CN102471377B - 优化抗体的生产 - Google Patents

Abstract

提供了一种用于通过层析方法分离抗体分子与抗体变体(例如为了增强治疗功效)来生产纯化的抗体的通用方法，其通过例如选择特定的收获时间点和/或特定的纯化方案来进行。如此，本发明报告了一种用于生产包含抗体分子及其变体的抗体组合物的方法，包括下列步骤：提供包含抗体分子及其变体的样品，在所述样品的等分试样中测定抗体分子和/或其变体的存在和/或抗体分子或其变体量与抗体分子及其变体量之和的比率，基于之前获得的数据确定随后的收获时间点和/或抗体纯化方案，由此生产包含抗体分子及其变体的抗体组合物。

Description

优化抗体的生产

发明领域

本发明涉及多肽生产和纯化领域。提供了用于通过层析方法分离抗体分子与抗体变体(例如为了增强治疗功效)来生产纯化的抗体的通用方法，其通过例如选择特定的收获时间点和/或特定的纯化方案来进行。

发明背景

单克隆抗体具有很大的治疗潜力，并且在当今的医学资财中发挥重要的作用。在过去十年期间，制药业的显著趋势已经是开发单克隆抗体(单抗)作为治疗剂以治疗多种疾病，诸如癌症、哮喘、关节炎、多发性硬化等。最近的报告指示了376个单抗开发项目(从临床前至销售)，而且单克隆抗体目前占临床试验中的所有生物药物的约20％。单克隆抗体主要以重组蛋白在经遗传工程化改造的哺乳动物细胞培养物中制造。通常，使用搅拌罐式生物反应器来生产分泌性单抗，即上游工艺，其接着有由收获、层析捕捉和精制(polishing)步骤组成的下游工艺。然后，通常为液体的药物物质被配制为药物产品。

对于人应用，每种药用物质必须满足独特的标准。为了确保生物药剂对人的安全性，制造工艺后必须接着一个或多个纯化步骤。因此，下游工艺开发的目的是开发产生高纯度产物的高产量的、稳健的、可缩放的、且可靠的工艺。工艺中的典型污染物包括DNA、宿主细胞蛋白(HCP)、病毒、聚集的和片段化的产物、和残留的培养基组分。分离抗体产物与这些污染物需要利用各种纯化模式的正交纯化工艺。一般地，单抗纯化工艺牵涉过滤和层析步骤的各种组合。除纯度之外，通量和收率在确定制药业中的合适纯化工艺中发挥重要的作用。单克隆抗体的大约40-60％的生产成本源自下游工艺。

依照国际协调会议(International Conference on Harmonization，ICH)指导文件，药物物质异质性限定其质量，并且应当监测并表征程度和概况以确保批次间一致性。因此，单抗的微不均一性是生产，特别是下游加工的关注。产物的表征对于测定变体是必需的，所述变体可以以相似的特性存在，并且可以使纯化变得复杂(参见例如Ahrer，K.和Jungbauer，A.，J.Chromatogr.B841(2006)110-122)。例如，单抗的微不均一性源自靶蛋白的翻译后修饰、酶促修饰、错误翻译、及通过加工和改变引起的修饰。每种修饰可以影响终产物的生物学活性或稳定性。如此，需要快速的、可靠的、且定量的分析方法来解析蛋白质的数种变体。例如，层析和电泳方法是用于解析蛋白质变体的工具。

蛋白质中的天冬酰胺和谷氨酰胺残基的侧变化的非酶促脱酰胺化经常造成重组蛋白的电荷异质性。这些氨基酸的不带电荷的侧链被修饰成异-谷氨酸和异-天冬氨酸残基或者谷氨酸和天冬氨酸残基。因此，每处修饰对蛋白质引入额外的电荷(Aswald，D.W.等，J.Pharmaceut.Biomed.Anal.21(2000)1129-1136)。

对于重组单克隆抗体，脱酰胺化可以在自在细胞内部、分泌后、纯化期间、贮存期间、和在不同应激条件下的任何阶段发生。已经报告了天冬酰胺的脱酰胺化牵涉单克隆抗体的电荷异质性，其根据在碱性pH下于升高的温度温育抗体或其分离的级分后观察到更具酸性种类得到(综述见：Liu，H.等，J.Pharmac.Sciences 97(2008)2426-2447)。脱酰胺化对抗体引入一个额外的负电荷，并且生成酸性种类，其一般导致阳离子交换层析上较早的洗脱。

抗体的其它典型修饰关注其糖基化样式(生成糖变体)，其例如可以在细胞培养过程中或者由于培养条件而变化(关于综述，参见：Beck，A.等，Curr.Pharm.Biotechnol.9(2008)482-501)。

对于纯化重组生成的免疫球蛋白，经常采用不同柱层析步骤的组合。一般地，亲和层析步骤继之以一个、两个或者甚至更多个别的分离步骤。最终的纯化步骤是所谓的“精制步骤”，其用于除去痕量杂质和污染物，如聚集的免疫球蛋白、残留的HCP(宿主细胞蛋白)、DNA(宿主细胞核酸)、病毒、或内毒素。

Tsai，P.K.等，Pharmac.Res.10(1993)1580-1586描述了抗人CD18单克隆抗体的等电异质性。电荷异质性推测为源自免疫球蛋白重链的序贯脱酰胺化。

Moorhouse，K.G.等(J.Pharmac.Biomed.Anal.16(1997)593-603)讨论了HPLC用于分析抗人CD20单克隆抗体的电荷异质性的用途。

Kaltenbrunner，O.等，J.Chrom 639(1993)41-49使用与盐梯度组合的线性pH梯度来分离在其pI值上不同的抗体变体。

在WO 2006/084111(Glaxo Group Ltd，)中，提及了依照脱酰胺化多肽的量来计算收获时间点的方法。

Robinson，D.K.等，Biotech.and Bioeng.44(1994)727-735披露了一种生成数种酸性单克隆抗体种类的补料-分批方法，其中发生取决于培养条件。

已经使用中性pH的线性NaCl梯度通过阳离子交换层析来解析在重链C端的赖氨酸残基的存在方面不同的三种单抗变体(Weitzhandler，M.，Proteomics 1(2001)179-185)。

rhuMAb HER2或曲妥单抗(Trastuzumab)(以商标赫赛汀(Herceptin)出售)是一种用于治疗HER2过表达/HER2基因扩增型转移性乳腺癌的重组人源化抗HER2单克隆抗体(本文中为her2抗体)。曲妥单抗与Hudziak，R.M.等，Mo1.Cell.Biol 9(1989)1165-1172中所描述的鼠抗HER2抗体4D5特异性结合相同的HER2表位。曲妥单抗是鼠抗HER2抗体4D5的重组人源化型式，称为rhuMAb 4D5或曲妥单抗，而且在已经接受广泛的先前抗癌疗法的HER2过表达型转移性乳腺癌患者中是有临床活性的(Baselga，J.等，J.Clin.Oncol.14(1996)737-744)。曲妥单抗及其制备方法记载于US 5,821,337。HER受体酪氨酸激酶家族是细胞生长、分化和存活的重要介导物。受体家族包括四种独特的成员，包括表皮生长因子受体(EGFR、ErbB1、或HER1)、HER2(ErbB2或p185neu)、HER3(ErbB3)和HER4(ErbB4或tyro2)。

发现单克隆her2抗体(其针对her2/neu基因的基因产物)以7种不同变体存在。重组生成的her2抗体的脱酰胺化和其它酸性变体导致电荷异质性，使得可以使用洗脱用离子强度的线性增加通过阳离子交换层析来分离变体。除了主峰外，可以使用分析技术，尤其是离子交换层析(IEC)的组合来指派所有6种次要形式。Harris R.J.等(J.Chromatogr.B 752(2001)，233-245)报告了IEC-峰3具有73.8％的峰面积，并且代表her2抗体的活性形式，其是最丰富的变体。脱酰胺化和其它酸性变体占所分离的所有抗体的约25％。

EP1075488B1和EP1308455B9报告了在以第四电导率洗脱(结合-洗脱方式)前使用具有不同电导率的清洗步骤通过阳离子交换层析来纯化her2抗体。由此，获得her2抗体的组合物，其中组合物中的酸性变体的量是降低的。类似地，WO 2004/024866(Genentech Inc.)披露了特别地使用梯度清洗通过阳离子交换层析来纯化her2抗体。

依照目前的规格，出售的赫赛汀必须含有大于等于65％的活性形式(IEC峰3/3*)和小于等于20％的无活性形式，其对应于分析用离子交换层析概况(参见图2和表1)中的峰4。

发明概述

如此，本发明的目的是提供用于纯化重组生成的抗体及用于相对于其抗体变体富集抗体分子的另一种方法。

凭借依照本发明的方法，可以获得关于成本和治疗功效的平衡。已经进一步发现了可以通过在抗体组合物的制造期间引入过程中控制步骤来获得优化，其中测定抗体分子和/或其变体的存在和/或抗体分子或其变体的量与抗体分子及其变体的量之和的比率，之后收获或确定纯化方案。凭借此方法，针对变体样式或抗体来源材料的质量改编收获时间点和纯化方案。

因此，本发明的第一方面是一种用于生产包含抗体分子及其变体的抗体组合物的方法，包括下列步骤：

a)提供包含抗体分子及其变体的样品，

b)在所述样品的等分试样中测定抗体分子及其变体的存在和/或抗体分子或其变体的量与抗体分子及其变体的量之和的比率，

c)基于步骤b)中获得的数据，确定随后的收获时间点和/或抗体纯化方案，

由此，生产包含分子抗体及其变体的抗体组合物。

本发明的另一方面是对包含多肽的样品的等分试样使用分析用离子交换层析以确定随后的所述样品的多肽纯化方案。

发明详述

在第一方面，本发明提供了一种用于生产抗体组合物的方法，其以高收率且高度经济地实现包含高百分比抗体分子的抗体的大规模生产。

因此，本发明的第一方面是一种用于生产包含抗体分子及其变体的抗体组合物的方法，包括下列步骤：

a)提供包含抗体分子及其变体的样品，

b)测定抗体分子及其变体的存在和/或抗体分子的量与抗体分子及其变体的量之和的比率，

c)基于步骤b)中获得的数据，确定随后的收获时间点和/或抗体纯化方案，

由此，生产包含抗体分子及其变体的抗体组合物。

在另一个实施方案中，本发明包括对包含多肽的样品的等分试样使用分析用离子交换层析以确定随后的所述样品的多肽纯化方案。

本发明的实践会采用分子生物学、微生物学、重组DNA技术、和免疫学的常规技术，其在本领域技术人员的技术范围内。此类技术在文献中全面解释。参见例如Sambrook，Fritsch & Maniatis，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)，Cold Spring Harbor，NY；Glover，D.M.(编)，DNA Cloning-A Practical Approach，第I卷和第II卷，IRLPress Limited(1985)；Gait，M.J.(编)，Oligonucleotide Synthesis-A PracticalApproach，IRL Press Limited(1984)；Hames，B.D.和Higgins，S.J.(编)，Nucleicacid hybridisation，IRL Press Limited(1984)；Freshney，R.I.(编)Animal cellculture-a practical approach，IRL Press Limited(1986)；Perbal，B.，A practicalguide to molecular cloning，Wiley Interscience(1984)；丛书Methods inEnzymology(Academic Press，Inc.)；Miller，J.H.和Calos，M.P.(编)，Genetransfer vectors for mammalian cells，Cold Spring Harbor Laboratory(1987)；Methods in Enzymology，第154卷和第155卷(分别为Wu和Grossman，及Wu编)；Mayer和Walker(编)，Immunochemical methods in cell and molecularbiology，Academic Press，London(1987)；Scopes，R.K.，Protein Purification-Principles and Practice，第二版，Springer-Verlag，N.Y.(1987)；及Weir，D.M.和Blackwell，C.(编)，Handbook of Experimental Immunology，第I卷-第IV卷，Blackwell Scientific Publications(1986)。

通用的层析方法及其用途对于本领域技术人员是已知的。参见例如Heftmann，E.(编)，Chromatography，第五版，Part A：Fundamentals andTechniques，Elsevier Science Publishing Company，New York，(1992)；Deyl，Z.(编)，Advanced Chromatographic and Electromigration Methods in Biosciences，Elsevier Science BV，Amsterdam，The Netherlands(1998)；Poole，C.F.和Poole，S.K.，Chromatography Today，Elsevier Science Publishing Company，New York(1991)；Scopes，R.K.，Protein  Purification：Principles and  Practice，Springer-Verlag，N.Y.(1987)；Sambrook，J.等(编)，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.，(1989)；Ausubel，F.M.等(编)，Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley & Sons，Inc.，New York；或Freitag，R.，ChromatographicalTechniques in the Downstream Processing of(Recombinant)Proteins，Methodsin Biotechnology，第24卷：Animal Cell Biotechnology：Methods and Protocols，第2版，Humana Press Inc.(2007)，第421页-第453页。

用于纯化多肽的方法是完善建立且普遍使用的。它们单独或组合采用。例如，此类方法是使用微生物衍生的蛋白质的亲和层析(例如，蛋白A或蛋白G亲和层析)、离子交换层析(例如，阳离子交换(羧甲基树脂)、阴离子交换(氨乙基树脂)和混合式交换层析)、亲硫吸附(例如，用β-巯基乙醇和其它SH配体)、疏水性相互作用或芳香族吸附层析(例如，用苯基-Sepharose、亲氮杂芳烃(aza-arenophilic)树脂、或间氨基苯硼酸)、金属螯合物亲和层析(例如用Ni(II)-和Cu(II)-亲和材料)、大小排阻层析、和制备用电泳方法(诸如凝胶电泳、毛细管电泳)(Vijayalakshmi，M.A.，Appl.Biochem.Biotech.75(1998)93-102)。

对于纯化重组生成的免疫球蛋白，经常采用不同柱层析步骤的组合。一般地，蛋白A亲和层析继之以一个或两个别的分离步骤。最终的纯化步骤是所谓的“精制步骤”，其用于除去痕量杂质和污染物，如聚集的免疫球蛋白、残留的HCP(宿主细胞蛋白)、DNA(宿主细胞核酸)、病毒、或内毒素。对于此精制步骤，经常使用流过模式的阴离子交换材料。

除非另有指示，下列术语应当理解为具有以下意义：

术语“宿主细胞”涵盖植物细胞和动物细胞。动物细胞涵盖无脊椎动物、非哺乳动物脊椎动物(例如，鸟类、爬行类和两栖类)和哺乳动物细胞。无脊椎动物细胞的例子包括下列昆虫细胞：草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛虫)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊)、白纹伊蚊(Aedes albopictus)(蚊)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)(果蝇)、和家蚕(Bombyx mori)(参见例如Luckow，V.A.等，Bio/Technology 6(1988)47-55；Miller，D.W.等，GeneticEngineering，Setlow，J.K.等(编)，第8卷，Plenum Publishing(1986)，第277页-第298页；及Maeda，S.等，Nature 315(1985)592-594)。

术语“表达”指宿主细胞内发生的转录和翻译。宿主细胞中的产物基因的表达水平可以基于存在于细胞中的相应mRNA的量或由细胞中表达的结构基因编码的多肽的量测定。

如本申请内所使用的，术语“培养”意指已经实施宿主细胞发酵，即异源多肽生成的容器的全部内容物。这包括培养液中存在的所生成的异源多肽、其它蛋白质和蛋白质片段、宿主细胞、细胞碎片、和以营养培养基供应并在培养期间由宿主生成的所有组分。

术语“细胞培养基”和“培养基”指用于在多细胞生物体或组织的外部的人工体外环境中维持、培养、增殖、或扩充细胞的营养溶液。可以针对特定的细胞培养用途优化细胞培养基，包括例如配制为促进细胞生长的细胞培养生长培养基，或者配制为促进重组蛋白生成的细胞培养生成培养基。

如本文中所使用的，术语“补料分批细胞培养”和“补料分批培养”指如下的细胞培养，其中最初对培养容器供应细胞，优选地哺乳动物和培养基，并且在或不在培养终止前周期性收获细胞和/或产物的情况中在培养期间对培养物连续或以离散的增量补入额外的培养营养物。补料可以基于特定的细胞培养成分的消耗。

本文中的术语要纯化的“样品”包括感兴趣的多肽和一种或多种污染物。组合物可以例如是“部分纯化的”(即，已经进行过一个或多个纯化步骤，诸如蛋白A层析)或者例如可以自生成多肽的宿主细胞或生物体直接获得(例如组合物可以包含收获的细胞培养液)。

术语“污染物”指存在于溶液诸如加载流体中的任何外来的或不想要的分子。污染物可以是与所纯化的感兴趣的蛋白质不同的生物学大分子诸如DNA、RNA、或蛋白质，其也存在于所纯化的感兴趣的蛋白质的样品中。污染物包括例如不想要的蛋白质变体，诸如聚集的蛋白质、错折叠的蛋白质、二硫化物键合不足的蛋白质、高分子量种类；来自分泌所纯化的蛋白质的宿主细胞的其它蛋白质、宿主细胞DNA、来自细胞培养基的组分、在先前的纯化步骤期间浸入样品中的作为亲和层析的吸附剂组的一部分的分子，例如蛋白A；内毒素；核酸；病毒；或前述任一项的片段。

如本申请内所使用的，术语“层析材料”意指包含优选地通过共价键来附着层析官能团的大体积核心材料的固体材料。大体积核心材料理解为不牵涉层析过程，即要分离的多肽与层析材料的层析官能团间的相互作用。它仅仅提供一种三维框架，其附着层析官能团，而且其确保含有要分离的物质的溶液可以接近层析官能团。优选地，所述大体积核心材料是固相。如此，优选地，所述“层析材料”是优选地通过共价键附着层析官能团的固相。优选地，所述“层析官能团”是可电离的疏水基团、或疏水基团、或组合不同层析官能团以仅结合某种类型的多肽的复合基团，或共价结合的带电荷的基团。

“固相”意指非流体物质，并且包括由诸如聚合物、金属(顺磁性、铁磁性颗粒)、玻璃、和陶瓷等材料制成的颗粒(包括微粒和珠)；凝胶物质诸如硅土、氧化铝、和聚合物凝胶；沸石和其它多孔物质。固相可以是固定的组分，诸如填充的层析柱，或者可以是非固定的组分，诸如珠和微粒。此类颗粒包括聚合物颗粒诸如聚苯乙烯和聚(甲基丙烯酸甲酯)；金颗粒诸如金纳米颗粒和金胶体；和陶瓷颗粒诸如硅土、玻璃、和金属氧化物颗粒。参见例如Martin，C.R.等，Analytical Chemistry-News & Features(1998)322A-327A。

术语“疏水性电荷诱导层析”或“HCIC”(它们在本申请内可以互换使用)意指采用“疏水性电荷诱导层析材料”的层析方法。“疏水性电荷诱导层析材料”是包含层析官能团的层析材料，所述层析官能团可以在一个pH范围中与要分离的物质形成疏水键，并且其在其它pH范围中带正电荷或带负电荷，即HCIC使用可电离的疏水基团作为层析官能团。一般地，在中性pH条件下将多肽结合疏水性电荷诱导材料，然后通过改变pH值来产生电荷排斥，从而将其回收。例示性的“疏水性电荷诱导层析材料”是BioSepra MEP或HEA Hypercell(Pall Corp.，USA)。

术语“疏水性相互作用层析”或“HIC”(其在本申请内可互换使用)意指采用“疏水性相互作用层析材料”的层析方法。“疏水性相互作用层析材料”是结合疏水基团，诸如丁基、辛基、或苯基基团作为层析官能团的层析材料。多肽根据其表面暴露的氨基酸侧链(其可以与疏水性相互作用层析材料的疏水基团相互作用)的疏水性来分离。多肽与层析材料间的相互作用可以受到温度、溶剂、和溶剂的离子强度影响。例如，温度升高支持多肽与疏水性相互作用层析材料间的相互作用，因为氨基酸侧链的运动增加，并且于较低温度掩埋于多肽内部的疏水性氨基酸侧链变得可接近。疏水性相互作用也受亲液盐(kosmotropic salt)促进，并且受离液盐(chaotropic salts)降低。“疏水性相互作用层析材料”是例如苯基Sepharose CL-4B、6FF、HP、苯基Superose、辛基Sepharose CL-4B、4FF、和丁基Sepharose 4FF(均可获自GEHealthcare Life Sciences，德国)，其经由与大体积材料的缩水甘油醚偶联获得。

如本申请内所使用的，术语“亲和层析”意指采用“亲和层析材料”的层析方法。在亲和层析中，多肽基于其生物学活性或化学结构来分离，这取决于与层析官能团形成静电相互作用、疏水键、和/或氢键形成。为了自亲和层析材料回收特异性结合的多肽，添加竞争配体或者改变层析条件，诸如缓冲液的pH值、极性或离子强度。“亲和层析材料”是包含组合不同单一层析官能团以仅结合某种类型的多肽的复合层析官能团的层析材料。此层析材料特异性结合某种类型的多肽，这取决于其层析官能团的特异性。例示性的“亲和层析材料”是“金属螯合层析材料”诸如含有Ni(II)-NTA或Cu(II)-NTA的材料，用于结合含有六组氨酸标签的融合多肽或具有大量表面暴露的组氨酸、半胱氨酸、和/或色氨酸残基的多肽，或“抗体结合层析材料”诸如蛋白A、或抗原、或“酶结合层析材料”诸如包含酶底物类似物、酶辅因子、或酶抑制剂作为层析官能团的层析材料、或“凝集素结合层析材料”诸如包含多糖、细胞表面受体、糖蛋白、或完整的细胞作为层析官能团的层析材料。

在本文中使用时，术语“蛋白A”涵盖自其天然来源回收的蛋白A、合成生成的蛋白A(例如通过肽合成或者通过重组技术得到)及其保留结合具有CH2/CH3区的蛋白质的能力的变体。例如，蛋白A可以在商业上购自GEHealthcare Life Sciences(德国)。

“蛋白A亲和层析”指使用蛋白A来分离或纯化物质和/或颗粒，其中一般将蛋白A在固相上固定化。包含CH2/Ch3区的蛋白质可以可逆地被蛋白A结合或吸附。在本文中的蛋白A亲和层析中使用的蛋白A亲和层析柱的例子包括固定化至受控孔玻璃骨架上的蛋白A、在聚苯乙烯固相上固定化的蛋白A，例如POROS 50A(TM)柱(Applied BioSystems Inc.)；或在琼脂糖固相上固定化的蛋白A，例如rPROTEIN A SEPHAROSE FAST FLOW(TM)或MABSELECT(TM)柱(GE Healthcare Life Sciences，德国)。

如本申请内所使用的，术语“金属螯合物层析”意指采用“金属螯合物层析材料”的层析方法。金属螯合物层析基于在金属离子诸如Cu(II)、Ni(II)或Zn(II)(其作为层析官能团被结合至大体积材料)与多肽，特别是具有含有咪唑的侧链和含有硫醇基团的侧链的多肽的表面暴露氨基酸侧链的电子供体基团间形成螯合物。螯合物在至少部分没有使那些侧链质子化的pH值形成。通过pH值的变化，即通过质子化自层析材料回收结合的多肽。例示性的“金属螯合层析材料”是HiTrap螯合HP(GE Healthcare Life Sciences，德国)，或Fractogel EMD(EMD Chemicals Inc，USA)。

如本申请内所使用的，术语“离子交换层析”意指采用“离子交换层析材料”的层析方法。术语“离子交换层析材料”涵盖(根据阳离子是否在“阳离子交换层析”中交换)“阳离子交换层析材料”或(根据阴离子是否在“阴离子交换层析”中交换)“阴离子交换层析材料”。如本申请内所使用的，术语“离子交换层析材料”意指携带共价结合的带电荷的基团作为层析官能团的固定的高分子量固相。为了总电荷中性，非共价结合的反荷离子与之结合。“离子交换层析材料”具有用其非共价结合的反荷离子交换周围溶液的带相似电荷的离子的能力。根据其可交换反荷离子的电荷，“离子交换层析材料”称为“阳离子交换层析材料”或者称为“阴离子交换层析材料”。进一步根据带电荷基团的性质，“离子交换层析材料”在例如阳离子交换的情况中称为具有磺酸基团(S)或羧甲基基团(CM)的层析材料。根据带电荷基团的化学性质，“离子交换层析材料”可以另外分类为强或弱离子交换层析材料，这取决于共价结合的带电荷取代基的强度。例如，强阳离子交换层析材料具有磺酸基团作为层析官能团，而弱阳离子交换层析材料具有羧酸基团作为层析官能团。“阳离子交换层析材料”例如以不同名称可获自多家公司，诸如例如Bio-Rex、Macro-Prep CM(可获自BioRad Laboratories，Hercules，CA，USA)、弱阳离子交换体WCX 2(可获自Ciphergen，Fremont，CA，USA)、MAC-3(可获自Dow化学公司：液体分离，Midland，MI，USA)、Mustang C(可获自Pall Corporation，East Hills，NY，USA)、纤维素CM-23、CM-32、CM-52、Hyper-D、和Partisphere(可获自Whatman plc，Brentford，UK)、IRC 76、IRC 747、IRC 748、GT 73(可获自Tosoh Bioscience GmbH，Stuttgart，德国)、CM 1500、CM 3000(可获自BioChrom Labs，Terre Haute，IN，USA)、和CM Sepharose^TM快速流动(Fast Flow)(可获自GE Healthcare，LifeSciences，德国)。商品化的阳离子交换树脂进一步包括羧基-甲基-纤维素、Bakerbond ABX^TM、在琼脂糖上固定化的磺丙基(SP)(例如，SP-Sepharose快速流动^TM或SP-Sepharose高效(High Performance)^TM，可获自GE Healthcare-Amersham Biosciences Europe GmbH，Freiburg，德国)和在琼脂糖上固定化的磺酰(例如，S-Sepharose快速流动^TM，其可获自GE Healthcare，Life Sciences，德国)。

如本申请内所使用的，术语“羟磷灰石层析”意指采用某种形式的磷酸钙作为层析材料的层析方法。例示性的羟磷灰石层析材料是Bio-Gel HT、Bio-Gel HTP、Macro-Prep Ceramic(可获自BioRad Laboratories)、羟磷灰石I型、II型、HA Ultrogel(Sigma Aldrich Chemical Corp.，USA)、羟磷灰石快速流动和高解析(High Resolution)(Calbiochem)、或TSK凝胶HA-1000(TosohHaas Corp.，USA)。

如本申请内所使用的，术语“缓冲的”意指通过缓冲物质使由于添加或释放酸性或碱性物质所致的pH变化成为水平的溶液。可以使用产生此类效应的任何缓冲物质。优选地，使用药学可接受缓冲物质，诸如例如磷酸或其盐、乙酸或其盐、柠檬酸或其盐、吗啉或其盐、2-(N-吗啉代)乙磺酸或其盐、组氨酸或其盐、甘氨酸或其盐、或三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)或其盐。特别优选的是磷酸或其盐、或乙酸或其盐、或柠檬酸或其盐、或组氨酸或其盐。任选地，缓冲溶液可以包含别的盐，诸如例如氯化钠、硫酸钠、氯化钾、硫酸钾、柠檬酸钠、或柠檬酸钾。

如本申请内所使用的，术语“膜”意指微孔性或大孔性膜两者。膜自身由聚合材料诸如例如聚乙烯、聚丙烯、乙烯乙酸乙烯酯共聚物、聚四氟乙烯、聚碳酸酯、聚氯乙烯、聚酰胺(尼龙，例如Zetapore^TM、N₆₆ Posidyne^TM)、聚酯、乙酸纤维素、再生纤维素、纤维素复合材料、聚砜、聚醚砜、聚芳基砜、聚苯基砜、聚丙烯腈、聚偏氟乙烯、非编织物和编织物(例如)、纤维材料构成，或者由无机材料诸如沸石(zeolithe)、SiO₂、Al₂O₃、TiO₂、或羟磷灰石构成。

“加载缓冲液”指用于将包含感兴趣的多肽分子和一种或多种污染物的组合物加载至离子交换树脂上的缓冲液。加载缓冲液具有一定电导率和/或pH，使得感兴趣的多肽分子(和一般地一种或多种污染物)结合至离子交换树脂。

术语“清洗缓冲液”指用于在洗脱感兴趣的多肽分子前清洗或再平衡层析材料，例如离子交换树脂的缓冲液。清洗缓冲液和加载缓冲液可以是相同的，但是这不是必须的。

“洗脱缓冲液”指用于自固相洗脱感兴趣的多肽的缓冲液。例如，改编洗脱缓冲液的电导率和/或pH，使得可以自层析材料，例如离子交换树脂洗脱感兴趣的多肽。

术语“再生缓冲液”指可以用于再生层析材料，例如离子交换或蛋白A树脂，使得其可以再次使用的缓冲液。

术语“电导率”指水溶液在两根电极间传导电流的能力。电导率的测量单位是mS/cm，并且可以使用电导率计来测量。可以通过改变其中的离子量来改变溶液的电导率。例如，可以改变溶液中的缓冲剂的量和/或盐(例如NaCl)的量以实现期望的电导率。

自包含多肽和一种或多种污染物的溶液“纯化”抗体或多肽意指通过自组合物除去至少一种污染物来提高溶液中的抗体或多肽的纯度。

多肽的“pI”或“等电点”指蛋白质不携带净电荷的pH。在等电点之下，蛋白质携带净正电荷，在其之上，携带净负电荷。等电点在蛋白质纯化中是有意义的，并且可以例如用等电聚焦或用计算机程序来测定。此外，分析用离子交换层析可以解析具有非常相似的pI值，即仅相差例如0.1个pI单位的蛋白质变体。

使分子“结合”层析材料，例如离子交换材料意指在合适的条件(pH/电导率)下将分子暴露于离子交换材料，使得依靠分子与离子交换材料的一种或多种带电荷的基团间的离子相互作用将分子在层析材料，例如离子交换材料之中或之上可逆地固定化。

“清洗”材料意指将合适的缓冲液在层析材料之中或之上通过，例如离子交换材料。

“洗脱”分子意指依靠溶剂例如自层析材料分离一种物质(例如，多肽或污染物)与另一种(例如抗体)的作用。

如本发明中所使用的，术语“结合-和-洗脱模式”及其语法等同用语意指层析方法的操作模式，其中使含有感兴趣的物质的溶液与固定相，优选地固相接触，由此感兴趣的物质结合固定相。因此，感兴趣的物质保留在固定相上，而不感兴趣的物质与流过物或上清液一起除去。然后，在第二步中自固定相洗脱感兴趣的物质，并且由此用洗脱溶液自固定相回收。这不必意指除去100％不感兴趣的物质，但是除去基本上100％不感兴趣的物质，即除去至少50％不感兴趣的物质，优选地除去至少75％不感兴趣的物质，优选地除去至少90％不感兴趣的物质，优选地除去超过95％不感兴趣的物质。

如本发明内所使用的，术语“流过模式”及其语法等同用语意指层析方法的操作模式，其中使含有感兴趣的物质的溶液与固定相，优选地固相接触，由此感兴趣的物质不结合所述固定相。因此，感兴趣的物质在流过物或上清液中获得。不感兴趣的物质(其也存在于溶液中)结合固定相，并且自溶液除去。这不必意指自溶液除去100％不感兴趣的物质，但是除去基本上100％不感兴趣的物质，即自溶液除去至少50％不感兴趣的物质，优选地自溶液除去至少75％不感兴趣的物质，优选地自溶液除去至少90％不感兴趣的物质，优选地自溶液除去超过95％不感兴趣的物质。

术语“梯度洗脱”、“梯度洗脱模式”、“连续洗脱”和“连续洗脱方法”(它们在本申请内可互换使用)在本文中意指如下的层析方法，其中例如连续提高或降低引起洗脱(即自层析材料分离结合的物质)的物质的量，即通过一系列小梯级改变所述量，每个所述小梯级不大于引起洗脱的物质的量的2％，优选地1％的变化。在此“梯度洗脱”中，可以线性改变、或以指数改变、或以渐近线改变一种或多种条件，例如层析方法的pH、离子强度、盐量、和/或流动。优选地，变化是线性的。可以通过固定相来分离这些线性变化。此外，线性变化的陡度在洗脱期间可以有所变化。特定层析步骤中的梯度洗脱后可以接着有梯级洗脱(step elution)以自特定柱洗脱结合的分子，如下文所描述的。

术语“梯级洗脱”、“梯级洗脱模式”和“梯级洗脱方法”(它们在本申请内可互换使用)意指如下的层析方法，其中例如一次性提高或降低引起洗脱(即自层析材料分离结合的物质)的物质的量，即从一个数值/水平直接至下一个数值/水平。在此“梯级洗脱”中，一种或多种条件，例如层析方法的pH、离子强度、盐量、和/或流动均一次性从第一，例如起始数值变化至第二，例如最终数值。梯级的变化大于引起洗脱的物质的量的5％，优选地10％的变化。“梯级洗脱”意指与线性变化相反，递增地，即逐步地改变条件。在每次增加后，维持条件，直至洗脱方法中的下一个步骤。

术语“仅梯级洗脱”指在相应的层析步骤中通过仅使用用于洗脱多肽的梯级洗脱而不使用梯度洗脱从某种层析柱的洗脱。

“单步骤”意指如下的方法，其中一种或多种条件，例如层析方法的pH、离子强度、盐量、和/或流动均一次性从起始数值变化至最终数值，即与线性变化相反，递增地，即逐步地改变条件。

如本申请内所使用的，术语“应用于”及其语法等同用语意指纯化方法的部分步骤，其中使含有要纯化的感兴趣物质的溶液与固定相接触。这意指a)将溶液添加至固定相定位的层析装置，或者b)将固定相添加至溶液。在情况a)中，含有要纯化的感兴趣物质的溶液流过固定相，容许固定相与溶液中的物质间的相互作用。根据条件，诸如例如pH、电导率、盐量、温度、和/或流速，溶液的一些物质结合固定相，并且如此自溶液除去。其它物质保留于溶液中。可以在流过物中找到保留于溶液中的物质。“流过物”意指在通过层析装置后获得的溶液。优选地，层析装置是柱或盒。可以通过本领域技术人员熟悉的方法，诸如例如沉淀、盐析、超滤、渗滤、冻干、亲和层析、或溶剂体积减少以获得浓缩的溶液自流过物回收未结合固定相的感兴趣物质。在情况b)中，将固定相例如以粉末添加至含有要纯化的感兴趣物质的溶液，容许固定相与溶液中的物质间的相互作用。在相互作用后，例如通过过滤取出固定相，并且在上清液中获得未结合固定相的感兴趣物质。

如本申请内所使用的，术语“不结合”及其语法等同用语意指感兴趣的物质，例如免疫球蛋白在与固定相，例如离子交换材料接触时保留于溶液中。这不必意指100％的感兴趣物质保留于溶液中，而是基本上100％的感兴趣物质保留于溶液中，即至少50％的感兴趣物质保留于溶液中，优选地至少65％的感兴趣物质保留于溶液中，优选地至少80％的感兴趣物质保留于溶液中，优选地至少90％的感兴趣物质保留于溶液中，优选地超过95％的感兴趣物质保留于溶液中。

术语“过程中控制参数”(In-Process-Control Parameter，IPC)是应用于过程验证的用于监测反应过程的参数。可以例如在表达抗体的细胞培养过程中监测IPC。通过测量或测定“过程中控制参数”，获得对反应过程触发特定作用的数值。例如，“IPC”的例子是抗体发酵期间的氧和葡萄糖水平、pH和CO₂值。通过测量这些参数触发的作用可以例如是对氧和葡萄糖供应的反馈控制。其它IPC可以产生关于要生产的抗体的信息，例如培养液中的量、质量，例如活性和无活性变体的百分比、或特定糖变体的含量。为了测定特定的IPC，可以例如自培养液取出样品，或者可以在发酵期间在线测定IPC。

“多肽”是由通过肽键连接的氨基酸组成的聚合物，无论是天然或是合成生成的。小于约20个氨基酸残基的多肽可以称为“肽”，而由两个或更多个多肽组成或者包含超过100个氨基酸残基的一个多肽的分子可以称为“蛋白质”。多肽还可以包含非氨基酸组分，诸如碳水化合物基团、金属离子、或羧酸酯。非氨基酸组分可以由表达多肽的细胞添加，并且可以随细胞类型而变化。多肽在本文中根据其氨基酸主链结构或其编码核酸限定。添加诸如碳水化合物基团一般不规定，但是仍然可以存在。

术语“重组多肽”指已经在已经用编码多肽的核酸转化或转染，或者由于同源重组而生成多肽的宿主细胞中生成的多肽。

术语“异源DNA”或“异源多肽”指在给定细胞内不天然存在的DNA分子或多肽，或DNA分子群体或多肽群体。对于特定细胞而言异源的DNA分子可以含有自细胞种类衍生的DNA(即，内源DNA)，只要细胞的DNA与非细胞的DNA(即，外源DNA)组合。例如，认为含有与包含启动子的细胞DNA区段可操作连接的编码多肽的非细胞DNA区段的DNA分子是异源DNA分子。相反，异源DNA分子可以包含与外源启动子可操作连接的内源结构基因。由非细胞DNA分子编码的肽或多肽是“异源”肽或多肽。

术语“抗体”指任何免疫球蛋白或其片段，并且涵盖包含抗原结合位点的任何多肽。该术语包括但不限于多克隆、单克隆、单特异性、多特异性、非特异性、人源化的、人的、单链、嵌合的、合成的、重组的、杂合的、突变的、嫁接的、双特异性、三特异性和体外生成的抗体。抗体片段包括Fab、F(ab”)₂、Fv、scFv、Fd、dAb，其可以保留抗原结合功能。通常，此类片段包含抗原结合域。

如本文中所使用的，术语“量”对应于多肽或抗体的数量。量可以以相对单位例如层析谱中的峰下面积，或者可以例如以μg表述。

如本文中所使用的，“抗体分子”指感兴趣的抗体，其例如与其变体相比可以是最具活性的形式。变体和抗体分子自相同序列表达。

如本文中所使用的，“活性抗体或活性变体”指具有较高生物学效力的抗体，即“活性变体”的活性是所有抗体变体(抗体变体自相同抗体序列表达)的平均活性的70-150％。例如，不携带其天冬酰胺残基的脱酰胺化或异构化的赫赛汀变体(其对应于离子交换层析谱(参见图2和表1)中的主峰，即峰3/3*)与分离的其它变体相比具有最高的生物学效力。

抗体分子的“酸性变体”是比感兴趣的抗体分子更具酸性(例如通过等电聚焦或离子交换层析来测定)的感兴趣抗体分子的变体。酸性变体的例子是脱酰胺化的变体。还包括在离子交换层析期间与主峰相比在酸性区中洗脱的所有变体。

多肽分子的“脱酰胺化”变体是如下的多肽，其中例如初始多肽的一个或多个天冬酰胺残基已经被转化成天冬氨酸，即中性酰胺侧链已经被转化成具有总体酸性特征的残基。例如，脱酰胺化的her2变体是具有氨基酸位置30处的天冬酰胺转化成天冬氨酸的her2抗体变体，例如其对应于离子交换层析谱(图2，表1)中的峰1。

抗体分子的“碱性变体”是比感兴趣的抗体分子更具碱性(例如通过等电聚焦或离子交换层析来测定)的抗体分子的变体。这里，还包括例如仅相差例如天冬酰胺异构化的变体，其在理论上不应改变抗体的总体理论电荷，但是其可以产生抗体的如下构象，使得抗体在离子交换层析期间与未修饰的抗体相比在更碱性的区域中洗脱。例如，峰4(图2，表1)中解析的赫赛汀变体正是该情况。

术语糖变体指以与抗体分子相比不同糖基化样式为特征的抗体变体。那意味着附着于抗体的多糖(聚糖)的类型和分布在糖变体间不同。若抗体分子的糖变体的pI值与抗体分子不同，则它也可以落入范畴碱性或酸性变体中。

所有抗体变体与抗体分子自相同序列表达，并且如此是例如体内或体外翻译后修饰的。

如本文中所使用的，术语“阈值比率”指做出特定决定的抗体分子或其变体的量与抗体分子及其变体的量之和的比率。例如，阈值比率对纯化方案或发酵期间的收获时间点可以是决定性的。或者，对于实施的阳离子交换层析的类型是决定性的，即在阈值比率之下，与在比率高于阈值比率时实施的洗脱不同地实施洗脱(例如梯度对梯级洗脱)。

术语“抗体分子或其变体的量与抗体分子及其变体的量之和的比率”指与某个体积中的抗体分子或其变体的量与相同体积中的抗体分子及其变体的量的商对应的比率。如此，相对于抗体分子的量及其变体的总量之和设置抗体分子或其变体的量。如此，对于含有抗体的溶液中的每种抗体变体和抗体分子，可以归于某个比率，并且所有这些比率的和必须是100％。可以例如自离子交换层析谱(如图2中所显示的，其中将UV吸收绘图)，或者在经由蛋白质测量来测定抗体含量后测定此类比率。绝对蛋白质测量对于测定比率不是必要的(因为它仅是比率而不是绝对值)，而是仅UV吸收(其对应于某个蛋白质量)对于计算比率可以是足够的。例如，可以使用层析谱下的峰面积来测定抗体分子或其变体的量与抗体分子及其变体之和的比率。然后，所有峰(抗体分子和变体)的面积之和会对应于分母，而单峰下的面积对应于各自的分子。

除非另有指明，术语“her2”在本文中使用时指人her2蛋白，并且“her2”指人her2基因。例如，人her2基因和her2蛋白记载于Semba等，PNAS(USA)82：6497-6501(1985)及Yamamoto等Nature 319：230-234(1986)(Genbank登录号X03363)。

如本文中所使用的，术语“药物产品”指用于治疗患者的配制缓冲液中的纯化的抗体。药物产品含有最小水平的活性抗体变体和最大水平的无活性变体。在开发期间评估这些数值，并且将其提交给卫生当局。

“治疗/处理”指治疗性处理和防范性或预防性措施两者。需要治疗的个体包括已经患有病症的个体及要预防病症的个体。

“病症”指会受益于用如本文中所描述的那样纯化的多肽的治疗的任何状况。这包括慢性和急性病症或疾病，包括那些使哺乳动物趋向于所讨论的病症的病理学状况。

在抗体发酵期间，不仅生成作为感兴趣抗体的抗体分子，而且生成所述抗体的变体。与抗体分子相比，这些变体可以具有相似的活性，而且还可以有较小的活性，例如在患者中的治疗期间，并且可能是大批药物产品中不想要的。一个例子可以是脱酰胺化的抗体变体，其可以更易受体内降解。关于不想要的变体，依照本发明的方法以高收率和高纯度实现抗体分子的生产。依照本发明的方法基于令人惊讶的发现，即可以通过改编抗体的收获时间点和/或随后的抗体纯化方案来关于变体分布(其可以表述为例如抗体分子的量与抗体分子及其变体的量之和的比率)将抗体组合物向期望的方向转换。

如此，在第一方面，本发明提供了一种用于生产包含抗体分子及其变体的抗体组合物的方法，包括下列步骤：

a)提供包含抗体分子及其变体的样品，

b)在所述样品的等分试样中测定抗体分子及其变体的存在和/或抗体分子或其变体的量与抗体分子及其变体的量之和的比率，

c)基于步骤b)中获得的数据，确定随后的收获时间点和/或抗体纯化方案，

由此，生产包含分子抗体及其变体的抗体组合物。

在本发明的一个优选的方面，样品是没有细胞和细胞碎片的包含抗体分子及其变体的细胞培养液，或者是蛋白A亲和层析步骤的洗脱物。在本发明的又一些方面，包含抗体分子及其变体的样品是自用于抗体分离的其它柱，如阴离子交换柱、疏水性相互作用柱、羟磷灰石层析柱等获得的洗脱物。

在本发明的某些方面，抗体分子的变体是酸性变体、碱性变体、糖变体、或与抗体分子相比对限定的抗原具有不同结合亲和力的变体。

在又一个优选的实施方案中，抗体分子的变体是比抗体分子自身具有更小活性的变体。活性可以例如在“体外”测定法(例如，中和抗原的功效)或在例如动物模型中测量。

在另一个优选的实施方案中，抗体分子的pI与抗体分子的pI相差0.1至0.5个pI单位。若例如要分析的蛋白质的序列是已知的，则用理论软件程序，或者通过本领域技术人员已知的方法，如例如等电聚焦来测定pI值。

在本发明的某个方面，提供包含培养基、细胞、抗体分子及其变体的样品，包括下列步骤：

i)提供含有核酸分子的细胞，所述核酸分子包含编码所述抗体分子的核酸序列，

ii)将所述细胞在培养基中培养4-28天，

iii)自培养液获得样品。

在本发明的又一些方面，步骤ii)中的将细胞在培养基中培养至少持续4-28天，优选地4-18天且最优选地4-16天。

在本发明的又一些方面，实施步骤ii)中的将细胞在培养基中培养，直至获得特定的抗体浓度，即至少200mg，优选地至少800mg/l，更优选地至少1000mg/ml且最优选地至少1500mg/ml。这些浓度取决于所表达抗体的种类等。在赫赛汀的情况中，至少200mg/l的抗体浓度是优选的。

在本发明的一个优选的方面，通过离子交换层析，例如通过分析用离子交换层析来测定抗体分子和/或其变体的存在和抗体分子或其变体的量与抗体分子及其变体之和的比率。此技术是本领域技术人员普遍已知的，并且牵涉例如使用梯度洗脱的阳离子交换层析。对于计算抗体分子及其变体的相对量，对解析的各个峰测定峰下面积(关于可能的方法的详情，参见下文的实施例)。测定抗体分子和/或其变体的存在是仅测定抗体分子和/或其变体是否包含在特定样品中。仅关于含有特定变体(不管其相对量)的观察结果对于收获时间点或纯化方案可以是决定性的。

在本发明的别的实施方案中，通过技术人员已知的其它合适方法，例如通过等电聚焦(在此背景中还可参见综述Ahrer和Jungbauer：J.of Chromatog.2006，第841卷，第110页-第122页)来测定抗体分子，即感兴趣的抗体分子，或其变体的百分比。

在本发明的别的方面，例如通过MALDI-TOF分析或本领域技术人员已知的其它方法来测定糖变体的存在和/或量。

在本发明的又一些方面，相对于最具活性的变体及其其它变体之和，测定最具活性的her2抗体变体(其对应于离子交换层析谱中的峰3/3*)的量，参见例如图2和表1(参见Harris，R.J.，J.Chromatogr.B 752(2001)233-245)。

在本发明的另一个实施方案中，在发酵的例如第3天、第5天、或第7天后每天、每隔一天、或者以其它限定的增量，或者在达到发酵培养液中的某个抗体浓度，即0.2至1.5mg/ml后每天或每隔一天测定抗体分子和/或其变体的存在或比率。在本发明的又一些实施方案中，在发酵的某个长度后，优选地对于赫赛汀在发酵的第10天、第11天或第12天后在发酵期间仅对活性抗体的相对量测定一次。

在本发明的方法的某个实施方案中，使用技术人员已知的方法，如例如蛋白质测量和ELISA来测定某个发酵日的抗体总量(样品中的抗体分子和所有变体的量之和)。在本发明的另一方面，基于对先前的相似发酵运行知道的抗体总量的时间过程计算某个时间点时的抗体总量。在下文的实施例中，描述了用于测定样品中的her2量的例示性方法。

在本发明的一个优选的方面，通过阳离子交换层析，任选地在实施亲和层析步骤后纯化抗体分子及其变体。然而，所使用的洗脱模式取决于来源材料的纯度，即取决于抗体分子的量与抗体分子及其变体的量之和的比率。依照本发明的一个优选的方面，自阳离子交换柱洗脱抗体如下实施：

i)逐渐提高应用于阳离子交换柱的缓冲液的电导率和/或pH，并

ii)然后，若步骤a1)中测定的抗体分子的量与抗体分子及其变体的量之和的比率低于阈值比率，则逐步提高应用于阳离子交换柱的洗脱缓冲液的电导率和/或pH，或者

若步骤a1)中测定的抗体分子的量与抗体分子及其变体的量之和的比率高于阈值比率，则在没有逐渐提高应用于该柱的洗脱缓冲液的电导率和/或pH的情况中逐步提高电导率和/或pH。

在本发明的上下文中的此阈值比率可以如下测定：目标是所述抗体的规格中所列的配制的治疗性抗体药物(大批药物产品)，其具有预定的最小水平的感兴趣抗体分子和预定的最大水平的其变体。例如，这些水平对于管理当局是相关的。出于其它原因，在体内可能例如具有较小活性的变体是不想要的。此阈值比率现在确定收获时间点和纯化方案，特别地阳离子交换层析期间的洗脱模式。例如，在阈值比率之下，在阳离子交换层析步骤中通过梯度洗脱，接着是梯级洗脱来纯化抗体以获得足够高的抗体分子纯度和收率，并且在所述比率之上，会仅通过梯级洗脱来纯化抗体以获得高收率及还有满足安全性标准的抗体。如此，设置阈值，使得不管来源材料的性质，满足管理当局要求的抗体可获得，而且使得可以获得最高的可能的收率。在另一个优选的实施方案中，阈值比率确定收获时间点，使得例如仅在达到阈值数值之上的数值时实施收获，参见下文，以在阳离子交换层析中总是使用仅梯级洗脱模式。本文的背景是在发酵期间，可以出现特定的抗体变体，并且在其相对量方面增加，而抗体分子的量在发酵期间可能降低。

过程的阈值比率的数值取决于要纯化的抗体、发酵条件、卫生当局的要求、和所使用的下游和配制规程(层析步骤、过滤等)等，并且如此必须个别地针对每种治疗性抗体生产方法限定。

在限定的阈值比率之下，某种例如不想要的变体的相对量是相对较高的，并且感兴趣抗体分子的量是相对较低的。已经发现了在此情况中，在同一个柱上的梯度洗脱模式，接着是梯级洗脱适合于以如下的程度自变体纯化抗体分子，使得可以获得适合于销售的药物产品。然而，仅梯级洗脱模式在此情况中是不太合适的，这是由于抗体分子自其变体的纯化程度较低。在最坏的情况中，若要纯化的含有抗体的溶液具有在阈值比率之下的抗体分子的量与抗体分子及其变体的量之和的比率，则梯级洗脱不会产生适合于销售的药物产品。参见下文的实施例。

另一方面，若要纯化的包含抗体的溶液中的抗体分子的量与抗体分子及其变体的量之和的比率高于阈值比率，则阳离子交换层析期间的仅梯级洗脱模式是优选的，因为与梯度洗脱，接着进行梯级洗脱相比，此洗脱模式导致更高的收率，而且还可以获得适合于销售的药物产品。换言之，由于应用于阳离子交换柱的来源材料的质量较高(以比率表述)，可以选择针对收率优化的洗脱模式(梯级洗脱)。

因为阳离子交换层析期间的梯级洗脱模式在收率方面是有利的，所以可以选择收获条件，使得抗体分子的量与抗体分子及其变体的量之和的比率总是高于阈值比率，并且如此，梯级洗脱会总是产生可接受的药物产品。

优选地，在抗体分子的量与抗体分子及其变体的量之和的比率比阈值比率高0-2％，并且最优选地，它与阈值比率非常接近或相同时自细胞培养液回收抗体。由此，利用的正是尽可能长地持续发酵以获得高绝对量的抗体，但是不太长以避免抗体分子的量与抗体分子及其变体的量之和的不想要的比率。依照我们的发现，在发酵的某个长度后，抗体分子的百分比降低，而其变体的百分比升高(参见关于赫赛汀的图1)。

在本发明的某个方面，用于测定会通过阳离子交换层析用梯度，接着用梯级洗脱，还是仅用梯级洗脱分离抗体的阈值比率是50至100％，优选地范围为60至80％，且最优选地范围为65至75％。在本发明的一个进一步优选的实施方案中，阈值比率是67.5％。

优选地，通过重组手段来生成依照本发明的抗体。如此，本发明的一方面是编码依照本发明的抗体的核酸，而另一方面是包含编码依照本发明的抗体的所述核酸的细胞。用于抗体的重组生产的通用方法是现有技术中公知的，并且包括在原核或真核细胞中的蛋白质表达，随后分离抗体，并且通常纯化至药学可接受产物(参见例如下列综述：Makrides，S.C.，Protein Expr.Purif.17，183-202(1999)；Geisse，S.等，Protein Expr.Purif.8(1996)271-282；Kaufman，R.J.，Mol.Biotechnol.16(2000)151-160；Werner，R.G.，Drug Res.48(1998)870-880)。

对于在宿主细胞中表达如前述的抗体，通过标准的方法来将编码相应的经修饰的轻链和重链的核酸插入表达载体中。杂交瘤细胞可以充当此类DNA和RNA的来源。一旦分离，可以将DNA插入表达载体中，然后将表达载体转染入在其它情况中不生成免疫球蛋白蛋白质的宿主细胞诸如CHO细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、HEK293细胞、PER.C6细胞、酵母、大肠杆菌细胞、或骨髓瘤细胞中，以获得重组单克隆抗体在宿主细胞中的合成。在适合于表达异源多肽的条件下培养宿主细胞，并且自细胞或培养物上清液分离异源多肽。

一般地，本发明的方法和组合物可用于生产重组蛋白。重组蛋白是通过遗传工程方法生成的蛋白质。特别优选的依照本发明的方法和组合物生产的蛋白质是基于蛋白质的治疗剂，又称为生物制剂。优选地，蛋白质作为胞外产物分泌。

在本发明方法的一个实施方案中，细胞是能够表达异源多肽的重组细胞克隆。

依照本发明的方法原则上适合于生产任何抗体。在一个实施方案中，用依照本发明的方法生产的免疫球蛋白是重组免疫球蛋白。在其它实施方案中，免疫球蛋白是人源化的免疫球蛋白、免疫球蛋白片段、免疫球蛋白缀合物或嵌合免疫球蛋白。

在本发明的另一方面，抗体选自下组：单克隆和多克隆抗体。在一个优选的实施方案中，抗体是单克隆抗体。

本发明的另一方面是IgG或IgE类的免疫球蛋白的纯化。在一个优选的实施方案中，抗体是单克隆抗体。在又一个实施方案中，通过依照本发明的方法生产的抗体是治疗性或诊断性抗体。在一个优选的实施方案中，抗体是治疗性抗体。

可用于依照本发明的用于生产异源多肽的方法的细胞原则上可以是任何真核细胞诸如例如酵母细胞或昆虫细胞或原核细胞。然而，在本发明的一个实施方案中，真核细胞是哺乳动物细胞。优选地，所述哺乳动物细胞是CHO细胞系、或BHK细胞系、或HEK293细胞系、或人细胞系，诸如此外，在本发明的一个实施方案中，真核细胞是动物或人起源的连续细胞系，诸如例如人细胞系HeLaS3(Puck，T.T.等，J.Exp.Meth.103(1956)273-284)，(Nadkarni，J.S.等，Cancer 23(1969)64-79)、HT1080(Rasheed，S.等，Cancer 33(1974)1027-1033)，或自其衍生的细胞系。

在本发明的某个方面，在表达抗体的条件下在培养基中培养细胞。一般地，可以以任何期望的方式培养重组细胞克隆。依照本发明的此方面添加的营养物包含必需氨基酸，诸如例如谷氨酰胺、或色氨酸、或/和碳水化合物、和任选地非必需氨基酸、维生素、痕量元素、盐、或/和生长因子诸如例如胰岛素和/或肽，例如自植物衍生的。在一个实施方案中，在细胞的整个生长期(培养)里添加营养物。在适合于培养的细胞的培养基中制备依照本发明的细胞培养物。在本发明的一个实施方案中，培养的细胞是CHO细胞。适合于哺乳动物细胞的培养条件是已知的(参见例如Cleveland，W.L.等，J.Immunol.Methods 56(1983)，221-234)。此外，可以在无需过度实验的情况中凭经验确定对于特定细胞系必需的培养基的营养物和生长因子(包括它们的量)，如由例如Mather(编)于：Mammalian cell culture，Plenum Press，NY(1984)；Rickwood，D.和Hames，B.D.(编)，Animal cell culture：A Practical Approach，第2版，Oxford University Press，NY(1992)；Barnes和Sato，Cell 22(1980)649所描述的。

术语“在适合于表达的条件下”意指用于培养表达多肽的细胞，并且对于本领域技术人员已知的或者可以由本领域技术人员容易地确定的条件。本领域技术人员已知的是，这些条件可以随所培养的细胞类型和所表达的多肽类型而变化。一般地，将细胞于一定温度，例如20℃和40℃间培养，且持续一段足以容许有效生成缀合物的时间，例如4至28天。

在本发明的一个实施方案中，培养物是悬浮培养物。此外，在另一个实施方案中，将细胞在含有低血清含量，诸如例如最大1％(v/v)的培养基中培养。在一个优选的实施方案中，培养物是无血清培养物，例如在无血清的低蛋白质发酵培养基中(参见例如WO 96/35718)，并且在又一个优选的环境中，培养基是无蛋白质的和/或完全合成的。商品化培养基诸如Ham氏F10或F12(Sigma)、极限必需培养基(MEM，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、或Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基(DMEM，Sigma)(它们含有合适的添加剂)是例示性的营养溶液。这些培养基之任一种可以在必要时补充如上文所提及的组分。

用于抗体的大或小规模生产的细胞培养规程在本发明的背景内是潜在有用的。可以使用以下规程，包括但不限于流化床式生物反应器、中空纤维生物反应器、滚瓶培养、或搅拌罐式生物反应器系统，在后两种系统中，与或不与微载体一起使用。可以在分批、补料-分批、拆分(split)-分批、连续、或连续-灌注模式之一中操作系统。在本发明的某些实施方案中，将培养作为依照培养要求补料的拆分-分批方法实施，其中在生长期后收获培养液的一部分，并且将培养液的剩余部分保留于发酵罐中，随后，用新鲜的培养基补充所述发酵罐，直至工作体积。依照本发明的方法使期望的抗体以非常高的收率收获。

依照本发明的另一方面，设计补料-分批或连续细胞培养条件以增强细胞培养的生长期中的哺乳动物细胞的生长。在生长期中，培养细胞，，培养的条件和时间在生长方面最大化。培养条件诸如温度、pH、溶解氧(DO₂)等是与特定宿主一起使用的，并且是技术人员已知的。

依照本发明，控制细胞培养的生产期期间的细胞培养环境。通过以下参数限定要生产的抗体的培养条件：

a)基础培养基：营养物的量和类型、任选的血浆组分、生长因子、盐和缓冲液、核苷和碱基、蛋白质水解物、抗生素和脂质、合适的载体，

b)碳水化合物的类型和量、溶解氧量、铵量、pH值、摩尔渗透压浓度、温度、细胞密度、生长状态，

c)任选地添加别的添加剂(例如，血浆组分、生长因子诸如例如血清组分、生长激素、肽水解物、小分子(如地塞米松(dexamethason)、皮质醇(cortisol)、铁螯合剂等)、无机化合物(如硒(selene)等)、和已知具有糖基化概况效应的化合物(如丁酸盐或奎尼丁(quinidine)、链烷酸(alkanoic acid)、或铜、胰岛素、运铁蛋白、EGF、激素、盐、无机离子、缓冲液、核苷和碱基、蛋白质水解物、抗生素、脂质，诸如例如亚油酸)。

例如，别的添加剂是刺激细胞生长和/或增强细胞存活和/或以任何期望的方向操作糖基化抗体的糖基化概况的非必需化合物。

一般地，多肽生成期在生长期开始后至少3小时开始，诸如在生长期开始后约12至约224小时时，或者备选地在生长期开始后约120至192小时时。生成期可以持续例如4至14天。或者，生成期可以是18-21天或者甚至更长，例如多至28天。在此期期间，细胞生长一般已经达到平台期，例如对数细胞生长已经结束，并且蛋白质生成是主要的(primary)。

在本发明的一个方面，可以采用培养液的间歇取样，例如以测定特定的细胞培养参数(乳酸生成、抗体量)或所生成抗体的质量检查(测定活性和无活性变体的相对量)。

在本发明的某个方面，在适合于表达特定抗体且导致抗体相对于其变体的某个百分比的条件下在培养基中培养细胞。此百分比在发酵期间可以变化，即可以增加或减少，为可预测的(例如线性减少/增加或依照特定的公式)或不可预测的。一般地，虽然编码抗体的核酸是相同的，但是在发酵期间及后来通过不同过程修饰，由宿主细胞所生成的抗体在结构和氨基酸序列方面不相同。常见的修饰是例如脱酰胺化和糖基化，其可以导致单一发酵批次中所生产的抗体的电荷异质性。导致电荷异质性的其它修饰是不完全的二硫键形成、N端焦谷氨酰胺环化、C端赖氨酸加工、异构化、和氧化、及通过马来酸一酰脲(maleuric acid)对N端氨基酸的不太常见的修饰和C端氨基酸的酰胺化。

收获时间点代表例如在抗体发酵期间收获，即自培养物取出并冷冻或者自培养基分离抗体的时间点。依照本发明基于含有抗体的培养液的组成或质量(其以抗体分子或其变体的量与抗体分子及其变体的量之和的比率表述)选择此时间点。例如，某种变体(例如酸性、碱性、糖变体)的存在或出现可以确定必须停止发酵，例如以避免在进一步发酵期间进一步富集不想要的(例如活性较小的)抗体变体。而且，某种变体与感兴趣的抗体分子的相对量，即抗体分子的变体与抗体分子及其变体的量之和的比率可以确定收获时间点以获得确定一种优选的纯化方案的期望的抗体组合物。

然后可以将所测定的比率与(限定的)阈值比率比较，在所述阈值比率，例如必须停止或者必须继续发酵，使得可以遵循某种层析方案以获得期望的抗体组合物。情况可能是例如在某个样品中，某些不利的变体的相对量相对较高，或者感兴趣的抗体分子的相对量较低，然后必须选择纯化方案，其容许纯化感兴趣的抗体分子，使得不利的变体低得耐受。另一方面，步骤b)中测定的比率可以指示必须进一步继续发酵，直至获得期望的比率。可以重复实施比率的测定，但是也可以对进一步的培养外推比率，参见下文。

生成抗体的细胞系的发酵持续时间和下游规程期间的条件是本文显示为影响例如样品中的脱酰胺化的变体与感兴趣抗体分子相比的相对量的例示性参数，参见下文实施例。

假设下游规程对紧密相关的抗体变体(其可以仅在单个氨基酸的电荷方面有所不同)的纯化设置某种限制，然后，例如发酵培养液中的抗体分子水平不可落在某个阈值数值之下，使得下游规程仍以高收率产生足够纯的大批药物产品。因此，发酵必须在特定的时间点时停止，例如在抗体分子量的相对量大于限定的阈值比率时，通过自细胞培养液回收抗体进行。

依照本发明的一个优选的方面，自培养液回收抗体的时间点自先前限定的阈值比率的比较推导。

在本发明的一个优选的实施方案中，通过评估抗体分子或其变体的量与抗体分子及其变体的量之和的比率来确定收获时间点，其通过假设抗体分子的相对量线性降低或升高某个每日百分比进行。特别地，在此情况中，通过分析用离子交换层析单次测量抗体分子或其变体与抗体分子及其变体的量之和的比率对于确定自培养液回收抗体的时间点可以是足够的，因为可以计算该时间点，而不是自进一步测量推导。在某个实施方案中，通过假设培养液中的抗体分子的量在培养的某个长度后降低某个每日百分比来计算抗体回收的时间点。

依照本发明的另一个优选的方面，实施取样并测定抗体分子的量与抗体分子及其变体的量之和的比率，直至比率比某个阈值比率高0-2％，和/或通过外推已经获得步骤iii)中的样品的那天后培养的培养液中的抗体分子的量与抗体分子及其变体的量之和的比率来完成，其通过依照以下公式计算所述比率来进行：

R_x＝R₀-C×(D_x-D_o)，其中

D_o是获得步骤c)中的样品的培养日，

D_x是D₀后的培养日，

R_x是D_x时抗体分子的量与抗体分子及其变体的量之和的比率，

R₀是步骤iv)中测定的在D_o时的抗体分子的量与抗体分子及其变体的量之和的比率，且

C是范围为1％/天和5％/天的数值。

然后，在培养液中的R_x比阈值比率高0-2％时，自培养液回收抗体分子。

优选地，在培养液中的R_x比阈值比率高0-2％时，最优选地，在所述比率与阈值数值接近或甚至相同时，自培养液回收抗体分子。

如上文所讨论的，阈值比率取决于抗体分子的性质及要在抗体组合物中获得的纯度等。

在本发明的另一个实施方案中，活性her2变体(其对应于离子交换层析谱中的峰3/3*)的量在培养某个时间后，例如培养的10天后每天降低约2％(参见图1)。

在本发明的某个方面，优选地在收获前不久(例如，在收获前1-2天或者例如对于赫赛汀发酵在第11天时)，对R_x仅测定一次。若如此测定的R_x比阈值比率高例如2％，则将培养再实施一天，并且如此在测定R_x后一天发生抗体的收获。在赫赛汀发酵的情况中，然后，收获时的R_x会非常接近阈值比率，因为比率自发酵的第11天至第12天降低约2％，其自许多先前的发酵运行已知。

然而，若第11天测定的R_x比阈值比率高小于2％，例如在发酵第11天(d11)比所述比率高1.5％，则立即停止赫赛汀发酵以确保大批药物产品的足够高的质量。

在本发明的一个优选的方面，获得来自包含抗体分子及其变体的培养液的样品。在又一些实施方案中，将取样实施超过一次，例如每天、每隔一天等，或者甚至超过每天一次。可以随着培养开始立即或者在某个时间后，例如培养7或10天后开始此取样。在此样品中，测定例如抗体分子和/或其变体的量与抗体分子及其变体的量之和的比率，例如活性抗体变体的百分比。或者，在此样品中测定其它参数。可以通过本领域技术人员已知的方法来实施取样。在本发明的其它方面，还可以测定活性抗体的绝对量。

可以自动或手动完成取样。在本发明的某些实施方案中，自动实施取样步骤。样品体积范围可以为例如1μl至10000μl。

在本发明的另一个实施方案中，用所描述的方法可获得的大批药物产品中的活性her2抗体变体的百分比大于等于65％，而无活性her2变体的百分比小于等于20％，其中活性her2变体对应于离子交换层析谱中的峰3/3*，而此背景中的无活性变体对应于此层析谱的峰4(参见图1)。

在本发明的某个方面，所生产的抗体组合物中的抗体分子的量与抗体分子及其变体的量之和的比率是50-100％，优选地60至100％且最优选地65至100％。这些数值特别取决于要纯化的抗体。

在本发明的某个方面，优选地，将感兴趣的多肽自培养液以分泌性多肽回收，虽然它在没有分泌性信号的情况中直接表达时也可以自宿主细胞溶胞物回收。通过本领域技术人员已知的方法，例如通过自发酵培养液分离细胞来实施收获，即自细胞培养液回收抗体。作为第一步，例如将培养液或溶胞物离心以除去微粒细胞碎片和细胞。接着可以有深度过滤或其它过滤和/或离心步骤。然后，获得没有细胞和细胞碎片的含有抗体的溶液。

然后，用合适的纯化规程例示性的以下规程自污染物纯化多肽：在免疫亲和和离子交换柱上分级；乙醇沉淀；反相HPLC；在硅土上或者在阳离子交换树脂诸如DEAE上的层析；层析聚焦；SDS-PAGE；硫酸铵沉淀；使用例如Sephadex G-75的凝胶过滤；和蛋白A Sepharose柱以除去污染物。蛋白酶抑制剂诸如苯甲磺酰氟(PMSF)或EDTA也可以用于抑制纯化期间的蛋白水解降解。本领域技术人员会领会，适合于感兴趣的多肽的纯化方法可能需要修饰以解决重组细胞培养中表达后的多肽特征变化。

在本发明的优选的实施方案中，抗体的纯化牵涉亲和层析，接着是阳离子交换层析。在这两个层析步骤间，可以包括本领域技术人员已知的适合于纯化抗体的别的层析和/或过滤步骤及阳离子交换层析步骤之后及蛋白A亲和步骤之前的别的层析和/或过滤步骤。还有可能反转层析步骤的次序。在对纯化方法的一个步骤(或者对随后的步骤)应用溶液前，必须调节参数诸如例如溶液的pH值或电导率。

在本发明的一个优选的方面，将含有抗体分子及其变体的培养液应用于亲和层析柱，并实施亲和层析。仍在本发明的某些方面，采用作为最先纯化步骤的亲和层析步骤以除去大量宿主细胞蛋白和培养副产物。此步骤的条件是本领域技术人员已知的。在本发明的某些方面，亲和柱材料是蛋白A材料、蛋白G材料、金属亲和层析材料、疏水性电荷诱导层析材料(HCIC)、或疏水性相互作用层析材料(HIC，例如用苯基-Sepharose、亲氮杂芳烃树脂、或间氨基苯硼酸)。优选地，亲和柱材料是蛋白A材料或金属亲和层析材料。

在本发明的某个方面，使用固定化于固相上的蛋白A来纯化抗体。优选地，固相是包含用于固定化蛋白A的玻璃或硅土表面的柱。优选地，固相是受控孔玻璃柱或硅酸柱。有时，为了阻止对该柱的非特异性粘附，已经用试剂诸如甘油包被该柱。PROSEP A柱(在商业上可获自Bioprocessing Limited)是用甘油包被的蛋白A受控孔玻璃柱的一个例子。在本发明的某些方面，蛋白A材料以比25mg抗体/ml蛋白A材料高的结合性能为特征。在本发明的又一些方面，在亲和层析步骤中采用高流动琼脂糖基础基质，其经由环氧活化在C端半胱氨酸处偶联蛋白A与基础基质。适合于依照本发明的方法的蛋白A材料的例示性材料是MabSelect Sure和MabSelect Xtra(两者都可获自GEHealthcare，Lifesciences，德国)。

在本发明的某个方面，用合适的缓冲液平衡蛋白A层析的固相。例如，平衡缓冲液可以是TRIS，NaCl，pH 7.1。在本发明的某个方面，此缓冲液含有EDTA或另一种蛋白酶抑制剂和/或抗体稳定剂。

在本发明的某个方面，使用可以与平衡缓冲液相同的加载缓冲液来将例如通过离心和/或过滤或深度过滤与细胞和细胞碎片分开的含有抗体的培养液在经过平衡的固相上加载。随着含污染物的制备物流过固相，蛋白质被吸附至固定化的蛋白A，而其它污染物诸如中国仓鼠卵巢蛋白(CHOP)(在CHO细胞中生成所述蛋白质时)和DNA非特异性结合固相。

后来实施的下一步包括除去结合固相的污染物。在本发明的某些方面，清洗缓冲液包含清洗步骤中的疏水性电解质溶剂，如例如TMAC和/或TEAC(约0.1至约1.0M)，或者可以包含二价离子或溶剂。适合于此目的的缓冲液包含例如TRIS、磷酸盐、MES、和MOPSO缓冲液(参见下文实施例)。在本发明的另一方面，清洗缓冲液包含中性或酸性pH的精氨酸。

在上文提及的清洗步骤后，用合适的洗脱缓冲液自所述柱回收感兴趣的蛋白质。例如，可以使用具有低pH，例如范围为约2至约5的洗脱缓冲液自柱洗脱蛋白质。出于此目的的洗脱缓冲液的例子包括柠檬酸盐或乙酸盐缓冲液。或者，洗脱缓冲液包含精氨酸、二价盐或溶剂。

可以将洗脱的蛋白质制备物进行别的纯化步骤。例示性的进一步纯化步骤包括羟磷灰石层析；透析、使用捕捉蛋白质的抗体的亲和层析、疏水性相互作用层析(HIC)、疏水性电荷相互作用层析(HCIC)、硫酸铵沉淀、阴离子或阳离子交换层析、乙醇沉淀；反相HPLC；硅土上的层析、层析聚焦和凝胶过滤。

在本发明的一个优选的方面，在亲和层析后采用阳离子交换层析。在本发明的某个方面，亲和层析步骤后直接接着阳离子交换层析，之间没有其它层析步骤。在本发明的别的方面，在亲和和阳离子交换层析间采用其它层析步骤和/或纯化步骤。

此阳离子交换层析步骤目的在于在含有要纯化的蛋白质的溶液中不仅降低不想要的抗体变体、宿主细胞蛋白(HCP)，而且降低浸出的蛋白A、其它浸出的材料、和/或病毒的量。

依照本发明的某个方面，实施阳离子交换层析步骤以纯化抗体。特别参考图3(其显示了可以在阳离子交换层析期间使用的例示性缓冲液概况)，相对于先前的缓冲液提高每种缓冲液的pH和/或电导率。使用加载缓冲液将包含感兴趣的多肽和污染物的水溶液加载至阳离子交换树脂上，所述加载缓冲液的pH和/或电导率使得多肽和污染物结合阳离子交换树脂。

加载缓冲液的例示性电导率可以是较低的，例如约5.2至约6.6mS/cm。加载缓冲液的例示性pH可以是5.7mS/cm。

在依照本发明的梯级或梯度洗脱模式中，可以用递增的电导率和/或pH的清洗缓冲液清洗阳离子交换树脂。在梯级洗脱模式中，第一清洗缓冲液可以与加载缓冲液具有相同的电导率和/或pH。在下文的例子中，用清洗缓冲液I(与加载缓冲液相同的电导率和pH，即pH 5.6，κ＝5,7±0,5mS/cm)，然后用清洗缓冲液II清洗阳离子交换柱，所述清洗缓冲液II具有第二电导率和/或pH，使得洗脱大部分污染物，但不洗脱感兴趣的多肽。这可以通过提高清洗缓冲液的电导率或pH，或这两者来实现。在本发明的某些方面，此缓冲液具有7.0至8.5mS/cm，优选地7.6+/-0.5mS/cm的电导率。自清洗缓冲液I至清洗缓冲液II的变化在梯级洗脱模式中是逐步的。

例示性的清洗缓冲液II具有比加载缓冲液和清洗缓冲液I的电导率大的电导率。或者，清洗缓冲液II的pH可以超过加载缓冲液和清洗缓冲液I的pH。

在梯度洗脱模式中，在阳离子交换柱的清洗期间，例如通过用加载缓冲液中的限定百分比的洗脱缓冲液(在下文的实施例中，21％洗脱缓冲液至72％洗脱缓冲液)清洗来连续地，但不必是线性地提高pH和/或电导率。多斜率梯度在本发明中是优选的。

在清洗步骤后，在梯度或梯级洗脱模式中，用洗脱缓冲液实现洗脱，所述洗脱缓冲液具有一定的pH和/或电导率，使得期望的多肽不再结合阳离子交换树脂，并且如此可以自柱洗脱。洗脱缓冲液的pH和/或电导率一般超过梯级洗脱模式的先前步骤中使用的加载缓冲液、清洗缓冲液I、和清洗缓冲液II的pH和/或电导率。洗脱缓冲液的例示性电导率范围为约9.5至约11mS/cm。

抗体洗脱期间的电导率和/或pH变化对于梯级洗脱模式的洗脱是逐步的，而对于梯度洗脱是逐渐的。

在本发明的某些方面，对于自阳离子交换柱梯级或梯度洗脱多肽和污染物两者，改变单一参数，即电导率或pH，而另一项参数(即分别为pH或电导率)保持大致恒定。

在本发明别的某些方面，在洗脱多肽后用再生缓冲液再生离子交换树脂，使得可以再使用该柱。

在本发明的一个优选的方面，用于阳离子交换层析步骤的阳离子交换材料是具有磺丙基基团的强阳离子交换体，如快速流动Sepharose FF(GEHealthcare，Lifesciences，德国)。在本发明的另一个方面，可以使用本领域技术人员已知的其它合适的阳离子交换材料。

在本发明的另一方面，在本发明方法中的阳离子交换层析步骤之前或之后在采用阴离子交换树脂的亲和层析之后分离蛋白质。关于阳离子交换树脂，电导率的变化一般如上文所描述的。然而，pH的变化方向对于阴离子交换树脂是不同的。或者，以流过模式实施阴离子交换层析。

若必要的话，可以将离子交换层析步骤后回收的抗体组合物进行进一步纯化步骤，如上文所讨论的。在本发明的某个方面，在以任何次序采用别的三种或更多种层析步骤，例如阳离子交换层析、阴离子交换层析和疏水性相互作用层析的亲和层析后分离蛋白质。

本文所公开的层析方法特别可用于分离抗体分子与至少一种污染物，其中污染物和感兴趣的抗体分子仅在其等电点方面略有不同，对于显示例如由于脱酰胺化或异构化所致的电荷异质性的蛋白质正是如此。凭借依照本发明的方法，若多肽和污染物的pI仅相差约0.05至约0.2个pI单位，则可以将它们解析。在下文的实施例中，可以使用此方法来解析具有pI 8.87的her2抗体与具有pI 8.79的其单一脱酰胺化的变体(参见Harris等R.J.等J.Chromatogr.B752(2001)，233-245)。

在本发明的另一个实施方案中，可以使用所述方法来解析抗体分子与其糖变体，例如以解析与非变体多肽相比具有不同唾液酸分布的多肽变体。

在本发明的另一方面，要分离的抗体与一种或多种异源分子缀合。此异源分子例如可以提高多肽的血清半衰期(例如PEG)、细胞毒性分子(例如，毒素、化疗性药物、或放射性同位素等)或者它可以是标记物(例如，酶、荧光标记物和/或放射性核素)。

在本发明的某些方面，要纯化的含有抗体的溶液可以是任何含有抗体的材料，其含有污染物和某种水平的活性抗体变体，例如通过过滤或层析方法预先纯化的样品。

在本发明的一个实施方案中，实施阳离子交换层析步骤，其采用单一层析步骤中的梯度洗脱，接着是梯级洗脱进行。

在本发明的某个方面，要纯化的抗体是单克隆抗体。

在本发明的别的方面，抗体针对肿瘤抗原(例如生长因子受体和生长因子)，其选自下组：EGFR、HER3、HER4、Ep-CAM、CEA、TRAIL、TRAIL受体1、TRAIL受体2、淋巴毒素-β受体、CCR4、CD19、CD20、CD22、CD28、CD33、CD40、CD80、CSF-1R、CTLA-4、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、Hepsin、黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、VEGF受体1、VEGF受体2、IGF1-R、TSLP-R、PDGF-R、TIE-1、TIE-2、TNF-α、TNF样凋亡弱诱导物(TWEAK)、IL-1R，优选地EGFR、CEA、CD20、或IGF1-R、和牵涉肿瘤形成的生长因子，如VEGF、EGF、PDGF、HGF和血管生成素(angiopoietin)。

在另一个实施方案中，单克隆抗体选自下组：阿仑单抗(alemtuzumab)、阿泊珠单抗(apolizumab)、西妥昔单抗(cetuximab)、依帕珠单抗(epratuzumab)、加利昔单抗(galiximab)、吉姆单抗(gemtuzumab)、易普利单抗(ipilimumab)、拉贝珠单抗(labetuzumab)、帕尼单抗(panitumumab)、利妥昔单抗(rituximab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、马帕木单抗(mapatumumab)、马妥珠单抗(matuzumab)和帕妥珠单抗(pertuzumab)、ING-1、正由Xoma开发的抗Ep-CAM抗体，优选地曲妥单抗、西妥昔单抗、和帕妥珠单抗，更优选地曲妥单抗。

在本发明的一个优选的方面，要纯化的抗体是单克隆抗HER2抗体，即her2抗体，优选地曲妥单抗或帕妥珠单抗，更优选地曲妥单抗。

在本发明的一个优选的方面，通过依照本发明的方法生产的大批药物her2产品具有大于65％的活性抗体和小于20％的无活性抗体(其分别对应于离子交换层析谱中的峰3/3*和峰4(参见图2))的含量。

图3a中显示了单一层析步骤中的梯度洗脱，接着是梯级洗脱的例子。在梯度洗脱或连续洗脱中，依照本发明，电导率和/或pH是连续升高的，使得可以分离抗体与污染物。这些变化可以是线性变化，并且可以通过固定期(stationary phase)来分离。此外，线性变化的斜度在洗脱期间可以变化，参见例如图3a。或者，变化也可以是非线性的，例如指数的。原则上，以梯级洗脱或梯度洗脱模式实施的阳离子交换层析采用相似的缓冲液(关于各个实施方案，参见上文)。在本发明的某些方面，洗脱缓冲液的电导率范围为约9.5至约11mS/cm。

在本发明的某个方面，在单一层析步骤中，梯度洗脱步骤继之以清洗步骤(例如，与加载缓冲液相同的电导率和/或pH)，然后接着是梯级洗脱。在别的方面，用电导率范围为9.5至约11mS/cm的100％洗脱缓冲液实施梯度洗脱后的梯级洗脱。

在本发明的又一些方面，通过在梯度洗脱后逐步提高电导率和/或pH自阳离子交换柱洗脱活性变体。

在本发明的某个方面，用于在阳离子交换层析步骤中洗脱抗体的梯度序贯牵涉以下缓冲液：3.9个柱体积：21％至49.4％洗脱缓冲液，3.6个柱体积：49.4％至58.8％洗脱缓冲液，7.8个柱体积：58.8％至72％洗脱缓冲液，1个柱体积：0％缓冲液B，6.5个柱体积：100％B。

在下文的实施例中，使用图3b中所显示的缓冲液概况通过逐步提高电导率来洗脱活性her2变体。

通过针对来源材料的纯度，即活性变体的百分比改编阳离子交换层析步骤中的洗脱模式(梯度或梯级)，可以获得足够高质量的高收率。在本发明的某些方面，针对关于活性her2变体百分比的纯度改编洗脱模式。

在本发明的又一些方面，针对要纯化的溶液中的脱酰胺化、酸性或碱性变体的百分比，并且在本发明的某些方面，针对脱酰胺化的和酸性的her2变体的百分比改编洗脱模式。在本发明别的某些方面，针对关于测定的某些糖变体的百分比的纯度改编洗脱模式。

已经发现了凭借阳离子交换层析中的梯级洗脱，可以获得与梯度洗脱，接着进行梯级洗脱相比更高的收率，但是与污染性变体的分离没有在梯度洗脱模式，接着进行梯级洗脱的情况中那样好。如此，前一种洗脱类型在要进一步纯化的蛋白质的纯度已经超过某个阈值的情况中是优选的，由此利用与梯级洗脱相关的高收率。反之亦然，在要进一步纯化的抗体的纯度小于某个阈值的情况中，不采用梯级洗脱，这是由于与梯度洗脱，接着进行梯级洗脱相比解析较差，由此接受较低的收率。换言之，在要纯化的样品中最想要的抗体变体，即抗体分子的百分比高于某个百分比(或者不想要的抗体变体的相对量小于某个百分比)的情况中，只能通过梯度洗脱获得治疗功效和安全性需要的纯度。

在本发明的另一个优选的方面，收率(即在没有逐渐提高应用于柱的缓冲液的电导率和/或pH的情况中通过逐步提高电导率和/或pH实施的阳离子交换层析生产的抗体组合物中的抗体分子及其变体的量与加载至阳离子交换层析上的含有抗体分子及其变体的步骤a2)的洗脱物中的抗体分子及其变体的量的比率)大于65％，优选地大于70％，且最优选地大于75％。

在本发明的别的方面，在测定抗体分子的量与抗体分子和抗体变体的量的比率的步骤与阳离子交换层析步骤间实施蛋白A亲和层析步骤。

可以将层析步骤后回收的蛋白质在药学可接受载体中配制，并且用于各种诊断、治疗或此类分子已知的其它用途。

本发明的某个方面针对通过依照本发明的方法生产的包含her2抗体的组合物。

提供以下例子、参考文献、和图以帮助理解本发明，其真实的范围在所附权利要求书中列出。应当理解，可以在不背离本发明精神的前提下对列出的规程做出修饰。

赫赛汀即一种her2抗体(WO 99/57134)在本发明时在我们的实验室中以足够的量可获得，并且因此本发明以此免疫球蛋白例示。同样地，本发明一般以免疫球蛋白可实施。此例示性的描述仅作为例子，而不作为本发明的限制完成。提供这些例子以帮助理解本发明，其真实的范围在所附权利要求书中列出。

附图描述

图1：发酵期间的赫赛汀变体分布。显示了分别归于发酵第10天、第11天和第12天(F10、F11和F12)的离子交换层析谱(参见图3)中的峰1、3/3*和4的特定变体的百分比。显示了来自15个发酵运行的平均值和标准偏差。

图2：分析用离子交换层析谱。阳离子交换柱上的曲妥单抗分离。表1中给出了峰指派。

图3：用于阳离子交换层析步骤中的洗脱：a)梯度洗脱，b)梯级洗脱的缓冲液概况。

实施例1

发酵期间的抗体变体样式的变化

在培养开始后第10天、第11天和第12天，对发酵期间的赫赛汀抗体的变体分布分析产生大批药物产品的此抗体的大规模发酵。将样品在第10天、第11天和第12天收集，并通过分析用离子交换层析分析变体样式和变体百分比。自获得的相应层析谱中的峰面积计算变体的百分比。如可以自图1(其汇总了自15个大规模发酵运行获得的数据)看出的，自发酵的第10天至第12天，归于离子交换层析谱(比较图2和表1)中的峰1和4的变体存在着清楚的增加。峰1对应于酸性、脱酰胺化的且活性较小的赫赛汀变体。峰4由具有天冬酰胺的异构化和/或Lys450残基的变体构成。此外，同时，第10天至第12天收集的样品中观察到的主峰3/3*(其对应于未修饰的、最具活性形式的赫赛汀)也存在着降低。如此，在发酵第10天至第11天间，存在着变体样式的清楚变换，即变体的相对量增加，而感兴趣的抗体分子的相对量同时降低。

表1：

曲妥单抗阳离子交换层析峰级分的指派

注意：与主峰形式的差异以粗体形式显示。

^a指N-乙酰神经氨酸(NeuAc)、重链中Asn387处的脱酰胺化、或重链Asn392处的脱酰胺化的存在。

实施例2

用蛋白A亲和层析纯化her2抗体并测定活性her2变体的百分比

重组DNA技术：

使用标准方法来操作DNA，如记载于Sambrook，J.等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.，(1989)的。依照制造商的指令使用分子生物学试剂。

蛋白质测定：

通过每种样品的分光光度扫描来测定每个层析级分的蛋白质量。使用结果来计算产物回收收率。her2的消光系数是1.45。用于推导结果的计算是：

蛋白质量(mg/ml)＝280nm/1.45x稀释因子

每个级分中的蛋白质质量(mg)＝蛋白质量(mg/ml)x级分体积(ml)

收率(％)＝级分质量(mg)/总质量(mg)x100

宿主细胞蛋白测定：

用血清清蛋白和链霉亲合素的混合物包被微量滴定板的孔壁。将针对HCP的山羊衍生的多克隆抗体结合微量滴定板的孔壁。在清洗步骤后，将微量滴定板的不同孔与不同量的HCP校准序列和样品溶液一起温育。在温育后，通过用缓冲溶液清洗除去未结合的样品材料。对于检测，将孔与抗体过氧化物酶缀合物一起温育以检测结合的宿主细胞蛋白。通过与ABTS一起温育并于405nm检测来检测固定的过氧化物酶活性。

DNA测定：

依照已知的规程经由定量PCR测定样品中的DNA含量。

蛋白A亲和层析：

使用源自两种不同发酵的以下her2抗体材料：

F1：her2A    <her2>＝0,907mg/mL

F2：her2B    <her2>＝1,739mg/mL

将源自发酵2的上清液，即材料F2在碱性条件(pH 9)贮存12小时以生成人工脱酰胺化的抗体材料，如此与F1的抗体相比低质量且活性异构体的百分比较低的抗体。3/3*峰面积(其对应于活性异构体的量)的百分比降低在离子交换层析谱(还可参见表2)中是明显的。在下文中，此样品表示为F2’。

F2’：her2B  <Her2>＝1,739mg/ml

在第一步中将含有her2抗体的溶液，即F1、F2和F2’应用于蛋白A亲和柱。

层析条件如下：

树脂：     MabSelect SuRe(GE Healthcare，Life Sciences，德国)

平衡：     25mM Tris，25mM NaCl，5mM EDTA，pH；7.1

清洗步骤I：25mM Tris，25mM NaCl，5mM EDTA，pH 7.1

清洗步骤II： 25mM NaCl，500mM TMAC，5mM EDTA，pH 5.0

清洗步骤III：25mM Tris，25mM NaCl，5mM EDTA，pH 7.1±0.5

洗脱：       25mM柠檬酸盐，pH 2.8±0.4

分析用离子交换层析：

经由分析用离子交换HPLC实施活性和无活性her2抗体变体的相对含量的测定。

层析条件：

树脂：Dionex ProPac^TM WCX-10分析型，4x 250mm，Dionex

      54993(弱阳离子交换层析)

流速：0.8ml/分钟

加载：50μl或50μg

压力：最大210巴

缓冲液A：10mM磷酸的钠盐，pH 7.5

缓冲液B：缓冲液A中的0.1M NaCl

温度：室温

依照以下方案实施平衡、梯度洗脱和再生：

时间(分钟)	缓冲液A	缓冲液B
			0	85	15
30	45	55
			35	45	55
36	0	100
			44	0	100
45	85	15
			55	85	15

通过测定峰3和3*(在下表中表示为3/3*)的相对峰面积来计算活性形式的her2抗体的百分比，其中3*代表峰3的小肩。通过测定峰1和4的相对峰面积来计算活性较小的her2变体的百分比。在峰1中，可以找到脱酰胺化的酸性her2变体(在一条轻链的第30位处的Asn至Asp)，及在峰4中，以一条重链中的第102位处的异天冬氨酸为特征的her2变体(参见图2和表1)。

表2汇总了自用于下文在实施例3中所描述的阳离子交换层析的F1、F2和F2’样品获得的蛋白A洗脱物的质量。可以看出代表her2抗体的主要形式的IEC峰3/3*(其表述为分析用离子交换层析谱中的峰下相对面积)在暴露于碱性条件的样品中相对于暴露前的样品降低(54.3％对58％)，并且反之亦然，峰1中的her2变体，即酸性的脱酰胺化的her2变体的百分比在暴露于碱性条件后是升高的(自9.7％至13.3％)。

表2：

未修饰的her2样品(F1和F2)和暴露于碱性条件的her2样品(F2’)的蛋白A层析后的Her2变体样式。

样品	F1	F2	F2’
				SEC[相对面积]	98,8	98,7	98,8
IEC峰1[相对面积]	9,7	9,8	13,3
				IEC峰3/3*[相对面积]	58	58,3	54,3
IEC峰4[相对面积]	17,1	18,9	16,6
				DNA[pgDNA/mg]	4,5	2	＜2,0
HCP[ppm]	4376	1452	946

*SEC：单体含量，HCP：宿主细胞蛋白

实施例3

使用不同洗脱模式用阳离子交换层析纯化亲和纯化的her2抗体

在蛋白A层析后，实施阳离子交换层析以进一步分离期望的her2抗体。在阳离子交换层析前，用1M TRIS将蛋白A洗脱物的pH调节至5,5。分别使用梯度，接着是梯级洗脱或者仅梯级洗脱通过在SP Sepharose FF(GE Healthcare)上的阳离子交换层析纯化每种样品(F1、F2和F2’的蛋白A洗脱物)，产生6个实验。在单体含量(SEC)、变体样式，特别是有活性的和脱酰胺化的变体的百分比，DNA和HCP降低方面分析每幅所得的层析谱。

层析条件如下：

树脂：SP Sepharose FF，GE Healthcare

柱长度：35cm

加载：条件化的蛋白A集合

用于梯度洗脱，接着是梯级洗脱的缓冲液：

平衡缓冲液和清洗缓冲液：30mM MES，45mM NaCl，pH 5.6±0.05；κ＝5.7±0.5mS/cm

洗脱缓冲液：30mM MES，95mM NaCl，pH 5,6±0,05；κ＝10.35±0,65mS/cm

图3a中显示了用于洗脱的梯度。

用于梯级洗脱的缓冲液：

平衡和清洗缓冲液I：25mM MES，50mM NaCl，5.6±0,1；κ＝5.7±0,5mS/cm

清洗缓冲II：25mM MES，70mM NaCl，pH 5.6±0,1；κ＝7.6±0,5mS/cm

洗脱缓冲液：25mM MES；95mM NaCl；pH 5.6±0,1；κ＝10.0±0.5mS/cm

图3b中显示了用于梯级洗脱的缓冲液概况。

下文表3和4显示了蛋白A亲和和阳离子交换层析(其仅用梯级洗脱或用梯度洗脱，接着梯级洗脱实施)后自F1(表3)和F2’(表4)样品获得的her2抗体的变体分布、纯度和收率。

表3：

自F1样品获得的her2抗体的纯度和收率

表4：

自F2’样品获得的her2抗体的纯度和收率

如可以自表3和4看出的，与仅梯级洗脱相比，梯度洗脱，接着是梯级洗脱导致较高百分比(4％-6％)的最具活性的抗体(3/3*峰)。梯度和梯级洗脱同等适合于降低污染性宿主细胞蛋白(HCP)的量。然而，与梯度洗脱相比，收率在梯级的情况中显著更高(约2倍)。这部分是由于在梯度洗脱模式中在清洗梯度期间的抗体损失。如此，根据哪个参数需要改善，即收率或纯度，梯度或梯级洗脱对于抗体的纯化可能是最佳的。

此外，在蛋白A洗脱物已经含有相对高含量的最具活性的抗体变体的情况中，阳离子交换层析步骤中的优选种类的洗脱是梯级洗脱，因为可以获得与梯度洗脱，接着是梯级洗脱相比具有高得多的收率的足够纯的抗体。显著更高的收率对应于生产的绝对抗体量更高，其直接导致更高的抗体生产率。

然而，在最具活性的抗体(3/3*)在蛋白A洗脱物中仅占小于某个百分比的情况中，梯度洗脱，接着是梯级洗脱是优选的，因为仅在此种洗脱的情况中，可以获得活性足够的her2抗体。然后，必须接受用此方法获得的较低收率。污染性DNA和HCP的降低对于这两种洗脱模式是相似的。

在本发明的另一方面，使用包含多肽的样品的等分试样的分析用离子交换层析来确定随后的所述样品的多肽纯化方案。优选地，多肽是抗体，更优选地单克隆抗体，且最优选的是her2抗体。优选地，样品是没有细胞和/或细胞碎片的自细胞培养物获得的样品或者是用于纯化多肽的层析期间获得的样品。优选地，分析用离子交换层析目的在于解析抗体变体。优选地，分析用离子交换层析是阳离子交换层析。优选地，分析用离子交换层析的使用确定用于阳离子交换层析步骤的方案。最优选地，在随后的纯化方案中，自阳离子交换柱洗脱抗体，其如下进行

i)逐渐提高应用于阳离子交换柱的洗脱缓冲液的电导率和/或pH，并

ii)然后，若抗体分子的量与抗体分子及其变体的量之和的比率低于阈值比率，则逐步提高应用于阳离子交换柱的洗脱缓冲液的电导率和/或pH，或者

若抗体分子的量与抗体分子及其变体的量之和的比率高于阈值比率，则在没有逐渐提高应用于阳离子交换柱的洗脱缓冲液的电导率和/或pH的情况中逐步提高电导率和/或pH。

优选地，自分析用离子交换层析谱中的峰面积测定抗体分子的量与抗体分子及其变体的量之和的比率。

阈值比率基于要获得的纯度来确定，并且其取决于抗体自身和所使用的纯化方案等。

Claims (7)

1.用于生产包含曲妥单抗分子及其酸性或碱性变体的曲妥单抗组合物的方法，包括下列步骤：

a)提供包含曲妥单抗分子及其变体的样品，

b)通过对所述样品的等分试样实施的分析方法来测定所述样品中的曲妥单抗分子的量与曲妥单抗分子及其酸性和碱性变体的量之和的比率，

且步骤c)包括：

a1)任选地，过滤和/或离心步骤a)的样品，

a2)实施亲和层析，其通过在亲和层析柱上应用步骤a1)的进一步过滤和/或离心的样品或步骤a)的样品来进行，

a3)实施阳离子交换层析，其通过任选地在调节pH和/或电导率后将含有曲妥单抗的步骤a2)的洗脱物加载至阳离子交换层析柱上来进行，若步骤b)中测定得到的曲妥单抗分子的量与曲妥单抗分子及其碱性和酸性变体的量之和的比率高于选自65至75％范围的阈值比率，

则

i)在没有逐渐提高清洗缓冲液的电导率和/或pH的情况中以逐步提高的电导率和/或pH清洗柱，并

ii)在没有逐渐提高洗脱缓冲液的电导率和/或pH的情况中以逐步提高的电导率和/或pH洗脱曲妥单抗分子，

由此生产包含所述曲妥单抗分子及其变体的纯化的曲妥单抗组合物。

2.依照权利要求1的方法，其中曲妥单抗分子的pI与所述变体的pI相差0.1至0.5个pI单位。

3.依照权利要求1-2中任一项的方法，其中在步骤b)中，所述分析方法是离子交换层析、ELISA、或MALDI-TOF分析。

4.依照权利要求1-3中任一项的方法，其中步骤a)中的样品是亲和层析步骤的洗脱物或者是没有细胞和细胞碎片的包含曲妥单抗及其变体的细胞培养液。

5.依照前述权利要求中任一项的方法，其中提供样品的步骤a)包括：

i)提供含有核酸分子的细胞，所述核酸分子包含编码曲妥单抗分子的核酸序列，

ii)将所述细胞在培养基中培养4-28天，

iii)自所述培养基获得样品，

由此提供包含所述培养基、所述细胞、所述曲妥单抗分子及其变体的样品。

6.依照前述权利要求中任一项的方法，其中所述阈值比率是67.5％。

7.依照权利要求1-6中任一项的方法，其特征在于亲和层析是蛋白A、或蛋白G、或金属亲和层析。