经转染的中国仓鼠卵巢细胞在具有5％CO2和37℃条件的培养箱中孵育，并对存活细胞进行重复筛选和传代培养。
<3-2>GNE/MNK基因表达的鉴定
为了鉴定导入实施例<3-1>所筛选的细胞中的GNE/MNK基因的表达，使用TRIzol试剂(Invitrogen)从培养的细胞中分离出总RNA。通过RT-PCR鉴定基因表达。对于RT-PCR，使用用于鉴定诱导有突变的GNE/MNK表达的正向引物(5′-GACCACCGACATTAAGCATTC-3′，SEQID NO：18)和反向引物(5′-GCGTCACAAAGTTCTCCTGTC-3′，SEQ IDNO：19)。
结果，如图6中所示，在转染了pREP4-rEK-R263L和pREP4-rEK-R263L-R266Q的中国仓鼠卵巢细胞中，鉴定出点突变的GNE/MNK基因(EC2-1H9-rEK-R263L、EC2-1H9-rEk-R263L II-7、EC2-1H9-rEK-R263L II-12、EC2-1H9-rEk-R263L-R266Q 4、EC2-1H9-rEK-R263L-R266Q 7和EC2-1H9-rEK-R263L-R266Q II-1)的显著高表达(图6)。
<3-3>重组促红细胞生成素的制备和纯化
把所述细胞注入T-175烧瓶后培养3天，并在用无血清培养基(CHO-S-SFM II，Sigma)进行替换后孵育48h以得到培养基。将所得培养基通过超滤浓缩，并通过免疫亲合层析纯化重组促红细胞生成素。
<3-4>胞内CMP-唾液酸的定量
在使用声波细胞破碎仪裂解预定数量的细胞来提取胞内的CMP-唾液酸后，使用CarboPac PA-1和PA-1保护柱(Dionex，Sunnyvale，CA)进行HPLC分析。为了与加入N-乙酰甘露糖胺的方法进行比较，在相同条件下，向具有野生型细胞系的SFM中添加5.0mM ManNAc并孵育48h。测定并比较胞内的CMP-唾液酸浓度。
结果，如图7中所示，相比于野生型中国仓鼠卵巢细胞，转染了pREP4-rEK-R263L或pREP4-rEK-R263L-R266Q的细胞中显示出胞内CMP-唾液酸含量的提高。特别地，相比于野生型细胞，鉴定出EC2-1H9-rEK-R263L-R266Q II-1中的CMP-唾液酸含量显著提高。
实施例4：通过过表达人α-2，3-唾液酸转移酶基因、CMP-唾液酸转运体基因和诱导有点突变的GNE/MNK基因，对唾液酸含量的变化进行鉴定<4-1>将人α-2，3-唾液酸转移酶基因、CMP-唾液酸转运体基因和诱导有点突变的GNE/MNK基因的表达载体导入中国仓鼠卵巢细胞
使用LipofectamineTMLTX和PLUSTM试剂(Invitrogen)，将在<实施例2>中制备的3种表达载体转染入产生重组促红细胞生成素或促血小板生成素的中国仓鼠卵巢细胞中。将经转染的产生重组促红细胞生成素的中国仓鼠卵巢细胞在含有500μg/ml Zeoncin、400μg/ml潮霉素B、10％dFBS、1％抗生素-抗真菌素和20nM MTX的MEM-α培养基中培养，并将经转染的产生重组促血小板生成素的中国仓鼠卵巢细胞在含有300μg/ml Zeoncin、250μg/ml潮霉素B、10％dFBS、1％抗生素-抗真菌素和80nM MTX的IMDM培养基中培养，然后将所述细胞在具有5％CO2和37℃条件的培养箱中孵育，并对存活细胞进行重复筛选和传代培养。
<4-2>基因表达的鉴定
为了鉴定导入实施例<4-1>所筛选的细胞中的α-2，3-唾液酸转移酶基因、CMP-唾液酸转运体基因和GNE/MNK基因的表达，使用TRIzol试剂(Invitrogen)从所述培养的细胞中分离出总RNA。使用下述表2中的引物对，通过RT-PCR鉴定人α-2，3-唾液酸转移酶基因、CMP-唾液酸转运体基因和诱导有点突变的GNE/MNK基因的表达。此外，使用实时PCR鉴定中国仓鼠卵巢细胞中的CMP-唾液酸转运体基因的过表达。
表2
Figure BDA0000136898090000161
结果，如图8中所示，在转染了人α-2，3-唾液酸转移酶基因、CMP-唾液酸转运体基因和诱导有点突变的GNE/MNK基因的产生促红细胞生成素的宿主细胞中，鉴定出α-2，3-唾液酸转移酶(A)基因和诱导有点突变的GNE/MNK(B)基因的过表达(图8)。如图9中所示，与野生型宿主细胞中的CMP-唾液酸转运体转录产物相比，在转染了人α-2，3-唾液酸转移酶基因、CMP-唾液酸转运体基因和诱导有点突变的GNE/MNK基因的产生促红细胞生成素的宿主细胞中，显示出明显更高的CMP-唾液酸转运体转录产物的过表达量(图9)。此外，在转染了人α-2，3-唾液酸转移酶基因、CMP-唾液酸转运体基因和诱导有点突变的GNE/MNK(pREP4-rEK-R263L-R266Q)的产生促血小板生成素的宿主细胞中，鉴定出α-2，3-唾液酸转移酶基因、CMP-唾液酸转运体基因和诱导有点突变的GNE/MNK基因的过表达。
因此，发现在产生促红细胞生成素或促血小板生成素的宿主细胞中，通过转染诱导了所述3种基因的过表达。
<4-3>重组糖蛋白的制备和纯化
将经转染的产生重组促红细胞生成素或促血小板生成素的中国仓鼠卵巢细胞注入T-175烧瓶中并培养3天。在用SFM替换其培养基并孵育48h后得到培养基。将得到的培养基通过超滤浓缩并使用免疫亲合层析纯化重组促红细胞生成素和重组促血小板生成素。
<4-4>胞内CMP-唾液酸的定量
通过裂解预定数量的细胞提取胞内的CMP-唾液酸，并使用CarboPacPA-1和PA-1保护柱(Dionex，Sunnyvale，CA)进行HPLC分析。通过两次独立实验计算平均值和标准差。
结果，如图10中所示，相比于野生型宿主细胞，在转染了人α-2，3-唾液酸转移酶基因、CMP-唾液酸转运体基因和诱导有点突变的GNE/MNK基因全部三者的产生促红细胞生成素的宿主细胞中，显示出明显更高的胞内CMP-唾液酸含量(图10)。此外，相比于野生型宿主细胞，在转染了人α-2，3-唾液酸转移酶基因、CMP-唾液酸转运体基因和诱导有点突变的GNE/MNK基因全部三者的产生促血小板生成素的宿主细胞中，显示出高出10～12倍的胞内CMP-唾液酸含量。
<4-5>促红细胞生成素亚型的鉴定
为了根据促红细胞生成素的分子电荷总量分离并比较亚型，进行等电聚焦(IEF)分析。促红细胞生成素聚糖结构的唾液酸带负电荷，基于此，对促红细胞生成素中唾液酸含量的变化进行了鉴定。根据制造商的说明书，通过Novex预制IEF凝胶(pI 3～7，Invitrogen)，在pI 3～7的范围内，对10μg纯化的促红细胞生成素进行分离。通过考马斯亮蓝染色对分离的亚型进行显色，通过Multi gauge version 3.0软件对在pI 4.5以下中显示的亚型条带的强度比进行分析以定量比较。
结果，如图11中所示，由于唾液酸增多，在导入了人α-2，3-唾液酸转移酶基因、CMP-唾液酸转运体基因和诱导有点突变的GNE/MNK基因的宿主细胞中，鉴定出全部亚型迁移到了负电荷处。特别地，EC2-1H9-CTSTrEKm细胞系显示出最清楚的迁移(图11)。
<4-6>重组糖蛋白中唾液酸含量的分析
所纯化的重组促红细胞生成素或重组促血小板生成素的唾液酸均通过温和水解分离，并用邻苯二胺-2HCl(OPD)标记。使用C18-反相柱，通过HPLC分析对所述标记的唾液酸进行定量。通过两次独立实验计算平均值和标准差。
结果，如图12中所示，相比于未转染的野生型宿主细胞，在转染了人α-2，3-唾液酸转移酶基因、CMP-唾液酸转运体基因和诱导有点突变的GNE/MNK基因全部三者的宿主细胞中，显示出明显更高的促红细胞生成素结合的唾液酸含量。对于从EC2-1H9-CTSTrEKm 9细胞系中纯化的促红细胞生成素，鉴定出其唾液酸含量相比于野生型提高了约43％(图12)。此外，相比于未转染的野生型宿主细胞中的促血小板生成素结合的唾液酸含量，转染了人α-2，3-唾液酸转移酶基因、CMP-唾液酸转运体基因和诱导有点突变的GNE/MNK基因全部三者的宿主细胞中的促血小板生成素结合的唾液酸含量提高了约20～30％。
因此，鉴定出：通过所述3种基因的过表达，糖蛋白的唾液酸含量提高。
实施例5：促红细胞生成素的唾液酸化图谱的鉴定
进行唾液酸化图谱分析以更准确地分析促红细胞生成素的N-连接型聚糖的唾液酸化图谱。为了基于包含在各N-连接型聚糖中的唾液酸数量进行分析，使用阴离子交换柱(TSKegel DEAE-5PW，7.5mm×75mm，Tosh，Tokyo，Japan)，通过HPLC(Waters system)分析标记有2-AB的N-连接型聚糖。具体地，将20％的含水乙腈(E1)和250mM甲酸铵与pH 9.0的乙腈(E2)用于HPLC分析。流速为0.4ml/min，柱温为30℃。使用0％的E2分析5min，然后在35min内成比例地提高E2的浓度直至100％的E2来进行分析。使用荧光分析器(Model 474；Waters)以330nm发射波长/420nm激发波长进行分析。对可商购的标准2-AB-牛胎球蛋白N-连接型聚糖文库(GLYKO；ProZyme)一起进行分析，以基于唾液酸数的峰区的保留时间来确定各个峰的唾液酸数。通过两次独立实验计算平均值和标准差。
结果，如图13和下述表3中所示，在本发明的全部细胞系中，无唾液酸的中性唾液酸化聚糖(脱唾液酸化聚糖)和单唾液酸化聚糖的比例大幅降低，而四唾液酸化聚糖的比例大幅提高至32％。
表3通过阴离子交换HPLC分析的促红细胞生成素中的唾液酸化N-连接型聚糖的相对量
Figure BDA0000136898090000191
工业实用性
如上文所述，通过制备唾液酸含量(所述唾液酸含量在唾液酸化糖蛋白的体内半衰期方面起关键作用)提高的重组糖蛋白，可利用唾液酸含量提高的重组糖蛋白，通过阻止糖蛋白的体内降解，以有效的方式来开发并制备具有优良品质和优良生物等效性的糖蛋白。
Figure IDA0000136898170000011
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Claims (4)

1.制备唾液酸含量提高的糖蛋白的方法，所述方法包括：
1）制备包含编码UDP-GlcNAc2-表异构酶/ManNAc激酶（GNE/MNK）的基因、编码α-2,3-唾液酸转移酶的基因以及编码单磷酸胞苷（CMP）-唾液酸转运体的基因的表达载体，所述GNE/MNK由SEQID NO：1所表示的氨基酸序列中的263位的精氨酸被亮氨酸取代、且266位的精氨酸被谷氨酰胺取代的氨基酸序列构成，所述α-2,3-唾液酸转移酶由SEQ ID NO：4所表示的氨基酸序列构成，所述CMP-唾液酸转运体由SEQ ID NO：5所表示的氨基酸序列构成；
2）将步骤1）中的所述表达载体转染入产生唾液酸化糖蛋白的哺乳动物宿主细胞中以制备转染子；以及
3）孵育步骤2）中的所述转染子以从所述转染子中纯化出重组糖蛋白。
2.如权利要求1中所述的方法，其中，所述糖蛋白选自于由促红细胞生成素、促血小板生成素、α-抗胰蛋白酶、胆碱酯酶、绒毛膜促性腺激素、CTLA4Ig、第八因子、γ-谷氨酰转移酶、粒细胞集落刺激因子（G-CSF）和促黄体生成激素（LH）所组成的组中的一种。
3.如权利要求1中所述的方法，其中，所述步骤2）中的所述哺乳动物宿主细胞选自于由如下细胞所组成的组中的一种：中国仓鼠卵巢细胞（CHO）、HT-1080、人类淋巴母细胞、SP2/0、NS0、幼仓鼠肾细胞（BHK）、人胚肾细胞（HEK）和PERC.6。
4.制备胞内CMP-唾液酸含量提高的细胞的方法，所述方法包括：
1）制备包含编码UDP-GlcNAc2-表异构酶/ManNAc激酶（GNE/MNK）的基因、编码α-2,3-唾液酸转移酶的基因以及编码CMP-唾液酸转运体的基因的表达载体，所述GNE/MNK由SEQ ID No：1所表示的氨基酸序列中的263位的精氨酸被亮氨酸取代、且266位的精氨酸被谷氨酰胺取代的氨基酸序列构成，所述α-2,3-唾液酸转移酶由SEQID NO：4所表示的氨基酸序列构成，所述CMP-唾液酸转运体由SEQ IDNO：5所表示的氨基酸序列构成；以及
2）将步骤1）中的所述表达载体转染入哺乳动物宿主细胞中以制备转染子。
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