CN102465103A - 一株好氧反硝化甲基杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株好氧反硝化脱氮的甲基杆菌及其应用。好氧反硝化的菌株为甲基杆菌(Methylobacterium phyllosphaerae)SDN-3CGMCC No.3660。该菌在好氧与限氧条件下，能利用硝酸盐氮进行好氧反硝化，也能利用氨氮进行异养硝化-好氧反硝化。该菌遗传性状稳定，可实现同步硝化-反硝化脱氮，能够独立完成生物脱氮的全过程。使用该菌处理各种含氮废水，只需要一个好氧阶段，工艺简单，脱氮效率高。

Description

一株好氧反硝化甲基杆菌及其应用

技术领域

本发明属于环境微生物领域，具体涉及一株用于生物脱氮的甲基杆菌(Methylobacterium phyllosphaerae)及其应用。本发明的甲基杆菌在好氧与限氧条件下均具有较强的反硝化性能，特别适用于含氨废水同步硝化反硝化过程脱氮。

背景技术

随着水体中氮素污染日益严重，脱氮成为目前水处理研究的重点和热点。目前普遍认为，生物脱氮是从废水中去除氮素污染的较为经济有效的方法之一。传统生物脱氮包括好氧硝化和厌氧反硝化两个过程，这就需要将硝化和反硝化分离开，存在工艺冗长，污水处理构筑物占地面积大，投资和运行费用高等诸多弊端。针对上述问题，有些研究者试图将硝化菌和反硝化菌投加到同一反应器中，虽然部分解决了传统工艺存在的问题，但由于两种菌体的差异，总氮去除效果往往不理想。

所以人们不断寻求新型、高效的脱氮微生物，好氧反硝化菌作为一种新型的脱氮细菌倍受关注。近年来，已发现的好氧反硝化菌有泛养硫球菌(Thiosphaerapantotropha)，现更名为脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)，粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)，海洋假单胞菌(Pseudomonas nautical)和细小好氧反硝化菌(Microvirgula aerodenitrificans)等。此类菌株的发现突破了传统技术限制，大大简化了脱氮工艺环节，可实现同时硝化反硝化脱氮。

CN200910083014.3公开了一株具有异养硝化-好氧反硝化性能的土壤杆菌(Agrobacterium sp.)。该菌在处理以有机物(琥珀酸钠、柠檬酸钠和无水乙酸钠等)为碳源，氨氮为唯一氮源的废水时，氨氮去除率80％～100％，去除速率3.14mg/(L·h)～7.95mg/(L·h)；总氮去除率78％～86.54％。在处理以硝酸盐氮或亚硝酸盐氮为唯一氮源的废水时，硝酸盐氮去除率64.05％～100％，去除速率3.12mg/(L·h)～5.44mg/(L·h)；总氮去除率63.28％～71.25％。张光亚等(应用与环境生物学报，2005，11(2))从土壤分离到一株好氧同时硝化-反硝化菌SDN，该菌为G⁺，球状或杆状，菌落橙红色。该菌以硝酸钠为氮源时能进行好氧反硝化，以乙酸钠和硫酸铵分别为碳源和氮源能进行异养硝化，能以乙酰胺为唯一碳源和氮源进行生长。陈昢圳等(环境科学，2009，30(12))从畜禽养殖废水中筛选到一株异养硝化-好氧反硝化细菌CPZ24。该菌为G⁺，杆状，菌落橙红色，初步鉴定为嗜吡啶红球菌(Rhodococuus pyridinivorans)。在硝化过程中，该菌可将氨氮全部去除，总氮去除率98.70％；在好氧反硝化中，硝酸盐氮去除率66.74％，总氮去除率64.27％。上述菌株在硝化及反硝化脱氮时的去除效率需进一步提高。

甲醇降解菌株的筛选为工业废水的生物处理提供了基础，甲基杆菌是能够有效降解甲醇的一类微生物。有些甲基杆菌能够通过铵盐和硝酸盐的转化影响氮循环。CN200710175890.X公开了一株重组甲基营养杆菌MB202，在利用重组甲基营养杆菌MB202的静息细胞生产L-丝氨酸，在处理甲醇废水中都具有十分广泛的应用前景。Madhaiyan等(Int J Syst Evol Microbiol，2009，59(Pt 1))从水稻中分离获得一株甲基杆菌(Methylobacterium phyllosphaerae sp.nov.)，该菌呈粉红色。晁红军(微生物学通报，2009，36(11))等从沼气池残渣中分离出200多株能以甲醇为唯一碳源的细菌，其中一株初步鉴定为甲基杆菌(Methylobacterium sp.)MB200。研究表明，该菌能利用甲醇、乙醇、丁二酸等作为唯一碳源。李宝庆等(农业环境科学学报，2007，26)以甲醇作唯一碳源，利用富集培养的方法从化工厂活性污泥中分离到一株甲醇降解菌CYW-32，鉴定为嗜有机甲基杆菌(Methylobacterium organophilium)。通过比色酸法明确了菌株CYW-32在24h内可高效降解500mg/L的甲醇，降解率达到97.75％。孔庆胜等(化学与生物工程，2009，26(1))从活性污泥中筛选到一株可利用甲醇为唯一碳源和能源生长的细菌SDM11，该菌G^-，短杆状，初步鉴定为甲基营养菌属。在温度30℃、甲醇含量为0.6％、pH7.0的最适生长条件下，甲醇的降解率达82.5％。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一株具有天然生长优势的好氧反硝化甲基杆菌，该菌株具有较高的好氧反硝化效率，还具有异养硝化脱氨氮和好氧反硝化同时进行的性能，将硝化和反硝化结合在一个过程中。

本发明提供一株好氧反硝化甲基杆菌，甲基杆菌(Methylobacteriumphyllosphaerae)SDN-3，2010年03月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.3660。

本发明甲基杆菌SDN-3为革兰氏阴性菌，菌体为杆状，能运动；菌落圆形细小，呈橘红色，边缘整齐光滑；接触酶阳性，氧化酶阳性，可利用多种碳源。生理生化特性如表1所示。

表1甲基杆菌SDN-3的生理生化特性

注：“+”表示阳性反应或能利用；“-”表示阴性反应或不能利用。

本发明甲基杆菌SDN-3的16SrRNA基因测序分析结果见序列表。

本发明甲基杆菌SDN-3的硝酸盐还原酶活性高，在好氧与限氧条件下均能表达，具有好氧反硝化与限氧反硝化功能，还具有同时完成硝化作用和反硝化作用的功能。具体性能包括：(1)利用廉价的碳源(如甲醇或含COD废水等)，硝酸盐氮作为唯一氮源，进行好氧反硝化脱氮；(2)利用廉价的碳源(如甲醇或含COD废水等)，氨氮作为唯一氮源，进行异养硝化-好氧反硝化同步脱氮。

本发明甲基杆菌SDN-3在温度22℃～40℃，pH7.0～9.5的条件下生物活性稳定，脱氮效果好。

本发明甲基杆菌SDN-3应用在污水处理领域，可耐受高浓度的有机碳源，适用于处理含COD、同时含硝酸盐氮或氨氮的废水，总氮去除率大于90％，总氮平均去除速率大于9mg/(L·h)；COD去除率大于85％。

本发明甲基杆菌SDN-3应用于污水处理的好氧反硝化过程，其操作条件为：溶解氧为0.2mg/L～2.5mg/L，碳氮质量比为3.0～6.0，温度为22℃～40℃，pH7.0～9.5。

本发明甲基杆菌SDN-3应用于污水处理的同时硝化反硝化过程，如可以用于含氨氮污水的同时硝化反硝化处理过程，其操作条件为：溶解氧为0.5mg/L～5.0mg/L，碳氮质量比为3.0～6.0，温度22℃～40℃，pH7.0～9.5。

本发明甲基杆菌SDN-3在污水脱氮处理效果不理想的情况下可以作为生物修复剂进行补加。

本发明甲基杆菌SDN-3可直接应用于含硝酸盐氮废水的反硝化脱氮，也可以应用于含氨氮废水的脱氮，是一株具有异养硝化-好氧反硝化性能的细菌。该菌投入使用后可以缩短系统的启动时间，在各类废水脱氮处理过程中具有非常广阔的应用前景，特别适合同步硝化反硝化生物脱氮工艺过程中。

本发明甲基杆菌SDN-3是具有好氧反硝化特性的异养硝化菌，使硝化与反硝化在一个单元内同步进行成为可能，同时克服了传统处理工艺在处理效率与经济适用两方面的矛盾，实现废水高效而经济的脱氮。因此，获得高效的降解菌株，并使其成为反应体系中的优势种群而发挥快速脱氮作用，将会加快同步硝化反硝化工艺工业化应用的进程。

生物材料保藏说明

本发明提供的甲基杆菌(Methylobacterium phyllosphaerae)SDN-3菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所；保藏编号：CGMCC No.3660；保藏日期：2010年03月11日。

附图说明

图1是本发明的甲基杆菌SDN-3处理含不同碳源废水的总氮去除效果。

具体实施方式

以下具体说明本发明菌株的分离筛选过程及应用实例，其中未指明基准的百分含量为重量百分含量。

本发明菌株采用稀释平板分离法从活性污泥菌群中分离筛选具有好氧反硝化性能的菌株，活性污泥来自抚顺石油三厂污水处理厂。

分离筛选方法如下：

①采用稀释平板分离法：取少许活性污泥，梯度稀释后涂布于初筛固体培养基平板(甲醇5.0mL，KNO₃ 1.0g，KH₂PO₄ 1.0g，FeCl₂·H₂O 0.5g，CaCl₂·H₂O 0.2g，MgSO₄ 1.0g，BTB 1.0mL，水1.0L，pH7.0～7.5，按2％的比例加入琼脂)，30℃～35℃培养，选择培养基变蓝的菌株进行纯化。经多次转接，筛选得到3株好氧反硝化菌，编号为SDN-1～SDN-3。

②好氧反硝化脱氮性能比较：将筛选获得的3株菌接种于复筛液体培养基(甲醇5.0mL，KNO₃ 1.0g，KH₂PO₄ 1.0g，FeCl₂·H₂O 0.5g，CaCl₂·H₂O 0.2g，MgSO₄1.0g，水1.0L，pH7.0～7.5)，30℃～35℃培养。获得硝酸盐氮和总氮去除率均大于91％的菌株SDN-3，其它菌株总氮去除率为60％～70％。经反复实验证明，菌株SDN-3的好氧反硝化性能可以稳定遗传。

③种子液的制备：将纯化培养的菌株SDN-3接入150mL复筛液体培养基，30℃～35℃培养3天。后续废水处理的菌体量均按照种子培养液离心后10g/L的量添加。

④碳源利用能力考察：选用筛选好氧反硝化菌较为常用的丁二酸钠、天冬酰胺、柠檬酸钠、乙酸钠、乙醇和甲醇等为碳源进行考察。结果表明菌株SDN-3能够利用多种碳源，尤其是以甲醇为碳源进行好氧反硝化，总氮去除率达90％，COD去除率达97％。SDN-3处理含不同碳源废水的总氮去除效果见附图1。

⑤异养硝化能力考察：以氨氮为氮源，甲醇为碳源进行异养硝化-好氧反硝化能力考察。结果表明SDN-3具有较强的异养硝化-好氧反硝化能力，氨氮去除率大于95％，总氮去除率大于90％，COD去除率大于98％。

实施例1

甲基杆菌SDN-3的好氧反硝化性能的检测。

配制模拟废水I，以硝酸盐氮为唯一氮源，初始浓度为277mg/L，碳氮质量比为5.3。在溶解氧(DO)为0.5mg/L，温度24℃，pH7.0的条件下处理24h。硝酸盐氮去除率大于95％；总氮去除率大于90％，总氮平均去除速率10.4mg/(L·h)；COD去除率大于85％。

模拟废水I：甲醇5.0mL，KNO₃ 2.0g，KH₂PO₄ 1.0g，FeCl₂·H₂O 0.5g，CaCl₂·H₂O 0.2g，MgSO₄ 1.0g，水1.0L，pH7.0～7.5。

实施例2

甲基杆菌SDN-3的异养硝化-好氧反硝化性能的检测。

配制模拟废水II，以氨氮为唯一氮源，初始浓度265mg/L，碳氮质量比为3.4。在DO为2.5mg/L，温度35℃，pH8.5的条件下处理26h。氨氮去除率和总氮去除率均大于90％，总氮平均去除速率9.2mg/(L·h)；COD去除率大于99％。

模拟废水II：甲醇3.0mL，硫酸铵1.25g，KH₂PO₄ 1.0g，FeCl₂·H₂O 0.5g，CaCl₂·H₂O 0.2g，MgSO₄ 1.0g，水1.0L，pH7.0～7.5。

实施例3

甲基杆菌SDN-3应用于高浓度COD的味精废水。

味精废水水质：氨氮浓度为300mg/L～450mg/L，COD为700mg/L～850mg/L，pH5.0～6.0。利用本实验室培养的硝化菌将氨氮转化为硝酸盐氮，硝化出水作为反硝化进水，然后利用SDN-3进行好氧反硝化脱氮。初始硝酸盐氮浓度为320mg/L，碳源不足补加甲醇，使碳氮质量比为4.0。在DO为1.5mg/L，温度30℃，pH7.0～8.5的条件下处理30h后，硝酸盐氮去除率大于90％；总氮去除率大于85％，总氮平均去除速率9.07mg/(L·h)；COD去除率大于75％。

实施例4

甲基杆菌SDN-3应用于尿素含氨废水。

尿素废水水质：氨氮浓度450mg/L，pH9.0～9.8。

不经过硝化菌将氨氮转化为硝酸盐氮，直接利用SDN-3进行异养硝化-好氧反硝化脱氮。碳源不足补加甲醇，使碳氮质量比为3.5。在DO为2.5mg/L，温度30℃，pH7.0～8.5的条件下处理42h后，氨氮去除率大于95％；总氮去除率大于90％，总氮平均去除速率9.64mg/(L·h)；COD去除率大于96％。

Claims (10)

1.一株好氧反硝化甲基杆菌，甲基杆菌(Methylobacterium phyllosphaerae)SDN-3，2010年03月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.3660。

2.按照权利要求1所述的甲基杆菌，其特征在于：甲基杆菌SDN-3为革兰氏阴性菌，菌体为杆状，能运动；菌落圆形细小，呈橘红色，边缘整齐光滑；接触酶阳性，氧化酶阳性，可利用多种碳源。

3.按照权利要求1所述的甲基杆菌，其特征在于：甲基杆菌SDN-3硝酸盐还原酶活性高，在好氧与限氧条件下均能表达，具有好氧反硝化与限氧反硝化功能，具有同时完成硝化作用和反硝化作用的功能。

4.按照权利要求1或3所述的甲基杆菌，其特征在于：甲基杆菌SDN-3能利用廉价的碳源，以硝酸盐氮为唯一氮源，进行好氧反硝化脱氮。

5.按照权利要求1或3所述的甲基杆菌，其特征在于：甲基杆菌SDN-3能利用廉价的碳源，以氨氮为唯一氮源，进行异养硝化-好氧反硝化同步脱氮。

6.按照权利要求1所述的甲基杆菌，其特征在于：甲基杆菌SDN-3在温度22℃～40℃，pH7.0～9.5的条件下生物活性稳定，脱氮效果好。

7.权利要求1所述甲基杆菌SDN-3应用在污水处理领域。

8.按照权利要求7所述的应用，其特征在于：甲基杆菌SDN-3适用于处理含COD、同时含硝酸盐氮或氨氮的废水，总氮去除率大于90％，总氮平均去除速率大于9mg/(L·h)；COD去除率大于85％。

9.权利要求1所述甲基杆菌SDN-3应用于污水脱氮处理的好氧反硝化过程，其操作条件为：溶解氧为0.2mg/L～2.5mg/L，碳氮质量比为3.0～6.0，温度22℃～40℃，pH7.0～9.5。

10.权利要求1所述甲基杆菌SDN-3应用于污水脱氮处理的同时硝化和反硝化过程，其操作条件为：溶解氧为0.5mg/L～5.0mg/L，碳氮质量比为3.0～6.0，温度22℃～40℃，pH7.0～9.5。

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