CN102482668A - 分子内核酸重排的组合物和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的诸多方面涉及相对于多核苷酸结构域将该多核苷酸中的感兴趣区域从第一位置移动到第二位置的方法，也称为“反射法”。在某些实施方式中，所述反射法导致感兴趣区域移动到与该多核苷酸内特定结构域元件(如引物位点和/或MID)功能性相邻。还提供可用于实施本文所述反射法的组合物、试剂盒和系统。
Description
背景技术
我们已经描述了标记片段化基因组群体内各成员，然后将它们混合在一起产生能作为混合物进行加工和最终测序的‘群体文库’的方法。群体标签使得分析软件能够将序列读数解析到归为该群体中特定基因组的文件内。总体方法的一个限制源于已有DNA测序技术的局限。具体说，如果基因组的感兴趣区域中的片段比具体技术的可测序长度长，则无法完全分析这类片段(因为测序从片段的一端向内进行)。而且，任何片段化依赖性测序技术的缺点是可能无法将特定基因组区域的一部分中的序列改变与同一基因组(例如同一染色体)的其它部分的序列改变相关联，因为序列改变位于不同片段上。(参见图5和其说明)。
本发明消除了现有测序技术造成的限制，并可用于多种其它核酸分析。
发明内容
本发明的诸多方面涉及相对于多核苷酸结构域将该多核苷酸中的感兴趣区域从第一位置移动到第二位置的方法，也称为“反射法”(或反射方法、反射序列法、反射反应等)。在某些实施方式中，所述反射法导致感兴趣区域移动到与该多核苷酸内特定结构域元件(如引物位点和/或MID)功能性相邻。还提供可用于实施本文所述反射法的组合物、试剂盒和系统。
附图简要说明
结合附图，通过以下详述更好地理解本发明。需要强调，按照惯例，附图的各个特征不成比例。事实上，各种特征的尺寸被任意放大或者缩小以清楚显示。附图包括以下图1-13：
图1：图A的示意图说明用反射序列将第一结构域从核酸分子中的一个位点移动到另一个位点。图B的示意图说明可用于本文所述反射方法的诸多方面的引物对(An-Bn引物)的相对位置。
图2显示采用结合对(生物素/链霉亲和素)分离感兴趣的单链多核苷酸的示范性实施方式。
图3的示意图说明将引物位点和MID移动到感兴趣核酸中的具体位置的示范性实施方式。
图4显示的示意图说明反射法用于产生富含具有感兴趣区域的片段(例如，从随机片段化和不对称标记的多核苷酸群体富集)的样品的示范性用途。
图5显示鉴定样品中同源核酸(例如，衍生自二倍体细胞的染色体对或病毒基因组/转录物的同一区域)的核酸多态性的方法比较。上方示意图显示样品中的两种核酸分子(1和2)在多态性位点A、B和C处有不同多态性分配(A1、B1、C1和C2)。利用片段化进行的标准测序方法(左侧)可鉴定这些核酸中的多态性，但不保留连接信息。利用本文所述的反射方法鉴定多态性(右侧)能保留连接信息。
图6：图A示意显示反射法中核酸物质的预计结构和大小；图B是聚丙烯酰胺凝胶，显示实施例1所述反射法产生的核酸物质。
图7：图A示意显示反射法所用的核酸和竞争剂的结构；图B是聚丙烯酰胺凝胶，显示实施例1所述反射法产生的核酸物质。
图8显示反射法流程图(左图)，其中T7外切核酸酶步骤是任选的。右侧凝胶显示没有T7外切核酸酶步骤(泳道1)或有T7外切核酸酶步骤(泳道2)时反射法所得的产物。
图9显示示范性反射法流程，右侧指出何时纯化反应产物(例如，采用Agencourt珠去除引物寡核苷酸)。
图10显示原料(左图)和采用反射法而不使用T7外切核酸酶步骤获得的产物(右图)(如实施例II所述)。原料中的反射位点是通常存在于所加工的多核苷酸中的序列(也称为“非人工”反射位点)。此图显示，755碱基对原料核酸被加工成预计的461碱基对产物，从而确认“非人工”反射位点能有效地将衔接子结构域以序列特异性方式从感兴趣多核苷酸中的一个位置转移到另一个位置。
图11显示实验示意图和结果，该实验在单一较大初始模板(“亲本”片段)上进行反射法以产生各自具有不同感兴趣区域的五种不同产物(“子代”产物)(即产生的各子代产物具有区域1、2、3、4或5)。
图12显示实验示意图和结果，该实验用于确定反射法(正如所需)期间的分子内重排相对分子间重排(MID交换)的普遍性。
图13显示制备反射法所用材料和进行反射法的示范性流程图。
定义
除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域普通技术人员通常所理解的同样含义。但为了清楚和易于理解，仍然定义了某些要素。
本文所用的核酸化学、生物化学、遗传学和分子生物学的术语和符号遵循本领域的标准论述和文本中的术语和符合，例如Kornberg和Baker，DNAReplication(《DNA复制》)，第二版(W.H.弗里曼出版社(W.H.Freeman)，纽约，1992)；Lehninger，Biochemistry(《生物化学》)，第二版(沃斯出版社(WorthPublishers)，纽约，1975)；Strachan和Read，Human Molecular Genetics(《人类分子遗传学》)，第二版(WL出版社(Wiley-Liss)，纽约，1999)；Eckstein编，Oligonucleotides andanalogs：A Practical Approach(《寡核苷酸和类似物：实践方法》)(牛津大学出版社(Oxford University Press)，纽约，1991)；Gait编，Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach(《寡核苷酸合成：实践方法》)(IRL出版社，牛津，1984)；等。
“扩增子”指多核苷酸扩增反应产物。即，它是从一个或多个引发序列复制的，通常是双链的多核苷酸群体。所述一个或多个引发序列可以是相同序列的一个或多个拷贝，或者可以是不同序列的混合物。扩增子可通过各种扩增反应产生，所述反应的产物是一种或多种核酸的多个复制体。通常，产生扩增子的扩增反应是“模板驱动的”，因为反应物(核苷酸或寡核苷酸)的碱基配对要求模板多核苷酸中存在产生反应产物所需的互补物。一方面，模板驱动的反应是用核酸聚合酶进行引物延伸或者用核酸连接酶进行寡核苷酸连接。这类反应包括但不限于：聚合酶链反应(PCR)、线型聚合酶反应、基于核酸序列的扩增(NASBA)、滚环扩增等，参见通过引用全文纳入本文的下述文献：Mullis等，美国专利4,683,195；4,965,188；4,683,202；4,800,159(PCR)；Gelfand等，美国专利5,210,015(用“TAQMANTM”探针进行实时PCR)；Wittwer等，美国专利6,174,670；Kacian等，美国专利5,399,491(“NASBA”)；Lizardi，美国专利5,854,033；Aono等，日本专利公开JP 4-262799(滚环扩增)；等。一方面，本发明扩增子通过PCR产生。如果有能够随着扩增反应进行测定反应产物的检测化学，那么扩增反应可以是“实时”扩增，例如下述的“实时PCR”，或如Leone等，Nucleic AcidsResearch，26：2150-2155(1998)等文献所述的“实时NASBA”。本文所用术语“扩增”指进行扩增反应。“反应混合物”指含有进行反应所需的所有反应物的溶液，其可包括但不限于，在反应期间将pH维持在所选水平的缓冲剂、盐、辅因子、清除剂等。
术语“评估”包括任何测量形式，并包括确定某要素存在与否。术语“测定”、“测量”、“评价”、“评估”、“测试”可互换使用，包括定性和定量测定。评估可以是相对的或绝对的。“评估...的存在”包括确定存在物质的量和/或确定该物质是否存在。本文所用术语“测定”、“测量”和“评估”和“测试”可互换使用，包括定性和定量测定。
“不对称标记的”多核苷酸的左侧和右侧衔接子结构域不同。这一方法总地称为不对称地连接衔接子或不对称地标记多核苷酸，如多核苷酸片段。可通过任何方便的方式产生具有不对称衔接子末端的多核苷酸。示范性不对称衔接子可参见：美国专利5,712,126和6,372,434；美国专利公开2007/0128624和2007/0172839；和PCT公开WO/2009/032167；所有文献通过引用全文纳入本文。在某些实施方式中，所用的不对称衔接子可参见2009年4月29日提交的美国专利申请序列号12/432,080，通过引用全文纳入本文。
例如，本发明使用者可使用不对称衔接子来标记多核苷酸。“不对称衔接子”是连接于双链核酸片段的两端时，导致产生侧接感兴趣基因组插入物的序列不同的引物延伸或扩增产物的衔接子。连接通常后接后续加工步骤，以便产生不相同的末端衔接子序列。例如，复制不对称衔接子连接片段产生在末端衔接子序列之间至少有一个核酸序列差异或核苷酸/核苷修饰的多核苷酸产物。将衔接子不对称地连接于多核苷酸(如多核苷酸片段)产生的多核苷酸在一端具有的一个或多个衔接子序列(例如，一个或多个区域或结构域，如引物位点)不存在于另一端或与另一端的衔接子序列相比具有不同核酸序列。需要注意，称为“不对称衔接子”的衔接子不一定是自身结构不对称，也不是仅通过将不对称衔接子连接于多核苷酸片段的行动立即使其不对称。而是说，各末端具有相同不对称衔接子的连有不对称衔接子的多核苷酸产生的复制产物(或分离的单链多核苷酸)相对于另一端的衔接子序列是不对称的(例如，至少一轮扩增/引物延伸后)。
任何方便的不对称衔接子或不对称连接衔接子的方法均可用于实施本发明。示范性不对称衔接子可参见：美国专利5,712,126和6,372,434；美国专利公开2007/0128624和2007/0172839；和PCT公开WO/2009/032167；所有文献通过引用全文纳入本文。在某些实施方式中，所用的不对称衔接子可参见2009年4月29日提交的美国专利申请序列号12/432,080，通过引用全文纳入本文。
“互补”或“基本上互补”指在核苷酸或核酸之间，例如在双链DNA分子的两条链之间或在寡核苷酸引物和单链核酸上的引物位点之间杂交或碱基配对或形成双链体。互补核苷酸通常是A和T(或A和U)，或C和G。参考合适核苷酸插入或缺失进行最优比对和比较时，一条链的核苷酸与另一条链的核苷酸的至少约80％，通常至少约90％至95％，更优选约98至100％配对时，称这两个单链RNA或DNA分子基本上互补。或者，RNA或DNA链在所选杂交条件下与其互补物杂交时，存在基本互补性。通常，在至少14至25个核苷酸的臂上至少约65％互补，优选至少约75％，更优选至少约90％互补时，出现选择性杂交。参见M.Kanehisa Nucleic Acids Res.12：203(1984)，通过引用纳入本文。
“双链体”指完全或部分互补的至少两个寡核苷酸和/或多核苷酸在所有或大部分核苷酸上发生沃森克里克型碱基配对，以形成稳定复合物。术语“退火”和“杂交”可互换使用，指形成稳定双链体。提到双链体时，“完美匹配”指构成双链体的多聚核苷酸链或寡核苷酸链相互形成双链结构，以使每条链中的每个核苷酸与另一条链的核苷酸发生沃森克里克碱基配对。稳定的双链体可包括双链体的两条链之间形成沃森克里克碱基配对和/或非沃森克里克碱基配对(其中碱基配对指形成氢键)。在某些实施方式中，非沃森克里克碱基配对包括核苷类似物，如脱氧次黄苷、2，6-二氨基嘌呤、PNA、LNA等。在某些实施方式中，非沃森克里克碱基配对包括“摆动碱基(wobble base)”，如脱氧次黄苷、8-氧代-dA、8-氧代-dG等，其中“摆动碱基”所指核酸碱基可与互补核酸链中的第一种核苷酸碱基发生碱基配对，但用作核酸合成的模板链时导致将第二种不同核苷酸碱基掺入合成链(下文进一步详述摆动碱基)。两个寡核苷酸或多核苷酸间双链体中的″错配″指双链体中一对核苷酸不能发生沃森克里克结合。
提到基因组或靶多核苷酸时，“遗传基因座”、“基因座”或″感兴趣基因座″指基因组或靶多核苷酸的毗连亚区或区段。本文所用的遗传基因座、基因座或感兴趣基因座可指核苷酸、基因或基因的一部分在基因组，包括线粒体DNA或其它非染色体DNA(如细菌质粒)中的位置，或者可以指基因组序列的任何毗连部分，无论它是否在基因内或与基因相关联。遗传基因座、基因座或感兴趣基因座可能是一个核苷酸至长度是几百个或几千个核苷酸或更长的区段。通常，感兴趣基因座具有相关联的参比序列(参见下文中有关“参比序列”的说明)。
“试剂盒”指用于提供实施本发明方法所用材料或试剂的任何供给系统。在反应实验的情况下，这种供给系统包括能够储存、运输或从一个位置向另一个位置提供反应试剂(例如，合适容器中的探针、酶等)和/或支持材料(例如，缓冲液、进行实验的书面说明等)的供给系统。例如，试剂盒包括含有相关反应试剂和/或支持材料的一种或多种容器(如盒)。可将这些内容物一起或单独地提供给预期接受者。例如，第一容器可含有用于实验的酶，而第二容器含有探针。
“连接″指在两个或多个核酸，如寡核苷酸和/或多核苷酸的末端之间，以模板驱动反应形成共价键或连接。这种键或连接的性质可能迥然不同，该连接可通过酶促或化学方法进行。本文所用的连接通常用酶促方法实现，在一个寡核苷酸的末端核苷酸的5’碳与另一个寡核苷酸的3’碳之间形成磷酸二酯键。下述文献中描述了各种模板驱动的连接反应，通过引用全文纳入本文：Whiteley等，美国专利4,883,750；Letsinger等，美国专利5,476,930；Fung等，美国专利5,593,826；Kool，美国专利5,426,180；Landegren等，美国专利5,871,921；Xu和Kool，Nucleic Acids Research，27：875-881(1999)；Higgins等，Methods in Enzymology，68：50-71(1979)；Engler等，TheEnzymes，15：3-29(1982)；和Namsaraev，美国专利公开号2004/0110213。
本文所用的“多重标识物”(MID)指与多核苷酸相关联的可用于区分样品中多核苷酸的标签或标签组合(如DNA序列标签)。在某些实施方式中，用多核苷酸上的MID标明该多核苷酸的产生来源。例如，核酸样品可能是由不同来源获得的多核苷酸库(例如，来自不同个体、不同组织或细胞的多核苷酸，或者在不同时间点分离的多核苷酸)，其中来自各个不同来源的多核苷酸用独特的MID做标记。同样，MID提供多核苷酸和其来源之间的关联。在某些实施方式中，利用MID独特地标记样品中各单独的多核苷酸。鉴定样品中独特MID的数量可提供样品中有多少单独多核苷酸的读数(或所操作的多核苷酸样品源自多少来源多核苷酸；参见例如，2009年5月26日授权的美国专利号7,537,897，通过引用全文纳入本文)。MID的长度可以是2至100或更多个核苷酸碱基，并且可包括多个亚基，其中各个不同的MID具有独特的亚基种类和/或顺序。可用作MID的示范性核酸标签参见2009年6月6日授权的题为“Nucleic Acid Analysis Using SequenceTokens(采用序列标记进行核酸分析)”的美国专利7,544,473，已经2008年7月1日授权的题为“Methods and Compositions for Tagging and IdentifyingPolynucleotides(标记和鉴定多核苷酸的方法和组合物)”的美国专利7,393,665中有关核酸标签和其在鉴定多核苷酸中的应用的描述，这两篇文献通过引用全文纳入本文。在某些实施方式中，用于标记多个样品的一组MID不需要具有任何特定的共有特性(如Tm、长度、碱基组成等)，因为本文所述方法可适应各种独特的MID组。在此强调，MID只需要在给定实验中独特。因此，可采用相同MID标记不同实验中加工的不同样品。此外，在某些实验中，使用者可使用相同MID来标记同一实验中的一小组不同样品。例如，获自具有特定表型的个体的所有样品可用同一MID标记，例如，获自对照(或野生型)对象的所有样品可用第一MID标记，而具有疾病病症的对象可用第二MID(不同于所述第一MID)标记。作为另一个例子，可能需要用不同MID标记获自相同来源的不同样品(例如，在不同时间上获得的样品或者从组织内不同位点获得的样品)。进一步，MID可以各种不同方式产生，例如，通过组合标记法产生，该方法中一种MID通过连接附连而第二MID通过引物延伸附连。因此，可以不同方式设计和实施MID，以便在加工和分析过程中追踪多核苷酸片段，因此在这方面不应有任何限制。
本文所用的“核苷″包括天然核苷，包括2′-脱氧和2′-羟基形式，例如Kornberg和Baker，DNA Replication(《DNA复制》)，第2版(弗里曼出版社(Freeman)，旧金山，1992)所述。提到核苷时，″类似物″包括具有修饰碱基部分和/或修饰糖部分的合成核苷，例如，参见Scheit，NucleotideAnalogs(《核苷酸类似物》)(约翰韦利出版社(John Wiley)，纽约，1980)；Uhlman和Peyman，Chemical Reviews，90：543-584(1990)等等，限制条件是：它们能够特异性杂交。这种类似物包括经设计提高结合特性、降低复杂性、提高特异性等的合成核苷。包含杂交性能或核酸酶抗性提高的类似物的多核苷酸可参见Uhlman和Peyman(上文引用)；Crooke等，Exp.Opin.Ther.Patents，6：855-870(1996)；Mesmaeker等，Current Opinion in StructualBiology，5：343-355(1995)等。能够提高双链体稳定性的多核苷酸示范类型包括寡核苷酸N3′→P5′氨基磷酸酯(本文中称为″酰胺化物″)、肽核酸(本文中称为″PNA″)、寡-2′-O-烷基核糖核苷酸、含C-5丙炔基嘧啶的多核苷酸、锁定核酸(“LNA”)等化合物。这种寡核苷酸或者可购得，或者可用文献所述方法合成。
“聚合酶链反应”或“PCR”指通过DNA互补链的同时引物延伸而在体外扩增特定DNA序列的反应。换言之，PCR是制备侧接引物位点的靶核酸的多个拷贝或复制体的反应，这种反应包括将以下步骤重复一次或多次。(i)使靶核酸变性，(ii)使引物与引物位点退火，和(iii)在三磷酸核苷存在下由核酸聚合酶延伸引物。通常，在热循环仪设备中，通过为各个步骤优化的不同温度循环进行该反应。具体温度、每步持续时间和步骤之间的改变速率取决于本领域普通技术人员熟知的众多因素，例如下述参考文献所述：McPherson等编，PCR：A Practical Approach(《PCR：实践方法》)和PCR2：A Practical Approach(《PCR2：实践方法》)(IRL出版社，牛津，分别出版于1991和1995年)。例如，在使用Taq DNA聚合酶的常规PCR中，可以在＞90℃的温度下使双链靶核酸变性，在50-75℃的温度下使引物退火，在72-78℃的温度下使引物延伸。术语“PCR”包括该反应的衍生形式，包括但不限于：RT-PCR、实时PCR、巢式PCR、定量PCR、多重PCR等。反应体积从几百纳升，例如200nL，到几百微升，例如200μL。“逆转录PCR”或“RT-PCR”指PCR前先用逆转录反应将靶RNA转化成互补单链DNA，然后扩增该DNA，例如Tecott等，美国专利5,168,038，通过引用全文纳入本文。“实时PCR”指在反应进行的同时监测反应产物即扩增子含量的PCR。实时PCR有多种形式，它们的区别主要是用于监测反应产物的检测化学，例如Gelfand等，美国专利5,210,015(“TAQMANTM”)；Wittwer等，美国专利6,174,670和6,569,627(插入染料)；Tyagi等，美国专利5,925,517(分子信标)；这些专利通过引用全文纳入本文。实时PCR所用检测化学的综述可参见Mackay等，Nucleic Acids Research，30：1292-1305(2002)，该综述也通过引用全文纳入本文。“巢式PCR”指两阶段PCR，其中第一阶段PCR的扩增子成为利用新一组引物进行第二阶段PCR的样品，新引物中至少一个引物结合第一扩增子的内部位置。提到巢式扩增反应时，本文所用的“初始引物”指用于产生第一扩增子的引物，“二级引物”指用于产生第二扩增子或巢式扩增子的一种或多种引物。“多重PCR”指在同一反应混合物中同时扩增多种靶序列(或单一靶序列和一种或多种参比序列)的PCR，例如Bernard等，Anal.Biochem.，273：221-228(1999)(双色实时PCR)。通常，每种待扩增序列使用独特的引物组。
“定量PCR”指设计用于测定样品或试样中一种或多种特定靶序列的丰度的PCR。定量PCR包括靶序列的绝对定量和相对定量。采用一种或多种参比序列进行定量测定，参比序列可与靶序列分开测定或一起测定。参比序列可以是样品或试样内源或外源的，在后一种情况下，可包含一种或多种竞争模板。典型的内源性参比序列包括以下基因的转录物区段：β-肌动蛋白、GAPDH、β2-微球蛋白、核糖体RNA等。定量PCR技术为本领域普通技术人员所熟知，例如，参见纳入本文作参考的下述参考文献：Freeman等，Biotechniques，26：112-126(1999)；Becker-Andre等，Nucleic Acids Research，17：9437-9447(1989)；Zimmerman等，Biotechniques，21：268-279(1996)；Diviacco等，Gene，122：3013-3020(1992)；Becker-Andre等，Nucleic Acids Research，17：9437-9446(1989)等。
“多核苷酸”或“寡核苷酸”可互换使用，各自指核苷酸单体的线型聚合物。构成多核苷酸和寡核苷酸的单体能够通过规律的单体-单体相互作用模式，例如沃森克里克型碱基配对、碱基堆积、哈斯汀(Hoogsteen)或反向哈斯汀型碱基配对、摆动碱基配对等特异性结合天然多核苷酸。如下文所详述，“摆动碱基”指核酸碱基可与互补核酸链中的第一核苷酸碱基碱基配对，但用作核酸合成的模板链时，导致将第二种不同的核苷酸碱基掺入合成链中。这种单体和其核苷间连接可能是天然产生的或者是其类似形式，例如天然产生的或非天然产生的类似物。非天然产生的类似物可包括肽核酸(PNA，如美国专利5,539,082所述，通过引用纳入本文)、锁定核酸(LNA，如美国专利6,670,461所述，通过引用纳入本文)、硫代磷酸酯核苷间连接、含有允许连接标记如荧光团或半抗原的连接基团的碱基等。使用寡核苷酸或多核苷酸需要酶促加工，如通过聚合酶延伸、通过连接酶连接等时，普通技术人员都会理解寡核苷酸或多核苷酸在这些情况下不会在任何或一些位置上含有核苷间连接的某些类似物、糖部分或碱基。多核苷酸的大小范围通常是当它们通常称作“寡核苷酸”时的少许单体单位如5-40个单体单位，直至几千个单体单位。多核苷酸或寡核苷酸由一系列字母代表(大写或小写)，如″ATGCCTG″时，应理解从左到右的核苷酸是5′→3′顺序，其中″A″指代脱氧腺苷，″C″指代脱氧胞苷，″G″指代脱氧鸟苷，″T″指代胸苷，“I”指代脱氧次黄苷，“U”指代尿苷，除非另有说明或从上下文中显见并非如此。除非另有说明，术语和原子编号习惯遵循Strachan和Read，Human MolecularGenetics 2(《人分子遗传学2》)(WL出版社(Wiley-Liss)，纽约，1999)所述。多核苷酸通常包含通过磷酸二酯键连接的四种天然核苷(如DNA中的脱氧腺苷、脱氧胞苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷，或RNA中它们的核糖对应物)；然而，它们也可能包含非天然核苷酸类似物，例如包含修饰碱基、糖或核苷间连接。本领域技术人员明显了解，当酶活性对寡核苷酸或多核苷酸底物有特定要求，例如单链DNA、RNA/DNA双链体时，本领域技术人员能够为寡核苷酸或多核苷酸底物选择合适组合物，特别是在专业文献的指导下，如Sambrook等，Molecular Cloning(《分子克隆》)，第二版(冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory)，纽约，1989)等参考文献。
“引物”指与多核苷酸模板形成双链体时能够用作核酸合成的起点并从其3’末端沿模板延伸以形成延伸的双链体的天然或合成寡核苷酸。延伸过程中添加的核苷酸序列由模板多核苷酸的序列决定。通常由DNA聚合酶来延伸引物。引物的长度通常与其在合成引物延伸产物中的应用相适合，通常范围是8至100个核苷酸，如10至75、15至60、15至40、18至30、20至40、21至50、22至45、25至40等等，更通常的长度范围是18-40、20-35、21-30个核苷酸，以及上述范围之间的任何长度。引物长度范围通常可以是10-50个核苷酸，如15-45个、18-40个、20-30个、21-25个等，以及上述范围之间的任何长度。在一些实施方式中，引物长度通常不超过约10、12、15、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65或70个核苷酸。
为使扩增效率最大化，引物通常是单链，但也可能是双链。如果是双链，通常首先处理引物以分离其两条链，然后用于制备延伸产物。这一变性步骤通常受热影响，但可以用碱进行，然后中和。因此，“引物”与模板互补，通过氢键或与模板杂交复合形成引物/模板复合物以通过聚合酶启动合成，在DNA合成过程中在3′端加入与模板互补的共价结合的碱基从而延伸。
本文所用的“引物对”指具有适合基于核酸的靶核酸扩增的核酸序列的第一与第二引物。这种引物对通常包括具有与靶核酸第一部分相同或相似的序列的第一引物，以及具有与靶核酸第二部分互补的序列的第二引物，以便扩增靶核酸或其片段。除非另有说明，本文中“第一”和“第二”引物的指代是任意的。例如，第一引物可设计为“正向引物”(从靶核酸5’末端启动核酸合成)或标为“反向引物”(从正向引物启动合成产生的延伸产物的5’末端启动核酸合成)。同样，第二引物也可设计为正向引物或反向引物。
本文所用的“引物位点”(如测序引物位点和扩增引物位点等)指多核苷酸中包含引物序列(如测序引物)和/或引物互补序列的区域。以单链形式(例如单链多核苷酸的形式)存在时，引物位点可以是引物的相同序列或引物的互补序列。
以双链形式存在时，引物位点含有与引物互补序列杂交的引物序列。
因此，引物位点是与引物序列相同或互补的多核苷酸区域(单链形式时)或是引物序列和其互补物形成的双链区域。引物位点可位于连接于多核苷酸的衔接子中。本领域普通技术人员可由相关多核苷酸的结构特征和/或使用它的具体情况中推知引物位点的具体方向。
“读出”指可检测和/或测定并转化成数字或数值的一个或多个参数。在某些情况下，读出可以指所采集或记录的数据的实际数值表示。例如，来自微阵列的荧光强度信号的读出是在微阵列的各个杂交位点上产生的信号的地址和强度；因此，这种读出可以各种方式记录或储存为(例如)微阵列图、数据表等。
用“反射位点”、“反射序列”和等同形式表示多核苷酸中用于将结构域从初始位置分子内移动到多核苷酸中不同位置的序列。反射位点序列可加入感兴趣的多核苷酸中(例如，在连接于该多核苷酸的衔接子中)，反射位点序列可基于感兴趣多核苷酸中天然存在的序列(例如，多核苷酸中的基因组序列)，或两者兼有。选择反射序列使其与多核苷酸中的其它序列不同(即，与该多核苷酸中很可能存在的其它序列，例如待加工的基因组或亚基因组序列的序列同源性很低)。同样，应选择反射序列，以使其在本文所述反射法所用条件下，不杂交其互补物以外的任何序列。如本申请下文所述，在该多核苷酸的相同链(例如，双链多核苷酸的同一条链或同一单链多核苷酸)上的具体位置处插入反射序列的互补物，以促进该具体链上发生分子内结合事件。因此，本文所述反射法中所用的反射序列可具有各种长度和序列。反射序列的长度范围可以是5至200个核苷酸。
“固体支持物”，“支持物”和“固相支持物”可互换使用，指具有刚性或半刚性表面或多个表面的材料或一组材料。在许多实施方式中，固体支持物的至少一个表面是基本平的，尽管在一些实施方式中，可能需要物理上隔离的用于不同复合物的合成区域，例如孔、突起区域、针、蚀刻沟槽等。根据其它实施方式，固体支持物是珠、树脂、凝胶、微球或其它几何构型的形式。微阵列通常包括至少一个平坦的固相支持物，例如玻璃载玻片。
提到一种分子与另一种分子结合时，如标记的靶序列与探针结合时，“特异性”或“特异”指两分子之间识别、接触和形成稳定复合物，以及该分子与其他分子的识别、接触或复合物形成明显较少。一方面，提到第一种分子与第二种分子结合时，“特异性”指在反应或样品中第一分子识别另一分子并与其形成复合物的程度，它与第二分子形成复合物的数量最大。此种最大数量优选为至少百分之五十。通常，参与特异性结合事件的分子的表面上或空穴中具有能使互相结合的分子之间发生特异性识别的区域。特异性结合的例子包括抗体-抗原相互作用、酶-底物相互作用、在多核苷酸和/或寡核苷酸之间形成双链体或三联体、生物素-亲和素或生物素-链霉亲和素相互作用、受体-配体相互作用等。提到特异性或特异性结合时，本文所用术语“接触”指两个分子足够接近，使得较弱的非共价化学作用，如范德华力、氢键结合力、碱基堆积相互作用、离子和疏水相互作用等主导分子的相互作用。
本文所用术语“Tm”用于指“解链温度”。解链温度是双链核酸分子群体中一半解离成单链的温度(例如，以℃计)。本领域已知计算核酸Tm的若干等式(参见例如，Anderson和Young，Quantitative Filter Hybridization(定量滤纸杂交)，刊于Nucleic Acid Hybridization(《核酸杂交》)(1985)。其它参考文献(如，Allawi，H.T.和小SantaLucia，J.，Biochemistry 36，10581-94(1997))包括考虑结构和环境因素以及序列特征以计算Tm的替代计算方法。
“样品”指来自生物、环境、医学或患者来源的需要检测、测定或标记靶核酸的一定量材料。一方面，它包括试样或培养物(如微生物培养物)。另一方面，它包括生物和环境样品。样品可包括合成来源的试样。生物样品可以是动物样品，包括人样品、液体、固体(如粪便)或组织，以及液体和固体的食品和饲料产品和成分，如乳制品、蔬菜、肉类和肉类副产品和废料。生物样品可包括取自患者的材料，包括但不限于培养物、血液、唾液、脑脊液、胸膜液、乳汁、淋巴、痰液、精液、针吸出物等。生物样品可获自各种家养动物家族，以及未驯服动物或野生动物，包括但不限于：有蹄类，熊、鱼、啮齿动物等。环境样品包括环境材料，例如表面物质、土壤、水和工业样品，以及获自食品和乳制品加工设备、装置、装备、器皿、一次性和非一次性制品的样品。这些例子不应解释为对可用于本发明的样品类型的限制。
描述核酸分子方向和/或聚合时，本文所用术语“上游”和“下游”具有本领域技术人员通常理解的含义。因此，“下游”通常指在5′至3′方向上行进，即核苷酸聚合酶通常延伸序列的方向，而″上游″的含义通常相反。例如，杂交于同一靶核酸分子上第二引物″上游″的第一引物位于第二引物的5′侧(因此核酸聚合由第一引物向第二引物行进)。
还应注意到，权利要求书可撰写成排除任何任选要素。同样，这种说明旨在作为排除性术语，如“只有”、“仅仅”等的使用与权利要求要素的引用相关联，或使用“负”限制的前提基础。
发明详述
本发明涉及用于分子内核酸重排的组合物和方法，所述组合物与方法可用于各种遗传学分析应用(包括测序)以及多核苷酸结构的普通分子生物学操作。
在描述本发明之前，应理解，本发明不限于本文所述的具体实施方式，因为它们当然可能变化。还应理解，本文所用术语的目的仅是描述具体实施方式，不用来构成限制，因为本发明的范围仅受所附权利要求书的限制。
提供数值范围时，也应视作具体公开了该范围的上限和下限之间以下限单位十分之一为间隔的各间插数值，除非上下文另有明确说明。本发明还包括设定范围内任何设定数值或间插数值和该设定范围内任何其它设定数值或间插数值之间的较小范围。取决于设定范围内任何明确排除的端值，所述范围可独立地包含或排除这些较小范围的上下限，本发明也包括这些较小范围不包含端值、包含某个或两个端值的各范围，。设定范围包含一个或两个端值时，本发明也包括排除这一个或两个被包括端值的范围。
除非另有说明，本文所用的所有科技术语与本发明所属领域普通技术人员所理解的通常含义相同。虽然也可采用与本文所述类似或等同的任何方法和材料实施或测试本发明，但在此描述一些潜在和优选的方法和材料。本文提及的所有出版物均通过引用纳入本文，以公开和描述与所引用出版物相关的方法和/或材料。应理解，出现抵触时，用本发明公开内容代替任何本文所纳出版物的公开内容。
必须注意到，本文和所附权利要求书所用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数含义，除非上下文另有明确说明。因此，例如，提到“核酸”包括多种这类核酸，提到“复合物”包括本领域技术人员已知的一种或多种复合物和其等同物，等等。
除非另有说明，本发明的实施可采用有机化学、聚合物技术、分子生物学(包括重组技术)、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术和介绍，它们均在本领域技术范围内。这类常规技术包括聚合物阵列合成、杂交、连接和用标记检测杂交。合适技术的具体说明可参照下文所述的具体例子。然而，当然也可采用其它等同的常规方法。这类常规技术和描述可参见标准实验室手册如Genome Analysis：A Laboratory Manual Series(《基因组分析：实验室手册丛书》)(第I-IV卷)，Using Antibdies：A Laboratory Manual(《使用抗体：实验室手册》)，Cells：A Laboratory Manual(《细胞：实验室手册》)，PCR Primer：ALaboratory Manual(《PCR引物：实验室手册》)和Molecular Cloning：ALaboratory Manual(《分子克隆：实验室手册》)(均来自冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press))，Stryer，L.(1995)Biochemistry(《生物化学》)(第4版)弗里曼公司(Freeman)，纽约，Gait，“Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach(《寡核苷酸合成：实践方法》)”1984，IRL出版社，伦敦，Nelson和Cox(2000)，Lehninger，A.，Principles of Biochemistry(《生化原理》)第3版，纽约州纽约市W.H.弗里曼出版社(W.H.Freeman Pub.)和Berg等(2002)Biochemistry(生物化学)，第5版，纽约州纽约市W.H.弗里曼出版社，将这些文献通过引用全文纳入本文用于所有目的。
提供本文讨论的出版物仅为其在本申请的申请日之前的公开。本文中所有内容均不应解释为承认本发明不能凭借在先发明而先于这些出版物。此外，所提供的出版日期可能与实际公开日期不同，可能需要单独确认。
如上所述，本发明的诸多方面涉及利用多核苷酸中(例如，多核苷酸的衔接子结构中，多核苷酸的基因组区域中，或其组合)的‘反射’序列将多核苷酸的某结构域从第一位置分子内移动到第二位置。本文所述的反射方法可用于多种应用，例如，将多核苷酸的功能元件(如，测序引物位点和/或MID标签)安置在感兴趣的所需亚区域的附近。
核酸
反射方法(如下文详述)可用于操作和分析来自几乎任何核酸来源的感兴趣核酸序列，包括但不限于基因组DNA、互补DNA(cDNA)、RNA(如信使RNA、核糖体RNA、短干扰RNA、微小RNA等)、质粒DNA、线粒体DNA、合成DNA等。而且，任何生物体、有机材料或含核酸物质均可用作本发明加工核酸的来源，它们包括但不限于：植物、动物(如爬行动物、哺乳动物、昆虫、蠕虫、鱼等)、组织样品、细菌、真菌(如酵母)、噬菌体、病毒、尸体组织、考古/古代样品等。在某些实施方式中，核酸样品中的核酸来自哺乳动物，其中在某些实施方式中，所述哺乳动物是人。
在某些实施方式中，在反射序列方法之前富集核酸序列。富集指对核酸进行降低核酸复杂性的过程，通常通过提高样品中特定核酸物质(例如，具有感兴趣的特定基因座，包括具体核酸序列、缺少某基因座或序列，在特定大小范围内等)的相对浓度。有多种方式来富集具有特定特征或序列的核酸，同样可采用任何能实现这一目的的方便方法。富集(或复杂性降低)可以在该方法的任何步骤中进行，将由使用者的要求决定。例如，富集可以在单个亲本样品(例如，衔接子连接之前的未标记核酸)或多重样品(例如，用引物位点、MID和/或反射序列标记并汇集的核酸；MID见下文详述)中进行。
在某些实施方式中，在分析之前扩增核酸样品中的核酸。在某些实施方式中，扩增反应也用于富集初始核酸样品中的感兴趣序列或基因座。例如，可对初始核酸样品进行聚合酶链反应(PCR)来扩增一个或多个感兴趣区域。在某些实施方式中，扩增反应是指数扩增反应，而在某些其它实施方式中，扩增反应是线性扩增反应。对初始核酸样品进行扩增反应的任何方便方法均可用于实施本发明。在某些实施方式中，用于扩增反应的核酸聚合酶是具有校对能力的聚合酶(例如，
DNA聚合酶、沿海热球菌(Thermococcus litoralis)DNA聚合酶，激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)DNA聚合酶等)。
在某些实施方式中，分析的核酸样品衍生自单一来源(例如，单一生物体、病毒、组织、细胞、对象等)，而在其它实施方式中，核酸样品是提取自多种来源的核酸库(例如，来自多种生物体、组织、细胞、对象的核酸库等)，其中“多种”指两种或更多种。因此，在某些实施方式中，核酸样品可含有来自2种或更多种、3种或更多种、5种或更多种、10种或更多种、50种或更多种、100种或更多种、500种或更多种、1000种或更多种、5000种或更多种、多达包括约10,000种或更多种来源的核酸。
在某些实施方式中，准备与核酸片段汇集的核酸片段衍生自多种来源(例如，多种生物体、组织、细胞、对象等)，其中“多种”指两种或更多种。在这类实施方式中，衍生自各来源的核酸包括多重标识物(MID)，以便确定各标记核酸片段的来源。在这类实施方式中，各核酸样品来源与独特MID关联，其中独特MID指所用的各个不同的MID可通过至少一种特征，如MID的核酸序列与所用的其它MID相互区别。可使用任何类型的MID，包括但不限于2007年1月22日提交的题为“Nucleic Acid Analysis Using Sequence Tokens(采用序列标记进行核酸分析)”的同在审理中的美国专利申请序列号11/656,746，以及2008年7月1日授权的题为“Methods and Compositions for Tagging andIdentifying Polynucleotides(标记和鉴定多核苷酸的方法和组合物)”的美国专利7,393,665中有关核酸标签和其在鉴定多核苷酸中的应用中所述的那些，这两篇文献通过引用全文纳入本文。在某些实施方式中，用于标记多种样品的一组MID不需要具有任何具体的共同特性(如Tm、长度、碱基组成等)，因为不对称标记方法(和许多标签读出方法，包括但不限于标签测序或标签长度测定)可适应多种独特的MID组。
在某些实施方式中，用独特MID标记待分析样品中的各单独多核苷酸(如，双链或单链，为适合所用的方法细节)，以便在后续方法中可追踪各多核苷酸的命运(其中，如上所述，独特MID指所用的各个不同MID可通过至少一种特征，如MID的核酸序列与所用其它MID相互区分)。例如(并如下所述)，用独特MID标记各核酸后能够用本文所述的反射序列法分析各单独核酸的序列。这能够关联无法在单次测序运行中测序的较大核酸片段的序列信息。
反射序列法
如上所述，本发明诸多方面包括将多核苷酸中的结构域从第一位置移动到该多核苷酸中的第二位置的方法和组合物。示范性实施方式见图1A。
图1A显示单链多核苷酸100，其在5’至3’方向上包含第一结构域(102；待移动结构域)；反射序列104；具有所述第一结构域的远端位点(位点A)的核酸序列106和反射序列互补物108(位于该多核苷酸的3’末端)。下文所述反射法的步骤将所述第一结构域移动到更接近位点A。这里需要注意，图1A中一撇“′”(prime)指结构域的互补序列。例如，第一结构域′是第一结构域的互补物。
在步骤1中，多核苷酸中的反射序列和其互补物通过分子内退火形成多核苷酸结构112，其中多核苷酸折叠回其自身，并杂交形成互补区(即双链的反射/反射′区域)。在此种构型中，反射序列互补物的3’末端可用作核酸合成引发位点。然后，在延伸步骤2中从该位点开始合成核酸，在核酸延伸的3’端产生所述第一结构域的互补物(见多核苷酸114；用标有“延伸”的虚线箭头标识延伸)。
多核苷酸114变性(如热变性)产生线性单链多核苷酸116。如图1所示，所得多核苷酸116在接近位点A的位置上含有所述第一结构域的互补物(即，只间隔反射序列的互补物)。所得多核苷酸可用于使用者所需的任何后续分析或加工步骤(例如，测序、作为扩增模板(线性、PCR等)、序列特异性提取等)。
在另一实施方式中，从多核苷酸114双链区的5’端去除所述第一结构域和反射序列(见多核苷酸118；用标记“去除”的虚线箭头标识去除)。可通过任何方便的方法去除该区域，这些方法包括但不限于：将多核苷酸结构114用T7外切核酸酶处理(在合适的孵育条件下)或用λ外切核酸酶处理；只要多核苷酸的5’端磷酸化，就可使用所述λ外切核酸酶。如果通过酶学方法去除该区域，则在后续步骤(如复制逆转极性)用所得的多核苷酸118代替多核苷酸116。
在某些实施方式中，多核苷酸116或118用作模板产生双链多核苷酸，例如用在所述第一结构域互补物中引发的引物进行核酸合成反应。该步骤有时称为复制逆转单链多核苷酸的极性，在某些情况下，该复制的双链中间体产物不显示(参见例如，图3)。例如，复制逆转多核苷酸116的极性导致单链多核苷酸120在5’至3’的方向上具有所述第一结构域(122)；反射序列(124)；多核苷酸106的互补物(与反射序列附近处位点A的互补物(位点A’；126)同向)；反射序列互补物(128)；和所述第一结构域的互补物(130)。
在某些实施方式中，所述多核苷酸中的所述第一结构域包含可用于一个或多个后续加工或分析步骤的一个或多个元件。这种序列包括但不限于：限制性酶切位点、PCR引物位点、线性扩增引物位点、逆转录引物位点、RNA聚合酶启动子位点(如用于T7、T3或SP6 RNA聚合酶)、MID标签、测序引物位点等。所述第一结构域中可包含任何方便的元件，且在某些实施方式中，由本文所述方法的使用者需求决定。
作为示范性实施方式，假定我们想要对汇集样品中多个基因组的特定多核苷酸区域测序，其中所述多核苷酸区域太长而无法在单一反应中测序。例如，利用Roche 454(康涅狄格州布兰福德(Branford，CT))技术对长度为2千碱基或更长的多核苷酸区域进行测序，其中单一测序运行的长度约为400个碱基。在这种情况下，我们可以设计对多核苷酸区域特异性的一组左侧引物(An)和右侧引物(Bn)，所述引物定位使我们可直接获得插入物所有部分的序列，如图1B所示。需要注意，图1B所示多核苷酸(140)具有结构域(142)，该结构域含有引物位点和MID，指明该多核苷酸源自哪个来源样品。因此，位点142是图1A中标为122的第一结构域位点的例子。多核苷酸也包括反射位点(144)，该位点可能是多核苷酸区域本身(如基因组序列)的一部分，在连接的衔接子结构域中与引物位点和MID(人工序列)一起加入，或两者的组合(跨衔接子/多核苷酸联接的序列)。
需要指出，多核苷酸140可归类为图1中多核苷酸100的前体，因为它不包含与反射位点互补的3’反射序列(图1A中的结构域108)。如下所述，多核苷酸140可转化成具有多核苷酸100的结构构型的多核苷酸，即适合用作本文所述反射方法(例如，利用Bn引物进行引物延伸并逆转极性)底物的多核苷酸。
在示范性实施方式中，各An-Bn引物对限定了长度约为400个碱基或更短的核酸区域。此大小范围在现有Roche 454测序平台的单测序运行阅读长度范围内；不同测序平台上可利用不同的大小范围的限定核酸区域。因此，各反射方法产生的各产物可以在一次运行中测序。需要指出，图1B所示引物对可用于限定图3所示的区域1-5(下文详述)。
在某些实施方式中，为了获得多核苷酸区域序列的第一部分(即，在原始结构中，多核苷酸最接近第一结构域的那部分)，我们只需要右侧引物(如B0)，我们不需要转移MID，因为它在该测序引物所及的范围内(即MID位于测序引物B0的400个碱基内)。所有其它Bn引物均具有加在其5’端的反射序列(B引物上的“R”元件)，因此将它们写成5’反射-Bn。但在某些实施方式中，B0引物包含反射序列，并且用于所述反射方法(以相应的A0引物一起)，如下所述。
如上所述，我们获得在5’到3’方向上具有引物位点(例如，用于Roche 454测序)、MID、反射序列和待测序多核苷酸的单链多核苷酸。获得感兴趣单链多核苷酸的许多方法已有记载并且为本领域已知，包括2007年5月15日授权的美国专利7,217,522；2006年3月16日提交的美国专利申请11/377,462；和2009年4月29日提交的美国专利申请12/432,080；各自通过引用全文纳入本文。例如，单链产物可利用线性扩增和模板引物位点的特异性引物来制得。在某些实施方式中，引物包括有利于分离感兴趣单链核酸的结合部分，例如，将上方链固定在固体支持物上固定的结合部分的结合伙伴上。通过热或高pH变性(或任何其它方便方法)去除杂交的非生物素化链用于分离生物素化链。在本文中，结合部分和其相应结合伙伴有时称为结合伙伴对。可采用任何方便的结合伙伴对，包括但不限于生物素/亲和素(或链霉亲和素)、抗原/抗体对等。
需要注意，虽然本文提供的有关反射方法的附图和描述介绍了对单链多核苷酸的操作，但不一定要求图中所述或所示的单链多核苷酸以分离形式(即与其互补链分离)存在于样品中。换言之，仅描述/介绍一条链时，也可使用双链多核苷酸，这通常由使用者决定。
利用上述方法或其变化形式分离单链的步骤(或任何其它方便的单链分离步骤)通常根据使用者需求进行。分离单链多核苷酸的一个例子见图2。在该图中，将初始的双链模板(具有如箭头所示的5’至3’方向)变性，并用引物位点的特异性生物素化合成引物引发。引物延伸(即，核酸合成)后，将样品接触结合有链霉亲和素的固体支持物。延伸链上的生物素部分(即，链霉亲和素的结合伙伴)将结合固相链霉亲和素。然后进行变性和洗涤，以去除所有非生物素化的多核苷酸链。如果需要，可从链霉亲和素支持物上洗脱所结合的多核苷酸，该多核苷酸可用于后续反射方法步骤(如用作Bn引物延伸反应的模板)。或者，结合的多核苷酸用于所需方法的后续步骤时，仍可结合于固体支持物(例如，在采用Bn引物进行的固相延伸反应中)。这种方法可用于多种要分离单链产物步骤的任意步骤中，其根据所用模板和所需单链多核苷酸的种类略有改变。需要指出，在某些实施方式中，结合于基材的生物素化多核苷酸可用于产生和分离非生物素化单链产物(即，洗脱非生物素化产物而使生物素化模板仍然结合于固体支持物上的链霉亲和素)。因此，如何用结合伙伴分离感兴趣单链多核苷酸的具体细节取决于实验设计参数而变化。
其它单链分离/产生方法包括不对称PCR，链特异性酶降解，和使用体外转录后接逆转录酶(IVT-RT)反应再破坏RNA链。如上所述，可采用任何方便的单链产生/分离方法。
对于图1B所示的单链多核苷酸，我们将具有大写字母“R”所示附加反射序列的Bn引物之一(如B1)与之退火，并在核酸合成条件下延伸引物，以产生在5’末端具有反射序列的多核苷酸拷贝。然后用所述第一结构域’(所述第一结构域102的互补物)中引物位点的特异性引物产生该多核苷酸的单链拷贝，以逆转极性。所得核酸具有图1A所示结构100，其中所述第一结构域102包括引物位点和MID。图1中的位点A(110)由所用5’反射-Bn引物的特异性决定。
然后进行所述反射方法(如图1所示)，以产生初始多核苷酸内的引物位点和MID紧邻所需位点(或感兴趣区域(ROI))(即所用引物如B1限定的位点)的产物。所得多核苷酸可根据使用者需要用于后续分析(例如，Roche 454测序技术)。
需要指出，虽然图1A和1B中未见显示，但将衔接子加到如本文所述的待加工多核苷酸中的任何方便方法均可用于实施反射方法(衔接子含有，例如引物位点、聚合酶位点、MID、限制性酶切位点和反射序列)。例如，可通过连接将衔接子加到特定位置上。在双链多核苷酸中，衔接子可设计成连接于特定的限制性酶切位点。使用单链多核苷酸时，可采用具有突出端的双链衔接子构建物，该突出端设计成结合所述单链多核苷酸的末端。例如，在后一种情况下，可使用末端转移酶和特定核苷酸改造单链多核苷酸末端，以包含与双链衔接子中突出端互补的特定核苷酸碱基。在其它实施方式中，利用以衔接子偶联引物进行的PCR或线性扩增在感兴趣位点上加入衔接子。再次强调，用于产生初始多核苷酸的任何方便方法均可用于实施本发明方法。
在某些实施方式中，可利用引物位点的特异性测序引物对核酸进行直接测序。该测序反应将读过插入物中的MID和所需位点。
在某些实施方式中，可利用合适的An引物(如，使用B1作为第一引物时，可采用引物A1)分离多核苷酸(或使其分成几部分)。在某些实施方式中，对An引发的多核苷酸施加核酸合成条件，以产生反射方法中所产生片段的拷贝。在某些实施方式中，An引物的5’末端附加有引物位点，可用于后续步骤，包括测序反应。在An引物中提供引物位点使得扩增和/或测序能够从所得片段的两端进行：从所述第一结构域102中的引物位点和An引物中的引物位点(图1B未显示)。由于引物位点的位置和其间隔距离(即，间隔小于一个测序运行)，从两端进行测序通常能捕获所需位点(或ROI)的序列和MID的序列，其可用于后续生物信息学分析，例如确切鉴定来源样品。需要指出，虽然可能从两个方向进行测序，但不一定需要这样做，因为单从任何一个引物位点进行测序就能捕获ROI的序列以及相应MID的序列。
需要指出，在某些实施方式中，与通过引物B1-Bn获得的片段中的ROI相比，从引物B0扩增/延伸直接获得的第一片段中ROI的极性被逆转。这是因为与B1-Bn产生的片段不同，B0产生的片段未经反射方法处理将ROI序列的方向相对于所述第一结构域/反射序列逆转(如上所述)。因此，B0引物可附加有可用于后续扩增和/或测序反应(例如，Roche 454测序系统)的引物位点(如在其5’端)，而不是如同引物B1-Bn那样的反射序列。然而，在某些实施方式中，如上所述，反射方法中可使用相应的上述B0-A0引物对，即使用具有5’反射序列的B0引物和具有相应5’衔接子结构域(如引物位点)的相应A0引物。
需要指出，因为待分析序列的特定部分由An-Bn引物对限定(如图示和如上所述)，所以与只用单一寡核苷酸结合事件(例如，使用微阵列上的探针)的现有提取方法相比，可实现高得多的序列特异性。
图3提供利用反射序列对多核苷酸中多个特定区域(即，λDNA中11kb区的区域1、2、3、4和5)进行测序的示范性实施方式的详细流程图。
产生单个亲本DNA片段202，其包含衔接子结构域(即Roche 454测序引物位点、单一MID和反射序列)和感兴趣序列。在所示实施例中，感兴趣序列来自λDNA，反射序列在上方链上(下方链是其互补链)。可采用产生该亲本DNA片段的任何方便方法，包括用包含衔接子结构域的引物扩增(例如，使用PCR)、将片段克隆到包含衔接子结构域的载体(例如，具有与克隆位点相邻的衔接子结构域的载体)中，或将衔接子连接于多核苷酸片段(例如，通过随机片段化、序列特异性限制性酶消化或其组合制备的片段)。虽然只显示具有单一MID的一个片段，但图3的步骤可应用于包含各自具有不同MID的多个不同片段的样品，例如，包含来自任何数量的不同来源(如不同个体)的同源片段群体的样品。图3描述产生五种子片段所涉及的后续酶促步骤，所述五种子片段中将区域1、2、3、4和5(如多核苷酸204中所示)重排安置到衔接子结构域的功能距离内(即，与衔接子结构域接近到足以在单次Roche 454测序反应中测序)。需要指出，某些步骤仅就区域4作显示(206)。
在步骤1中，五个感兴趣区域限定在亲本片段内(在多核苷酸204中标为1至5)，为各个区域设计相应引物对。在多核苷酸204下方显示各感兴趣区域与反射序列的距离。如图1B所述和所示设计引物对(即An-Bn引物对)。为了清楚，图3中只显示区域4的引物位点(围绕区域4的“引物位点”)。在步骤2中，用相应Bn引物进行序列特异性引物延伸(只显示区域4)，以产生具有结构208的单链多核苷酸(即在5’末端具有反射序列)。如图所示，用于区域4的Bn引物包含序列特异性引物位点，该位点在区域4的最3’端引物位点引发(其中“最3’端”参照模板链，在图3中是上方链)。将此多核苷酸复制回来，产生具有逆转极性的多核苷酸210(如用与454A’结构域杂交的引物复制)。多核苷酸210具有类似于图1上方所示多核苷酸100的结构。步骤4描述在反射序列和其互补物之间分子内引发，然后延伸以在3’端产生MID’和454A’结构的结果(多核苷酸212)。在图3所示的实施方式中，多核苷酸212用T7外切核酸酶处理以去除5’端的双链DNA(如图所示，该步骤任选)。为区域4形成的多核苷酸如216所示，也显示了为其它区域产生的多核苷酸(214)。
这里需要指出，可以在单独的反应中(即，区域1与衔接子结构域接近的结构在第一个样品中，区域2与衔接子结构域接近的结构在第二个样品中等)或者在一个或多个混合样品中形成各个多核苷酸214。
在步骤6中，复制多核苷酸214，以逆转极性形成多核苷酸218。在步骤7中，这些产物各自用特异性引物对的第二引物(参见An引物，如图1B所示)引发并延伸形成产物220，其中各第二引物在5’端连有第二Roche 454引物位点(454B)。步骤6和7可合并(例如，合并到一个PCR或其它扩增反应中)。
总之，图3显示如何将所述反射方法用于产生长度相似(如～500bp)的五个子片段220，各片段含有与反射序列的距离不同于初始结构202中的DNA序列，同时保持初始MID。
图4显示本文所述反射方法的另一示范性应用。在图4所示的实施方式中，从连接有衔接子的片段库中富集靶序列(即含有感兴趣区域“E”)。在某些实施方式中，随机剪切片段，选择某大小范围(如长度为100至5000个碱基对的DNA)，并用衔接子标记(如不对称衔接子，如2009年4月29日提交的美国专利申请序列号12/432,080所述)。图4所用的不对称衔接子包含测序引物位点(454A，如Roche 454测序平台所用)、MID、X序列和内部主干区(ISR)，其指代与衔接子连接位点相邻的不对称衔接子的互补性区域(参见例如，2009年4月29日提交的美国申请序列号12/432,080的说明书，通过引用全文纳入本文)。X序列可以是可用作含有X序列互补物的多核苷酸的结合位点的任何序列(类似于引物位点)。如下所述，X序列能够与具有5’突出端的寡核苷酸退火，所述5’突出端可用作衔接子寡核苷酸3’端延伸的模板。确定测序引物位点(图4的结构401中的454A引物位点)的测序方向，以使利用测序引物位点扩增衔接子连接片段沿远离连接的基因组插入物的方向进行。这使得初始不对称衔接子连接的文库对该引物引发的扩增，如PCR反应呈‘惰性’。
为了提取感兴趣区域(“E”区)，在杂交/退火条件下将该文库与含有3’X’序列和靶点特异性引发序列(1’序列)的寡核苷酸(403)混合。设计靶特异性序列1’，使其侧接感兴趣区域(基因组插入物中与E相邻的1’序列；需要指出，图4中只显示含E的多核苷酸片段)的一侧，这与PCR引物十分相似。引物403退火后，延伸杂交复合物，从而所有衔接子标记片段均在3’端获得靶特异性序列的互补物(即1序列)(参见结构405；箭头指延伸方向)。
然后将延伸产物405变性，在反射方法引发事件中允许1/1’区域在分子内杂交，此后进行核酸延伸形成结构407(从1引发位点开始延伸；如箭头所示)。该反射反应产生产物(407)，与母体结构(405)不同，该产物具有测序引物位点(454A)，其方向使利用该引物序列进行的延伸向感兴趣区域进行。因此，在不存在引发和延伸反射反应时，用测序引物进行延伸不会产生含有感兴趣区域(E区)的产物。换言之，只有含E区的靶多核苷酸才具有可扩增基因组物质的454A序列(结构407)。
反射方法(1/1’用作反射序列)完成后，进行PCR扩增反应以扩增感兴趣区域(以及相关联的衔接子结构域)。然而，进行PCR反应之前，用末端转移酶和ddNTP使片段样品“失活”以免进一步延伸。此种失活能防止非靶衔接子标记分子从3’引物1位点开始进行引物延伸。一旦失活后，则用测序引物(即454A引物409)和第二引物进行PCR反应，第二引物能从感兴趣区域对侧开始引发和延伸(即，引物411，其包含5’454B测序引物位点和3’“2”区，从E的与1区相对的末端开始引发)。只有进行反射方法和含有E区的片段才适合用作PCR反应的模板并产生所需产物(413)。
因此，图4举例说明的方法能够将衔接子结构域(如含有功能元件和/或MID)移动到所需感兴趣区域附近。
本文所述的反射方法与核酸计数方法联合后，可用于进行强效的连接分析。可利用标记和/或对具有独特标签的各单独核酸分子计数的任何方便方法(参见例如，2009年5月26日授权的美国专利7,537,897；2007年5月15日授权的美国专利7,217,522；2006年3月16日提交的美国专利申请11/377,462；和2009年4月29日提交的美国专利申请12/432,080；各自通过引用全文纳入本文)。所有这些方法可平行进行以节约劳力、事件和材料的成本。
在一个示范性实施方式中，用MID标记一大群序列，使得样品中的各个多核苷酸分子具有独特的MID。
换言之，样品中的各多核苷酸(例如，各单独的双链或单链多核苷酸)的MID标记不同于样品中每个其它多核苷酸上的其它MID。通常，为了进行这种分子标记，所用不同MID标签的数量应该是所分析分子的实际数量的许多倍。这将导致大部分单独核酸分子被标上独特的MID标签(参见例如，Brenner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2000 97(4)：1665-70)。因此，由反射方法从特定分子产生的任何序列(如上所述)将被标上相同的独特MID标签，因此产生固有关联。需要指出，一旦样品中的所有分子均被单独标记，则可按照加工需要对它们进行操作和扩增，只要MID标签保持在所产生的产物中。
例如，我们可能想要对一千个病毒基因组(或某具体基因组区域)或体细胞中一千个基因拷贝进行测序。用测序引物位点、MID和反射序列标记样品中各多核苷酸后(如附图和上文所述)，我们使用反射方法将各多核苷酸打断成适合所用测序方法的长度，将测序引物位点和MID转移至各个片段(如上所述)。从所有反射加工样品获得序列信息可用于确定初始样品中各个多核苷酸的序列，使用MID序列确定来自测序多核苷酸不同区域的序列之间的连接关系。使用具有较长阅读长度的测序平台可最大程度降低所用引物(和所产生反射片段)的数量。
上述优点见图5。该图显示鉴定样品中同源核酸(例如，衍生自二倍体细胞的染色体对或病毒基因组/转录物的同一区域)的核酸多态性的方法比较。上方示意图显示样品中的两种核酸分子(1和2)在多态性位点A、B和C处有不同多态性分配(A1、B1、C1和C2)。利用片段化进行的标准测序方法(左侧)可鉴定这些核酸中的多态性，但不保留连接信息。利用本文所述的反射方法鉴定多态性(右侧)能保留连接信息。需要指出，为了简明，没有显示反射方法所用的所有结构域结构和步骤。
试剂盒和系统
本发明还提供实施如上所述方法的试剂盒和系统，经安置将反射序列加到感兴趣核酸插入物中的载体，和进行本文所述的克隆或反射方法的任何步骤的试剂(如限制性酶、核苷酸、聚合酶、引物、外切核酸酶等)。按照需要，所述试剂盒的各个组件可放入单独容器中，或者某些相容性组分可预先混入单个容器中。
所述系统和试剂盒也可包括按照本发明方法制备或加工核酸样品的一种或多种其它试剂。所述试剂可包括一种或多种基质、溶剂、样品制备试剂、缓冲剂、脱盐试剂、酶学试剂、变性试剂，其中也可提供校准标准品如阳性和阴性对照。同样，所述试剂盒可包括一个或多个容器如小瓶或瓶，各容器含有进行样品加工或制备步骤的单独组分，和/或进行本发明核酸变体分离试验的一个或多个步骤的单独组分。
除上述组分外，本发明试剂盒通常还包括使用试剂盒组分实施本发明方法的说明书，例如，制备按照本发明方法各个方面进行反射方法的核酸样品的说明书。实施本发明方法的说明书通常记录在合适的记录媒介上。例如，所述说明书可印刷在基材如纸或塑料等上。同样地，所述说明书在试剂盒中可作为包装插入物存在、处于试剂盒或其组分的容器标签中(即与包装或分装相联)等。在其它实施方式中，通过存在于合适的计算机可读存储介质例如CD-ROM、磁盘等上的电子存储数据文件提供所述说明书。在另外一些实施方式中，试剂盒中不存在实际的说明书，但提供从远程来源例如经互联网获得说明书的手段。该实施方式的一个例子是包括网络地址的试剂盒，可从所述网络地址查看说明书且/或可从所述网络地址下载说明书。就说明书而言，获得说明书的手段记录在合适的基材上。
除了本发明数据库、程序和说明书外，所述试剂盒还可包括一种或多种对照样品和试剂，例如用于测试该试剂盒的两种或多种对照样品。
用途
本文所述反射方法在大量应用中提供显著优势，其中一部分如下所述(以及如上所述)。
例如，如上所述，反射方法的某些方面限定用引物对(例如，两个寡核苷酸如图1B的An-Bn所示)如在PCR中加以分析的序列具体区段。这导致序列特异性比只使用一种寡核苷酸序列的其它提取方法(例如，微阵列中使用的探针)更高。探针分离可能造成长度相对均一(从而使后续处理，包括扩增更均一)并且经修饰以适应所用的特定测序平台。
另外，如上所述，本发明诸多方面可用于分析所含多核苷酸标记有MID的多重样品(即，具有来自不同基因组样品的多核苷酸的样品)中的同源基因组位置。这是可能实现的，因为在分子内进行的反射过程能保持MID，因此将任何特定片段与来源样品关联起来。
最后，由于本文所述的反射方法在分子内发生作用，可测定同一较大片段上距离太远以至无法在一次序列读数中测序的不同区域之间的遗传连锁。这种连锁测定在植物和动物遗传学中(例如，用于确定某一组变异是否一同连锁在染色体的同一段上)或在病毒研究中(例如，用于确定某些变异是否一同连锁在病毒基因组/转录物(如HIV、肝炎病毒等)的同一段上)有巨大价值。
实施例
实施例I
图6和7利用合成的多核苷酸底物为本文所述反射方法提供实验数据和验证
方法
底物：
合成100碱基寡核苷酸底物(如图6A中图示)，内部荧光素-dT位于反射和反射’序列之间。该标记提供通过聚丙烯酰胺凝胶电泳检测寡核苷酸物质的方便而灵敏的方法。
延伸反应：
制备反应物，其中含有1μM 100碱基寡核苷酸底物、200μM dNTP、存在或不存在1μM竞争寡核苷酸、0.5μl各DNA聚合酶(“DNAP”)：Vent(NEB，2单位/微升)，Taq(恰根热启动Taq酶(Qiagen HotStarTaq)5单位/微升)和Herculase(司查塔基公司(Stratagene))，并用适合各聚合酶的商业缓冲液和dH2O补足至50μl。对于Taq滴定0.5μl、1μl、2μl和3μl，酶以相同的50μl体积使用。在百梅塔(Biometra)热循环仪上将该反应加热至95℃保持15分钟(Taq)或5分钟(Herculase、Vent)，随后在55℃或50℃保持30秒，最后在72℃孵育10分钟。
T7外切核酸酶消化：
用10μl上述延伸反应物、0.5μl T7外切核酸酶(NEB，10单位/微升)并用NEB缓冲液4和dH2O补足至50μl，以制备反应物。反应在25℃孵育30分钟。
凝胶电泳分析：
用8％变性聚丙烯酰胺凝胶分析反应物质。加载0.4μl延伸反应物和2μl消化反应物，并在800V运行约1.5小时。用安玛西亚(Amersham)/通用电气(General Electric)的台风(Typhoon)成像仪对凝胶进行荧光素分析。
结果
图6A显示反射序列方法的各个阶段的结构，其中左边显示预计核酸大小。具有测序引物位点(Roche 454测序引物A位点；标为454A)；MID；反射序列；插入物；和反射序列互补物的初始单链核酸的长度为100个核苷酸。自身退火和延伸后，预计产物长度为130个核苷酸。去除5’端的双链区后，预计该核酸的长度为82个碱基。
图6B显示使用三种不同核酸聚合酶(Vent、Herculase和Taq，在各泳道的上方表示)进行的三次实验的结果。进行退火的温度显示在各泳道上方(50℃或55℃)。上述三种核酸的大小在凝胶的左侧和右侧说明。
如图6B所示，似乎在使用Herculase的条件下延伸最有效率(Herculase是两种酶，即修饰的Pfu DNAP和Archaemax(dUTP酶)的混合物)。初始100碱基对核酸的大部分(或全部)被转化成130碱基对的产物(见泳道6和7)。然而，T7外切核酸酶消化后，Herculase的3’-5′外切核酸酶活性导致所需的82碱基产物部分消化(请注意泳道8和9中82碱基对位置处及其下侧的条带)。
在T7外切核酸酶消化后，缺乏3’-5′外切核酸酶活性的Taq酶在最终产物预计大小处显示更强的条带(见泳道13)。
图7显示Taq聚合酶用量增加的反射方法以及使用反射序列竞争物(图示见图7A)的效果。
如泳道2至5所示，Taq浓度提高将延伸提高到约转化90％初始核酸的水平(见泳道5)。泳道7至8显示，T7外切核酸酶消化不会留下完美的82碱基产物。这可能是由T7外切核酸酶几乎完成其从折回(fold-back)结构双链区5’端的消化时dsDNA瓦解所造成。需要指出，在许多实施方式中，从5’端去除若干额外碱基不会干扰后续分析，因为在后续步骤中常常去除5’端的碱基。
如泳道11-14所示，加入竞争物(能干扰反射序列退火形成折回结构)只会导致完全延伸产物少量减少(～5-10％)。因此，不出所料，分子内反应非常占优。虽然未作显示，但我们观察到竞争寡核苷酸也有相同量的延伸(～5-10％)。
竞争物浓度、反射底物浓度和总体遗传复杂性都可能影响特定结果。图6和7所示实验说明，本文所述反射方法的核心部分是有功能的并且是可以实施的。
实施例II
图8显示对特定感兴趣区域(ROI)的反射流程图(左侧示意图)和该流程的示范性结果(右侧凝胶)。原料是含有454A引物位点、MID、反射位点和在不同位置具有三个ROI(2、3和4)的感兴趣多核苷酸的双链核酸分子(700)。对该原料采用该图左侧示意图所示的ROI 2特异性反射方法(如上所述)，使用或不使用T7外切核酸酶步骤(图中所示T7外切核酸酶步骤标为“任选”)。
完成反射方法中所示的所有步骤后，包含或不包含T7外切核酸酶步骤，都应得到488个碱基对的双链多核苷酸(702)。
如图8右侧的凝胶所示，包含或不包含T7外切核酸酶步骤的反射方法均产生该488碱基对产物。
图9显示基于上述结果的反射方法的示范性方案。该图显示具体的反射法步骤，右侧指出何时纯化反应产物(例如，采用Agencourt SPRI珠去除引物寡核苷酸)。进行这种纯化步骤的一个原因是降低反应中产生副产物(如不需要的扩增子)的可能性。虽然图9显示三个纯化步骤，但根据使用者需求可采用更少或额外的纯化步骤。应指出，极性逆转步骤、反射引发和延伸步骤以及“伸展”(或变性)/第二极性逆转步骤均可在无间插纯化步骤的情况下进行。
图9所示方案包括以下步骤：
含有对R’区3’引物位点特异性的5′反射序列(或反射尾，如图中所示)的第一引物退火至起始多核苷酸，延伸(引物退火至多核苷酸902中R右侧引物位点的上方链，用*表示；该步骤代表右侧所示的第一次变性、退火和延伸过程)；
纯化后，加入454A引物并进行三个变性、退火和延伸的循环：第一个循环导致由454A引物复制回去，逆转刚刚合成的链的极性；第二个循环将所产生的双链结构打开，允许形成反射结构并延伸；第三个循环导致使用初始添加的相同454A引物再次复制回去；
纯化后，加入对具有5′454B尾的R’区的第二引物位点特异性的第二引物(该引物退火至多核苷酸904中R’区3’处的引物位点，用*表示)，并且变性、退火和延伸产生具有包围MID、反射序列和R’的454A和454B位点的多核苷酸产物。需要指出，对R’区特异性的第一引物和对R’区特异性的第二引物限定其边界，如上所述和如图1B所示)；
再次纯化后，加入454A和454B引物并进行PCR扩增反应。
实施例III
如上所述，反射序列可以是作为衔接子一部分加入多核苷酸的“人工”序列，或可基于正在分析的感兴趣多核苷酸中的序列，如基因组序列(或“非人工”序列)。
上述实施例中所示数据均采用“人工”反射位点。本实施例中，反射位点是所分析的多核苷酸中的基因组序列。
原料是含有454A位点、MID和待分析多核苷酸的双链DNA。通过连接衔接子将454A和MID加到亲本多核苷酸片段上，然后通过基于杂交的拉出反应(pull-out reaction)和后续的二次PCR扩增富集待分析的多核苷酸(参见图13中的路径1)。因此，本实施例所用的反射位点是主题多核苷酸的5’末端上通常存在的序列(基因组序列)。正在分析的多核苷酸包括长度为354碱基对的454A和MID序列远端的感兴趣区域。
该起始双链的长度是755个碱基对。根据该起始核酸中各相关结构域的长度，反射方法应产生461碱基对的产物。
图10显示反射方法所用原料(左图)和利用反射方法所得产物(右侧；按照实施例II所述进行反射方法，不使用T7外切核酸酶步骤)。各凝胶的最左侧泳道中包含大小梯，以便估计测试材料的大小。此图显示，755碱基对原料核酸被加工成预计的461碱基对产物，从而确认“非人工”反射位点能以序列特异性方式有效地将衔接子结构域从感兴趣多核苷酸中的一个位置移动到另一个位置。
实施例IV
图11显示实验示意图，该实验在单一较大初始模板(“亲本”片段)上进行反射法以产生各自具有不同感兴趣区域的五种不同产物(“子代”产物)(即产生的各子代产物具有区域1、2、3、4或5)。图11的示意图显示起始片段(11,060个碱基对)和各个不同的感兴趣区域特异性反射反应(如上所述进行反射反应)所得产物(各488个碱基对)。图11底部图片(凝胶)显示较大的起始片段(泳道1)和各区域特异性反射反应所得的子产物(泳道2至6，用方框标注感兴趣区域)，其中起始片段和子片段具有预计长度。产物测序证实凝胶所示各反射产物中感兴趣区域的种类。这些结果表明，可由单独的不对称标记的亲本片段产生多种不同反射产物，同时保持衔接子结构域(如引物位点和MID)。
实施例V
图12详细说明进行实验测定分子内重排(反射方法所需)相对分子间重排的普遍性。分子间重排是不利的，因为它可能导致MID从一个片段转移到另一个片段上(也称为MID交换)。如果在反射方法中第一片段中的反射序列与第二片段中它的互补物杂交，则可发生MID交换，导致MID从第二片段附加到第一片段上。因此，应最大程度减少分子间重排或MID交换，以防止MID从样品中的一个片段上转移到另一个片段上，这会导致错误标识片段来源。
为了测定不同反射条件下MID交换的普遍性，产生包含两种不同MID的具有不同大小的片段，如图12的上图所示。这些片段上的共有序列用作第一延伸反应的引发位点，以加入第二反射序列(参见例如，图3的步骤2)。图12显示片段大小各不相同的三个示范性片段(即，具有MIDB和MIDA组合的800碱基对；具有MIDC和MIDA组合的1900碱基对；具有MIDD和MIDA组合的3000碱基对)。在各MID家族(A、B、C和D)中，有10个不同成员(即，MIDA有10个不同成员，MIDB有10个不同成员等)。对各不同大小的片段(即800、1900和3000碱基对)产生一组片段大小各不相同的10个双MID片段，其中MID对(即，MIDA/MIDB、MIDA/MIDC和MIDA/MIDD)标为1/1、2/2、3/3、4/4、5/5、6/6、7/7、8/8、9/9和10/10。然后，将大小相同的所有10个片段混合在一起，进行反射方法。
由于片段的结构域结构，成功的反射方法导致各片段的两个MID被移动到足够接近而能用Roche 454测序平台的一次阅读进行测序的程度(参见图12示意图所示的反射产物)。各片段大小的反射反应在四种不同片段浓度下进行，以确定该参数以及片段长度对MID交换普遍性中的影响。对所进行的各反应的反射产物进行454测序，以确定各片段上MID的种类，从而确定发生MID交换的比例。
图12的左下图显示各不同浓度(X轴；300、30、3和0.3nM)下，各不同片段长度的MID交换率(Y轴，用不正确(或交换)MID对的％表示)。如该图所示，不出所料，随着浓度降低MID交换率降低，因为与分子内不同，分子间结合事件有浓度依赖性(即，较低浓度导致分子间杂交/结合降低)。此外，MID交换率随着长度增加略有下降。这有点出乎意料，因为在浓度较低时较长DNA片段的末端相互作用效率高。我们没有观察到这一现象的原因可能是在最终PCR过程中持续产生反射引发中间体，这意味着造成MID交换的反射引发反应持续发生。很可能是较短的反射产物能以较高比率进行“背景”反射，从而略微提高总体MID交换率。
这些结果证明，可通过改变某些反应参数，例如降低片段浓度和/或片段长度，最大程度降低MID交换(例如，降至低于2％、低于1％或甚至接近不可检测水平)。
图12的右下方图显示800碱基对片段(即，含MIDA/MIDB的片段)的反射方法中的MID交换频率。该图中，各圆圈的面积与含相应MIDA和MIDB物质(如MIDA1/MIDB1；MIDA1/MIDB2等)的读数数量成正比。因此，代表200个读数的圆圈面积是代表5个读数的圆圈面积的40倍。
如上所述，在进行反射方法之前该样品中存在的MIDA/MIDB组合由含相同编号的MIDA/MIDB组合(分别显示在X和Y轴上)代表(即，初始样品中存在MIDA/MIDB组合1/1、2/2、3/3、4/4、5/5、6/6、7/7、8/8、9/9和10/10)。Roche 454测序鉴定出的所有其它MIDA/MIDB组合均是MID交换的结果。
该图显示，反射方法中发生的MID交换是随机的，即MID交换不会因反应中MID的种类而变化。
示范性反射方案
图13显示对各自用独特MID标记的核酸库进行反射方法的示范性方案示意图，所述核酸库包括例如，来自不同个体的核酸库。在路径3中，对汇集和标记的延伸文库直接进行反射方法。在路径2中，通过靶点特异性杂交富集汇集的文库，然后进行反射方法。路径1中通过PCR扩增富集。如图13所示，可以对汇集的、标记的延伸文库直接进行PCR富集，或者在进行基于杂交的富集步骤后进行二次PCR反应以富集(如路径2)，以产生适合反射方法的扩增子底物。也可实施制备用于反射方法的多核苷酸样品的其它路径(例如，具有额外的扩增、纯化和/或富集步骤的方法)，其通常取决于使用者需求。
虽然出于阐明目的已经通过说明和举例的方式对本发明有所描述，但本领域普通技术人员根据本发明的教导不难了解，可以对本发明作出某些改变和修改而不背离所附权利要求书的构思和范围。
因此，前述内容只是说明本发明的原理。应理解，本领域技术人员能够设计各种安排，虽然本文没有明确描述或显示这些安排，但它们均体现本发明的原理，应该包含在本发明构思和范围内。而且，本文所述的所有举例和条件语言主要旨在辅助读者理解本发明的原理和本发明对现有技术作出的贡献，应理解为不限于这些具体说明的例子和条件。而且，本文有关本发明原理、诸多方面、实施方式以及具体实施例的所有陈述都应包括其结构和功能等同物。此外，这些等同物应包括目前已知的等同物和将来开发的等同物，即新开发的具有相同功能的任何结构的等同物。因此，本发明的范围不应仅限于本文所示和所述的示范性实施方式。适当的是，本发明的范围和构思由所附权利要求书限定。
Claims (20)
1.一种在核酸内移动结构域的方法，所述方法包括：
a)使样品中多核苷酸链的反射序列与所述多核苷酸链中所述反射序列的互补物退火，其中所述多核苷酸链在5’至3’方向上包含以下元件：
第一结构域；
所述反射序列；
感兴趣多核苷酸；和
所述反射序列的互补物，其中所述反射序列的互补物位于所述多核苷酸链的3’末端；和
b)从所述反射序列的互补物的3’末端延伸通过所述第一结构域，产生双链区；
所述第一结构域的互补物位于所述延伸的多核苷酸链的3’末端，从而在所述多核苷酸链中移动所述第一结构域。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一结构域包含多重标识物(MID)。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一结构域包含引物位点。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反射序列的长度为10至50个核苷酸。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反射序列包含RNA聚合酶位点。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括从所述双链区的5’末端去除所述第一结构域和所述反射序列。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述去除步骤包括用T7外切核酸酶处理步骤b所述的核酸。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一结构域位于连接所述感兴趣多核苷酸的衔接子区。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述反射序列位于衔接子区。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述反射序列是所述感兴趣多核苷酸的5’区域内的序列。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样品是多重样品，其中所述样品中各多核苷酸链内的所述第一结构域包含对应于其亲本样品的MID。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样品包含多个多核苷酸链，其中所述样品中各多核苷酸链在所述第一结构域中包含独特的MID。
13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多核苷酸链通过下述步骤产生：
使核酸合成引物与亲本多核苷酸链退火，其中所述亲本多核苷酸链在5’至3’方向上包含以下元件：
所述第一结构域；
所述反射序列；和
包含感兴趣多核苷酸的第二结构域；
其中所述核酸合成引物包含：
3’引发结构域，该结构域与所述第二结构域中感兴趣多核苷酸相邻且在3’方向上的位点互补；和
5’反射序列；
延伸所述核酸合成引物，产生延伸产物；和
用在所述第一结构域的互补物的3’末端上退火的第二核酸合成引物复制所得的延伸产物，从而产生所述多核苷酸链。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述第二结构域的长度是30个碱基至30,000个碱基。
15.如权利要求13所述的方法，其特征在于，在基于序列进行退火的步骤之前富集所述亲本多核苷酸链。
16.如权利要求1所述的方法，该方法还包括以下步骤：
c)用在所述第一结构域的互补物的3’末端上退火的第一核酸合成引物复制步骤b的多核苷酸链，从而产生第一延伸产物；
d)使第二核酸合成引物与所述第一延伸产物退火，其中所述第二核酸合成引物包含与所述第一延伸产物中感兴趣多核苷酸内的位点互补的3’引发结构域；和
e)延伸所述第二合成引物，以产生第二延伸产物。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述第二合成引物包含不与所述第一延伸产物中感兴趣多核苷酸互补的5’结构域。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述第一结构域包含第一引物位点，且所述第二合成引物的5’结构域包含第二引物位点。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述第二延伸产物中感兴趣多核苷酸的长度是50至10,000个核苷酸。
20.一种多核苷酸链，其在5’至3’方向上包含以下元件：
第一结构域；
反射序列；
感兴趣多核苷酸；和
所述反射序列的互补物，其中所述反射序列的互补物位于所述多核苷酸链的3’末端。
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