CN102477091B

CN102477091B - 水稻雄性不育蛋白及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN102477091B
Application number: CN2010105742921A
Authority: CN
Inventors: 程祝宽; 洪丽兰; 李明; 唐丁; 王克剑
Original assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Current assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Priority date: 2010-11-30
Filing date: 2010-11-30
Publication date: 2013-11-13
Anticipated expiration: 2030-11-30
Also published as: CN102477091A

Abstract

本发明公开了一种水稻雄性不育蛋白及其编码基因与应用。该蛋白，是如下1)或2)的蛋白质：1)由序列表中的SEQ ID №.2的氨基酸残基序列组成的蛋白质；2)将序列表中的SEQ ID №.2氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有SEQ ID №.2的氨基酸残基序列相同活性的蛋白质。本发明水稻雄性不育蛋白基因，可用于培育雄性不育水稻，为免去雄杂交水稻做出贡献。

Description

水稻雄性不育蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及水稻雄性不育蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

水稻是人类最主要的粮食作物之一，世界上约有一半的人口以稻米为主要粮食。中国稻作面积约占全世界的23％，稻谷产量占全世界的37％左右。中国的水稻播种面积占全国粮食作物播种面积的30％，而总产量却占粮食作物产量的42％以上，单位面积产量比整个粮食作物平均高出45.7％，其中一个重要的原因就是杂种优势的广泛应用。杂种优势是生物界的一种普遍现象，指两个遗传性不同的亲本杂交，杂种一代性状表现比双亲具有较强的生活力、生长势、抗性、适应性和丰产性。杂交水稻在许多性状上表现显著的杂种优势，综合表现在营养优势、生殖优势、抗性优势和品质优势等方面。杂交水稻的推广应用，为中国乃至世界的粮食增产作出了巨大贡献。

水稻杂种优势能够有效利用的基础是水稻雄性不育。植物雄性不育是植物有性繁殖过程中不能产生具有正常功能花粉的现象，这种现象在高等植物中普遍存在，是有效利用杂种优势，提高作物产量的前提和基础。从基因型组成角度上划分，水稻的雄性不育分为：细胞核雄性不育(Genie Male Sterility，GMS)和核质互作雄性不育(亦即细胞质雄性不育，Cytoplasmic Male Sterility，CMS)。细胞核雄性不育由细胞核不育基因控制，无正、反交遗传效应。根据不育基因与对应的可育基因之间的显隐性关系，又可分为隐性核不育和显性核不育，大多数植物的雄性核不育属于隐性核不育，约占88％。显性核不育水稻因其F1代可育与不育的分离比为1∶1，通常既无恢复系又无保持系，不能直接用于生产；单基因隐性核不育、双基因隐性核不育和多基因隐性核不育，这几类不育系因在生产上难于找到相对应的保持系，不能实现三系配套，限制了其在杂种优势利用中的应用。至今较为成功地应用隐性核不育是水稻光温敏核不育。在水稻中发现有光(温)敏感雄性核不育系，分为温敏型、光敏型和温光互作型。

发明内容

本发明的目的是提供一种水稻雄性不育蛋白及其编码基因和应用。

本发明提供的水稻雄性不育蛋白(MSPL)，来源于水稻，是如下1)或2)的蛋白质：

1)由序列表中的SEQ ID №.2的氨基酸残基序列组成的蛋白质；

2)将序列表中的SEQ ID №.2氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有SEQ ID №.2的氨基酸残基序列相同活性的蛋白质。

序列表中序列2由127个氨基酸残基组成。

为了便于MSPL的纯化，可在由序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质的氨基端或羧基端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述(b)中的MSPL可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的MSPL的编码基因可通过将序列表中序列1或3所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码上述水稻雄性不育蛋白(MSPL)的基因(MSPL)也属于本发明的保护范围。

所述水稻雄性不育蛋白cDNA基因可为如下1)或2)或3)或4)的DNA分子：

1)序列表中SEQ ID №.1的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID №.2蛋白质序列的多核苷酸；

3)与序列表中SEQ ID №.1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

4)在严格条件下可与序列表中序列2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

序列表中的序列1由384个碱基组成，其开放阅读框架(ORF)为自5′末端第1-384位核苷酸。

上述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃条件下杂交并洗膜。

含有以上任一所述基因的重组载体也属于本发明的保护范围，如重组表达载体。

可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。

所述植物表达载体包括双元农杆菌载体(如pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA3301、pCAMBIA1301-UbiN、pCAMBIA1300等)和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。

使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子、组成型启动子或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin)、胁迫诱导型启动子Rd29A等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

含有以上任一所述基因(MSPL)的表达盒、转基因细胞系及重组菌均属于本发明的保护范围。

扩增上述基因的全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围之内。

所述蛋白、所述基因、所述重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌中的任意一种均可应用于培育雄性不育转基因水稻。

利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将编码所述蛋白的基因导入植物细胞，可获得抗盐、耐旱性增强的转基因细胞系及转基因植株。携带有所述基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

本发明得到一个籼稻中籼3037的自然发生的雄性不育突变体，mspl(microsporocyteless)，该突变体抽穗后花药中不产生花粉母细胞，导致无任何花粉，但雌配子发育不受影响。该突变表型由一个隐性核基因控制。通过构建籼粳杂交群体，利用图位克隆的方法，获得了控制这一性状的基因。序列比较表明，该基因编码一个谷氧还蛋白，目前水稻中尚无这类基因突变影响花粉母细胞发育的报道，说明这是一个控制细胞核雄性不育的新基因。这一新突变体的获得，对了解水稻花粉的形成发育机制具有重要的应用价值。新基因克隆后，可以探索将其用于水稻育种，丰富现有的水稻育种材料的遗传多样性。本发明水稻雄性不育蛋白基因，可用于培育雄性不育水稻，为免去雄杂交水稻做出贡献。

附图说明

图1为3037与突变体mspl的花药；A和B分别为对照3037(左)与mspl(右)的花药；C和D分别为对照3037(C)与mspl(D)的成熟花药的横切。

图2为MSPL基因的定位及互补表达载体的构建

A.MSPL基因位点被定位到水稻6号染色体短臂上的分子标记S8和S9之间。

B.MSPL基因的结构。黑色代表外显子，该基因只有一个外显子。箭头标示的是外源片段的插入位点。

C.互补表达载体的构建。pCMSPL，互补表达载体，包括MSPL基因上游3870bp和下游1306bp；pCMSPLC，互补表达载体对照，与pMSPL相比少了MSPL基因的部分启动子区、整个编码区和3’调控区。

图3为3037与MSPL基因RNA干扰转基因植株的花药。

图4为野生型盐稻8号和pMSPLRNAi植株MSPL基因表达量。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量

实施例1、水稻雄性不育突变体mspl的表型及遗传分析

1、水稻雄性不育突变体mspl的表型分析

水稻雄性不育突变体mspl本实验室在田间发现的中籼3037(WT，购自扬州大学农学院)的自然突变体。mspl突变体在营养生长阶段与与对照3037相比没有明显差异，抽穗以后突变体才表现出典型的雄性不育表型，表现为花药呈白色，不会开裂散出花粉。半薄切片结果显示该突变体花药中没有任何花粉，花粉囊中分布着大小形状都类似的薄壁细胞，有的花粉囊中央甚至木质化，有类似于维管束的组织分化(图1)。

我们将mspl突变体授予野生型的花粉，发现它能正常结实，且这种杂交种子能正常萌发生长，其植株在存活率、营养生长生殖生长等方面都与野生型植株无明显差异，表明mspl突变体雌性可育。

2、水稻雄性不育突变体mspl的遗传分析

水稻雄性不育突变体mspl和粳型野生型材料(Japonica)日本晴(中国农科院作物科学研究所水稻种质资源中心保藏，库编号I1A13071)，二品种杂交得F1代，F1代自交产生F2代，对F2代植株进行表型鉴定，日本晴和mspl分别作为正、负对照，F2代植株的表型鉴定结果如表2所示，表明水稻雄性不育这一性状符合单基因控制遗传规律。表2中，正常株数是指具有日本晴表型的株数，雄性不育mspl株数是指具有mspl表型的株数。

表1水稻雄性不育突变体mspl的遗传分析

组合	正常株数	mspl株数	总株数	分离比
					mspl/日本晴	306	94	400	3.25∶1

实施例2、MSPL及其编码基因MSPL的获得

1.图位克隆MSPL的基因组基因

为了克隆MSPL基因，我们将用纯合的雄性不育突变体mspl和日本晴进行杂交，获得的F₁代自交得到F₂群体，对其中236个F2隐性个体(具有雄性不育表型的F2代个体)进行MSPL基因的初步定位。应用STS(Sequence-Tagged Site)分子标记，利用PCR的方法，我们发现位于第7染色体上的STS标记S1、S2、S3和S4与突变位点在位置上具有明显的连锁性。突变位点和S2之间的交换单株，绝大多数在突变位点和S1之间也进行交换，而突变位点和S3之间的交换单株，绝大多数包含在突变位点和S4之间的交换单株中。同时突变位点和S3之间的交换单株与突变位点和S2之间的交换单株不同，因此推断突变基因可能位于标记S2和标记S3之间的区域。在此基础上，我们进一步扩大突变体mspl和日本晴的杂交组合，获得了包含1020株突变单株的F₂分离群体用于MSPL精细定位。参照已经完成的水稻基因组序列(http://www.tigr.org/tdb/e2k1/osa1/和http://btn.genomics.org.cn)，对粳稻和籼稻的序列进行比较，利用序列差异发展了5个新的STS分子标记(表3)。最终将MSPL精细定位于BAC克隆AP003704标记S8和S9之间，这两个标记之间的物理距离约为13kb。利用水稻基因组注解数据库RiceGAAS(http://ricegaas.dna.affrc.go.jp/rgadb)分析表明，13kb区域内共有4个基因，我们将这4个基因进行DNA序列测定，比较了突变体和野生型序列，发现其中三个基因在突变体中的序列都与野生型的一致，只有一个编码谷氧还蛋白的基因，其ORF区不能通过PCR扩增出来，通过TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)的方法我们确定出在该基因ORF的第223bp之后有外源片段的插入。因此，我们将谷氧还蛋白基因确定为目标基因，命名为MSPL。图2中C为MSPL基因结构，图中标记为基因的突变位点。

因为该基因在KOME(http://cdna01.dna.affrc.go.jp/cDNA)水稻日本晴的cDNA数据库有没完整的cDNA序列，而水稻基因组注解数据库RiceGAAS预测该基因ORF区有579bp。我们对该基因进行了5’RACE(5’Rapid Amplification of cDNA Ends)PCR和3’RACE(3，RapidAmplification of cDNA Ends)PCR，发现该基因从起始密码子到终止密码子的基因组全长为384bp，没有内含子，共编码127个氨基酸。该基因的完整的ORF序列为序列表中序列1所示的序列。5’RACE和3’RACE采用Clonetech公司PCR cDNA合成试剂盒(K1052-1)按照说明书操作。

表3本研究新创制的STS标记

2.MSPL基因全长ORF的获得

水稻日本晴叶片总RNA提取采用Bioteke公司RNA提取试剂盒(Bioteke，RP1201)按照说明书操作。以Oligo(dt)-18为引物，以所提取的总RNA为模板进行反转录合成第一链cDNA。以此cDNA为模板，primer 1(5’-AGGATGAGGATGCAGGTGGTGG-3’)和primer 2(5’-AACCGATTCAACAGCACAC-3’)，进行PCR扩增反应，反应条件如下：

反应体积50μl，其中含有：模板(cDNA)5μl(5ng)，引物正向引物、反向引物终浓度各0.2μM，dNTP终浓度各200μM，Taq DNA聚合酶2.5U，10×Taq DNA聚合酶缓冲液5μl，用双蒸水补足至50μl体积。

反应温度、时间：94℃，变性5分钟；然后94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒，扩增30个循环；最后在72℃下延伸5分钟。

扩增产物为3’有碱基A的3’突出粘端片段，用Biomed胶回收试剂盒(Biomed，28706)按产品说明书进行纯化，然后与3’有碱基T的线性pBM19-T载体(Biomed，A1360)在室温下下连接20分钟，使用2mm电极杯，2500V转化大肠杆菌DH5α，转化物在含氨苄青霉素的LB平板培养基上生长，挑选克隆，提取质粒，使用AbI PRISM3700DNA分析仪(Perkin-Elmer/Applied Biosystem)测序，获得如序列表中序列1所示的MSPL的cDNA的ORF，其全长384bp，其编码的氨基酸序列见序列表中序列2。

实施例3、雄性不育突变体MSPL表型的互补实验

1、互补载体pCMSPL及互补对照载体pCMSPLC的构建

利用EcoRI酶切BAC OsJNBa0057C01(购自中科院上海国家基因研究中心，编号OsJNBa0057C01)，获得包含有MSPL的起始密码子ATG上游的3870个碱基和终止密码子TGA后的1306个碱基的全长序列的DNA片段(5360bp)，克隆到pCAMBIA1300(DingGuo，MCV033)EcoRI位点，即构建成了互补表达载体pCMSPL。将构建好的互补载体pCMSPL用SacI酶切，去除MSPL基因的部分启动子区、整个编码区和3’调控区，保留5’端的部分启动子区，即构建成了互补对照载体pCMSPLC(图2中C)。

2、pCMSPL和pCMSPLC转化株系的获得及其表型鉴定

两载体pCMSPL和pCMSPLC通过电击的方法分别转入农杆菌(AgroBacteriumtumefaciens)株系EHA105(北京亚平宁生物)中，利用农杆菌的介导法分别将pCMSPL和pCMSPLC转入雄性不育突变体mspl与日本晴杂交群体的自交F2代种子的胚中。转化的具体方法是将该F2代种子的幼胚灭菌后切出，接种到诱导愈伤组织的培养基中。培养1周后，挑选生长旺盛，颜色浅黄，比较松散的胚性愈伤组织，用作转化的受体。用含有pCMSPL和pCMSPLC质粒的EHA105菌株分别侵染水稻愈伤组织，在黑暗处25℃培养3天后，在含有50mg/L潮霉素的选择培养基上筛选抗性愈伤组织和转基因植株。

将潮霉素抗性植株在阴凉处练苗，7天后移栽到水田。因为F2代种子中既有mspl隐性纯合个体，又有携带野生型MSPL基因的个体，所以我们鉴定出转基因植株的基因型，挑出来源于mspl隐性纯合种子的转基因植株，再观察这些转基因植株的表型恢复情况。结果表明互补载体pCMSPL能恢复雄性不育表型为野生型表型，而互补对照载体pCMSPLC不能恢复雄性不育表型。功能互补实验表明MSPL控制雄性不育突变体mspl表型

实施例4、MSPL基因RNA干扰转基因植株的获得

MSPL基因RNA干扰质粒pMSPLRNAi详细构建方法：

将用引物对primer 3(5’-ACCGTATCGTGGTGGAAGG-3’)和primer 4(5’-ACGAGGGTGCCATTGATGTG-3’)进行PCR反应扩增日本晴基因组DNA，反应条件如下：

反应体积50μl，其中含有：模板(cDNA)5μl(5ng)，引物正向引物、反向引物终浓度各0.2μM，dNTP 终浓度各200μM，Taq DNA聚合酶 2.5U，10×TaqDNA聚合酶缓冲液5μl，用双蒸水补足至50μl体积。

反应温度、时间：94℃，变性5分钟；然后94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒，扩增30个循环；最后在72℃下延伸8分钟。

扩增产物为3’有碱基A的3’突出粘端片段，用Biomed胶回收试剂盒(Biomed，28706)按产品说明书进行纯化，然后连入3’有碱基T的线性pMD19-T(Takara，D101)载体中得到载体pMD19-MSPL，分别用Sal I和BamHI以及Pst I和Xba I双酶切载体pMD19-MSPL得到片段1和片段2，用Bgl II和Xba I双酶切载体pUCCRNAi(购自中国科学院遗传发育研究所)得到片段3，将片段1、2、3同时连入过表达载体pCam13OX的Pst I和Sal I识别位点间，即构建成了RNAi干扰载体pMSPLRNAi。pCam13OX的构建方法如下：

用引物对35S-F：(5’-AAGCTTCCCAGATTAGCCTTTTCAAT-3’)和35S-R：(5’-CTGCAGTCCCCCGTGTTCTCTCCAA-3’)PCR 扩增质粒pBI 121(DingGuo，MCV032)得到约850bp的组成型CaMV35S启动子片段，将该片段用Pst I和Hind III双酶切然后连入载体pCAMBIA1300(DingGuo，MCV033)的Pst I和HindIII识别位点间，构成中间载体pCam13OXM。用EcoR I和Sac I双酶切质粒pBI121，将得到的片段连入中间载体pCam13OXM的EcoR I和Sac I识别位点间，最终得到过表达载体pCam13OX。

通过电击的方法将载体pMSPLRNAi转入农杆菌(AgroBacterium tumefaciens)株系EHA105中，利用农杆菌的介导法将其转入粳型野生型材料盐稻8号(中国水稻研究所国家水稻数据中心保藏，登记编号苏审稻200307)中。转化方法同实施例2。

结果表明，得到的转基因植株在营养生长阶段与与野生型材料盐稻8号相比没有明显差异，抽穗以后转基因植株才表现出像mspl突变体一样的典型的雄性不育表型，表现为花药呈白色，不会开裂散出花粉。半薄切片结果显示该转基因植株花药中没有任何花粉，花粉囊中也是分布着大小形状都类似的薄壁细胞，说明MSPL基因进行RNA干扰能获得雄性不育植株(图3)。图3中，A和B分别为盐稻8号(左)与转基因植株(右)的花药；C和D分别为盐稻8号(左)与转基因植株(右)的成熟花药的横切。

pMSPLRNAi植株MSPL表达量的定量检测：

取转基因植株及野生型材料盐稻8号的2cm幼穗，提取总RNA，采用Bioteke公司RNA提取试剂盒(Bioteke，RP1201)按照说明书操作。以Oligo(dt)-18为引物，以所提取的总RNA为模板进行反转录合成第一链cDNA。通过semi-qPCR比较转基因植株及野生型材料日本晴的抽穗期叶片cDNA中MSPL基因的表达量，以水稻Ubiquitin基因的表达量做参照。扩增MSPL基因用引物对primer 5(5’-TCCATCCATCGATCCCTACC-3’) 和 primer 6(5’-GCATTTCAAACTCATCGTCG-3’)，扩增Ubiquitin基因用引物对primer 7(5′-CAAGATGATCTGCCGCAAATGC-3’) 和 primer 8(5′-TTTAACCAGTCCATGAACCCG-3’)。

PCR扩增反应条件如下：

反应体积20μl，其中含有：模板(cDNA)1μl(25ng)，正向引物、反向引物终浓度各0.2μM，dNTP终浓度各200μM，Taq DNA聚合酶1U，10×Taq DNA聚合酶缓冲液2μl，用双蒸水补足至20μl体积。

反应温度、时间：94℃，变性5分钟；然后94℃变性25秒，58℃退火25秒，72℃延伸25秒，扩增若干个循环；最后在72℃下延伸5分钟。

扩增循环数：MSPL基因36个循环；Ubiquitin基因25个循环。

结果显示以水稻Ubiquitin基因的表达量做参照，pMSPLRNAi植株中MSPL基因的表达有明显下降(见图4)，确实达到了干扰的效果。图4野生型和pMSPLRNAi植株MSPL基因表达量；上为MSPL基因的表达量，下为对照Ubiquitin(UBQ)基因的表达量；左为野生型材料盐稻8号(WT)的2cm幼穗cDNA，右为转基因植株pMSPLRNAi的2cm幼穗cDNA。

Claims

1.一种蛋白，是由序列表中的SEQ ID№.2的氨基酸残基序列组成的蛋白质。

2.权利要求1所述蛋白的编码基因。

3.根据权利要求2所述编码基因，其cDNA基因的核苷酸序列是下列核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID№.1的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID№.2蛋白质序列的多核苷酸。

4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体。

5.含有权利要求2或3所述基因的重组工程菌。

6.含有权利要求2或3所述基因的重组病毒。

7.权利要求1所述的蛋白或者其编码基因在培育雄性不育的转基因水稻中的应用。