CN102481380A

CN102481380A - 体内肿瘤血管系统成像

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Publication number: CN102481380A
Application number: CN2010800394906A
Authority: CN
Inventors: M.多伯兹; C.克莱恩; J.萨姆; W.舒尔
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2009-07-09
Filing date: 2010-07-09
Publication date: 2012-05-30
Also published as: WO2011003996A1; JP2012532846A; US20120226119A1; CA2766861A1; SG177583A1; EP2451487A1

Abstract

本发明涉及对受试者中的肿瘤血管系统体内成像的非侵入性方法和用途，包括检测经荧光标记的抗CD31抗体。在又一方面，本发明涉及在受试者中体内监测抗血管生成剂的治疗功效的非侵入性方法和用途，包括检测经荧光标记的抗CD31抗体。另外，提供了在本发明的方法中使用的试剂盒，其包含经荧光标记的抗CD31抗体和用于近红外荧光成像以检测受试者中的该抗体的手段。

Description

体内肿瘤血管系统成像

血管形成经由血管生成(vasculogenesis)和血管发生(angiogenesis)过程发生。血管生成是胚胎发育期间血管内皮细胞自前体细胞(称为成血管细胞)的重新分化。

此过程与血管发生过程不同，血管发生过程是一种以自先前存在的血管萌发新血管为特征的重塑过程(Folkman和D’Amore，Cell 1996；第87卷：1153-1155；Risau，Nature 1997；第386卷：671-674)。始终广泛认为，血管生成仅在早期胚胎发生期间发生。最近的研究揭示了内皮祖干细胞的存在，而且已经发现这些骨髓衍生细胞掺入成人中的新血管病灶(包括受损伤的角膜、缺血性下肢和肿瘤血管系统)中，提示血管生成可以在成人中发生(Asahara等，Science 1997；第275卷：964-967；Shi等，Blood 1998；第92卷：362-367)。

然而，血管发生在胚胎发生期间，并且以有限的程度在成人中，例如在女性生殖系统中、在生理性伤口愈合中及在病理性疾病过程诸如癌症中发生(Klagsbrun和Moses，Chemistry&Biology 1999；第6卷：217-224)。

血管发生是由各种生长因子诸如血管内皮生长因子(VEGF)和成纤维细胞生长因子(FGF)刺激的。对血管发生刺激因子的早期应答是蛋白酶诸如基质金属蛋白酶(MMP)家族成员对内皮细胞基底膜的降解。MMP降解胶原和其它胞外基质组分(见图1)。破坏基底膜屏障让内皮细胞自先前存在的血管向血管生成刺激迁移并增殖(Marsh，Stem Cells 1997；第15卷：180-189)。血管细胞粘着分子通过介导细胞-胞外基质相互作用来促成内皮细胞迁移。主要的介导物之一是整联蛋白α_vβ₃，即蛋白质诸如纤连蛋白的一种受体。整联蛋白α_vβ₃的拮抗剂抑制新血管的生长，提示细胞粘着是血管发生中的一个至关重要的步骤(Brooks等，Cell 1994；第79卷：1157-1164)。在迁移和增殖后，内皮细胞装配成具有开放腔的管。生成成熟血管中的一个重要步骤是间充质细胞的募集及其随后分化成平滑肌细胞样周细胞，认为所述平滑肌细胞样周细胞稳定化新形成的血管系统。这些周细胞逐渐被内皮丛吸引，导致血管树的进行性覆盖(Benjamin等，Development 1998；第125卷：1591-1598)。在此期间，未覆盖的毛细管发生消退，这在获得周细胞包被后停止。因此，血管形成的此较晚期阶段以重塑步骤为特征，其中切除不受保护的血管，并且经周细胞覆盖的血管变得稳定，而且不太易于脱稳定化和消退。大概自内皮细胞来源衍生的血小板衍生生长因子(PDGF)募集周细胞以与内皮细胞联合，从而提高血管稳定性(Lindahl等，Science 1997；第277卷：242-245)。图1中也显示了上文所描述的血管发生中的过程。

血管生成和血管发生，特别是新血管发生是不仅在正常的发育中，而且在异常发育中诸如在肿瘤形成中发生的过程。也就是说，肿瘤细胞的增殖和存活依赖于生长因子的足够供应和毒性分子的除去。在实体组织中，例如氧可以自毛细管放射状扩散仅150至200μm。

在距离超过这点时，继之以细胞死亡(Vincent等，CANCER-Principles&Practice of Oncology，第5版；Lippincott-Raven)。如此，肿瘤块的扩大超出直径为2mm依赖于足够血供的形成。许多出版物描述了肿瘤血管发生的现象。可以将肿瘤植入无血管区，诸如角膜中，或者在特征性血管化表面，诸如鸡尿囊绒膜上植入，及在每种情况中形成新毛细管向内生长的观察结果提示了肿瘤释放血管发生的扩散性活化剂，其可以向静止的血管系统发信号以开始毛细管萌发(Hanahan和Folkman，Cell 1996；第86卷：353-364)。

在过去数年中，已经通过使用许多体外和体内生物测定法，诸如增殖测定法和趋化性测定法来鉴定血管发生的许多诱导物和抑制剂。增殖测定法使用培养的毛细管内皮细胞，并测量增加的细胞数目或经放射性标记的或经修饰的核苷的掺入以检测S期的细胞。相反，趋化性测定法通过多孔膜盘来分开内皮细胞和测试溶液，使得内皮细胞迁移穿过屏障指示测试溶液中存在的化学引诱物(Hanahan和Folkman，Cell 1996；第86卷：353-364)。

通过使用体内测定法，诸如角膜中的植入物，可以补充体外测定法。已经使用这些测定法来鉴定血管发生的数种诱导物和抑制剂。要检测的第一种是成纤维细胞生长因子，并且几乎同时，通过其引发血管通透性的能力鉴定一种分泌性蛋白质，称作血管内皮生长因子或血管通透性因子(VEGF)(Simpson-Haidaris和Rybarczyk，Annals of the New York Academy of Sciences2001；第936卷：406-425)。已经显示了这两种蛋白质(VEGF，FGF)都能够增强毛细管生长，并且如此，是血管发生的有力诱导物。

最近，已经鉴定出两种相关生长因子VEGF-B和VEGF-C，并且所有三种VEGF基因及FGF在小鼠和人的正常成年器官中广泛表达，提示在组织稳态及血管发生中的作用。FGF和VEGF结合内皮细胞上的受体，其是跨膜酪氨酸激酶，并且如此经由信号转导级联与细胞调节网络偶联(Brown等，EXS1997；第79卷：233-269)。

FGF和VEGF通常在极其多种人和动物癌症中表达，并且它们已经在显著分数的携带肿瘤的患者的尿液和血清中以升高的水平检出(Simpson-Haidaris和Rybarczyk，Annals of the New York Academy of Sciences2001；第936卷：406-425)。在过去数十年期间，已经鉴定出数目日益增加的血管生成诱导物，而且还已经呈现了内源血管发生抑制剂的第一项证据。例如，研究人员分别使用基于体外趋化性的测定法和角膜袋体内测定法观察到α干扰素和血小板因子-4可以抑制内皮细胞趋化性和增殖(Brouty-Boyé和Zetter，Science 1980；第208卷：516-518)。

上述段落汇总了如下的证据，即血管发生可以受到内皮细胞增殖和迁移的诱导物和抑制剂两者调节。

目前，存在着提示抑制剂和诱导物的平衡决定血管生成开关的线索。数个线索为此假设提供了基础。第一个线索来自体外生物测定法。如提及的，使用增殖和趋化性测定法，FGF和VEGF可以引发来自毛细管内皮细胞的正响应。实验已经表明了，量增加的抑制剂诸如血小板反应蛋白-1(TSP-1)阻断血管发生，提示足够量的抑制剂压倒正活化剂的信号，将血管生成开关保持关闭(Dameron等，Science 1994；第265卷：1582-1584)。第二个线索来自人癌细胞的研究，其中p53肿瘤阻抑物功能的恢复导致TSP-1的上调，压倒细胞自身合成的血管发生诱导物及添加的FGF两者(Dameron等，Science 1994；第265卷：1582-1584)。这些和其它线索提示了正和负信号平衡的变化介导“血管生成开关”(见图2)。

已知血管生成和血管发生，特别是新血管发生是肿瘤形成中的关键因素，研究人员对以最终杀死肿瘤为目的干扰这些过程感兴趣。因而，在超过30年前，研究人员假设为了存活和生长，肿瘤需要血管，并且通过切断血供，可以将癌症饥饿成消退。

这种针对癌症的革命性方法已经发展成目前科学调查的最令人兴奋的领域之一。在过去数十年中，研究人员已经分离出调节血管发生的蛋白质并解开调节血管发生的过程(Ribatti，Angiogenesis 2008；第11卷：3-10)。在理论上，血管生成级联的每个步骤是癌症疗法的一个潜在靶物。已经分离并表征了内皮增殖和血管发生的许多特异性和非特异性抑制剂。美国国家癌症研究所(National Cancer Institute，NCI)协调临床试验中的19种潜在的血管发生抑制剂，而它们中的5种现在处于临床3期(NCI，国家癌症研究所的官方网站)。两种相当有希望的抑制剂血管他丁(angiostatin)和内皮他丁(endostatin)抑制内皮细胞的增殖。没有招致周细胞、成纤维细胞和肿瘤细胞自身的增殖。血管他丁在前列腺癌异种移植物中显示99％肿瘤抑制，而内皮他丁在数种鼠肿瘤模型，诸如路易士(Lewis)肺癌和B16F10黑素瘤中揭示肿瘤消退(O’Reilly等，Cell 1994；第79卷：315-328；O’Reilly等，Cell 1997；第88卷：277-285)。现今，主要的制药公司已经认识到该有希望的主题，并且致力于开发抑制血管发生活化剂诸如VEGF、FGF或血管生成素的新抗体。

已经开发并测试数种抗体，获得或大或小的成功。例如，安维汀(Avastin)(即一种为抑制血管内皮生长因子而设计的抗体)因其在乳腺癌和结肠癌患者中的抑制效果获得很大成功而驰名。发表了第一项研究，其中在恶性肿瘤的基因疗法中使用血管发生抑制剂。除了那点之外，在用特异性血管生成抑制剂的动物研究中，迄今为止尚未报告副作用(NCI，国家癌症研究所的官方网站)。已经对TNP-470仅部分报告了血管发生抑制剂也可以抑制重要的生理学功能，诸如伤口愈合的评价。已经显示了伤口愈合在小鼠中延迟(O’Reilly等，Science 1999；第285卷：1926-1928)。其它抑制剂如内皮他丁或血管他丁对小鼠中的伤口愈合或其它生理学功能没有显示负影响。

总之，已经完成了许多努力来研究血管发生。研究人员已经分离出调节血管发生的蛋白质。已经实施了数项体外研究以研究内皮血管形成。在过去数十年中，研究人员认识到血管发生在肿瘤形成中确实也发挥主要的作用。使用动物中的植入物的早期研究报告了由肿瘤组织诱导的血管生成应答，即血管形成比由正常组织诱导的或伤口后的血管生成应答更实质性且更早。因为已经显示了肿瘤生长是血管发生依赖性的，所以各公司聚焦于开发针对血管生成生长因子的新药物以使肿瘤饥饿成消退。为了监测肿瘤血管发生，特别是在用抗血管生成药物的治疗期间，研究人员尝试并应用不同成像技术、不同血管靶物和染料。

然而，迄今为止应用的成像技术不容许实时条件下的体内成像。例如，计算机断层摄影术(CT)、正电子发射断层摄影术(PET)、单光子发射计算机化断层摄影术(SPECT)和磁共振成像(MRI)是一些经典的非侵入性成像技术(见表1)。基于解剖学、形态学和生理学变化，这些技术容许诊断疾病，诸如癌症。然而，大多数这些建立的技术缺乏灵敏性，降低特异性靶向，而且不能展现出以分子为基础的功能变化，并且如此不是基础研究、临床前和转化应用中的合适工具。因此，仅可以在晚期、形态学可见的时间点时诊断出疾病。

其它成像技术遭受不得不自受试者获得包括血管系统的肿瘤材料的缺陷。

肿瘤内的血管系统一般经历活跃的血管发生，导致新血管的连续形成以支持生长中的肿瘤。此类血管生成血管与成熟的血管系统的可区别之处在于血管生成血管系统表达独特的内皮细胞表面标志物，包括α_vβ₃整联蛋白(Brooks等，Cell 1994，第79卷：1157-1164；WO 95/14714)和血管生成生长因子受体(Mustonen和Alitalo，J.Cell Biol.1995，第129卷：895-898；Lappi，Semin.Cancer Biol.1995，第6卷：279-288)。此外，肿瘤血管系统与一般的血管在组织学上的可区别之处在于肿瘤血管系统是有孔的(Folkman，Nature Med.1995，第1卷：27-31；Rak等，Anticancer Drugs 1995，第6卷：3-18。如此，血管生成血管系统是一种用于靶向肿瘤归巢分子的特别有吸引力的靶物。

因而，α_vβ₃整联蛋白、血管生成生长因子诸如VEGF及其受体是用于对肿瘤血管系统成像的有吸引力的靶物。US 6,958,140提示了肝配蛋白(ephrin)-B2为用于成像，特别地对肿瘤血管系统成像的血管靶物。US 6,051，230提示了FGF为用于成像的靶物。EP 627 940提示了ELAM-1-1、VCAM-1、ICAM-1、LAM-1或MHC II类抗原。Citrin等，Mol Cancer Ther.2004，第4卷：481-8提示了内皮他丁。Bix等，J Natl Cancer Inst.2006，第98卷：1634-1646提示了Endorepellin。其他作者提示了使用MPI造影剂，即钆(Saban等，BMC Cancer2007，第7卷：219-238)。

此外，迄今为止没有发现成像技术、血管标志物和染料间的合适相互作用，其容许肿瘤血管系统的非侵入性体内成像或在受试者中在实时条件下监测抗血管生成剂的治疗功效。因而，研究人员停留于用于对肿瘤血管系统成像的已知技术，并且如此对肿瘤的冷冻切片应用免疫化学技术(参见Ninomiya等，J.Surg.Res.2009，第154卷：196-262)。一些研究人员通过使用CD31抗体来应用对补充有Matrigel并植入小鼠中的HUVEC的命运的体内成像(Bogdanov等，Pharm.Res.2007，第24卷：1186-1192)。这些作者提示了使用CD31抗体来对人内皮细胞在小鼠中的过继转移体内成像及出于生物工程目的在确定人细胞在小鼠模型中的命运中以及在药物开发中使用CD31抗体。具体地，这些作者想要追踪人细胞在小鼠中的命运，并且如此测定抗CD31抗体对小鼠中人内皮细胞的特异性。然而，这些作者没有通过使用经标记的CD31抗体使用小鼠肿瘤模型来显现肿瘤的血管形成。另外，这些作者提示了非侵入性成像可以充当一种重要的辅助以监测细胞过继及最后体内接受的命运。因而，他们进一步提示了如此，抗CD31抗体可以是一种用于对人内皮细胞在小鼠中过继转移成像的潜在成像剂，以及这些抗体可以出于生物工程目的帮助确定人细胞命运及帮助药物开发。然而，这些作者没有提示使用抗CD31抗体来在受试者中体内监测抗血管生成剂的治疗功效。

Mitra和Foster，Neoplasia 2008，第10卷：429-438应用体内共焦荧光成像来显现光敏剂单-L-天冬氨酰二氢卟酚-e6(NPe6)的摄取和肿瘤内分布。光敏剂在光动力疗法中使用。光动力疗法是一种第三水平的癌症治疗，其牵涉三种关键的组分：光敏剂、光和组织氧。因而，Mitra和Foster调查NPe6光敏剂的分布及其动力学。出于所述目的，他们经由尾静脉对小鼠EMT6肿瘤模型系统性施用NPe6，并且通过使用缀合有Alexa Fluor 647的抗小鼠CD31抗体就血管系统而言显现NPe6。然而，Mitra和Foster没有使用经标记的抗CD31抗体来显现肿瘤血管系统。他们应用此类抗体来显现NPe6光敏剂的分布。

Runnels等，Mol.Imaging 2006，第5卷：31-40在小鼠中应用体内成像来显现血管内皮细胞的典型粘着分子的分子表达。因而，Runnels等施用针对例如CD31(PECAM-1)、E-选择蛋白、P-选择蛋白和VCAM-1的单克隆抗体，并调查这些蛋白质的时间和空间表达。然而，Runnels等没有显现肿瘤血管系统，因为他们没有使用肿瘤模型，并且对显现血管系统根本不感兴趣，而是对显现例如CD31的表达感兴趣。

JP 2009126864披露了一种血管成像剂，其能够显现膜中的血管，并且其是一种与靶物定向基团和检测基团组合的聚合物。

总之，尽管有可用于监测血管发生，特别地肿瘤血管发生的各种成像技术、各种血管靶物和许多染料的知识，据我们所知，仍需要寻找用于显现肿瘤血管发生和/对肿瘤血管系统体内成像，特别地在用治疗性抗血管生成药物治疗期间和/或之后的合适手段和方法。更具体地，仍需要提供用于对受试者中的肿瘤血管系统体内成像及用于对受试者中的抗血管生成剂的治疗功效成像的非侵入性手段和应用这些手段的方法。

因此，本发明的技术问题遵照上文所描述的需要。

本发明解决此需要，并且如此作为技术问题的解决办法提供关注通过检测经荧光标记的抗CD31抗体来对肿瘤血管系统体内成像及在受试者中体内监测抗血管生成剂的治疗功效的手段，例如工具和试剂盒及应用这些手段的方法和用途的实施方案。这些实施方案在本文中表征并描述，在实施例中例示，并在权利要求书中反映。

本申请的发明人以非侵入性研究肿瘤血管发生，优选地在实时条件下，特别地在用治疗性抗血管生成剂治疗期间和/或之后非侵入性研究肿瘤血管发生为目的应用不同成像技术、血管标志物、用于结合这些血管标志物的手段和便于显现所述手段结合这些血管标志物的染料。他们还以寻找对显现肿瘤血管最合适的成像剂、染料和成像技术为目的检查各种成像参数，由此对肿瘤血管系统成像。

他们可以实现其目的及用于非侵入性显现并量化肿瘤血管发生的已建立的且评估的手段和方法。具体地，他们已经发现了，在已经尝试的不同成像技术、血管标志物、用于结合这些血管标志物的手段和便于显现所述手段结合这些血管标志物的染料中，应用抗CD31抗体的基于荧光的监测方法对于通过检测经荧光标记的抗CD31抗体对肿瘤血管系统非侵入性成像和/或在受试者中监测抗血管生成剂的治疗功效是最合适的。本发明人惊讶的是，CD31是一种特别适合于肿瘤形成期间的血管发生的标志物，因为已经可以预期肿瘤特异性血管发生标志物更合适。

此外，通常在内皮细胞、血小板、巨噬细胞和库普弗(Kupffer)细胞、粒细胞、T/NK细胞、淋巴细胞、巨核细胞、破骨细胞、嗜中性粒细胞上找到CD31。CD31还在某些肿瘤，包括上皮样血管内皮瘤、上皮样肉瘤样血管内皮瘤、其它血管肿瘤、组织细胞性恶性肿瘤、和浆细胞瘤中表达。

还可以在嗜中性粒细胞、单核细胞、骨髓细胞、未成熟的淋巴样细胞、髓样造血细胞和来自白血病和淋巴瘤患者的细胞的膜中以及在血小板和内皮细胞膜中找到CD31。

如此，已经可以预期抗CD31抗体会非特异性结合许多细胞/组织，由此产生太多的背景信号。然而，本发明人令人惊讶地观察到相反的事情。

总之，开发的方法对于以高的信号-比-背景比率特异性监测肿瘤血管发生是可行的。它容许比较肿瘤血管系统，并且能够监测抗血管生成剂抑制肿瘤血管形成和/或对肿瘤血管施加异化影响的能力和/或功效。

因而，在第一方面，本发明涉及对受试者中的肿瘤血管系统体内成像的非侵入性方法，包括检测经荧光标记的抗CD31抗体。本文中所描述的方法和用途容许实时成像，即直接显现血管系统，特别是肿瘤血管系统，使得不需要显现照片等的延迟。因而，可以直接(在线)显现血管系统，特别地肿瘤血管系统的任何变化。实时成像的优点在于可以在施用例如抗血管生成剂后不久监测此类药剂的效果。

术语“对肿瘤血管系统体内成像”还包括对肿瘤形成期间发生的血管发生体内成像或体内监测。它还包括对血管，特别地肿瘤血管体内成像或体内监测。

具体地，所应用的方法基于经荧光标记的抗CD31抗体，其已经证明为靶物特异性的，并且适当地显现血管。

如本发明人已经证明的，CD31是一种用于显现肿瘤血管系统的特别有用的标志物，因为CD31是一种在血管发生期间，特别地肿瘤形成中的血管发生期间表达的标志物。

更具体地，对不同靶向剂、基于抗体的或非肽的分子检查对血管生长和分布成像。所有药剂在血管发生中具有关键的作用，并且是药物开发的重要靶物。它们比体外试剂面临更严格的设计标准。基本的根本性困难是以高的靶物比背景比率设计它们。例如，应当存在有最小的非特异性组织外渗、被巨噬细胞内在化、或肾或肝消除，但是应当在感兴趣的区域产生高的局部浓度。出于这些原因，单抗3-alexa647、抗CD31-alexa610和单抗7-alexa700服从特定标记设计，尽管对单一抗体使用多拷贝alexa标记物(比率为约1/3)。第四种成像剂IntegriSense 680是一种靶向性荧光成像剂，其包含一种有力的、选择性非肽的小分子整联蛋白α_vβ₃拮抗剂和NIR荧光染料。已经对它进行开发以显现整联蛋白α_vβ₃表达，即一种通过在新血管系统中及在肿瘤细胞中介导细胞-胞外基质相互作用来促成内皮细胞迁移的细胞粘着分子。用单抗3-alexa647的成像结果揭示了一种强烈的且肿瘤浓缩的信号，然而，Nuance成像研究指示抗体与肿瘤细胞结合，但是不可检出血管(见图16A)。已经显示了单抗3生长因子复合物被猴视网膜切片中的肿瘤掺入。相反，抗CD31-alexa610成像在整个小鼠身体中展现出规则的抗体分布。这可以通过所使用的单克隆抗体(抗小鼠CD31)和小鼠CD31的最小程度表达解释。组织学检查显示血管毛细管的充分限定的轮廓(见图16B)。第三种成像剂单抗7-alexa700及其血管生成生长因子靶物似乎经由整个血液系统循环，在肺和肝中结束。Nuance成像仅可以在鼠间质中检出弱的信号强度和少量的抗体。血管不可见(见图16C)。IntegriSense680(即认为能够显现新血管系统的非肽小分子)不是适合于监测所使用的异种移植物中的血管发生的成像剂。在体内，它以低的靶物比背景比率给出强烈的信号。然而，通过靶向肿瘤细胞，而不是期望的血管来产生此信号(见图16D)。

为此，本发明人观察到，仅抗CD31抗体以高的信号-比-背景比率特异性标记血管内皮细胞。

可以在本发明的试剂盒、方法和用途中应用容许检测经荧光或近红外荧光标记的结构，例如器官或肿瘤的任何合适的成像系统。

一种优选的成像系统是本文中所描述的MAESTRO系统(见图5)，其容许靶物特异性体内活体成像以检查肿瘤血管系统，包括肿瘤中的血管发生。除了这点外，有可能同时在仅一只小鼠中测定靶物特异性信号。该程序能够分开两个发射光谱，并以不同颜色显现这两种试剂。此外，可以比较信号强度，并且容许关于靶物浓度和分布的结论。用alexa700标记赫赛汀(Herceptin)(即一种人源化的单克隆抗体，其结合HER2受体)，并将其以相等浓度与抗CD31-alexa610一起注射以检查不同表达样式和成像系统的灵敏性(见图17)。可以分开荧光信号，并且信号强度的比较揭示了CD-31信号比赫赛汀-alexa700的信号弱百倍(见图17E-F)。通过离体Nuance图像确认这些结果，如本文中所描述的。肿瘤细胞表面上浓缩的赫赛汀比代表血管毛细管的小鼠CD31+内皮细胞多得多地存在。

对于理想的成像条件，期望高的靶物-比-背景比率。剂量减少的循环成像试剂和微少的非特异性结合是最好的成像结果必需的。相反，肿瘤内的靶物特异性浓度应当为最大值。IntegriSense680的成像结果表明背景信号随时间逐渐降低。试剂注射后2小时和5小时的成像图揭示由循环的荧光剂或非特异性结合引起的高背景信号(见图18)。后来的时间，可以将这些探针代谢，随后消除。

MAESTRO成像系统是一种平面荧光反射成像系统，并且因此近红外放射的组织渗透是有限的。荧光信号强度取决于其在小鼠组织中的位置(深度)。因此，成像剂在器官如肝、脾、肾和肺中的信号相对于在上部组织切片，如皮下肿瘤中的信号不能精确量化。肿瘤和排泄器官中自体内活体成像获得的单抗3-alexa647信号强度与用Nuance系统的离体研究中的信号分布不相关联。虽然体内研究展现出肿瘤中的最高药剂浓度，但是对外植器官的荧光检查揭示在肝、肾和脾中更高的，或者至少相似的浓度(见图19)。这些结果与信号强度高度依赖于成像剂的组织深度的理论一致。

总之，已经评估了对血管生成剂特异性的数种成像剂以在体内监测肿瘤血管发生并且非侵入性使用体内荧光成像，优选地近红外成像。可以用MAESTRO系统在体内评估成像探针，并且任选地，以离体方式在经福尔马林固定的经石蜡包埋的肿瘤切片中评估以测试这些标志物的灵敏性和特异性。内皮细胞的鉴定和肿瘤的血管分布是随后研究的先决条件。仅抗CD31标志物以高的信号-比-背景比率特异性标记血管内皮细胞(见图28)。它还容许单一血管的离体显现作为量化方法的起始点。

本发明还涵盖，在如本文中所描述的对肿瘤血管系统体内成像或者在受试者中体内监测抗血管生成剂的治疗功效外，可以通过用本文中所描述的任何成像技术检测经标记的抗体来对受试者中经标记的抗CD31抗体的位置监测/成像。

此别的方面提供了关于抗体位置的概述。例如，关于抗体是否也在血液中，特别地在血清中，在肾、膀胱等中，可以对其监测。因而，也可以根据抗体的特异性、半衰期、分布等来判断。

在所要求保护的方法和用途中，对受试者胃肠外，优选地静脉内施用抗体，优选地在治疗期间的不同时间点时，并通过荧光成像系统，优选地通过近红外荧光成像系统诸如荧光反射成像(FRI)系统或通过荧光介导的断层摄影术(FMT)系统对其体内成像。

可用于实施本发明的NIR荧光测量的成像系统通常包含三种基本构件：(1)近红外光源，(2)用于分开或区分荧光发射与用于荧光染料激发的光的手段，和(3)检测系统。

光源提供单色(或基本上单色)近红外光。光源可以是适当过滤的白光，即，来自宽带来源的带通光。例如，可以将来自150瓦特卤素灯的光通过可购自Omega Optical(Brattleboro，VT)的合适带通滤光器。在一些实施方案中，光源是激光。参见例如Boas，D.A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1994，第91卷：4887-4891；Ntziachristos，V.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2000，第97卷：2767-2772；Alexander，W.，J.Clin.Laser Med.Surg.1991，第9卷：416-418。

可以使用高通滤光器(700nm)来分开荧光发射与激发光。合适的高通滤光器可购自Omega Optical。

一般地，可以认为光检测系统包括光聚集/图像形成构件和光检测/图像记录构件。虽然光检测系统可以是并入这两种构件的单一集成装置，但是光聚集/图像形成构件和光检测/图像记录构件可以是分开的。

可以在本发明中使用任何合适的光检测/图像记录构件，例如电荷耦合装置(CCD)系统或照相胶片。光检测/图像记录的选择会取决于包括所使用的光聚集/图像形成构件的类型的因素。选择合适的构件、将它们装配成近红外成像系统、及操作所述系统在本领域的普通技术内。

在本发明中应用的体内成像技术还包括FMT技术(荧光分子断层摄影术)、基于激光的三维成像系统，其提供小动物模型中的非侵入性、全身、深组织成像，而且产生荧光源的3D重建和/或容许测量由于本发明中应用的经荧光标记的抗CD31抗体结合所致的经荧光标记的结构的荧光浓度。该系统容许测定成像探针的实际分布。平面二维成像(见图29A)揭示了肿瘤区内的最高抗体浓度，而用FMT系统的3D成像研究容许小鼠身体中的抗体分布的评估改善(见图29B-D和图31)。因此，可以在更实际的方法中分析荧光信号强度的量化。

在实施本发明的方法和用途时，优选的是，要对受试者施用经荧光标记的抗CD31抗体，之后检测抗体，即来自经荧光标记的抗CD31抗体的信号。如上文提及的，然后涵盖的是，要在相同位置处和/或在与第一位置不同的位置处为了控制、排除另一个肿瘤的复发在治疗期间及任选地在治疗后的不同时间点时施用抗体。还有，为了在治疗前显现肿瘤血管系统和/或为了在监测抗血管生成剂的治疗功效前显现肿瘤以便然后评估抗血管生成剂是否治疗有效，可以在治疗前施用抗体。

近红外荧光成像系统的例子是所附实施例中所描述的MAESTRO系统。因而，MAESTRO系统是一种优选的系统，其可以在本发明的试剂盒、方法和用途中应用。

MAESTRO系统是一种平面荧光反射成像系统，其容许非侵入性体内荧光测量。在此多光谱分析中，在特定波长捕获一系列图像。捕获的波长范围应当覆盖存在于标本中的标记物的预期光谱发射范围。结果会是一系列称作“图像立方体(image cube)”的图像，并且它是用于限定自身荧光和特定标记物两者的个别光谱的此一系列图像内的数据。生物学感兴趣的许多标记物具有相似的发射光谱，使得使用昂贵的窄带滤光器分离是困难或不可能的。用单一长通发射滤光器替换大量发射滤光器。在皮肤、毛皮、皮脂腺的天然自身荧光外，还存在着来自共栖生物体(真菌、螨等)和摄取食物(叶绿素)的独特自身荧光。多光谱分析经由发射荧光的线性信号混合物的数学解开(分解)能够分开来自应用于标本的特定标记物的所有这些信号，只要期望信号和自身荧光的发射光谱是已知的。

用MAESTRO系统的测量如下运转：给照明模块装备激发白光的氙气灯(Cermax)。经由下游连接的激发滤光器(由实验者选择)，将光限定于(对于该实验)期望的波长范围，并经由光纤引导入成像模块中。在这里，将受限制的光划分入照亮麻醉的测试动物的四根光纤中。MAESTRO系统自动选择最佳的暴露时间，从而没有过度暴露的风险。用发射滤光器选择激活的荧光探针的发射荧光光(见表1)，并经由液晶(LC)引导至高灵敏性、冷却型CCD照相机。液晶使照相机能够进行特定波长的选择性照片记录。波长测量范围取决于选定的滤光器组(蓝色、绿色、黄色、红色、深红色、NIR)，并且以10nm为梯级记录照片。在一个称作“图像立方体”的“照片包”中组合每个单一照片的光谱信息。

表1：Maestro滤光器组。

用MAESTRO系统的分析如下运行：

每次记录由12比特黑白照片组成，其可以以4096个不同灰度显示并且因此有可能区别发射强度的最小差异。相反，人眼能够区别30-35个灰度。针对波长范围将发射强度的那些数值(灰度)绘图，并且因此，我们获得每个探针和组织自身荧光的发射光谱。软件将三个基本色(红色、绿色、蓝色)细分成用于成像立方体的波长范围，由此黑白照片变成有颜色的图像(RGB图像，见图6B)。在这些获取的多光谱信息外，系统能够区别注射的探针和任何来源的自身荧光。程序是使用光谱文库，其中每个纯探针的单一光谱和通过对没有任何注射的研究动物(Balbc/裸鼠或Scid米色小鼠)成像获取的光谱(小鼠自身荧光)。通过已知纯的成像和自身荧光的精确光谱，系统能够过滤期望光谱的整个图像，并且将颜色归入它们中的每个。起源图像(分解的合成图像)显示不同颜色的目前光谱。为了显现探针信号的强度分布，有可能以假颜色显示信号，而低强度是蓝色，并且高强度区是红色。除了那点外，可以限定探针的信号强度的检测限度，其容许降低循环探针和非特异性结合的信号。

用MAESTRO系统的比较和量化如下运行：

MAESTRO比较图像荧光团区的能力使其易于比较治疗期间的肿瘤荧光信号强度。程序提供了用于比较肿瘤区(比较的图像)中的不同信号强度的工具。因为在最佳的暴露时间时拍摄所有图像，所以它们随信号强度而有所不同。对于可靠的比较，相对于一个暴露时间标准化照片，导致信号强度差异的显示。通过手工绘制并修饰测量区，可以以强度值量化信号强度。一旦在肿瘤周围选定测量面积，便可以将其克隆，并移动至要比较的下一图像。基于目前的设置(台高度和框并(binning))以像素和mm2计算每个区域。因此，它给出关于创建的测量面积内平均信号、总信号、最大信号和平均信号/暴露时间(1/ms)的信息(见图7)。

体内荧光成像系统，特别是优选地在本发明的方法、用途和试剂盒中应用的近红外荧光成像系统容许比较和量化体内信号，并且如此例如不仅容许血管系统，特别是肿瘤血管系统的体内成像，而且可以通过经荧光标记的抗CD31抗体信号随时间的升高或降低来揭示并比较抗血管生成剂的效果。也就是说，可以通过经标记的抗CD31抗体对CD31的结合(或不结合)来显现血管的增加或减少，即血管发生/血管越少，由抗体提供的信号越小或者，同样地，血管越多，由抗体提供的信号越大。

已经应用离体实验来确认体内数据。具体地，将肿瘤外植，固定并在石蜡中包埋以用荧光显微镜检查肿瘤切片。

因而，在本发明的一个优选的方面，本文中所描述的试剂盒、方法和用途可以包括如下的步骤，其包括通过适合于此目的的任何技术，例如通过免疫化学、免疫组织化学、组织学技术，例如组织染色，或mRNA表达序型分析来确认体内数据。

具体地，对于组织染色，将肿瘤外植，制备切片，将其固定，在石蜡中包埋，并用例如苏木精-曙红染色，如在所附实施例中更为详细描述的。可以通过例如

系统对如此染色的肿瘤切片离体成像。

用Nuance照相机的多光谱成像技术获取关于石蜡或冷冻切片的高灵敏性图像，并且容许定量且灵敏测量光谱发射的微妙差异。Nuance具有两个主要优点。第一，它能够完成明视场成像，而且它还可以充当一种卓越的彩色照相机。第二，在荧光显微术中，在自身荧光的样品，如大多数组织切片中，Nuance通过使用滤光器组和多光谱分析来分开组织自身荧光与感兴趣的信号。Nuance系统也记载于所附实施例中，并且是本发明的试剂盒、方法和用途中应用的一个优选的实施方案。

作为肿瘤外植的一个例子，将动物处死，并依照承诺的准则(GVSolas，Felasa，TierschG)外植肿瘤。在处死动物后，使用例如手术刀将肿瘤外植，并转移入包埋盒中或者在具有异戊烷(用于免疫组织化学应用)和没有异戊烷(用于mRNA/PCR应用)的液氮中快速冷冻。

作为固定的一个例子，将外植的肿瘤在包埋盒中密封，并在连续摇动下在福尔马林中温育，优选地持续约24小时。此后，弃去福尔马林，并用蒸馏水(dest.water)清洗肿瘤，接着将肿瘤脱水，并用石蜡渗透。使用Tissue

VIP真空渗透处理器来实施所有温育步骤。

在石蜡渗透后，用组织

石蜡包埋机(Paraffin embedding station)将肿瘤在液体石蜡中包埋成最终的组织块。使用切片机自这些块获得厚度范围为2-8μm的石蜡切片。将它们切割，在玻璃载玻片上举起，于37℃空气干燥过夜，接着去石蜡化(de-paraffinization)和HE染色(见实施例4.10和表6和7)。用Nuance系统检查载玻片。

另外，本发明在一个优选的方面还提供了一种量化肿瘤切片中的经荧光标记的血管面积的方法。此量化在本发明的方法和用途中可以作为进一步的步骤应用。

具体地，在肿瘤的组织染色的背景中如上文所描述的那样制备肿瘤切片。因而，可以使用定制的书面MATLAB脚本(其通过使用k-均值聚簇来分开抗CD31信号)来实施石蜡切片中的血管密度量化(见图10B)。然后，将过滤的特定信号转化成二进制图像，并“腐蚀”以除去扰乱的信号(腐蚀功能)。在倒转照片后(见图10C)，有可能手工限定血管出现的区域。该程序以红色标记感兴趣的区域(见图10D)，并计算记录照片内的血管区域的百分比。

此血管量化工具容许每块载玻片的血管面积的百分比。涵盖的是，此工具可以以如下的方式应用，使得系统应当通过人工智能自动鉴定并计算血管面积。系统会能够区别血管面积和非特异性信号，并计算包埋的血管面积。

关于免疫组织化学，胃肠外，优选地静脉内注射未标记的抗CD31抗体，将肿瘤外植，优选地在注射抗体后24小时左右，在例如液氮和异戊烷中快速冷冻，并切片。通过使用针对未标记的抗CD31抗体的Ig亚型的二抗，例如山羊抗小鼠IgG来鉴定未标记的抗CD31抗体。此技术更为详细地记载于所附实施例中，并且是本发明的试剂盒、方法和用途的一个优选的实施方案。

作为免疫组织化学的一个例子，贯穿整个肿瘤切片显现肿瘤血管，将未标记的内皮抗体(来自小鼠、仓鼠、大鼠等的抗小鼠CD31)注射入受试者中。例如，在小鼠中，以50μg/小鼠的浓度注射未标记的来自仓鼠的抗小鼠CD31。在注射后24小时时外植肿瘤，并在液氮和异戊烷中快速冷冻后切片。使用二抗(山羊抗仓鼠IgG)碱性磷酸酶系统来鉴定未标记的血管标志物(见图9)。载玻片扫描仪容许显现整个肿瘤切片。

对于免疫组织化学应用，将肿瘤在切割后立即在异戊烷和液氮中快速冷冻，并于-20℃保持，直至切片。例如，用Cryostat(2800 Frigocut)于-18℃的最佳切割温度切出10μm肿瘤冷冻切片，用丙酮固定1分钟，空气干燥，并用于免疫组织化学应用。

免疫染色规程和微小扫描详细记载于所附实施例中。

就mRNA表达序型分析而言，将肿瘤外植，并在例如液氮(没有异戊烷)中快速冷冻。将肿瘤溶解，同质化，并依照本领域中通常已知的并且还在所附实施例中显示的方法来制备RNA。然后，将cDNA制备，并对其定性和/或定量分析血管生成生长因子诸如FGF、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、其受体诸如VEGFR1或VEGFR2和/或血管生成素的表达。作为定量表达分析中的加载对照，可以使用典型的持家基因诸如β-肌动蛋白或GAPDH。

mRNA表达序型分析的一个优选的实施方案更为详细地记载于所附实施例中。可以使用它来监测治疗性抗血管生成剂诸如本文中所描述的抗血管生成剂的效果，其通过例如测定牵涉肿瘤样品中的血管发生的基因诸如VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGFR1、VEGFR1和/或Ang2的存在和/或表达水平来实现。因而，mRNA表达序型分析是可以在进一步，即别的步骤中应用的本发明的试剂盒、方法和用途的一个优选的实施方案。

用荧光标记物(包括近红外荧光标记物)标记本发明的方法和用途中应用的抗体。因而，在本发明的试剂盒、方法和用途的背景中使用时，术语“荧光”包括本领域中通常已知的或如本文中所描述的荧光标记物，而且还包括近红外荧光标记物，后一种是本发明的背景中优选的。使用荧光团的化学反应性衍生物来实现荧光标记。常见的反应性基团包括胺反应性异硫氰酸盐衍生物诸如FITC和TRITC(荧光素和罗丹明的衍生物)、胺反应性琥珀酰亚氨基酯诸如NHS-荧光素、和硫氢基反应性马来酰亚胺活化的荧光素(fluor)诸如荧光素-5-马来酰亚胺。任何这些反应性染料与另一种分子的反应产生荧光团和经标记的分子间形成的稳定共价键。因而，可以用前述荧光标记物标记本发明的抗体。本发明涵盖的其它合适的荧光标记物是Alexa Fluor、DylightFluor和ATTO染料。同样地，可以使用荧光蛋白诸如GFP、YFP或CFP。还有，涵盖要使用通过pH变化或电压、温度活化的可活化荧光染料。还涵盖的是，经标记的抗CD31抗体包含超过一种荧光或近红外荧光标记物，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10种。同样地，涵盖的是，在本发明的试剂盒、方法和用途中应用2、3、4、5、6、7、8、9或10种不同荧光或近红外荧光标记的抗CD31抗体。这些不同抗体结合CD31，然而，可以结合不同表位。

在备选中，可以间接标记本发明的抗CD31抗体。例如，通过针对未标记抗体的二抗标记(由于其结合未标记抗体的恒定区)未标记的抗CD31抗体，其中所述二抗投递荧光信号。

如提及的，也可以用近红外(NIR)荧光标记物标记本发明的试剂盒、用途和方法中应用的抗体。使用在近红外光谱中具有激发和发射波长的NIR荧光标记物，即640-1300nm，优选地640-1200nm，且更优选地640-900nm。电磁谱的此部分的使用使组织穿透最大化，并使生理学丰富的吸收剂诸如血红蛋白(＜650nm)和水(＞1200nm)的吸收最小化。体内使用的理想的近红外荧光染料展现出：

(1)窄的光谱特征，

(2)高灵敏性(量子产额)，

(3)生物相容性，和

(4)解耦吸收和激发光谱。

各种近红外(NIR)荧光标记物是商品化的，并且可以用于依照本发明制备探针。例示性的NIRF标记物包括下列各项：Cy5.5、Cy5和Cy7(Amersham，Arlington Hts.，IL)；IRD41和IRD700(LI-COR，Lincoln，NE)；NIR-I，(Dejindo，Kumamoto，Japan)；LaJoIIa蓝(Diatron，Miami，FL)；吲哚花青绿(indocyaninegreen，ICG)及其类似物(Licha，K.，等，SPIE-The International Society for OpticalEngineering 1996；第2927卷：192-198；US 5,968,479)；吲哚三羰花青(indotricarbocyanine)(ITC；WO 98/47538)；和螯合的镧系元素化合物和SF64、5-29、5-36和5-41(来自WO 2006/072580)。荧光镧系元素金属包括铕和铽。镧系元素的荧光特性记载于Lackowicz，J.R.，Principles of FluorescenceSpectroscopy，第2版，Kluwer Academic，New York，(1999)。

优选地，通过选自下组的NIR荧光标记物来标记本发明的抗体：Cy5.5、Cy5、Cy7、IRD41、IRD700、NIR-I、LaJoIIa蓝、吲哚花青绿(ICG)、吲哚三羰花青(ITC)和SF64、5-29、5-36和5-41(来自WO 2006/072580)，更优选地，用选自下组的NIRF标记物标记所述抗体：Cy5.5、Cy5和Cy7。

用于偶联NIR荧光标记物的方法是本领域中公知的。NIR荧光标记物与抗体的缀合技术在过去数年期间已经显著成熟，并且卓越的综述参见Aslam，M.和Dent，A.，Bioconjugation(1998)216-363，London及Tijssen，P.，“Practiceand theory of enzyme immunoassays”(1990)，Elsevier，Amsterdam中的“Macromolecule conjugation”一章。

合适的偶联化学自上文所引用的文献(Aslam，见上文)已知。NIR荧光标记物(取决于存在哪个偶联模块)可以与水性或有机介质中的抗体直接起反应。偶联模块是一种用于化学偶联荧光染料标记物与抗体的反应性基团或活化的基团。可以将荧光染料标记物直接附着于抗体或者经由间隔物与抗体连接以形成包含抗体和NIR荧光标记物的NIR荧光标记物偶联物。可以选择或设计所使用的间隔物，从而本质上具有长得适当的体内持续性(半衰期)。

在本文中使用时，受试者包括哺乳动物和非哺乳动物受试者。出于治疗的目的，“哺乳动物”指分类为哺乳动物的任何动物，包括人、家畜和牲畜、非人灵长类、和具有乳房组织的任何其它动物。哺乳动物包括人、啮齿类诸如小鼠、大鼠或家兔、犬、猫、黑猩猩等，其中人是优选的。受试者还包括人和兽医患者。例如，非哺乳动物受试者是鸡、鸭或斑马鱼。在本发明的方法和用途的优选的方面，要用抗血管生成剂治疗受试者。

此外，本发明人应用本文中所描述的方法和用途来在受试者中监测抗血管生成剂针对肿瘤血管系统(包括血管发生)的治疗功效，并且发现它也适合于此目的。

具体地，本发明的方法和用途容许比较和量化体内信号，并且如此可以通过经荧光标记的抗CD31抗体信号随时间的升高或降低来揭示并比较抗血管生成剂的效果。

更具体地，测定用抗血管生成剂治疗期间和/或之后受试者中的抗CD31抗体荧光信号的升高或降低，并与用抗血管生成剂治疗前的抗CD31抗体荧光信号比较。此比较容许判断抗血管生成剂的治疗效果。

因而，本发明的方法和用途提供了关于肿瘤体积变化与肿瘤血管系统变化间的关联的数据和/或信息，由此容许在受试者中监测抗血管生成剂的治疗效果。

另外，可以通过组织学应用，诸如组织染色、免疫化学或免疫组织化学来确认如此获得的数据和/或信息，如本文中所描述的，并且如此可以作为本发明的方法和用途的另外的步骤实施。

或者/另外，可以通过mRNA表达序型分析来确认如此获得的数据和/或信息，从而揭示抗血管生成剂的效果，并且如此可以作为本发明的方法和用途的另外的步骤实施。

实质上，本发明的方法和用途适合于监测肿瘤形成期间的血管发生，优选地以高的信号-比-背景比率。如此，它容许比较肿瘤血管系统，而且能够揭示抗血管生成治疗剂抑制肿瘤血管形成和/或异化肿瘤血管的不同能力或效率。

如本文中所使用的，术语“抗体”指免疫球蛋白或其片段，并且涵盖包含抗原结合片段或抗原结合域的任何多肽。该术语包括但不限于多克隆、单克隆、单特异性、多特异性、非特异性、人源化的、人的、单链、嵌合的、合成的、重组的、杂合的、突变的、嫁接的、和体外生成的抗体。除非前面有词语“完整的”，术语“抗体”包括抗体片段诸如Fab、F(ab’)₂、Fv、scFv、Fd、dAb、和保留抗原结合功能的其它抗体片段。通常，此类片段会包含抗原结合域。

抗体(又称为免疫球蛋白)通常是各为约25kDa的两条轻(L)链和各为约50kDa的两条重(H)链构成的四聚体糖基化蛋白质。可以在抗体中找到两类轻链，称作λ和κ。根据重链恒定域的氨基酸序列，免疫球蛋白可以归入5种主要类：A、D、E、G、和M，并且这些中的数种可以进一步分成亚类(同种型)，例如IgG1、1gG2、IgG3、IgG4、IgA1、和IgA2。每条轻链包括N端可变(V)域(VL)和恒定(C)域(CL)。每条重链包括N端V域(VH)、3或4个C域(CH)、和铰链区。与VH最接近的CH域称为CH1。VH和VL域由4个称作框架区的相对保守序列区(FR1、FR2、FR3、和FR4)(其形成三个高变序列区(互补决定区，CDR)的支架)组成。CDR含有负责抗体与抗原的特异性相互作用的大多数残基。CDR称为CDR1、CDR2、和CDR3。因而，重链上的CDR组分称为H1、H2、和H3，而轻链上的CDR组分称为L1、L2、和L3。

CDR3通常是抗体结合位点内最大的分子多样性来源。例如，H3可以短到2个氨基酸残基或者大于26个氨基酸。不同类的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是本领域中公知的。关于抗体结构的综述，参见Antibodies：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Harlow等编，1988。本领域技术人员会认可，每个亚基结构，例如CH、VH、CL、VL、CDR、FR结构包含活性片段，例如VH、VL、或CDR亚基中结合抗原的部分，即抗原结合片段，或者例如CH亚基中结合和/或激活例如Fc受体和/或补体的部分。CDR通常指Kabat CDR，如记载于Sequences of Proteins of immunological Interest，US Department of Health and Human Services(1991)，Kabat等编的。另一种用于表征抗原结合位点的标准指高变环，如由Chothia所描述的。参见例如Chothia，D.等；J.Mol.Biol.1992，第227卷：799-817；及Tomlinson等，EMBO J.1995，第14卷：4628-4638。又一个标准是由Oxford Molecular的AbM抗体建模软件所使用的AbM定义。一般参见例如Protein Sequence and StructureAnalysis of Antibody Variable Domains.于：Antibody Engineering Lab Manual(Duebel，S.和Kontermann，R.编，Springer-Verlag，Heidelberg)。或者，可以使用就Chothia高变环或AbM限定环而言相似的所述关系来执行就Kabat CDR而言所描述的实施方案。

Fab片段(抗原结合片段)由通过恒定区间的二硫键共价连接的VH-CRI和VL-CL域组成。F_v片段更小，并且由非共价连接的V_H和V_L域组成。为了克服非共价连接的域解离的趋势，可以构建单链F_v片段(scF_v)。scF_v含有连接(1)V_H的C端与V_L的N端，或(2)V_L的C端与V_H的N端的柔性多肽。可以使用15聚体(Gly₄Ser)₃肽作为接头，但是其它接头是本领域中已知的。

装配和体细胞突变后的抗体基因序列是高度变化的，并且估计这些变化的基因编码10¹⁰种不同抗体分子(Immunoglobulin Genes，第2版，Jonio等编，Academic Press 1995，San Diego，CA)。

术语“抗原结合域”和“抗原结合片段”指抗体分子中包含负责抗体与抗原间特异性结合的氨基酸的部分。抗原中被抗体特异性识别并结合的部分称为“表位”。抗原结合域可以包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)；然而，它不必须包含这两者。例如，Fd片段具有两个VH区，并且经常保留完整的抗原结合域的一些抗原结合功能。抗体的抗原结合片段的例子包括(1)Fab片段，即一种具有VL、VH、CL和CH1域的单价片段；(2)F(ab’)₂片段，即一种具有通过铰链区处的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(3)具有两个VH和CH1域的Fd片段；(4)具有抗体单臂的VL和VH域的Fv片段，(5)dAb片段(Ward等，Nature 1989，第341卷：544-546)，其具有VH域；(6)分离的互补决定区(CDR)，和(7)单链Fv(scFv)。虽然Fv片段的两个域VL和VH是由不同基因编码的，但是可以使用重组方法、通过合成接头来将它们连接，使它们能够作为单一蛋白质链生成，其中的VL和VH区配对以形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如Bird等，Science 1988，第242卷：423-426；及Huston等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1988，第85卷：5879-5883)。使用本领域技术人员已知的常规技术来获得这些抗体片段，并且以与完整抗体相同的方式对片段评估功能。

术语“人抗体”包括具有基本上与本领域中已知的人种系免疫球蛋白序列对应的可变和恒定区的抗体，包括例如那些由Kabat等(参见Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department ofHealth and Human Services，1991 NIH Publication No.91：3242)所描述的。本发明的方法和用途中应用的人抗体可以包括例如CDR，且特别地CDR3中不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机或定点诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。人抗体可以具有至少1、2、3、4、5、或更多个用不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基替换的位置。

本领域技术人员已知的许多方法可用于获得抗体或其抗原结合片段。例如，可以使用重组DNA方法(美国专利4,816,567)来生成抗体。也可以依照已知方法通过生成杂交瘤(参见例如Kohler和Milstein，Nature 1975，第256卷：495-499)来生成单克隆抗体。然后，使用标准方法，诸如酶联免疫吸附测定法(ELISA)和表面等离振子共振(BIACORE^TM)分析来筛选以此方式形成的杂交瘤，以鉴定一种或多种生成与规定抗原特异性结合的抗体的杂交瘤。可以使用规定抗原的任何形式作为免疫原，例如重组抗原、天然存在形式、其任何变体或片段、及其抗原肽。

一种生成抗体的例示性方法包括筛选蛋白质表达文库，例如噬菌体或核糖体展示文库。噬菌体展示记载于例如Ladner等，美国专利No.5,223,409；Smith，Science 1985，第228卷：1315-1317；Clackson等，Nature 1991，第352卷：624-628；Marks等，J.Mol.Biol.1991，第222卷：581-597；WO 92/18619；WO91/17271；WO 92/20791；WO 92/15679；WO 93/01288；WO 92/01047；WO92/09690；及WO 90/02809。

在使用展示文库外，可以使用规定的抗原来免疫非人动物，例如啮齿类，例如小鼠、仓鼠、或大鼠。在一个实施方案中，非人动物包含人免疫球蛋白基因的至少一部分。例如，有可能用人Ig基因座的大片段工程化改造小鼠抗体生成方面有缺陷的小鼠系。使用杂交瘤技术，可以生成并选择具有期望特异性的自基因衍生的抗原特异性单克隆抗体。参见例如XENOMOUSE^TM，Green等，Nature Genetics 1994，第7卷：13-21，US 2003-0070185、1996年10月31日公布的WO 96/34096、和1996年4月29日提交的PCT申请No.PCT/US96/05928。

在另一个实施方案中，自非人动物获得单克隆抗体，然后可以使用本领域中已知的重组DNA技术来生成经修饰的，例如人源化的、去免疫化的、嵌合的。已经描述了多种用于生成嵌合抗体的方法。参见例如Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81：6851，1985；Takeda等，Nature 1985，第314卷：452，Cabilly等，美国专利No.4,816,567；Boss等，美国专利No.4,816,397；Tanaguchi等，欧洲专利公开文本EP 171 496；欧洲专利公开文本0 173 494，英国专利GB 2177096B。例如，也可以使用转基因小鼠来生成人源化抗体，所述转基因小鼠表达人重链和轻链基因，但是不能表达内源小鼠免疫球蛋白重链和轻链基因。Winter描述了可以用于制备本文中所描述的人源化抗体的例示性CDR嫁接方法(美国专利No.5,225,539)。可以用非人CDR的至少一部分替换特定人抗体的所有CDR，或者可以用非人CDR替换仅一些CDR。仅必需替换人源化抗体结合预定的抗原需要的CDR数目。

可以通过用来自人Fv可变域的等同序列替换Fv可变域中不直接牵涉抗原结合的序列来生成人源化抗体或其片段。用于生成人源化抗体或其片段的例示性方法由Morrison，Science 1985，第229卷：1202-1207；由Oi等，BioTechniques 1986，第4卷：214；及由US 5,585,089；US 5,693,761；US5,693,762；US 5,859,205；及US 6,407,213提供。那些方法包括分离、操作、和表达编码来自至少一条重链或轻链的整个或部分免疫球蛋白Fv可变域的核酸序列。可以自生成针对预定靶物的抗体的杂交瘤(如上文所描述的)及自其它来源获得此类核酸。然后，可以将编码人源化抗体分子的重组DNA克隆入合适的表达载体中。

可以通过引入保守替代、共有序列替代、种系替代和/或回复突变来优化人源化抗体。可以通过本领域中已知的数种技术之任一来生成此类改变的免疫球蛋白分子(例如Teng等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1983，第80卷：7308-7312；Kozbor等，Immunology Today 1983，第4卷：7279；Olsson等，Meth.Enzymol.1982，第92卷：3-16)，并且可以依照PCT公开文本WO 92/06193或EP 0 239 400的教导来生成。

也可以通过WO 98/52976和WO 00/34317中披露的方法通过AT细胞表位的特定删除或“去免疫化”来修饰抗体或其片段。简言之，可以对抗体的重链和轻链可变域分析结合MHC II类的肽；这些肽代表潜在的T细胞表位(如WO 98/52976和WO 00/34317中限定的)。对于检测潜在的T细胞表位，可以应用称作“肽穿引”的计算机建模方法，并且另外，可以对人MHC II类结合肽的数据库搜索存在于VH和VL序列中的基序，如记载于WO98/52976和WO 00/34317的。这些基序结合18种主要MHC Il类DR同种异型之任一种，并且如此构成潜在的T细胞表位。可以通过替换可变域中的少量氨基酸残基，或者优选地，通过单一氨基酸替代来消除检出的潜在T细胞表位。通常，进行保守替代。经常但不排他，可以使用人种系抗体序列中的某个位置常见的氨基酸。人种系序列例如披露于Tomlinson等，J.Mol.Biol.1992，第227卷：776-798；Cook，G.P.等，Immunol.Today 1995，第16卷(5)：237-242；Chothia，D.等，J.Mol.Biol.1992，第227卷：799-817；及Tomlinson等，EMBO J.1995，第14卷：4628-4638。V BASE目录提供了人免疫球蛋白可变区序列的综合目录(由Tomlinson，LA.等，MRC蛋白质工程中心，Cambridge，UK汇编)。可以使用这些序列作为人序列的来源，例如框架区和CDR的。也可以使用共有人框架区，例如如记载于美国专利No.6,300,064的。

同样地，本发明的试剂盒、方法和用途中应用的抗体可以含有改变的免疫球蛋白恒定或Fc区。例如，依照本文中的教导生成的抗体可以更强烈地或更特异性地结合效应器分子诸如补体和/或Fc受体，其可以控制抗体的数种免疫功能诸如效应细胞活性、裂解、补体介导的活性、抗体清除、和抗体半衰期。结合抗体(例如IgG抗体)Fc区的典型Fc受体包括但不限于FcγRI、FcγRII、和FcγRlll及FcRn亚类的受体，包括这些受体的等位变体和可变剪接形式。Fc受体的综述见Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol 1991，第9卷：457-92；Capel等，lmmunomethods 1994，第4卷：25-34及de Haas等，J.Lab.Clin.Med.1995，第126卷：330-41)。

关于别的抗体生成技术，参见Antibodies：A Laboratory Manual，Harlow等编，Cold Spring Harbor Laboratory，1988。本发明的试剂盒、方法和用途中应用的抗体不必限于抗体的任何特定来源、生成方法、或其它特殊特征。

“双特异性”或“双功能抗体”是一种具有两对不同重/轻链和两个不同结合位点的人工杂合抗体。可以通过多种方法，包括杂交瘤融合或Fab’片段连接来生成双特异性抗体。参见例如Songsivilai和Lachmann，Clin.Exp.Immunol.1990，第79卷：315-321；Kostelny等，J.Immunol.1992，第148卷：1547-1553。在一个实施方案中，双特异性抗体包含经由免疫球蛋白恒定区与第二结合域多肽连接的第一结合域多肽，诸如Fab’片段。

小模块免疫药物(Small Modular lmmunopharmaceutical，SMIP^TM)提供了包含结合域多肽的变体分子的例子。SMIP及其用途和应用披露于例如美国公布专利申请No.2003/0118592，2003/0133939，2004/0058445，2005/0136049，2005/0175614，2005/0180970，2005/0186216，2005/0202012，2005/0202023，2005/0202028，2005/0202534、和2005/0238646及其相关专利家族成员，在此通过提及都完整收入本文。

SMIP^TM通常指一种包含结合域多肽的结合域-免疫球蛋白融合蛋白，所述结合域多肽与免疫球蛋白铰链或铰链作用区多肽融合或以其它方式连接，其继而与包含一个或多个与CH1不同的来自免疫球蛋白重链的天然或工程化改造恒定区，例如IgG和IgA₁的CH2和CH3区或IgE的CH3和CH4区的区域融合或以其它方式连接(关于更完整的描述，参见例如Ledbetter，J.等的U.S.2005/0136049，通过提及而将其收录)。结合域免疫球蛋白融合蛋白可以进一步包含如下的区域，其包含与铰链区多肽融合或以其它方式连接的天然的或工程化改造的免疫球蛋白重链CH2恒定区多肽(或者在完全或部分自IgE衍生的构建体的情况中为CH3)和与CH2恒定区多肽(或者在完全或部分自IgE衍生的构建体的情况中为CH3)融合或以其它方式连接的天然的或工程化改造的免疫球蛋白重链CH3恒定区多肽(或者在完全或部分自IgE衍生的构建体的情况中为CH4)。

本发明的试剂盒、方法和用途中应用的抗体是抗CD31抗体。原则上，每种已知的或新制备的抗CD31抗体是合适的。若抗CD31抗体在本文中所描述的方法和用途中应用时具有高的信号-比-背景比率，则它是合适的。

“抗CD31”意指抗体是针对CD31，结合CD31或与CD31起反应。针对、结合或与...起反应包括抗体特异性结合CD31。在此上下文中的术语“特异性”意指抗体与CD31蛋白，而基本上不与另一种蛋白质起反应。例如，优选地，针对人CD31的抗CD31抗体基本上不结合小鼠CD31蛋白。同样地，优选地，针对小鼠CD31的抗CD31抗体基本上不结合人CD31。因而，术语“另一种蛋白质”包括如下的任何蛋白质，其包括与抗CD31抗体针对的CD31蛋白紧密相关或同源的蛋白质。例如，若抗CD31抗体针对人CD31，则优选的是，它基本上不结合来自另一生物体或物种的CD31。

术语“基本上不结合”意指本发明的试剂盒、用途和方法中应用的抗CD31抗体不结合另一种蛋白质，即显示小于30％，优选地20％，更优选地10％，特别优选地小于9、8、7、6或5％的交叉反应性。

可以通过比较所述抗体与CD31蛋白的反应与所述抗体与一种或多种其它蛋白质的反应来容易地测试如本文中所限定的抗体是否特异性起反应，等等。

因而，优选地，本发明的试剂盒、方法和用途中应用的抗CD31抗体施加特异性结合或者特异性结合CD31。在本发明的试剂盒、方法和用途中应用的抗CD31抗体的上下文中使用时，术语“特异性结合”指两种分子，即在细胞，优选地牵涉血管发生中肿瘤血管形成的内皮细胞上表达的CD31和结合CD31的抗体形成在生理条件下相对稳定的复合物。特异性结合以高亲和力及低至中等性能为特征，如与通常具有低亲和力及中等至高性能的非特异性结合区别的。通常，在结合亲和力是约10^-11至10^-8M(KD)，优选地约10^-11至10^-9M的时，认为结合是特异性的。

CD31是一种分化分子簇。它又称作PECAM-1(代表血小板内皮细胞粘着分子)。此外，其又称为FLJ58394。因而，术语“CD31”、“PECAM-1”和“FLJ58394”在本申请中可互换使用。例如，人CD31蛋白序列在GenBank中以登录号NP_000433可获得。可以通过本领域中已知的手段获得来自其它物种的CD31。

CD31在自身体除去老化的嗜中性粒细胞中发挥重要的作用。巨噬细胞触测(palpate)任何通过的嗜中性粒细胞，并且必须决定细胞是否健康或者是否必须被摄取。

在成熟形式中，人CD31具有SEQ ID NO：11中所描述的711个氨基酸的序列(多肽分子量：79,578道尔顿)。此序列仅仅是例示性的序列，因为术语“CD31”包括来自表达CD31的所有哺乳动物物种的分子。

通常，CD31是糖基化的，其程度使得约39％的其分子量可归因于碳水化合物，并且成熟的蛋白质具有9个推定的、天冬酰胺连接的糖基化位点。所有这些位点存在于糖蛋白胞外域(其具有574个氨基酸)中。CD31还包含19个氨基酸的跨膜部分和118个氨基酸的胞质域。这种域排布与质膜内PECAM-1的取向一致，这是其它膜内在糖蛋白典型的。

在本发明的上下文中，已经发现了CD31是一种对于显现，即对肿瘤血管系统体内成像和/或在受试者中监测抗血管生成剂的治疗功效特别有用的标志物，因为CD31是一种在血管发生期间，特别是如本文中所描述的血管发生期间表达的标志物。

在本文中使用时，术语“CD31”包括CD31的所有形式(野生型、剪接变体、片段、衍生物、类似物、与SEQ ID NO：11中所显示的氨基酸序列至少40、50、60，优选地70，更优选地80，甚至更优选地90％相同的氨基酸序列的蛋白质)，其中在细胞表面上表达的CD31形式是优选的。特别优选的是由内皮细胞，优选地牵涉血管发生中的血管形成，优选地肿瘤形成中的血管形成的那些内皮细胞表达的CD31蛋白。

表达CD31的细胞是例如哺乳动物细胞或非哺乳动物细胞诸如鸡或斑马鱼细胞，优选地哺乳动物细胞诸如小鼠、大鼠、犬、猫、牛、黑猩猩或人细胞，其中人细胞是特别优选的。

还有，本发明内的例示性CD31蛋白是与CD31的一部分对应，或者包含CD31的一部分，而不与天然分子一致，并且展现出如下文所描述的CAM的粘着促进活性的分子。含有与CD31的胞外域(缺乏跨膜或胞内部分)对应；也就是说，与CD31的“可溶性受体”形式对应的氨基酸序列的多肽会在这些变体中。

本发明的其它CD31蛋白是保留CAM样粘着促进活性的CD31片段。同样地，合成的多肽会在本发明内，所述合成的多肽(i)对应于CD31氨基酸序列的一部分，并(ii)保留如下文所描述的CD31特征性活性。

可以依靠CD31活性测定法常规地测定多肽是否是本发明的CD31蛋白。两种此类活性分别是响应化学引诱剂(趋化性)的细胞粘着依赖性移动和内皮细胞-细胞粘着的介导。前一种活性可以遵循Ohto等，Blood 1985，第66卷：873-881通过测定结合所讨论的合成多肽的抗体是否还抑制嗜中性粒细胞或单核细胞响应合适的刺激物，诸如大肠杆菌内毒素的趋化性来测定。可以以常规方式类似地测定介导内皮细胞间的粘着的能力，即通过测试多肽识别抗体是否抑制分散的内皮细胞锚定于合适的基片和/或此后形成细胞间连接来进行。

在本文中使用时，“成像”指用于创建人身体(或其一部分)的图像，优选地出于临床目的(寻求揭示、诊断或检查疾病的医学规程)或医学科学(包括研究正常的解剖学和生理学)的任何技术和方法。优选地，在本发明的方法和用途中应用时，使用成像来创建受试者的肿瘤血管系统的图像。

在本发明的上下文中“在体内”完成成像。“体内成像”指使用成像或扫描技术在活的受试者中定位感兴趣的配体。因而，不在部分或死亡的生物体中实施应用体内成像的本发明的方法和用途。

在本发明的上下文中，感兴趣的配体是被经荧光标记的抗CD31抗体定位，即结合的CD31，所述经荧光标记的抗CD31抗体通过本领域中已知的任何合适的成像或扫描技术可检出，其中近红外荧光成像是优选的。

本发明的方法和用途是非侵入性的。“非侵入性”意指不产生受试者皮肤中的破裂，例如切口，而且与粘膜、或皮肤破裂、或超出天然的或人工的身体孔口的内部体腔没有接触。例如，对穿过鼓膜的或在鼻内部的成像或伤口敷料更换均落在“非侵入性”定义外面。

在本文中使用时，“血管系统”指血管在器官或身体部分中的排布或分布(例如，脑、肺、肾、或心自身的血管系统)。血管系统是器官或身体部分的血管网络；它包含身体自主动脉至动脉、毛细管和静脉的所有血管。

血管系统仅能在血管已经通过血管发生形成时形成。如本文中解释的，肿瘤可以启动血管发生，由此形成血管。然后，这些血管构成血管系统。因而，在本文中使用时，术语“血管系统”涵盖血管发生的过程，并且如此血管，例如肿瘤血管的形成。

术语“肿瘤血管系统”指肿瘤，优选地如本文中所描述的肿瘤的血管系统。因而，如本文中别处所解释的，在本文中使用时，优选地，受试者具有肿瘤。

血管是一种血液经由其循环并且由内皮细胞，即血管系统细胞构成的以内皮为衬里的管。用于在身体周围转运的循环系统由控制身体周围的血液流动的许多管组成，这些是血管，其主要由动脉和静脉组成。

肿瘤血管具有血管周脱离、血管扩张、和不规则的形状。认为肿瘤血管不像正常组织一样平滑，并且其定制(order)不足以将氧给予所有组织。内皮前体细胞自骨髓组织(organize)，然后并入生长中的血管。然后，内皮细胞分化并迁移入血管周空间中，以形成肿瘤细胞。血管内皮生长因子(VEGF)在导致肿瘤生长的血管的形成中发挥至关重要的作用，容许血管扩张。它被称作萌发的血管发生。

因而，本发明还涵盖通过检测经荧光标记的抗CD31抗体来体内成像，即监测肿瘤形成期间的血管发生的方法和用途。CD31是特别合适的血管发生标志物。

如本文中所提及的，CD31是一种用于显现肿瘤血管系统的特别有用的标志物，因为CD31是一种血管发生(由此导致血管形成)期间表达的标志物。

“血管发生”是具有/没有肌肉平滑肌壁和周细胞(纤维细胞)的薄壁的以内皮为衬里的结构的形成。

在本文中使用时，所述术语也指牵涉自先前存在的血管生长新血管的生理学过程。在本发明的上下文中，术语“血管发生”优选地意指肿瘤形成期间的血管发生。因而，所述术语不仅指血管发生的过程，而且指血管生成和/或动脉生成的过程。

“血管生成”指自循环的或组织驻留的内皮干细胞(成血管细胞)(其从头增殖为内皮细胞)形成血管结构。此形式特别涉及血管系统的胚形成。

“动脉生成”是拥有中膜加外膜的中间大小的血管的形成。

血管发生是一种在生长和发育中及在伤口愈合中的正常过程。血管发生由各种生长因子诸如血管内皮生长因子(VEGF)和成纤维细胞生长因子(FGF)刺激。对血管发生刺激因子的早期应答是蛋白酶诸如基质金属蛋白酶(MMP)家族成员对内皮细胞基底膜的降解。MMP降解胶原和其它胞外基质组分。破坏基底膜障碍容许内皮细胞自先前存在的血管向血管生成刺激迁移并增殖(Marsh，Stem Cells 1997；第15卷：180-189)。血管细胞粘着分子通过介导细胞-胞外基质相互作用促成内皮细胞迁移。主要介导物之一是整联蛋白α_vβ₃，即一种诸如纤连蛋白等蛋白质的受体。整联蛋白α_vβ₃的拮抗剂抑制新血管的生长，提示了细胞粘着是血管发生中的一个至关重要的步骤(Brooks等，Cell1994；第79卷：1157-1164)。迁移和增殖后，内皮细胞装配成具有开放腔的管。生成成熟血管中的一个重要步骤是间充质细胞的募集及其随后分化成平滑肌细胞样周细胞，认为所述平滑肌细胞样周细胞稳定化新形成的血管系统。这些周细胞逐渐被内皮丛吸引，导致血管树的进行性覆盖(Benjamin等，Development 1998；第125卷：1591-1598)。在此期间，未覆盖的毛细管发生消退，这在获得周细胞包被后停止。因此，血管形成的此较晚期阶段以重塑步骤为特征，其中切除不受保护的血管，并且经周细胞覆盖的血管变得稳定，而且不太易于脱稳定化和消退。大概自内皮细胞来源衍生的血小板衍生生长因子(PDGF)募集周细胞以与内皮细胞联合，从而提高血管稳定性(Lindahl等，Science 1997；第277卷：242-245)。图1中也显示了上文所描述的血管发生中的过程。

在第二个方面，本发明涉及在受试者中体内监测抗血管生成剂的治疗功效的非侵入性方法，包括检测经荧光标记的抗CD31抗体。

术语“体内监测抗血管生成剂的治疗功效”还包括监测抗血管生成剂对血管发生，优选地肿瘤形成期间的血管发生的治疗功效。

因而，本发明此外涵盖体内成像，即监测抗血管生成剂对血管发生的治疗功效的方法和用途，其通过检测经荧光标记的抗CD31抗体来进行。CD31是特别合适的血管发生标志物。

通过检测经荧光标记的抗CD31抗体来对受试者中肿瘤血管系统体内成像的非侵入性方法的上下文中所描述的实施方案也适用于本发明的第二方面。

在本发明的方法和用途的上下文中使用时，术语“监测”包括通过合适的手段和方法在体内显现血管，特别地血管和/或血管系统，特别地肿瘤血管系统。它还包括可以通过来自经荧光标记的抗CD31抗体的信号由于其结合(或不结合)血管系统细胞表面上的CD31而随时间发信号来显现血管系统，优选地肿瘤血管系统的血管的增加或减少，即血管越少，由抗体提供的信号越少，或者同样地，血管越多，由抗体提供的信号越多。它还包括监测血管发生，优选地肿瘤形成期间的血管发生和/或监测抗血管生成效果对肿瘤血管系统和/或血管发生的治疗功效。此外，它包括监测和/或测量肿瘤和/或肿瘤血管的大小。

如本文中所使用的，抗血管生成剂的“治疗功效”指在对受试者(诸如人患者)施用单剂或多剂后抗血管生成剂在降低或阻止血管发生，优选地肿瘤形成中的血管发生方面的功效程度。降低或阻止肿瘤形成中的血管发生是肿瘤治疗的测量。

可以通过会指示治疗效果的所有已建立的方法和办法来检测抗血管生成剂的治疗效果。例如，涵盖的是，通过受影响组织/器官的手术切除或活组织检查，随后通过免疫组织化学(IHC)或相当的免疫学技术分析来检测治疗效果。或者，作为抗血管生成剂的治疗功效的间接测量，还涵盖的是，检测患者血清中的肿瘤标志物(若存在的话)以诊断治疗方法已经有效与否。另外/或者，也有可能评估各位患者的一般外观(适合度、舒适、肿瘤介导的疾病减轻/减少等)，其也会帮助熟练从业人员评估治疗效果是否已经存在。技术人员知道会使他或她能够观察到治疗效果的许多其它方式。对于癌症疗法，例如可以通过评估疾病进展前时间(TTP)和/或测定响应率(RR)来测量治疗功效。具体地，抗血管生成剂可以引起肿瘤的缩小，或者更优选地消除。如此，可以基于TTP和/或RR来测量/判断抗血管生成剂的治疗功效。

术语“处理/治疗”指治疗性或预防性措施。可以对具有肿瘤诸如实体瘤或最后可形成肿瘤的受试者施用治疗，以预防、降低和/或治愈肿瘤形成或者以使受试者的存活延长得超出在没有此类治疗的情况中预期的。出于本发明的目的，具有肿瘤的受试者患有癌症。因而，本发明的方法和用途适用于患有癌症的受试者。

在一些实施方案中，受试者具有实体瘤。实体瘤是一种通常不含囊肿或液体区域的异常组织块。实体瘤可以是良性(不是癌症)，或恶性(癌症)。

例如，实体瘤指选自下组的肿瘤：胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝瘤、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌、睾丸癌、食管癌、胆管肿瘤、及头和颈癌。

出于本发明的目的，实体瘤具有至少1mm，优选地2mm的大小。在此大小，为了增殖并存活，实体瘤依赖于生长因子的足够供应和毒性分子的除去以及依赖于足够的供氧。在实体组织中，例如氧可以自毛细管放射状扩散仅约150至200μm，并且如此，肿瘤依赖于通过血管的氧供应，并且如此启动血管发生，如本文中所描述的。

肿瘤块的扩大超出直径为约1或2mm依赖于足够血供的形成。因而，肿瘤开始给自身供应血液，并且因此发生肿瘤血管发生现象。由于本发明的方法和用途，有可能对肿瘤血管系统成像和/或在受试者中监测抗血管生成剂的治疗功效，由此提供对癌症治疗的支持。

用于对肿瘤血管系统体内成像或在受试者中体内监测抗血管生成剂的治疗功效的本发明的方法和用途还容许监测肿瘤的大小。因此，可以在用抗血管生成剂治疗受试者期间和/或之后得出关于此类药剂是否可以降低肿瘤大小的结论。因而，在应用本发明的方法和用途以对肿瘤血管系统体内成像或在受试者中体内监测抗血管生成剂的治疗功效时，任选地，也可以应用它们来监测和/或测量肿瘤的大小。如此，术语“对肿瘤血管系统体内成像”和“对抗血管生成剂的治疗效果体内成像”还包括监测和/或测量肿瘤的大小。

在通过常规成像技术诸如计算机断层摄影术测量时，肿瘤的大小忍受如下的缺点，即不能得出关于肿瘤是否仍是“有活性的”，即它是否为代谢活性的和活着的结论。例如，肿瘤在已经用抗血管生成剂治疗后可以具有较大的大小，并且如此可推断治疗是不成功的。然而，实际上，治疗是成功的，因为肿瘤尽管仍然较大，但是在血管发生方面不再是活性的。如此，会得出假阳性结果。同样地，若观察到肿瘤的大小较小，而在血管发生方面是有活性的，则可以得出假阴性结果。

然而，由于本发明，本文中所描述的方法和用途不仅容许监测和/或测量肿瘤的大小，它们也容许测量和/或监测肿瘤的血管生成活性。如此，它容许产生肿瘤大小与血管生成活性间的关联。具体地，经荧光标记的抗CD31抗体足够稳定，使得可以外植肿瘤和/或可以采集活组织检查，然后，例如可以在体外对其进行分析，如上文所描述的。更具体地，可以测定抗CD31抗体的信号，并且如此可以推断关于治疗肿瘤是否是成功的，尽管肿瘤在大小上仍然较大，且反之亦然。

术语“癌症”指或描述受试者中通常以不受调节的细胞生长为特征的生理学状况。癌症或肿瘤的例子包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、母细胞瘤(包括髓母细胞瘤和视网膜母细胞瘤)、肉瘤(包括脂肪肉瘤和滑膜细胞肉瘤)、神经内分泌肿瘤(包括类癌瘤、胃泌素瘤、和胰岛细胞癌)、间皮瘤、神经鞘瘤(schwannoma)(包括听神经瘤)、脑膜瘤、腺癌、黑素瘤、和白血病或淋巴树恶性肿瘤。此类癌症的更具体例子包括鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)、肺癌，包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌和肺的鳞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌，包括胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝瘤、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌、睾丸癌、食管癌、胆管肿瘤、及头和颈癌。

如本文中所使用的，术语“抗血管生成剂”指降低或阻止负责血管生长和形成的血管发生的分子。

因此，依照本发明的抗血管生成剂可以停止或抑制原发性肿瘤的生长，阻碍或降低转移的形成，并阻碍继发性生长的出现。血管生成抑制剂也可用于治疗存在血管生成活性的非新生物病症。

例如，抗血管生成剂是VEGF-A抑制剂(诸如以商品名安维汀(Avastin)

出售的抗体)、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGFR1、VEGFR2、或血管生成素的抑制剂。例如，抑制剂是抗体、siRNA或小分子。此外，多种抗血管生成剂可用于本发明，并且可以通过常规的方法制备。此类抗血管生成剂包括但不限于小分子；蛋白质诸如血管生成因子的显性失活形式、转录因子和抗体；肽和肽模拟物；及核酸分子，包括核酶、反义寡核苷酸、和编码例如血管生成因子的显性失活形式和受体、转录因子、和抗体及其抗原结合片段的核酸分子。参见例如Hagedorn和Bikfalvi，Crit.Rev.Oncol.Hematol.2000，第34卷：89-110及Kirsch等，J.Neurooncol.2000，第50卷：149-163。

可以通过使用许多体外和体内生物测定法诸如增殖测定法和趋化性测定法来测试抗血管生成剂的抗血管生成效果。增殖测定法使用培养的毛细管内皮细胞并测量增加的细胞数目或放射性标记的或经修饰的核苷的掺入以检测S期的细胞。相反，趋化性测定法通过多孔膜盘来分开内皮细胞和测试溶液，使得内皮细胞迁移穿过屏障指示测试溶液中存在的化学引诱物(Hanahan和Folkman，Cell 1996；第86卷：353-364)。通过这些测定法，还可以鉴定别的抗血管生成剂。

已经显示了血管内皮生长因子(VEGF)对于体内许多类型的癌症中的血管发生，包括乳腺癌血管发生是重要的(Borgstrom等，Anticancer Res.1999，第19卷：4213-4214)。VEGF的生物学效果包括刺激内皮细胞增殖、存活、迁移和管形成及调节血管通透性。例如，可用于本发明的抗血管生成剂可以是降低VEGF或另一种血管生成因子的表达或信号传导的抑制剂或中和性抗体，例如抗VEGF中和性单克隆抗体(Borgstrom等，见上文，1999)。抗血管生成剂也可以抑制另一种血管生成因子诸如成纤维细胞生长因子家族成员诸如FGF-1(酸性)、FGF-2(碱性)、FGF-4或FGF-5(Slavin等，Cell Biol.Int.1995，第19卷：431-444；Folkman和Shing，J.Biol.Chem.1992，第267卷：10931-10934)或血管生成因子诸如血管生成素-1、经由内皮细胞特异性蛋白Tie2发信号的因子。

多种其它分子也可以充当可用于本发明的抗血管生成剂，包括不限于血管他丁；血管他丁的kringle肽；内皮他丁；Anastellin，纤连蛋白的肝素结合片段；抗凝血酶的经修饰形式；胶原酶抑制剂；基底膜周转抑制剂；血管抑制性(angiostatic)类固醇；血小板因子4及其片段和肽；血小板反应蛋白及其片段和肽；和多柔比星(O’Reilly等，Cell 1994，第79卷：315-328)；O’Reilly等，Cell 1997，第88卷：277-285；Homandberg等，Am.J.Path.1985，第120卷：327-332；Homandberg等，Biochim.Biophys.Acta 1986，第874卷：61-71；及O’Reilly等，Science 1999，第285卷：1926-1928)。可用于本发明的商品化抗血管生成剂包括例如血管他丁、内皮他丁、Metastatin和2ME2(EntreMed；Rockville，Md.)；抗VEGF抗体诸如安维汀(Genentech；South San Francisco，Calif.)；和VEGFR-2抑制剂诸如SU5416，即VEGFR-2的一种小分子抑制剂(SUGEN；South San Francisco，Calif.)和SU6668(SUGEN)，即VEGFR-2、血小板衍生的生长因子和成纤维细胞生长因子I受体的一种小分子抑制剂。应当理解，可以通过常规的方法来制备这些和其它抗血管生成剂，并且被如本文中所描述的术语“抗血管生成剂”涵盖。

在本发明方法和用途的一个优选的方面，受试者的实体瘤是异种移植物，优选地人异种移植物。

此方面涵盖用于测试化合物，即(潜在的)抗血管生成剂的抗血管生成效果的临床前模型。因而，具有实体瘤异种移植物，优选地来自人的实体瘤的受试者是非人哺乳动物，优选地啮齿类诸如家兔、大鼠和小鼠(其中小鼠是优选的)、或黑猩猩。此方面中应用的抗CD31抗体是针对小鼠CD31的抗CD31抗体，其基本上不结合另一种蛋白质诸如人CD31。最优选地，此抗体可以获自Acris Antibodies，32052 Herford，德国(克隆2H8，产品目录编号SM007A)。它是一种仓鼠抗小鼠CD31抗体。此抗体也记载于Bogen等，Am.J.Pathol 1992，第141卷：843-854；Bogen等，J.Exp.Med.1994，第179卷：1059-1064及Ishikaw等，Jpn J Pharmacol.2002，第88卷：332-340。

特别地，发明人已经观察到在将Calu3细胞皮下细胞接种入小鼠中后，肿瘤揭示了初始的一致扩大。在第7天时，即肿瘤大小测量的第一天，平均肿瘤体积比随后的平均肿瘤体积高(见图11)。细胞首先需要以协调的方式排列自身以建立实体瘤。在研究第35天时，即开始治疗，肿瘤达到约150mm³的平均肿瘤体积。直至此时间点并且自第一次测量起，肿瘤以每周约40-50mm³的肿瘤生长速率展现出指数生长。在第7天时，肿瘤没有显示明显的血管化。它们没有揭示肿瘤的典型颜色，指示尚未建立功能性血供。新形成的血管不可在肿瘤周围检出(见图12)。在第14天时，在皮下接种的人肿瘤细胞周围的区域中，出现肿瘤周围的约1mm红色区。此区由充血的小毛细管组成，其形成许多交织血管的密集网络。在第21天时，血管充血延伸入大血管中(见图12)。用Qtracker705非靶向量子点获得的成像结果表明小鼠组织中的血管变化和肿瘤组织周围及进入肿瘤组织的血管生长(见图13)。在研究第35天时，肿瘤血管的数目增加，并且如此，肿瘤揭示微红的颜色，提示肿瘤内完善建立的血供。使用碱性磷酸酶系统，接着使用载玻片扫描仪显现小鼠内皮CD31+细胞的免疫组织化学评估容许更好地显现整个肿瘤内的血管分布。第7天的冷冻切片(cryoslide)表明小鼠组织如何掺入人肿瘤中(见图14A)。鼠基质细胞迁移入连接第一血管与肿瘤的人癌组织中。第21天时，建立的人肿瘤的血管分布样式揭示肿瘤轮廓处的血管积累(见图14B)。主要的动脉在肿瘤边缘处聚集，而肿瘤的内部部分弥漫着小的且充血的毛细管。肿瘤形成的前35天期间的mRNA表达序型分析没有揭示血管生成生长因子的基因表达的显著变化。分别在第7天、第14天、第21天、第28天和第35天，将3个肿瘤外植，并准备好mRNA提取，如本文中所描述的。包括β-肌动蛋白的检测作为加载对照。VEGF(人的)展现出牵涉血管生成形成的两种主要剪接变体。那些剪接变体在肿瘤形成的不同状态中交替。在第7天时，一般地，剪接变体5(462bp)的水平比在后来的阶段中高，而剪接变体6(365bp)的表达在肿瘤形成的早期状态中较低(见图15)。Ang2(人的)水平自第7天直至第35天逐渐升高，而VEGF(小鼠的)水平未变化(见图15)。Ang2(小鼠的)完全缺乏(数据未显示)，或者使用了不适当的RT-PCR条件。血管生成生长因子的存在是用靶物特异性治疗性抗体应用抗血管生成疗法的基本原理。

使用碱性磷酸酶系统，接着使用载玻片扫描仪显现小鼠内皮CD31+细胞的免疫组织化学评估容许更好地显现整个肿瘤内的血管分布。第7天的冷冻拉出术表明小鼠组织如何掺入人肿瘤中(见图14A)。鼠基质细胞迁移入连接第一血管与肿瘤的人癌组织中。第21天时，建立的人肿瘤的血管分布样式揭示肿瘤轮廓处的血管积累(见图14B)。主要的动脉在肿瘤边缘处聚集，而肿瘤的内部部分弥漫着小的且充血的毛细管。

肿瘤形成的前35天期间的mRNA表达序型分析没有揭示血管生成生长因子的基因表达的显著变化。分别在第7天、第14天、第21天、第28天和第35天，将3个肿瘤外植，并准备好mRNA提取。包括β-肌动蛋白的检测作为加载对照。VEGF(人的)展现出牵涉血管生成形成的两种主要剪接变体。那些剪接变体在肿瘤形成的不同状态中交替。在第7天时，一般地，剪接变体5(462bp)的水平比在后来的阶段中高，而剪接变体6(365bp)的表达在肿瘤形成的早期状态中较低(见图15)。Ang2(人的)水平自第7天直至第35天逐渐升高，而VEGF(小鼠的)水平未变化(见图15)。Ang2(小鼠的)完全缺乏(数据未显示)，或者使用了不适当的RT-PCR条件。血管生成生长因子的存在是用靶物特异性治疗性抗体应用抗血管生成疗法的基本原理。

在研究第35天时，根据小鼠的体重和肿瘤大小将它们随机化至统计学良好分布的组。对于用治疗性抗体治疗，每组由携带Calu3肿瘤的10只Balbc/裸鼠组成，并且用治疗性抗体应用治疗达6周时段。一周一次实施肿瘤大小和体重测量。相对于对照单抗，所有治疗组揭示范围为27-50％的平均肿瘤生长抑制(见图20)。实施体重测量以监测小鼠的一般状况。没有观察到异常(见图21)。由于没有观察到一组内的一致分布，这两次测量进行非参数分析(中值)。

使用SAS程序TUMGRO和AUC评估来测定治疗-比-对照比率(TCR)及其双侧非参数置信区间(CI)。此非参数分析揭示通过使用显著性水平5％(á)，相对于对照单抗，仅有用单抗4的处理组6是统计学显著的。处理组2-4不是统计学显著的(参见图22)。

用抗CD31的血管监测初步研究揭示抗CD31抗体是用于对肿瘤血管系统成像的最好药剂。此药剂靶向小鼠内皮CD31受体，并且以高的信号-比-背景比率显现单一血管。因此，抗CD31抗体的成像代表一种对肿瘤血管系统成像的可行方式。已经选出每个治疗组的三只小鼠，并且在第35天、第49天和第79天给其i.v注射50μg/小鼠抗CD31抗体。在麻醉动物后注射试剂后24小时实施近红外成像。研究期间，一些小鼠必须排除，因为它们揭示伪造成像结果的肿瘤溃疡。通过使用MAESTRO系统的比较图像工具来显现肿瘤血管系统的增加或减少(见图23)。对照单抗和单抗1处理组显示肿瘤血管自第35天至第79天的明显增加，而组合处理单抗2+3和单抗4展现出肿瘤血管系统的减少。通过手工绘制测量面积来量化肿瘤区，并以强度数值(总信号/暴露时间)评估信号强度。在图28中将自第35天至第49天及自第49天至第79天的CD31信号的平均变化绘图。所有处理组揭示自第35天至第49天的肿瘤血管系统增加。虽然CD31肿瘤信号在组1(对照单抗)和组3(单抗2)中稳定加速，但是肿瘤血管系统在组5和6中显著减少(参见图24)。

刚好在最后一次体内成像研究后，将肿瘤外植(第79天)，在福尔马林中固定，并在石蜡中包埋，供离体研究用。荧光显微术显示用对照单抗处理的肿瘤中的许多限定较好的毛细管。在用单抗2处理的小鼠中观察到数个肿瘤血管。相反，与其它处理组相比，处理组5和6在肿瘤中具有明显更少的且限定较差的血管。它们揭示较低的微血管密度，毛细管一般较小且未结构化，而且它们展现出较弱的抗CD31荧光信号。组织化学HE染色在用单抗4的处理组中显示多至90％的肿瘤内坏死区。肿瘤坏死的那些面积在组5和6中比在其它处理组中显著更高。相反，对照组中的肿瘤与完整的肿瘤细胞连续分布(见图25)。

通过定制的书面MATLAB脚本测定石蜡切片中的血管密度。血管区在对照处理组中比在用治疗性抗体处理的组中显著地大8.8％。在单抗2处理组中观察到2.8％毛细管面积，而对用单抗4处理的组计算出仅0.9％血管存在(见图26)。

治疗期间的血管生成生长因子的mRNA表达序型没有揭示表达样式的任何变化。在第79天时，分别将3个肿瘤外植，并准备好mRNA提取。包括β-肌动蛋白的检测作为加载对照。如提及的，VEGF(人的)展现出两种主要的剪接变体，但是在此点时，不出现交替。VEGF(人的)水平及Ang2(人的)和VEGF(小鼠的)水平在所有治疗组中相当(见图27)。Ang2(小鼠的)完全缺乏(数据未显示)或者使用了不适当的RT-PCR条件。

相对于对照组，所有处理组揭示多至50％的肿瘤抑制。然而，仅在处理组中观察到统计学显著的肿瘤抑制。组单抗2和组单抗4的肿瘤体积展现出相似的生长曲线形成。可以假定血管化样式是相似的，并且如此，揭示相似的抗CD31信号。然而，用抗CD31的血管监测显示组单抗2中的肿瘤血管系统增加和用单抗4的组中的抗CD31信号降低(见图24)。此外，用单抗4处理的肿瘤揭示多至95％坏死区，提示对正确血管形成的功能破坏或抑制。处理组单抗2展现出大约70％坏死区和比在组单抗4中高几乎三倍的血管密度(见图26)。这些结果提示肿瘤血管系统与肿瘤体积间没有关联。显示了单抗4和单抗2在其于分子水平抑制肿瘤血管形成的能力上有所不同，尽管肿瘤体积没有显著不同。不能确认如下的假定，即可以在用靶物特异性抗体治疗期间调控血管生成生长因子的mRNA表达。VEGF和Ang2的mRNA表达在不同处理组中既不上调也不下调。然而，对于更精确的分析，应当使用能够实现更定量评估的Light-Cycler系统来实施mRNA表达序型分析。可以通过所应用的单抗的剂量来解释治疗性抗体的不同肿瘤抑制效果。例如，以5mg/kg的浓度注射单抗1，并且显示最小肿瘤抑制。相反，具有13,3mg/kg的单抗4施加最高的肿瘤抑制。然而，已经基于初步功效研究选择剂量。更高浓度的单抗1引起严重的副作用，并且因此必须终止临床前研究。应当用相等的抗体浓度实施用于比较基于抗体的血管生成效果的进一步研究。单抗4。在不同时间点时用抗CD31抗体的血管形成监测表明对照处理组中肿瘤血管系统的增加，而用单抗2+3和单抗4的处理组显示治疗期间肿瘤血管系统的显著减少。对外植的肿瘤组织的组织学HE染色揭示用单抗2+3和单抗4处理的肿瘤中高度坏死的区域(见图30)。这些组中的血管密度比在用对照单抗处理的组中小得多(见图26)。

组单抗2和组单抗4的肿瘤体积展现出相似的生长曲线形成。可以假定血管化样式是相似的，并且如此，揭示相似的抗CD31信号。然而，用抗CD31的血管监测显示组单抗2中肿瘤血管系统的增加和用单抗4的组中的抗CD31信号降低(见图24)。此外，用单抗4处理的肿瘤揭示多至95％坏死区，提示对正确血管形成的功能破坏或抑制。处理组单抗2展现出大约70％坏死区和比在组单抗4中高几乎三倍的血管密度(见图26)。这些结果提示肿瘤血管系统与肿瘤体积间没有关联。显示了单抗4和单抗2在其于分子水平抑制肿瘤血管形成的能力上有所不同，尽管肿瘤体积没有显著不同。不能确认如下的假定，即可以在用靶物特异性抗体治疗期间调控血管生成生长因子的mRNA表达。VEGF和Ang2的mRNA表达在不同处理组中既不上调也不下调。然而，对于更精确的分析，应当使用能够实现更定量评估的Light-Cycler系统来实施mRNA表达序型分析。可以通过所应用的单抗的剂量来解释治疗性抗体的不同肿瘤抑制效果。例如，以5mg/kg的浓度注射单抗1，并且显示最小肿瘤抑制。相反，具有13.3mg/kg的单抗4施加最高的肿瘤抑制。

上文呈现的结果表明啮齿类，优选地小鼠异种移植物肿瘤模型适合于测定关于药剂是否具有抗血管生成效果，其可以通过本文中所描述的经荧光标记的抗CD31抗体显现。

因此，本发明还涉及用于测定关于化合物是否具有抗血管生成效果的方法，包括提供具有实体瘤，优选地来自人的实体瘤的啮齿类，优选地小鼠，对动物施用具有潜在的抗血管生成效果的药剂，并通过检测经荧光标记的抗CD31抗体来在动物中监测潜在的抗血管生成效果。

也就是说，可以通过经荧光标记的抗CD31抗体信号随时间的升高或降低来揭示并比较抗血管生成剂的效果。具体地，可以通过经标记的抗CD31抗体结合(或不结合)CD31来显现给肿瘤供应血液的血管的增加或减少，即血管越少，由抗体提供的信号越小，或者同样地，血管越多，由抗体提供的信号越多。因而，信号越小，药剂的抗血管生成效果越高。

在第三方面，本发明涉及在本文中所描述的方法中使用的经荧光标记的抗CD31抗体。

在第四方面，本发明涉及在本文中所描述的方法中使用的试剂盒，其包含经荧光标记的抗CD31抗体和用于检测受试者中的抗体的近红外荧光成像的手段。这些手段在本文中描述，例如作为优选实施方案的MAESTRO系统。

在另一方面，本发明涉及经荧光标记的抗CD31抗体用于制备供对受试者中的肿瘤血管系统体内成像用的诊断组合物的用途。

在又一方面，本发明涉及经荧光标记的抗CD31抗体用于制备供在受试者中体内监测抗血管生成剂的治疗功效用的诊断组合物的用途。

加以必要的变更，上文所描述的方面同等涵盖本文中所提供的实施方案。

附图简述

图显示了：

图1：血管发生中的过程

(a)血管发生生长因子结合其在内皮细胞上的受体，并激活信号转导途径。(b)基质金属蛋白酶(MMP)被激活，并降解胞外基质，使内皮细胞能够迁移出先前存在的毛细管壁并增殖。(c)整联蛋白α_vβ₃由内皮细胞表达，促进其粘着胞外基质及其迁移。(d)血管生成素-1(Ang1)结合内皮细胞上的Tie2受体。认为此相互作用刺激血管萌发、周细胞募集及血管存活和稳定化。(e)内皮细胞释放PDGF-BB，其是周细胞前体的化学引诱物。这些细胞变得与内皮细胞结合，并分化成周细胞。

图2：血管生成开关的平衡假设

可以激活通常静止的血管系统以萌发新的毛细管，即一种通过血管生成开关机制控制的形态发生过程。血管发生的诱导物和抑制剂的相对平衡的变化可以激活开关。

图3：RPMI 1640培养基中培养的Calu3细胞

在第34天时，细胞群体达到总数约1.3*109，其足以接种150只小鼠。到接种时(细胞传代数6)，细胞存活力是约84％，并且对数图揭示约3.5天(84小时)的世代间隔。

图4：小鼠模型

(A)Balbc/裸鼠。(B)Scid米色小鼠。

图5：MAESTRO系统基本上由彼此连接的三个主要模块构成。

(I)照明模块，其准备期望波长范围的激发光，(II)成像模块，其中将测试动物放置并麻醉。可以通过CCD照相机检测注射探针的发射光，(III)工作站和分析模块，其获得并分析数字多光谱数据。

图6：用MAESTRO系统的体内成像和光谱分解

(A)白光中的研究动物的照片。(B)使用红色滤光器组产生的RGB照片。(C)经标记的靶物特异性抗体的分开灰度图像(分解的图像)。(D)组织自身荧光的分开灰度图像(分解的图像)。(E)分开灰度图像的覆盖图(分解的合成图像)，白色表明组织自身荧光，红色代表经标记的抗体。(F)显示假彩色的经标记抗体的信号强度。(G)限定检测限度以降低非特异性标记物信号。

图7：靶物特异性信号强度的量化

具有覆盖图的灰度图像显示测量的区域。在该区域上面绘制的虚线显示通过重心绘制的区域长轴和短轴。系统以像素及以mm²计算每个区域面积。

图8：用Nuance照相机的多光谱成像

将组织切片用两种特定的标记物(Dapi，alexa647)染色，并用Nuance系统检查。(A)RGB图，其显示了由于未过滤的自身荧光所致的受限制的特定显现。(B)在高对比色中分开并显现后的三种特定发射光谱的覆盖图(合成图像)显示每个单一组分的卓越显现。(C)alexa647的信号。(D)红细胞特异性自身荧光。(E)用Dapi染色的细胞核。(F)组织自身荧光。

图9：免疫组织化学

使用碱性磷酸酶系统检测小鼠内皮细胞。(A)小鼠内皮细胞。(B)CD31受体。(C)抗CD31抗体。(D)与碱性磷酸酶(E)缀合的山羊抗仓鼠IgG二抗。(F)通过与永久红溶液一起温育显现。

图10：血管密度的离体量化

在肿瘤外植、固定和石蜡渗透后使用Nuance系统拍摄照片(放大率40x)。(A)初始的荧光照片。以黄色显现抗CD31-alexa610信号，而以亮蓝色代表自身荧光的红细胞。(B)分开的抗CD31-alexa610信号(黄色)。(C)抗CD31-alexa610的经转化且倒转的二进制照片(黑色)。(D)手工限定的血管区(红色)。

图11：裸鼠中皮下植入的Calu3肿瘤的肿瘤大小测量

肿瘤显示指数生长。在第35天时，肿瘤大小范围为约40-200mm3。在随机化过程中，将小鼠以各10只小鼠在6组间最佳分布，并用治疗性抗体处理它们。

图12：肿瘤形成和肿瘤激活的毛细管生长的照片演示

在肿瘤接种后第21天时，小的血液通道(蓝色箭)已经延伸入先前存在的大的小鼠血管(绿色箭)中，并且肿瘤建立血液系统以给它们自身供应氧和至关重要的营养物。

图13：体内非靶向性血管显现

在第21天时，肿瘤周围的血管结构(蓝色箭)在尾静脉注射Qtracker705(2nmol/小鼠)非靶向性量子点并在24小时后使用MAESTRO系统显现后可见。量子点705是随着组织渗透增强展现出具有红移发射的强烈荧光的小纳米晶体，并且它们在动物血液系统中循环多至3小时。肿瘤以黑色面积表征，提示功能性肿瘤血液系统的建立。

图14：整个肿瘤切片中的血管分布

在肿瘤外植前24小时给小鼠注射未标记的抗小鼠CD31抗体。(A)第7天的CD31显现(粉红色)和用苏木精复染色(紫色)。放大的图像显示迁移入未结构化的肿瘤组织(亮紫色)中的鼠基质细胞(紫色)。(B)在接种后21天，CD31+内皮细胞(粉红色)的显现和用苏木精复染色(紫色)在肿瘤轮廓处展现主要的血管。

图15：肿瘤形成期间各种血管生成生长因子的表达

通过使用5个不同时间点时外植的3个肿瘤来测定mRNA表达。使用1％凝胶(对于VEGF(人的)和β-肌动蛋白)和1,5％(对于VEGF(小鼠的)和Ang2(人的))来实施凝胶电泳。VEGF(人的)和VEGF(小鼠的)揭示肿瘤大小依赖性表达样式，而VEGF(小鼠的)水平保持相同。

图16：用于监测血管发生的可注射成像剂

给动物注射50μg/小鼠单抗3-alexa647、抗CD31-alexa610和单抗7-alexa700及2nmol/小鼠Integrisense680，并在注射药剂后24小时成像。小鼠A和D是携带Kpl4肿瘤的Scid米色小鼠，而B和C代表携带Calu3肿瘤的Balbc/裸鼠。将肿瘤外植，在福尔马林中固定24小时，并在石蜡中包埋。以40x放大率拍摄Nuance图像。(A-D)体内NIRF成像。深红色代表高试剂浓度区，而蓝色代表低浓度区。(A-40x-D-40x)Nuance离体成像容许在肿瘤中定位成像剂(红色荧光)。亮蓝色荧光(DAPI)显示细胞核。黄色(B-40x)和蓝色(C-40x)代表肿瘤组织。

图17：用两种靶物特异性抗体的体内活体成像

(A-C)在两个单一图像中分开CD31-alexa610(绿色荧光)和赫赛汀(Herceptin)-alexa700(红色荧光)。(D-40x)离体Nuance图像揭示靶向肿瘤细胞的赫赛汀(红色荧光)，并且主要在肿瘤边缘处观察到血管(绿色荧光)。黄色荧光代表红细胞。(E-F)抗CD31-alexa610的强度比源自赫赛汀-alexa700的强度弱得多。抗CD31-alexa610遍及小鼠身体，但是主要在肿瘤、肺和膀胱中良好分布。赫赛汀-alexa700分布较少，并且高度位于肿瘤和肝/肾中。

图18：人异种移植物中的时间依赖性抗体分布

给携带H322M肿瘤的Scid米色小鼠注射IntegriSense680(2nmol/小鼠)，并在不同时间点时成像。动力学揭示来自循环试剂和非特异性结合的信号随时间逐渐降低。

图19：试剂信号强度依赖于其组织深度

在携带Calu3的Balbc/裸鼠中i.v注射50μg/小鼠单抗3-alexa647。NIRF成像揭示肿瘤区内的最高浓度。Nuance离体成像表明(A)肝、(B)肾和(C)脾中的相似信号强度。(D)肺中的药剂浓度比肿瘤和排泄器官中低。

图20：处理组1-6的生长曲线

所有组揭示，相对于对照单抗在单抗4的情况中多至50％的肿瘤抑制。

图21：体重曲线

图22：对疗法的统计学分析

通过使用SAS程序的AUC评估相对于对照单抗实施分析。

图23：不同处理组的肿瘤血管系统的比较

给小鼠注射抗CD31抗体(50μg/小鼠)，注射后24小时成像，并用比较成像工具比较。

图24：治疗期间CD31信号的相对变化

处理组在处理的前两周中在肿瘤区内展现出经标记的抗CD31信号的升高(黄色柱形)。相反，在第79天和第47天间，用单抗2+3和单抗4的处理显著减少肿瘤血管系统，而对照组和用单抗2的处理加速肿瘤血管形成(紫色柱形)。

图25：抗CD31的荧光显微术和组织化学染色

处理44天后，给小鼠注射抗CD31抗体，处死，并取出肿瘤。下部行代表离体荧光研究。用抗CD31抗体染色的血管(黄色)在用对照单抗处理的组中多得多地存在。肿瘤毛细管的另一个证据是自身荧光红细胞的出现(亮蓝色)。上部行显示经HE染色的肿瘤切片。对照肿瘤揭示一些坏死区，而肿瘤坏死在用抗血管生成抗体处理的那些组中得到极端加速。

图26：血管密度的离体量化。

图27：治疗期间的各种血管生成生长因子的mRNA表达样式

在第79天通过使用3个肿瘤来测定mRNA表达。使用1％凝胶(对于VEGF(人的)和β-肌动蛋白)和1,5％(对于VEGF(小鼠的)和Ang2(人的))来实施凝胶电泳。

图28：抗小鼠CD31离体荧光成像

注射药剂后24小时外植肿瘤。抗小鼠CD31抗体(红色荧光)是用于监测肿瘤血管发生的最好的成像剂。它揭示肿瘤血管的精确轮廓。蓝色荧光代表肿瘤细胞核，而黄色荧光对应于红细胞自身荧光。

图29：FMT三维成像技术

(A)二维成像显示肿瘤区中的最高抗体浓度(白色圆圈)。(B)FMT图像前侧。(C)FMT图像+30°侧。(D)FMT图像-30°侧。

图30：对照单抗、单抗2(处理组3)和单抗4(处理组6)的肿瘤大小测量和离体分析。

图31：通过使用经Cy5标记的抗CD31检测血管

(A)在Calu3异种移植物BALB/c裸鼠中以50μg/小鼠(2mg/kg)的浓度i.v注射用Cy5标记的抗鼠CD31抗体。48小时后，获得体内图像。

(B)此后15分钟，将肿瘤外植，并通过荧光显微术分析组织载玻片切片。

血管内的红细胞(为黄色)是血管为功能性的指标。

用经Cy5标记的抗CD31抗体染色血管壁(为红色)。

以下实施例不应解释为限制本发明，而是仅例示本发明。

实施例

1.细胞系

1.1Calu3(高加索人，腺癌，肺，人)

人NSCLC(非小细胞肺癌)细胞系Calu3自Chugai(Kamakura，Japan)获得。其特征是动物研究中及细胞培养(其中细胞以单层生长，并且强烈附着于细胞培养烧瓶底部)中缓慢的生长样式。在体内，肿瘤展现出高血管化样式，并且如此，它是此工作中使用的主要细胞类型。将细胞系培养，注射入小鼠中，用不同血管生成探针成像，并用由Roche开发的治疗性抗体处理。

1.2KPL-4

乳腺癌细胞系KPL-4自具有炎性皮肤转移的乳腺癌患者的恶性胸腔积液获得。该细胞系也自Chugai(Kamakura，Japan)获得。使用KPL-4异种移植物来优化对于监测血管发生特异性的试剂的体内成像参数。

1.3H322M

第二种“非小细胞肺细胞系”是H322M。它也源自Chugai(Kamakura，Japan)。以与用于优化体内生命成像参数的KPL-4异种移植物相同的方式应用此细胞系。

2.抗体和荧光成像剂

表2：抗体和荧光成像剂的概述

3.PCR引物

对于mRNA表达研究，使用自TIB MOLBIOL GmbH(Berlin)获得的靶物特异性引物来实施RT-PCR。人VEGF-A基因表达揭示7种不同剪接变体，并且通过使用VEGF-A特异性引物检出它们中的6种。

表3：引物序列和退火温度的概述

通过使用这些引物，期望的片段应当具有如下的大小：

表4：PCR片段大小

引物(人特异性)	剪接变体	片段大小[bp]
			VEGF-A	6	620，569，551，497，462，365
血管生成素2	1	100
			β-肌动蛋白(对照)	1	1128
引物(小鼠特异性)	剪接变体	片段大小[bp]
			VEGF-A	1	78
血管生成素2	1	264

4.方法

4.1细胞培养

将Calu3细胞在装有补充有10％胎牛血清(FBS)和2mM L-谷氨酰胺的RPMI 1640培养基的T75细胞培养烧瓶中在5％CO2中于37℃培养。通过使用胰蛋白酶以7天时段拆分缓慢生长的NSCLC细胞，使用普通光学显微镜来实施形态学评估，并通过Vi-CellTM细胞存活力分析仪计数。细胞以约3，5天的世代间隔揭示指数生长样式，并且在第35天时，将细胞胰蛋白酶化，清洗，计数，并稀释至5*106/100μl。

4.2小鼠模型

为了避免针对注射的人肿瘤细胞的免疫反应，自Bomholtgard(Ry，Denmark)选择4-5周龄的雌性Balbc/裸鼠(见图6A)。这些动物缺乏胸腺，不能生成成熟的T细胞，并且因此是免疫缺陷的且适合于异种移植物研究。对于初步测试，使用注射KPL4或H322M肿瘤的来自Charles River(Sulzfeld，Germany)的Scid米色小鼠(见图6B)。Scid米色小鼠拥有“Scid”和“Beige”(米色)这两种遗传常染色体隐性突变。“Scid”小鼠显示影响B和T淋巴细胞两者的重度组合免疫缺陷，而“Beige”突变仅影响NK细胞。对Scid米色小鼠剃毛以进行成像实验，从而降低源自身体毛皮的自身荧光信号。贯穿整个研究时间让所有动物都自由获得食物和水。对于体内活体成像实验，经由吸入在合适的麻醉盒中插入的异氟烷来实施麻醉。依照动物福利条例实施所有研究，并且已经得到地方当局批准。

4.3肿瘤和转发器剂接种

将指数生长的Calu3细胞收获，在PBS中清洗，并由有经验的实验室技术人员皮下注射入麻醉小鼠的右体侧区中，体积为0.1ml且总数为5*106个肿瘤细胞。为了在整个研究期间容易地鉴定Balbc/裸鼠，给它们注射转发器，其也使用转发器注射装置皮下注射。依照承诺的准则(GV-Solas，Felasa，TierschG)实施所有实验研究。地方政府审阅并批准实验研究方案(登记号211-2531.2-22/2003)。

4.4肿瘤大小和体重

通过使用测径器和天平以mm和g测量肿瘤大小和体重。将结果转移至局部数据库。程序中使用的肿瘤体积计算的公式适合于计算椭圆形肿瘤。它包含肿瘤的长度L(最常的维度)和宽度W(较短的维度，与小鼠身体平行)。

V＝0.5x L x(W²)

4.5随机化

为了获得用治疗性抗体治疗的统计学良好分布的组，需要将动物随机化。使用称作“Phasis”(Pharmacology Animal study Information System)的基于内部软件的系统来实施此随机的且同质的分布。开始治疗前不久，根据小鼠的体重及其肿瘤大小来将它们分组。系统找到一组中最大的与最小的肿瘤间的最小距离。随机化工具给出同质的且(最重要的)相当的分组作为治疗起始点。

4.6抗体的胃肠外注射

使用1.0ml注射器和18G套管来实施治疗期间的治疗性抗体的腹膜内(i.p.)注射，并以200μl的体积在小鼠腹腔的下部中应用。使用1.0ml注射器和27G套管来实施经荧光标记的抗体的静脉内(i.v)应用，并以200μl的体积注射入小鼠尾静脉中。

4.7用

的NIRF体内活体成像

MAESTRO系统是一种平面荧光反射成像系统，其容许非侵入性体内荧光测量。在此多光谱分析中，在特定波长捕获一系列图像。捕获的波长范围应当覆盖存在于标本中的标记物的预期光谱发射范围。结果会是一系列称作“图像立方体”的图像，并且它是用于限定自身荧光和特定标记物两者的个别光谱的此一系列图像内的数据。生物学感兴趣的许多标记物具有相似的发射光谱，使得使用昂贵的窄带滤光器分离是困难或不可能的。用单一长通发射滤光器替换大量发射滤光器。在皮肤、毛皮、皮脂腺的天然自身荧光外，还存在着来自共栖生物体(真菌、螨等)和摄取食物(叶绿素)的独特自身荧光。多光谱分析经由发射荧光的线性信号混合物的数学解开(分解)能够分开应用于标本的特定标记物的所有这些信号，只要期望信号和自身荧光的发射光谱是已知的。

测量

给照明模块装备激发白光的氙气灯(Cermax)。经由下游连接的激发滤光器(由实验者选择)，将光限定于(对于该实验)期望的波长范围，并经由光纤引导入成像模块中。在这里，将受限制的光划分入照亮麻醉的测试动物的四根光纤中。MAESTRO系统自动选择最佳的暴露时间，从而没有过度暴露的风险。用发射滤光器选择激活的荧光探针的发射荧光光(见表1)，并经由液晶(LC)引导至高灵敏性、冷却型CCD照相机。液晶使照相机能够进行特定波长的选择性照片记录。波长测量范围取决于选定的滤光器组(蓝色、绿色、黄色、红色、深红色、NIR)，并且以10nm为梯级记录照片。在一个称作“图像立方体”(见表1)的“照片包”中组合每个单一照片的光谱信息。

分析

每次记录由12比特黑白照片构成，其可以以4096个不同灰度显示并且因此有可能区别发射强度的最小差异。相反，人眼能够区别30-35个灰度。针对波长范围将发射强度的那些数值(灰度)绘图，并且因此，我们获得每个探针和组织自身荧光的发射光谱。软件将三个基本色(红色、绿色、蓝色)细分成用于成像立方体的波长范围，由此黑白照片变成有颜色的图像(RGB图像，见图8F)。在这些获取的多光谱信息外，系统能够区别注射的探针和任何来源的自身荧光。程序是使用光谱文库，其中每个纯探针的单一光谱和通过对没有任何注射的研究动物(Balbc/裸鼠或Scid米色小鼠)(小鼠自身荧光)成像获取的光谱。通过已知纯的成像和自身荧光的精确光谱，系统能够过滤期望光谱的整个图像，并且将颜色归入它们中的每个。起源图像(非混合合成图像)显示不同颜色的本光谱。为了显现探针信号的强度分布，有可能以假颜色显示信号(见图6F)，而低强度是蓝色，并且高强度区是红色。除了那点外，可以限定探针的信号强度的检测限度，其容许降低循环探针和非特异性结合的信号(见图6G)。

比较和量化

MAESTRO比较图像荧光团区的能力使其易于比较治疗期间的肿瘤荧光信号强度。程序提供了用于比较肿瘤区(比较的图像)中的不同信号强度的工具。因为在最佳的暴露时间时拍摄所有图像，所以它们随信号强度而有所不同。对于可靠的比较，相对于一个暴露时间标准化照片，导致信号强度差异的显示。通过手工绘画并修饰测量区，可以以强度值量化信号强度。一旦在肿瘤周围选择测量区，便可以将其克隆，并移动至要比较的下一图像。基于目前的设置(台高度和框并)以像素和mm2计算每个区域。因此，它给出关于创建的测量面积内平均信号、总信号、最大信号和平均信号/暴露时间(1/ms)的信息。

4.8肿瘤外植

将动物处死，并依照承诺的准则(GVSolas，Felasa，TierschG)外植肿瘤。在处死动物后，使用手术刀将肿瘤外植，并转移入包埋盒中或者在具有异戊烷(用于免疫组织化学应用)和没有异戊烷(用于PCR应用)的液氮中快速冷冻。

4.9肿瘤固定和石蜡切片

将外植的肿瘤在包埋盒中密封，并在连续搅动下在福尔马林中温育约24小时。此后，弃去福尔马林，并用蒸馏水清洗肿瘤，接着将肿瘤脱水，并用石蜡渗透(见表5)。使用Tissue VIP真空渗透处理器来实施所有温育步骤。

表5：脱水和石蜡包被

在石蜡渗透后，用Tissue石蜡包埋机将肿瘤在液体石蜡中包埋成最终的组织块。使用切片机自这些块获得厚度范围为2-8μm的石蜡切片。将它们切割，在玻璃载玻片上举起，于37℃空气干燥过夜，接着去石蜡化和HE染色(见表10)。用Nuance系统检查载玻片。

4.10苏木精-曙红染色

苏木精和曙红染色剂是组织学上最常用于检查活组织检查中的异常组织变化的染色剂或手术化合物。苏木精自苏木树的木提取。在氧化时，它形成氧化苏木精，即一种具有富含蓝色-紫色颜色的化合物，并且与合适的媒染剂(最通常为Fe(III)或Al(III)明矾)一起使用，形成苏木精明矾(见表6)，以将细胞核染色，之后在显微镜下检查。染色期间，带正电荷的明矾复合物与核酸的带负电荷的磷酸根基团相互作用。通过用自来水变蓝色来获得最终的蓝色。应当使用光学显微镜来对染色检查期望的染色等级，并在有利的染色强度停止。

表6：苏木精明矾溶液

曙红是一种经常作为苏木精染色的复染剂使用的合成红色染料。曙红是一种酸性染料并且带负电荷，从而它经由静电吸附结合阳根，并且在细胞的碱性部分(胶原、胞质的碱性部分)中显露。

表7：去石蜡化和HE染色

4.11供应切片

在HE染色后，将组织切片脱水(见表8)，给其供应约100μl CytosealTM封固剂，并用玻璃盖片覆盖。

表8：脱水和盖片供应

4.12

离体成像

用Nuance照相机的多光谱成像技术获取关于石蜡或冷冻切片的高灵敏性图像，并且容许定量且灵敏性测量光谱发射的微妙差异。Nuance具有两个主要优点。第一，它能够完成明视场成像，而且它还可以充当一种卓越的彩色照相机。第二，在荧光显微术中，在有自身荧光的样品，如大多数组织切片中，Nuance分开组织自身荧光与感兴趣的信号。功能与使用滤光器组和多光谱分析的MAESTRO系统相似。

测量

将石蜡载玻片在标本台上放置，并调节焦距。荧光显微镜的UV灯发射广谱的UV光。激发滤光器将光限于期望的波长范围，并且经由分束器将其聚焦于组织切片上。切片中含有的荧光探针吸收光，并且发射荧光团特异性波长的光。最佳暴露时间由Nuance系统自动建立。下游连接的发射滤光器仅容许限定的波长通过，并且它们被照相机识别。Nuance照相机是一种含有液晶滤光器的高灵敏性、冷却型CCD照相机。此照相机系统与所描述的Maestro系统(第4.7章)相同。多光谱成像和分析基于相同的背景，其容许分开具有相似发射光谱的荧光探针并除去组织自身荧光。

分析

Nuance系统也与光谱文库一起运行。需要荧光探针和自身荧光的纯的单一光谱来分开并显现不同信号(见图8)。为了完成这点，在不进行任何标记的情况中使用合适的滤光器组及组织切片来测量每个荧光团的单一光谱以揭示组织自身荧光。将这些光谱转移至系统中，分开并以不同颜色显现(见图8)。

4.13免疫组织化学

为了显现遍及整个肿瘤切片的肿瘤血管，以50μg/小鼠的浓度将未标记的内皮抗体(仓鼠抗小鼠CD31)注射入小鼠中。在注射后24小时时外植肿瘤，并在液氮和异戊烷中快速冷冻后切片。使用二抗(山羊抗仓鼠IgG)碱性磷酸酶系统来鉴定未标记的血管标志物。载玻片扫描仪容许显现整个肿瘤切片。

冷冻切片

对于免疫组织化学应用，切割后立即将肿瘤在异戊烷和液氮中快速冷冻，并于-20℃保持，直至切片。简言之，用低温恒温器(2800Frigocut)于-18℃的最佳切割温度切割10μm肿瘤冷冻切片，用丙酮固定1分钟，空气干燥，并用于免疫组织化学应用。

免疫染色规程和载玻片扫描

将切片在Dako清洗缓冲液中调节5分钟，并用10％山羊血清封闭20分钟以防止二抗的非特异性结合。将载玻片漂洗2次达2分钟，之后将山羊抗仓鼠IgG二抗(AP缀合的)温育1小时，且为1/200稀释。将切片用含有0.025％Tween的Dako清洗缓冲液清洗三次，达5分钟。对于显现，将载玻片与永久红溶液一起温育两次，达10分钟，在蒸馏水中漂洗，并变蓝至少5分钟。将组织切片脱水(见表8)，给其供应约100μl CytosealTM封固剂，并用玻璃盖片覆盖。MIRAX SCAN装备有外部扫描照相机，并容许将载玻片数字化。它检测载玻片上的样品，并以恒定的高质量对其扫描，并提供量化整个肿瘤组织样品的可能性。

4.14mRNA表达序型分析

实施RT-PCR以测定肿瘤形成和肿瘤血管生长期间的各种血管生成生长因子(VEGFA，ANG2)的表达序型。使用小鼠和人特异性引物来揭示源自人材料的RNA表达与源自小鼠自身的表达间的平衡。RNA提取将外植的肿瘤在MagNA Lyser LC Green Bead中放置，并在液氮中快速冷冻。通过添加合适体积的裂解缓冲液(根据肿瘤的重量)，将样品在快速制备仪中均质化，直至完全破坏肿瘤组织。离心步骤使碎片在管底沉淀，使得容易采集上清液，并将其放入样品筒中以开始用MagNA纯LC系统提取mRNA。系统通过选择用于自组织样品分离mRNA的程序来自动工作。

使用Magna纯LC mRNA分离试剂盒II(组织)的MagNA纯LC系统规程

1)将溶胞物上清液移液入样品筒中；

2)用含有经生物素标记的寡聚(dT)(其与mRNA的多聚(A)尾部杂交)的捕捉缓冲液稀释样品；

3)添加SMP(链霉亲合素磁性颗粒)后，捕获寡聚(dT)-mRNA复合物，并将其固定化于珠表面上；

4)通过与DNA酶I一起温育来除去基因组DNA；

5)通过应用来自反应管外部的磁体自加工筒的孔回收具有吸附的mRNA的SMP；

6+7)用清洗缓冲液的重复清洗步骤除去未结合的物质，如蛋白质、细胞膜，并降低离液盐浓度；

8)于70℃自洗脱筒的孔中的SMP洗脱纯化的mRNA，而SMP保留于反应管中。

mRNA量化

使用NanoDrop 1000分光光度计来获得纯化的mRNA收率。它通过在没有任何稀释的情况中使用仅1μl来实现高度精确的UV/Vis分析。以260nm和280nm测量mRNA，并且因此，该程序给出以ng/μl计的mRNA收率和mRNA质量的数值(高质量：OD 260/280比率为1.8-2.2)。

RT-PCR

在两步中实施RT-PCR：使用第一条链cDNA合成试剂盒合成第一条链cDNA，接着是使用高保真度PCR大师级混合物的聚合酶链式反应。

cDNA合成的组分

通过使用寡聚p(dT)15引物来在多聚(A)-mRNA的3’端将mRNA转录成单链cDNA。

表9：第一条链cDNA合成的组分

cDNA合成反应：

PCR的组分：

表10：聚合酶链式反应的组分

PCR反应：

退火温度在引物与引物间有所不同(见第3章)。

凝胶电泳

通过在含有溴化乙锭的琼脂糖凝胶(1-2％)中电泳分离来实施片段的分离和显现。基于片段重量和组成，凝胶中交联的聚合物展现出多孔性。利用电动势来移动核酸通过凝胶基质。通过在孔中放置样品并应用电流，分子会以不同速率(由其质荷比决定)移动通过凝胶，朝着阴极。溴化乙锭(即一种带正电荷的荧光剂)在运行期间插入核酸碱基对中，以显现分开的片段。将凝胶暴露于UV光，并且照相机以照片记录荧光图像。使用分子大小标志物来鉴定分开的片段的近似大小。

4.14统计学分析

统计学分析关于原发性肿瘤生长的数据。简言之，在随机化的两样品设计中，测定治疗-比-对照比率(TCR)及其双侧非参数(1-á)置信区间(CI)。使用SAS第9.1版(SAS Inc.Cary)用特殊的SAS程序TUMGRO(第3.0版)实施计算。系统容许“终点”评估(EP)和测量数据的“曲线下面积”评估(AUC)。EP评估使用肿瘤测量最后一天的数值，而AUC评估包括所有数据。

4.16离体血管量化

使用定制的书面MATLAB脚本来实施石蜡切片中的血管密度量化。程序后面的基本想法是通过使用k均值聚簇来分开抗CD31信号(见图10B)。然后，将过滤的特定信号转化成二进制图像，并“腐蚀”以除去扰乱的信号(腐蚀功能)。在倒转照片后(见图10C)，有可能手工限定血管出现的区域。该程序以红色标记感兴趣的区域(见图10D)，并计算记录照片内的血管区域的百分比。

***

鉴于说明书内引用的参考文献的教导，说明书得到最彻底地了解。说明书内的实施方案提供了本发明实施方案的例示，并且不应解释为限制本发明的范围。熟练技术人员容易认识到，本发明涵盖许多其它实施方案。通过提及而完整收录本公开内容中引用的所有出版物和专利。凡是通过提及收录的材料与本说明书矛盾或者不一致，说明书应当代替任何此类材料。本文中的任何参考文献的引用不是承认此类参考文献是本发明的现有技术。

除非另有指示，在说明书(包括权利要求书)中所使用的表述成分数量、反应条件等的所有数目应当理解为在所有情况中通过术语“约”修饰。因而，除非另有相反的指示，数值参数是近似值，并且可以随本发明寻求获得的期望特性而有所变化。至少，而且不作为试图限制与权利要求书的范围等同的教条的应用，每个数值参数应当根据有效数和常规舍入方法来解释。

除非另有指示，在一系列成分之前的术语“至少”应当理解为指系列中的每种成分。本领域技术人员只是使用常规实验就会认识或能够确认，本文中所描述的本发明具体实施方案的许多等同方案。意图此类等同方案被本发明所涵盖。

遍及此说明书和所附的权利要求书，除非上下文另有需要，词语“包含”及变型诸如“包括”和“含有”应当理解为暗示包括所述的整数或步骤或整数或步骤组，但是不排除任何其它整数或步骤或整数或步骤组。

遍及此说明书文本引用数个文件。本文中引用的每篇文件(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、指令等)(无论上文或下文)在此通过提及而完整收录。凭借在先发明，本文中的任何文字都不应解释为承认本发明没有资格早于所述公开。

应当注意，如本文中及所附权利要求书中所使用的，单数形式“一种”、“一个”、和“所述/该”包括复数指示物，除非上下文另有明确指示。如此，例如，提及“一种试剂”包括一种或多种此类不同试剂，而提及“该方法”包括提及可以修饰或替换本文中所描述的方法的本领域普通技术人员已知的等同步骤和方法。

Claims

1.一种对受试者中的肿瘤血管系统体内成像的非侵入性方法，包括检测经荧光标记的抗CD31抗体。

2.一种在受试者中体内监测抗血管生成剂的治疗功效的非侵入性方法，包括检测经荧光标记的抗CD31抗体。

3.前述权利要求中任一项的方法，其中要在检测所述抗体前对所述受试者施用所述经荧光标记的抗CD31抗体。

4.前述权利要求中任一项的方法，其中所述受试者患有癌症。

5.前述权利要求中任一项的方法，其中所述受试者具有实体瘤。

6.权利要求5的方法，其中所述受试者的实体瘤是异种移植物，优选地人异种移植物。

7.前述权利要求中任一项的方法，其中要用抗血管生成剂治疗所述受试者。

8.前述权利要求中任一项的方法，其中通过近红外荧光成像(NIRE)来实现检测。

9.权利要求8的方法，其中近红外荧光成像包括荧光反射成像(FRI)或荧光介导的断层摄影术(FMT)。

10.权利要求7的方法，其中所述抗血管生成剂是VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGFR1、VEGFR2或血管生成素的抑制剂。

11.权利要求10的方法，其中所述抑制剂是抗体、siRNA或小分子。

12.在前述权利要求中限定的任何方法中使用的经荧光标记的抗CD31抗体。

13.在前述权利要求中限定的任何方法中使用的试剂盒，其包含经荧光标记的抗CD31抗体和用于近红外荧光成像以检测受试者中的所述抗体的手段。

14.经荧光标记的抗CD31抗体用于制备用于对受试者中的肿瘤血管系统体内成像的诊断组合物的用途。

15.经荧光标记的抗CD31抗体用于制备用于在受试者中体内监测抗血管生成剂的治疗功效的诊断组合物的用途。