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CN102460114A - 用于鉴别和计数表达特定标志物的颗粒的多频阻抗方法和装置 - Google Patents

用于鉴别和计数表达特定标志物的颗粒的多频阻抗方法和装置 Download PDF

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CN102460114A
CN102460114A CN2010800345168A CN201080034516A CN102460114A CN 102460114 A CN102460114 A CN 102460114A CN 2010800345168 A CN2010800345168 A CN 2010800345168A CN 201080034516 A CN201080034516 A CN 201080034516A CN 102460114 A CN102460114 A CN 102460114A
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impedance
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particle
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H.摩根
D.霍尔姆斯
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Koninklijke Philips Electronics NV
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Abstract

提供了一种鉴定和计数表达特定抗原标志物的颗粒的分析方法。一个实例（但不唯一）是血液中CD4+T淋巴细胞分析。所述方法包括获得悬液形式的包含颗粒的样品，用阻抗标记物标记表达特定标志物的颗粒，以及使用双频系统测量被标记的样品以鉴别至少表达特定标志物的被标记的颗粒。所述方法允许精确计数颗粒，例如血流中的CD4+T淋巴细胞的数量。也提供了相应的装置。

Description

用于鉴别和计数表达特定标志物的颗粒的多频阻抗方法和装置
技术领域
本发明涉及医疗设备、医疗诊断及颗粒计数的领域，及更特别地涉及一种用于鉴别（discriminating）、鉴定（identifying）和计数不同颗粒的方法和装置，所述颗粒包括细菌、病毒、非生物颗粒和细胞。一个实例可为例如表达特定标志物的血细胞，例如用于鉴别、鉴定和计数人类血液中的CD4+ T淋巴细胞。另一个实例可为表达不同表面标志物的细菌或病毒。另一个实例可为带有表面标志物的的固体颗粒，所述标志物可以是抗体，或DNA或肽的片段。
背景技术
微流体系统已在研究细胞功能、细胞和组织工程学、疾病诊断、血液样品制备和药物发现中显示出独特的前景。最近微流体用于从全血中分离纯的白细胞群或白细胞亚群的用途已吸引了许多对于即时诊断的兴趣。
作为实例，免疫缺陷疾病（主要是HIV）的诊断用血液分析进行。测定血液中辅助性T淋巴细胞的浓度对于检测HIV感染的进程是很重要的。因此重要的是检测CD4+ 和CD8+T淋巴细胞的存在和对其计数。根据WHO的指导方针，血液中CD4+T细胞计数少于200细胞/µl确定为AIDS阳性诊断，并且在多数情况下被用作需要应用抗病毒治疗的指示。在CD4+计数降至200细胞/µl以下之前开始抗病毒治疗，例如从350细胞/µl的阈值开始，是被推荐的，并且CD4+计数500细胞/µl的阈值被广泛用于增加患者临床监控的频率。
用以荧光为基础的流式细胞术（FACS）定量CD4+T淋巴细胞的水平是目前的金标准。以荧光为基础的流式细胞术复杂并且设备昂贵，因此尚未进入资源匮乏的地区，如撒哈拉以南非洲。对便于使用的即时的CD4+T细胞计数系统存在需求，例如对用于发展中世界。
阻抗频谱法（IS）已被广泛用于测量细胞的电介质性质，提供膜电容、膜电阻、细胞质传导率和介电常数的值。其也可被认为是“无标记”的分析方法。通常细胞以悬液形式被测量，并且所述数据代表了种群的平均值。单个细胞的电性质最初的高速测量由Coulter于20世纪50年代进行的。显示的是使用用单一低频（或DC）电信号进行的电体积测量法单独的血细胞可被计数和鉴别。在20世纪70年代Hoffman和Britt发展了用于单个细胞的同时的低和高频阻抗分析的宏观系统，使用微型的具有放置于流体通道中的电极的流通池。
X.Cheng等人在“Cell detection and counting through cell lysate impedance spectroscopy in microfluidic devices” Lab Chip, 2007, 7, 746-755中描述了计数细胞的电方法，所述方法以测量从微流体通道内表面被固定的细胞释放的离子引起的周围介质传导率的变化为基础。被固定的细胞用低传导率、低渗的介质裂解，导致的阻抗变化用表面加工（patterned）的电极测量以检测和定量细胞数。如上描述的细胞裂解的方法对于检测20 细胞 µl-1是足够灵敏的，并提供了简单有效的方法在很多应用中用于检测和列举在微流体装置中的细胞，包括在资源有限的地区HIV患者的CD4细胞计数的测量。
阻抗频谱法通常在大的细胞群上进行，所述细胞通常是混合型的。在其他细胞的悬液中的CD4+细胞的分析因此不可能使用该方法。CD4+细胞可被固定在基质上并通过显微镜计数，但其不是很可靠。
虽然细胞分离方法背后的原理可容易地适于临床应用的宽谱，但是检测这些分离的细胞仍旧是需要解决的技术挑战。
发明内容
本发明的实施方案的目的是提供好的用于鉴定和计数表达特定标志物的颗粒的方法和装置 ，所述颗粒例如细菌、病毒、非生物颗粒或细胞，例如血细胞。根据本发明的实施方案的好的方法和装置是精确的，因为鉴定的表达特定标志物的颗粒的数量可被精确地测定。另外根据本发明的实施方案的好的方法和装置也可被用在资源匮乏的地区而不在那里受限制。应用的其他范围包括用于普通分析和鉴定表达不同标志物的不同细胞的PoC装置。
上述目的通过根据本发明的方法和装置来完成。
本发明提供了一种通常的方法和装置，用于鉴别、鉴定和计数表达特定标志物的颗粒，在具体的实施方案中是血细胞，所述标志物例如是特定的抗原标志物。这通过使用阻抗标记联合复频（两个或更多频率）阻抗细胞计数来获得，任选地用于疾病的诊断。
在第一方面，本发明提供用于鉴定和计数表达特定标志物或其他抗体的颗粒的分析方法，所述颗粒例如细菌、病毒、非生物颗粒或细胞，例如血细胞。仅作为实例，所述方法可被用于鉴定和计数血液中的CD4+T淋巴细胞，所述方法包括：
获得悬液中的颗粒样品，例如包含血细胞的血液，
用阻抗标记物标记表达特定标志物的颗粒，例如血细胞，和
使用复频系统测量被标记的样品以鉴别至少表达特定标志物的被标记的颗粒。
根据本发明的实施方案的方法的优势是允许快速、廉价并简单的分析，例如全血细胞分析（全血计数）可在几分钟内进行。根据本发明的实施方案的方法可被常规地用于临床实践。仅有限量的样品，例如血液，是需要的，因为所述分析在单独的颗粒（或单独的颗粒/标记物复合物）上而不是在大量的颗粒群上进行。为取得计数事物的预先确定的数量，特定的样品量，例如血液，必须被使用。根据本发明的实施方案的方法不改变样品滴中颗粒的数量，例如血液滴中的细胞数。但是，本领域系统的情况使用在4ml管中的静脉穿刺血，因为其被用于大的中心实验室，并且所述4ml管是样品如何被送到实验室的。根据本发明的实施方案，所述方法可被用于微流体装置中，所述微流体形式允许整合样品制备，其又能够即时使用，因此允许立即使用样品无需将其储存。刺破指尖取的血中包含足够的细胞使计数有统计意义的事实允许使用仅刺破指尖取血而不是4ml管。
在根据本发明的实施方案的分析方法中标记表达特定标记物的颗粒可在微流体系统中进行。在具体的实施方案中，所述方法可被用于例如微流体系统中的血液细胞。所述细胞仅需要被加入到微流体系统中，裂解和标记可被顺序地完成。
在根据本发明的实施方案的分析方法中，测量被标记的样品以鉴别至少表达特定标志物的被标记的颗粒的步骤可包括使所述被标记的样品分离为包含单个颗粒的液滴，至少在第一频率和第二频率可选地在多于两个频率测定所述单个颗粒的阻抗，所述第一频率低于第二频率，将在第一较低频率的阻抗与不透明度关联，所述不透明度被定义为第二较高频率阻抗与第一较低频率阻抗的比值，以及从该关联鉴别至少表达特定标志物的被标记的颗粒。
在根据本发明的实施方案的分析方法中，标记样品可包括使所述样品与用针对所述特定标志物的抗体包被的珠子温育。
根据本发明的实施方案的方法可进一步包括在测量被标记的样品之前进行裂解步骤。这样的裂解步骤允许更容易地鉴别表达特定标志物的细胞。特别有优势的是裂解步骤可在微流体装置中进行。在所述样品是血液的情况下，所述裂解步骤可包括红细胞裂解步骤。这样的红细胞裂解步骤可包括使所述血液样品暴露于皂苷的有机酸溶液。
在本发明的实施方案中，测量所述被标记的样品可在样品流中进行，例如在微流体装置中。
在第二个方面，本发明提供根据本发明的实施方案的方法用于鉴定和计数样品中的颗粒的用途。在第二个方面的具体实施方案中，本发明提供根据本发明的实施方案的方法用于检测和计数CD4+T淋巴细胞的用途。这样的计数是有优势的，因为其帮助诊断HIV。在本发明的实施方案中单独的CD4+ 细胞的数量是从单个细胞的阻抗信号中估计出的。
在第三个方面，本发明提供用于鉴定和计数表达特定标志物的颗粒的装置，所述装置包含用于包含样品流的微通道（所述样品流，例如悬液中的颗粒，包含表达特定标志物的被标记的颗粒）；至少一对电极，电子电路，例如函数发生器（function generator），用于将至少在第一频率的第一AC信号和至少在第二频率的第二AC信号应用至所述至少一对电极，所述第一频率低于第二频率；及计算单元，用于测定所述电极对之间存在的颗粒的阻抗，所述计算单元被配置为适于测定至少在第一较低频率和第二较高频率的所述颗粒的阻抗，适于将在所述第一较低频率的阻抗与不透明度关联，所述不透明度被定义为所述第二较高频率阻抗与所述第一较低频率阻抗的比值，以及适于从该关联鉴别至少表达特定标志物的被标记的颗粒。
根据本发明的实施方案的这样的装置与现有技术不同，现有技术中表达特定标志物的颗粒，例如血细胞，是被固定在固定的基质上的，因此微通道不包括样品流。
根据本发明的实施方案的装置可另外包含被配置为适于发挥参考电极的功能的第二对电极。
根据本发明的实施方案的装置可另外包含放大器电路，被配置为适于对在电极对中的一对之间存在的颗粒进行微分测量。这样，提供了微流体单个细胞阻抗细胞计数器，能够进行微分计数，例如在所述样品是血液样品的情况下，对白细胞微分计数。
在根据本发明的实施方案的装置中，微通道可被配置为适于接收悬液中的颗粒流并适于将所述悬液中的颗粒流导向所述至少一对电极之间，以鉴定和计数在悬液中的颗粒流中那些表达特定标志物的颗粒。
在根据本发明的实施方案的装置中，所述低频测量能力可被扩展以便允许通过修改用于标记颗粒的功能化珠子的阻抗性质检测存在于样品中的生物颗粒，例如DNA、病毒、蛋白质等。
根据本发明的实施方案，微流体装置可被缩小规模到允许检测生物颗粒，例如DNA、病毒、蛋白质等，与功能化的纳米尺度的珠子的结合。
本发明的实施方案的优势是其可被用于CD4+ T淋巴细胞的计数。本发明的实施方案的优势是其便于操作、快速、精确并且廉价。
本发明特别并优选的方面在所附的独立和从属权利要求中陈述。从属权利要求中的特征可与独立权利要求的特征和其他从属权利要求的特征组合，其为恰当的并不仅仅在权利要求中明确陈述。
参考下文中描述的实施方案，本发明的以上及其他方面将是显而易见的并被说明。
附图说明
图1为根据本发明的实施方案的微阻抗细胞计数器系统的示意图，实现双频阻抗测量。
图2（a）为根据本发明的实施方案的阻抗检测系统的简化的示意图，其显示了微分检测系统。左侧的电极对说明电极之间没有细胞的等效电路模型（ECM），右侧的电极对在电极之间有细胞存在。图2（b）说明了聚合体珠子和近似大小的细胞之间的典型的频率依赖性阻抗幅度信号的对比。
图3提供了实验数据，显示对于（a）5.62µm直径的乳胶珠子和（b）MACS纯化的T淋巴细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞群，阻抗幅度（magnitude of the impedance）相对于频率。每一个点包含约1500个事件并显示测量数据的均值和标准差。虚线显示PSpice电路模拟，将用于含有细胞（或珠子）的检测区域的等效电路模型与微分的放大电子技术结合。
图4（a）是散点图，显示了对于T淋巴细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞和5.62µm直径的乳胶珠子群的混合物，不透明度（|Z| @ 1707 kHz / |Z| @ 503 kHz）相对于低频（503 kHz）阻抗幅度的绘图。
图4（b）显示低频阻抗幅度的柱状图。
图4（c）显示不透明度的柱状图。
图4（d）说明相同样品的FACS分析，显示了细胞（无珠子）的前和侧散射性质。
图5（a）到（c）是FACS散点图，显示了荧光标记（抗-CD14-FITC和抗-CD16- Alexa700）的皂苷/甲酸处理的全血的荧光和前光散射性质。所有事件在FSC信号上触发，细胞群根据其荧光信号被鉴定。
图5（d）到（f）为（相同样品的）散点图，显示荧光和如用微阻抗细胞计数器测量的低频（503 kHz）阻抗幅度性质。数据显示两个系统都可清晰地分辨（resolve）嗜中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞三个细胞群。
图6（a）为散点图，显示对于皂苷/甲酸处理的全血和7.18µm直径的乳胶珠子群，不透明度（|Z| @ 1707 kHz / |Z| @ 503 kHz）相对于低频（503 kHz）阻抗幅度。
图6（b）显示低频阻抗幅度的柱状图。单独群的数据符合正态分布（灰色曲线）。
图6（c）显示了不透明度的柱状图。单独群的数据符合正态分布（灰色曲线）。
图6（d）是相同样品的FACS分析，显示了细胞（无珠子）的前和侧散射性质。
图7说明用皂苷/甲酸裂解溶液处理后的白细胞的典型微分散点图。图中的椭圆说明二维高斯概率分布和相应的淋巴细胞、单核细胞和粒细胞群是从这些概率分布中获得的。在此微分散点图中的数据如图8中被分析。
图8说明作为从参考全血分析器中获得的测量的函数的相应WBC分布的相关性。从根据本发明的实施方案的阻抗细胞计数器和参考装置中获得的结果间的协方差因素在图例中说明。对一个样品，相同的实验重复5次，每次准备新的裂解产物和完全干净的芯片。
图9显示CD4+群如何由于用抗体包被的珠子标记来鉴定。淋巴细胞和单核细胞在阻抗图上被清晰地鉴别。
图10和图11显示了来自实验数据的实例。图10显示了标记前的淋巴细胞和嗜中性粒细胞的图。图11显示了用CD4抗体功能化的珠子标记后的血细胞图。
图12为裂解的全血和与CD4珠子温浴的裂解的全血的FACS散点图。椭圆显示了带有附着的乳胶珠子的CD4+T淋巴细胞群的位置。
图13显示了来自裂解的全血样品的FACS数据，所述全血用荧光抗体（抗CD4和CD14）标记并与CD4珠子温浴。
图14为不透明度（|Z| @ 10007 kHz / |Z| @ 503 kHz）对低频幅度（503 kHz）的IS散点图，显示了不同的群。
图15显示根据本发明的实施方案的阻抗微细胞计数器的校准数据。
附图仅为示意而非限制性的。在附图中，为了说明的目的，一些元件的大小可被夸大或未按照比例绘制。
权利要求中的任何参考标记不应作限制所述范围解释。
在不同的附图中，相同的参考标记涉及相同的或类似的元件。
具体实施方案
在一方面，本发明提供廉价的简单阻抗流式细胞计数分析方法结合阻抗标记的应用以鉴定和计数表达特定标志物的细胞，例如血细胞，例如以鉴定和计数人类血液中CD4+T淋巴细胞。
下文中将给出鉴定和计数血液中CD4+T淋巴细胞的具体实施方案的详细描述；但是本发明不局限于此而包括了通常的颗粒鉴定、鉴别和计数，所述颗粒可包括（非穷尽的列出）细菌、病毒、非生物颗粒、细胞、解离的组织、病毒附着的纳米珠子。
通常地血液和具体地人类血液，包含血细胞，其可归入以下三类中的任意一类：用于运输氧气到身体组织的红细胞（red blood cells 或erythrocytes），用于产生抗体以防护机体对抗感染和外源材料的白细胞（white blood cells 或leukocytes），用于血液凝结的血小板或凝血细胞。所述三类血细胞悬浮在血浆中。血浆中有90%的水，血浆组成约55%的血液体积并包含多种蛋白（例如白蛋白、纤维蛋白原、球蛋白和其他凝结蛋白）。
存在5种不同且多样的白细胞类型：嗜中性粒细胞（40-75%的白细胞）、嗜酸性粒细胞（0-7%的白细胞）、嗜碱性粒细胞（0-1%的白细胞）（这三类被归到粒细胞名下）、淋巴细胞（20-45%的白细胞）和单核细胞（3-11%的白细胞）。血液中白细胞的数量通常是疾病的指示。通常在一升血液中有4x109到1.1x1010白细胞。
淋巴细胞包括自然杀伤细胞（NK细胞）、T细胞和B细胞。T细胞和B细胞的功能是在被称为抗原呈递的过程中识别特异性的“非自身”抗原（细菌中的抗原）。一旦T细胞和B细胞鉴别了入侵者，其产生特异性的反应，被调整以最大程度地消除特异性病原体们或病原体感染的细胞。当B细胞中和外源目标如细菌和病毒时，B细胞通过产生大量抗体对病原体产生应答。应答病原时一些称为辅助T 细胞的T细胞产生引导免疫应答的细胞因子，同时其他称为细胞毒性T细胞的T细胞产生引起病原体感染的细胞死亡的毒性颗粒。
分化簇，也称为指定簇，并通常缩写作 CD，是用于鉴定和研究白细胞上存在的细胞表面分子的方法。约有250种不同的CD蛋白质。所述CD系统通常用作细胞标志物，允许根据其表面上存在的什么分子来鉴定细胞。这些标志物通常被用于将细胞和特定的免疫功能关联。
使用不同的方法包括流式细胞术，CD分子被用于细胞分类中。细胞群通常使用“+”（阳性）或“-”（阴性）符号来定义以指示某些细胞部分是否表达或缺乏CD分子。两种通常使用的CD分子是CD4和CD8，其通常分别用作辅助和细胞毒性T细胞的标志物。人类免疫缺陷病毒（HIV）结合辅助T细胞表面上的CD4和趋化因子受体以获得进入。血液中CD4和CD8 T细胞的数量通常用于监控HIV感染的进程。
HIV感染导致拥有CD4受体的T细胞数量逐渐减少。因此，医疗人员参考CD4的量以决定何时开始HIV感染患者的治疗。CD4测试测量在其表面表达CD4受体的T细胞的数量。正常的血液值是大于1×109/L。结果通常以每微升血液的细胞数表达。当CD4量达到低值，约200-350细胞每微升时，患者通常进行治疗。
流式细胞术是用于研究，例如计数、分类和检查显微颗粒（例如细胞，悬浮在流体流中）的化学和/或物理性质的技术。
本发明的实施方案利用流式细胞术进行阻抗频谱。
图1显示了根据本发明的实施方案的单细胞分析系统10的图表。提供了微流体装置11，包含微通道12，细胞13通过其中流动，所述细胞被悬浮在悬浮的流体中。这与现有技术分析系统不同，现有技术中细胞被固定在固定的基质上用于计数。第一对微电极14被制作于通道12中，并且这些与小的信号AC电压相连，所述小的信号AC电压由函数发生器15产生。该施加的电压和所述测量的流经微电极14之间的微通道12的电流的比值被用于测定通过微电极14之间的单细胞13的电阻抗。
如图1和图2所示，两对电极14、16被用于定义两个相近位置的检测体积，并都与相同的函数发生器15相连接，因此接收相同的AC电压，以便在单独的细胞13上进行差异测量。所述第一对电极14测量了来自所述细胞13的电信号，同时所述第二对电极16作为参考并测量来自所述含有悬浮流体但无细胞13存在的微通道12的信号。所述电信号可使用定制的电子学仪器测量。这种双重测量方法显著降低测量噪音和漂移，所述噪音和漂移可由悬浮流体的温度或组成变化引起。
在使用中，使用注射泵（未图释），将在悬液中的细胞13泵抽通过微流体装置11的微流体通道12，以预先设定的速度，例如约每秒100个细胞13的速度进行。当细胞13通过通道12时，它们扰乱检测体积的电场，因此随后产生正信号（当细胞13通过第一对电极14时）和负信号（当细胞13通过第二对电极16时）；这些信号被加工以提供阻抗。在测量的信号的两个峰值（正和负）之间的时间相当于细胞13在述电极14、16之间的通过时间。根据本发明的实施方案，高速阻抗分析在两个同时发生的频率上进行并且从系统10中获得的数据使用在分析装置18上运行的分析软件分析。分析装置18可包含计算单元，用于测定电极对之间存在的血细胞的阻抗，计算单元被配置为适于测定在第一频率和第二频率的血细胞的阻抗，适于将在第一频率的阻抗与不透明度关联，所述不透明度为高频阻抗与低频阻抗的比值，以及适于从该关联鉴别至少表达特定标志物的被标记的血细胞。
在悬液中的细胞13的电介质性质用麦克斯韦混合物理论描述，其特征为异质系统的等效复介电常数与单独颗粒和悬浮介质的性质之间的关系。
对于介质中的球形颗粒（例如细胞13）的悬液，混合物的等效复介电常数εmix通过下式给出：
Figure 792275DEST_PATH_IMAGE001
其中
Figure 974994DEST_PATH_IMAGE002
和和
Figure 681099DEST_PATH_IMAGE004
分别是悬浮介质和细胞13的复介电常数。Ф是体积分数，例如细胞13的体积和检测体积的比例。该模型基于细胞13是固体均质物体的假设。其可使用壳层模型被扩展到生物细胞的情况，所述模型将颗粒作为由薄膜包围的均质物体处理。现在
Figure 26630DEST_PATH_IMAGE005
通过下式给出：：
Figure 849092DEST_PATH_IMAGE006
其中
Figure 647284DEST_PATH_IMAGE007
和
Figure 908501DEST_PATH_IMAGE008
分别是细胞膜和细胞内部（细胞质）的复介电常数。R是细胞的半径，d（d<<R）是膜的厚度。
混合物理论描述在低体积分数Ф < 0.2，例如Ф < 0.1的细胞混合物的行为，并被用于模拟位于第一对测量电极的两个测量电极14之间的单个细胞13的电介质性质。如果系统的几何学参数是已知的（电极大小、通道直径等），那么介电常数的值和所述系统的传导率可用等效电组件（electric components）代替。
在悬液中的细胞13的简化的等效电路模型（ECM）在图2（a）中显示。所述无细胞的介质的阻抗由电阻器（Rm）和电容器（Cm）的并联表示，如图2（a），左侧。在所述电极14之间含有细胞13，电路被修正，如图2（a），右侧。细胞13具有薄的绝缘膜并作为电容器（Cmem）运转。Rcyto是细胞质的等效电阻。Cdl代表液体电极界面处的电双层电容。
ECM中的组件值通过所述细胞13的电介质性质（膜电容和细胞质电阻）、悬浮介质的传导率和介电常数及体积分数来鉴定。控制所述系统的行为的等式在下文中详细描述。
对于保持在两个平面电极14之间的细胞13和低体积分数Ф（例如< 10%），单独的电组件可如下表示：
Figure 577380DEST_PATH_IMAGE009
Figure 101902DEST_PATH_IMAGE010
Figure 387390DEST_PATH_IMAGE011
Figure 932858DEST_PATH_IMAGE012
其中
Figure 456243DEST_PATH_IMAGE013
在此等式中，κ是阻抗感应区域的几何细胞常数，用考虑到不均匀电场的施瓦茨-克里斯托费尔映射方法求解。h是微流体通道12的高度，w是宽度，以及l是所述电极14的长度。K（k）是第一类的完整椭圆积分，K’（k）是互余积分，k是椭圆函数的系数。
在这些等式中。体积分数
Figure 924451DEST_PATH_IMAGE015
通过下式给出：：
Figure 465154DEST_PATH_IMAGE016
也
Figure 374204DEST_PATH_IMAGE017
Figure 506108DEST_PATH_IMAGE018
其中Cmem是比膜电容（电容每单位区域），d是膜的厚度，ε∞是在无限频率的介电常数，
Figure 969450DEST_PATH_IMAGE019
和
Figure 845002DEST_PATH_IMAGE020
分别是细胞13和悬浮介质的复介电常数。
系统的复阻抗，
Figure 608559DEST_PATH_IMAGE021
，成为：
Figure 911364DEST_PATH_IMAGE022
由于在电极-电解液界面上的电双层，悬浮介质中的电场也随频率改变。在此工作中电双层被简单模拟为理想电容器（Cdl）。
电路（包括双层）的总阻抗是：
Figure 862003DEST_PATH_IMAGE023
细胞13的电介质参数的通常值为：
εo = 8.854×10− 12 Fm-1，d = 5nm，εm = 80 εo，σm = 1.6 Sm-1，εmem = 11.0 εo，σmem = 10− 8 Sm-1，εi = 60 εo，σi = 0.6 Sm-1。在所述模拟中，细胞参数的实际值从表1中取得。所述微流体装置11的通常的几何学尺寸为w = h = l = 20 µm。实际值从单独的微流体装置的测量中获得。
从上文中可以看出，低频阻抗由所述细胞膜（Cmem） 控制。当施加场的频率上升时，此电容器变为短路的并且细胞表现为电阻器（Rcyto），具有与细胞质传导率成比例的值。细胞质的容抗对高频应答具有很小的影响并被忽略。
上述等式被用于计算所述悬液形式的单细胞13的电阻抗。用PSPICE进行完全的电子电路分析。模型包括微流体装置11、电双层、在悬浮介质中的细胞13和放大器电路17的组件的电学性质。图2（b）显示了任意细胞13 和乳胶珠子（类似大小的）的阻抗大小如何随频率变化。在低频下，系统由电双层控制。在1 MHz 到10 MHz的频率范围内，细胞13的阻抗迅速降低，由于细胞膜（Maxwell-Wagner）界面弛豫（在电介质谱中此现象被称为β散射）。对珠子测量不到这样的驰豫并且阻抗保持基本恒定。对于细胞13，在较高频率上，电路的性质由细胞质阻抗也由电路的寄生电容控制。图2（b）显示了膜电容对于在1到3MHz区域内的应答具有极大影响。
为了表征不同白细胞亚群和测定鉴别用的最佳频率，纯化的T淋巴细胞、单核细胞和嗜中性粒细胞的频率依赖性阻抗被测量。
嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞被一起分组为粒细胞，因它们作为一个组被检测。所述嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞占小的百分比并需要特殊技术以单独鉴定和列举。在每一种情况下，5.62 µm直径的乳胶珠子的样品的性质也作为参考被测量。
纯化的细胞13群和/或乳胶珠子（悬浮在生理盐水、PBS（磷酸盐缓冲液）中）流过所述细胞分析系统10的微流体装置11并且在几个不连续的频率记录所述阻抗的大小。图3（a）显示了作为频率的函数的5.62 µm直径的乳胶球体的阻抗大小。所述数据通过同时应用所述电极14、16的两个频率获得。第一频率（所述参考）保持在503 kHz。所述低频基本上作为DC。503kHz是优选值，100kHz到800kHz是好的，以及达到1MHz的DC也可以工作，同时第二频率在500kHz到50MHz之间不连续的频率上变化。图3（a）中的每一个数据点是约1500个单独事件的阻抗信号值的平均值和标准差，其在对于第二频率的特别频率值上测量。图3（a）显示的完整的数据集是5.62 µm珠子的平均频率依赖性阻抗。每一个测量集（1500个珠子）占用约2分钟；图中有14个数据集，完整的谱占用30分钟去读取。珠子的通过时间是约1ms（60 mm/sec的颗粒速度）。当每一个珠子通过电极14、16时，双极电压信号被记录。此信号被加工以提供平均峰值；无进一步的信号加工被应用到数据上。
图2（b）显示来自所述PSPICE模型的数据，其使用带有60 pF的双层电容Cdl的等效电路，并且包括多个放大器（从制造商处获得）的转移函数。拟合（虚线）用PBS（磷酸盐缓冲液）悬浮介质中的2.5 εo的珠子介电常数、0.36 mS/m的传导率（表面传导率=1.2 nS）来计算。数据通过等效电路模型很好的描述。
三个白细胞亚群的频率依赖性质以相同的方式测量，如图3（b）中说明的。也显示了用等效电路进行的PSPICE模拟，用获自Yang J., Huang Y., Wang X-B., Becker FF. and Gascoyne, PRC (2000), “Differential analysis of human leukocytes by dielectrophoretic field-flow-fractionation”, Biophys J. 78:2680-2689的电介质参数，如表1中总结的。
表1
直径(μm) 膜电容 (mF/m2) 细胞质传导率 (mS/m) 细胞质介电常数
淋巴细胞 6.58±0.7 10.5 ± 3.1 0.65±0.15 154.4±39.9
单核细胞 9.26±0.72 15.3 ± 4.3 0.56±0.1 126.8±35.2
粒细胞 9.42±0.46 11 ± 3.2 0.6±0.13 150.9±39.3
表3（b）中的数据显示了随细胞大小而变化的阻抗大小的变化，特别是在低频（例如所述503kHz参考频率）。由于膜电容不同而引起的变化也很明显。T淋巴细胞比单核细胞或嗜中性粒细胞小很多，可根据大小被单独鉴别出。表1显示了单核细胞和粒细胞（包括嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞）具有类似的大小并且根据低频阻抗的大小不易区分。但是它们的膜电容是不同的，意味着在中频带（参考图2（b））区分是可能的。PSPICE拟合（虚线）确认了这点，其中单核细胞和嗜中性粒细胞的阻抗间的最大区别是在1到3MH窗口中。实验测定的阻抗的平均值也表明鉴别单核细胞和嗜中性粒细胞在此频率窗口是可能的。但是在这些细胞的大小和膜电容分布存在较大范围，因此所述鉴别不是直截了当的。
从图3中，清楚的是基于大小鉴别的最适频率是约500kHz。在1到10MHz的范围内膜电容的差异占主导。为测定鉴别的潜力，细胞的阻抗分析通过以等效比例混合纯化细胞（在缓冲溶液中，例如包含0.5% BSA（牛血清白蛋白）和2mM EDTA（乙二胺四乙酸）的PBS）来进行。测量同时使用两个探针频率来进行，低频和高频，例如503 kHz和1.707 MHz。
为了独立地确认，单核细胞和嗜中性粒细胞用荧光标记物标记，例如对于单核细胞用FITC偶联的抗CD14的抗体及对于嗜中性粒细胞用Alexa700偶联的抗CD16的抗体。荧光信号鉴别每个细胞并确保测量的阻抗信号和细胞表型的关联。
图4显示来自三种不同的细胞类型（T淋巴细胞、单核细胞和嗜中性粒细胞）的混合物和5.62 µm直径珠子的数据。在此图中阻抗以不透明度（|Z|@ 1707kHz /|Z|@503kHz）对低频阻抗（|Z|@503kHz）的散点图来展示。不透明度是高频对低频阻抗的比例，并提供独立于细胞大小的参数，因此反应细胞膜中的变化。所述单核细胞和嗜中性粒细胞群是根据所述荧光由颜色标记的。在图表中，不同的细胞群被“最适椭圆”围绕。所述散点图（图4（a））显示T淋巴细胞基于大小（低频阻抗）可被从包含单核细胞和嗜中性粒细胞的群中鉴别出来。也显示了低频阻抗大小（图4（b））和不透明度的柱状图（图4（c）），同从所述相同样品在商用流式细胞仪（FACSAria, Becton Dickinson）（图4（d））测量的数据绘制成侧散射（SSC），相对于正散射（FSC）的粒度测量，与细胞大小粗略地成比例。发现在低频阻抗数据（大小）和FSC（表2）之间存在好的关联。
表2
阻抗散点图（图4（a））和柱状图（图4（b）和图4（c））的分析显示了纯化及重新混合后的单核细胞和嗜中性粒细胞之间显著的重叠，暗示了没有细胞的进一步修饰，明确的鉴别将不可能。
全血中，相对于上文中指出的纯化的群，白细胞的化学修饰可被用于增强电信号及帮助鉴别白细胞亚群。例如将全血暴露于裂解试剂，其有效地改变，在选择性的基础上，复杂血液样品中一种或多种细胞的要素到一个程度，该程度对于允许后来的分离、鉴定和/或感兴趣的细胞要素的分析是必要的。这样的裂解试剂的例子例如可以是皂苷的有机酸（甲酸）溶液，全血可以暴露于所述溶液小段时间（<10秒），并且所述溶液修饰白细胞的性质，改变细胞体积及细胞膜特征。其他裂解试剂可被用于破坏红细胞。其他裂解试剂例如在US-5155044和US-4485175中描述的。在全血中分析白细胞的传统技术通常（但不总是）需要某些形式的预处理以裂解红细胞。作为本发明的实施方案，已发现将全血暴露于皂苷能够如之前报道地裂解红细胞并修饰白细胞群以改进其鉴别。
在荧光标记嗜中性粒细胞（例如用抗CD16- Alexa700）和单核细胞（例如用抗CD14-FITC）后，全血（50μl）被暴露于皂苷的甲酸溶液（0.12% v/v 甲酸，0.05% w/v皂苷）6秒，随后淬灭（0.6% w/v碳酸钠，3 % w/v 氯化钠）并在根据本发明的实施方案的阻抗细胞计数器和本领域已知的流式细胞仪（FACS）上分析。如图5（a-c）所示，皂苷/甲酸处理既去除了红细胞又允许单核细胞、嗜中性粒细胞和淋巴细胞被鉴定。图5（d-e）显示了从根据本发明的实施方案的阻抗细胞计数器来的相似的数据，带有触发低频信号（503kHz）的振幅和根据荧光信号伪彩的每一个事件。这些数据集的事件的数量在表2中总结并与FACS数据相关联。
图6显示了根据本发明的实施方案的对于皂苷处理的全血的散射数据，（群，和由“最适椭圆”围绕的每一个类型，便于说明）带有从图6（d）中之前领域的FACS中来的SSC和FSC数据。图6（a）的阻抗图显示三种不同细胞类型（淋巴细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞）可基于二重频率测量被明确地鉴定。FACS和阻抗细胞计数器两者的细胞计数类似并代表全血中发现的比例（表2）。这些数据用三个不同患者的样品重复三次。
皂苷处理细胞的精确的作用是未知的，但图4（a）和图6（a）的比较显示皂苷处理导致细胞大小分布上的下降（阻抗在503kHz）。细胞大小的变化评估可从低频阻抗中获得。所述系统首先被校准以允许血细胞明确的大小分析。所述系统用三种不同大小（5.8 µm、7.18 µm和9.52 µm）的乳胶珠子校准。三种大小的乳胶珠子（5.8 µm、7.18 µm和9.52 µm-在图15中以黑色正方形绘图）被混合并悬浮于皂苷/甲酸处理的全血中。所述样品在根据本发明的实施方案的阻抗微细胞计数器系统上运行，在与全血实验（图5和图6中所示数据）相同的的条件下。数据在图15中显示，其中所述珠子群的平均值和标准偏差以珠子大小对低频（503kHz）信号幅度绘图。二次多项式作为矫正曲线被拟合至珠子数据。从图5和图6的全血数据中获得的平均信号幅度随后与校正曲线被用于评估淋巴细胞、单核细胞和嗜中性粒细胞的细胞大小。这些矫正数据被用于依大小排列白细胞，结果在表1中总结。可以看到的是细胞的平均大小中有很小的变化但单核细胞和嗜中性粒细胞群的分布的变化降低了。
比较图4（a）和图6（a）也显示了作为所述皂苷处理的结果单核细胞和嗜中性粒细胞群相对着彼此移动，因此能够清晰地鉴别和鉴定这两个群。在皂苷处理后 ，单核细胞群的不透明度相对于其他细胞下降了约5%。单核细胞的膜电容的等效变化被计算（用PSPICE），并与15 mF/m2到19 mF/m2的上升相符。在补充实验中，单核细胞（磁性纯化的，Miltenyi-Biotec MACS）的膜电容使用电旋转分析被测量并发现上升了16 ± 2 mF/m2(12个未处理的细胞) 到19 ± 3 mF/m2（皂苷/甲酸处理的细胞）。此不同反映了在皂苷处理了全血后单核细胞的变化，所述变化用根据本发明的实施方案的阻抗细胞计数器测量。在任一情况中， 暴露于皂苷/甲酸后细胞的平均半径没有显著地变化；主要改变的是不透明度，由于改变了细胞膜结构。
为了进一步评估根据本发明的实施方案的微流体装置用于微分的血液计数，从志愿者处取得的样品用商用血液分析设备和根据本发明的实施方案的微阻抗分析器测量。经过10天的过程，7个单独的静脉血液样品从不同的志愿者（n=7）中获得。取两瓶血液，一瓶用于实验，第二瓶送到医院（Mount Alvernia, Guildford UK）在Horiba-ABX Pentra DX 120机器上做独立的全血计数分析。图7显示了一个样品的散点图。用最大似然法，三个分布被鉴定并符合二维高斯概率分布。图中的椭圆说明这些分布。相关的淋巴细胞、单核细胞和粒细胞群从这些概率分布中获得。
图8显示相对的WBC分布和从Horiba-ABX Pentra来的数据之间的相关性。单核细胞是最少量的细胞种类，占5%-20%的部分。粒细胞（主要是嗜中性粒细胞）占40%-80%的部分。相对分数的范围覆盖了显著的部分，但不是所有的临床范围。例如，正常的临床粒细胞范围是20%-90%。从阻抗细胞计数器和参考装置中获得的结果的协方差（CV）因数在图例中说明。为提供实验变化的测量，所述一个样品的实验重复5次，每次制备新的裂解物并使用干净的芯片。此结果在图8 中用十字表示。从图中看出，根据本发明的实施方案的阻抗细胞计数器和商用全血分析仪之间的相关性在95% 的范围内。
根据本发明的实施方案的用于鉴定和计数表达特定标志物的血细胞（例如用于鉴定和计数人类血液中CD4+T淋巴细胞）的分析方法可包括：
获得血液样品，
用阻抗标记物（例如电介质标记物）标记血液样品中的这些表达特定标志物的血细胞，例如标记血液样品中的CD4+T淋巴细胞，
使用复频例如双频系统测量被标记的血液样品以鉴别至少表达特定标志物的被标记的血细胞，例如，鉴别至少被标记的CD4+ T淋巴细胞。
根据本发明的实施方案，测量被标记的样品以鉴别至少表达特定标志物的被标记的血细胞（例如被标记的CD4+T淋巴细胞）的步骤可包括
使所述被标记的样品分离为包含单个细胞的液滴，
测定在第一频率所述单个细胞的阻抗，及
测定在第二频率所述单个细胞的阻抗，所述第一频率低于第二频率，将在第一较低频率的阻抗与不透明度关联，所述不透明度为第二较高频率阻抗与第一较低频率阻抗的比值，从该关联鉴别至少表达特定标志物的被标记的细胞，例如鉴别至少CD4+ T淋巴细胞。
标记表达特定标志物的细胞，例如标记CD4+T淋巴细胞，可包括用抗体包被的珠子标记它们，例如CD4+ 抗体包被的珠子，例如从Beckman Coulter 可得到的商售试剂盒Manual CD4 Count 珠子，Coulter CD4 Cyto-spheres Reagent。标记颗粒，例如细胞，目的在于根据颗粒大小的变化鉴别。珠子包含到系统中导致噪音小量上升。噪音的幅度与当血小板存在时所见的相似。此噪音信号易于屏蔽，由于用3部分微分测量。
根据本发明的实施方案的方法和系统仅需要很少的从指尖取得的血液样品及最小限度的样品制备，这些可任选地自动化。这样可包括全血与抗体包被的珠子例如CD4+ 抗体包被的珠子（从制造商例如Beckman Coulter处获得的）温浴例如2分钟。在给定的具体实施例中，CD4+抗体标记T淋巴细胞亚群和单核细胞亚群。可进行红细胞裂解步骤，例如使用去垢剂的自动的红细胞裂解步骤，例如使用皂苷/甲酸或2%乙酸的蒸馏水溶液。所述皂苷/甲酸裂解试剂具有不导致明显噪音的优势，由于其不会引起RBC碎片的存在。
因此处理的样品可被直接导入细胞分析系统10的微流体装置11，无需任何其他预备的步骤。
如上所述，CD4+抗体标记T淋巴细胞亚群和单核细胞。但是，HIV的诊断需要精确计数仅CD4+ T淋巴细胞亚群。根据本发明的实施方案这容易达到，因为CD4+标记的T淋巴细胞和CD4+标记的单核细胞在不透明度对低频阻抗散点图上被很好地与所有其他细胞及彼此间区分开。此方法的原理在图9中显示。图9显示CD4+群如何由于用抗体包被的珠子标记而被鉴定。在阻抗图上淋巴细胞和单核细胞被清晰地鉴别。
本发明的实施方案的优势是通过运用双频阻抗谱方法，在血液样品上（其中表达特定抗原标志物的血细胞被用电介质标记物标记），CD4+T淋巴细胞和CD4+单核细胞可被同时鉴别和计数。
根据本发明的实施方案，测量所述样品使用双频系统进行以计数单核细胞、淋巴细胞和嗜中性粒细胞。精确的诊断通过计数CD4+ 细胞进行，所述CD4+细胞作为明显的群可被容易地鉴定，因为其可被电介质地标记。在本发明的实施方案中，所述完全的CD4+计数可对全部淋巴细胞计数参照。可选地，较少精确的实施方案，所述完全的CD4+计数可对全部白细胞计数参考，所述全部白细胞计数是主要的淋巴细胞和嗜中性粒细胞的总和。
根据本发明的实施方案的装置是微流体阻抗细胞计数器，其测量单个细胞的电介质性质。
根据本发明的实施方案的双频测量能够既根据膜阻抗又根据大小鉴别细胞。使用皂苷/甲酸的全血的化学前处理可被用于从样品中去除红细胞群以提供干净的白细胞样品，其免于细胞碎片（包括红细胞血影）的污染。所述前处理也改变单核细胞和嗜中性粒细胞的电性质，改进鉴别。淋巴细胞、单核细胞和嗜中性粒细胞群可用双频阻抗数据完全明白地鉴定。在微细胞计数器和医院血液学分析仪上测量志愿者血液，显示极好的相关性。
根据本发明的实施方案的微流体阻抗细胞计数器的稳健的性质和简单性提供了在细胞分析中潜在的应用范围，包括可提供的使用无荧光标记技术的即时(PoC)检测诊断系统。系统的简单性带来的节省和在试剂成本上的下降（例如不需要荧光探针等）使它适用于资源贫乏地区例如发展中世界。另外由于细胞的电介质性质对于来自暴露于药物分子和细菌衍生的有丝分裂原和病毒产物的刺激物可以是敏感的，该技术可以在细胞周期分析和毒性/存活能力检测中找到应用。
所述系统也可以被进一步通过发展电介质标签而被精制以使带有相似阻抗性质的细胞能够被区分开（例如HIV诊断中的CD4+ 计数）。可能的是做多色荧光的等效物，即用多种CD标志物的多重检测，每一个检测使用带有不同电介质标签的珠子群（由于其具有不同材料、不同大小）。
图10 和图11显示从实验中得到的数据的实例。来自健康供体的人类血液被如上文所述地处理并用根据本发明的实施方案的阻抗细胞计数器测量。图10显示了在血液样品标记前双频阻抗测量淋巴细胞和粒细胞的结果。图11显示了在用根据本发明的实施方案的用CD4+抗体包被的珠子标记之后双频阻抗测量血液的结果。被标记的单核细胞和T淋巴细胞都被鉴别出，使简单计数能够进行并因此进行诊断。
所述方法可被用于诊断和治疗的管理。抗体的绝对值或比例（例如CD4+/CD8+）可被测定。CD4+群对CD8+ 群的比值可通过对两个群使用不同的标签来测定，例如一个是绝缘的和另一个是传导的，或不同大小的标签，其允许鉴定不同的细胞亚群。
对于AIDS患者，CD4+T细胞计数提供额外的信息，如
- 少于200/ µl：肺囊虫肺炎（PCP）
- 少于100/ µl：弓形虫病和隐球菌脑膜炎
- 少于75/ µl：鸟分枝杆菌复合体（MAC）。
实验结果 1 ：
50µl新鲜人类血液用抗CD4和CD14 的荧光抗体标记。这允许鉴定表达这些表面抗原的细胞亚群。CD14存在于单核细胞表面，CD4在T细胞的亚群（诱导T细胞）的表面也低水平存在于单核细胞表面。
细胞也用CD4包被的珠子标记。所述荧光抗体标记和珠子偶联都在红细胞裂解（在皂苷/甲酸中6秒接着淬灭）之前进行。相同的样品随后用本领域已知的FACS（荧光激活的细胞分选仪）和根据本发明的实施方案的IS（阻抗频谱）分析。
图12显示裂解的全血样品的FACS数据。图12（a）是未用CD4 珠子标记的血液的散点图，图12（b）显示与CD珠子温浴的相同的血液样品。（SSC在对数级上描绘以允许便于观察到所有群）。
如这些图所示，当与CD4珠子（~2.2 um直径）复合时CD4+T细胞形成独特的群（在图12（b）中标出），并且SSC信号上升超过粒细胞的信号。
图13显示了裂解的全血样品的FACS数据，所述全血既用荧光抗体标记又与CD4珠子温浴。CD4+细胞和CD14+细胞可根据它们的荧光信号被清楚地鉴定（分别在图13（b）中的区域P1和P2）。选通（gating on）这些荧光群和将FSC对SSC作图允许鉴定CD4珠子附着的细胞–图13（a）。
与珠子复合的细胞的数量可从FACS的数据中列举，FACS的数据基于所述群的荧光和散射性质。附着珠子的CD4+T细胞与无珠子的淋巴细胞群（CD4-T细胞、B细胞、NK等）不同。单核细胞上的低水平的CD4表达意味着仅小百分比的单核细胞结合CD4 珠子（参见Beckman Coulter Manual CD4 Count试剂盒数据页）。所述单核细胞形成两个群：（i）不带珠子的非常低水平低表达CD4+的细胞，表示为“单核细胞（无珠子）”及（ii）与珠子复合引起更高SSC的细胞，但是与T细胞明显不在同一水平。这是可能的，由于与T细胞相比，较少的珠子附着在单核细胞上（代表了抗原表达的水平）—参见图13（a）。
图14 显示了IS数据，根据本发明的实施方案以不透明度（10MHz/0.5MHz）对幅度（0.5MHz）作图。不同的群在散点图上明显可见。与CD4珠子复合的细胞在不透明度和大小上均有上升并形成了一个区别的群（被圈住的）。
FACS显示了当细胞与珠子复合时在FSC上的小变化（图13（a））。
表3显示了不同亚群的此数据，比较了FACS和IS。尽管在FACS和IS中总计数不同，但是比较细胞的比例是可能的。总的选通（gated）细胞计数在括号中显示。这是有代表性的一个血液样品的数据集。类似的数据在3个进一步的FACS实验（不同的血液样品）中获得。
表3
细胞类型 FACS （总% ） IS （总%）
带有CD4 珠子的T细胞 18.0 (11243/62312) 15.6 (1215/7789)
淋巴细胞（无珠子） 12.7 (7914/62312)) 12.9 (1005/7789)
带有CD4 珠子的单核细胞 0.6 (328/62312) 0.8 (66/7789)
单核细胞（无珠子） 4.3 (2695/62312) 5.4 (2695/7789)
粒细胞 64.4 (40132/62312) 65.4 (5095/7789)
所述CD4+T细胞计数是诊断HIV的重要参数；FACS和IS的比较显示百分比计数是相似的。两者之间的小误差可由于很多原因，包括选通参数、较小的样品大小、或由于沉淀在IS系统中珠子复合的细胞的损失。此实验显示使用这种方法学两种技术产生可比较的结果。
以上实验的目的是为了显示使用根据本发明的实施方案的阻抗频谱测量的CD4+T淋巴细胞和CD4+单核细胞的数量与用商用的FACS测量的CD4+细胞的数量是类似的。
实验结果 2 ：
细胞制备
血液样品从知情同意的健康供体处获得。血液（5ml）被收集到VacutainerTM管中（EDTA K3E 15%，0.12ml，Becton Dickinson）。收集之后所述血液管被放置在混合器上并在室温继续混合；所有随后的过程和实验工作在12小时内进行。
纯化的白细胞亚群
血液用密度梯度分离和磁激活细胞分选（MACS, Miltenyi Biotech, Bisley, UK）处理。抗凝全血（5ml）被小心地铺在5ml的PolymorphoprepTM（Nycomed，Zurich，Switzerland）上并在室温450 x g离心30分钟。离心后单核细胞部分（主要是单核细胞和淋巴细胞）和多形核部分（粒细胞）作为分离的带出现在梯度上并被收集到分离管中。两个细胞部分通过交替地在新鲜PBS（包含0.5% BSA和2mM EDTA）中重悬和离心沉淀（室温，400 x g，10分钟）洗涤3次以去除残留的PolymorphoprepTM和污染的血浆和血小板。
T淋巴细胞（CD3+细胞）、单核细胞（CD14+细胞）和嗜中性粒细胞（CD16+细胞）的纯化群用磁激活细胞分选（MACS）制备。单核细胞样品被分成两个部分，一份样品与抗CD3的MACS珠子温浴，另一份与抗CD14 的MACS珠子温浴。多形核细胞与抗CD16的MACS珠子温浴。所有温浴和清洗步骤根据制造商的指导进行。单独的磁力标记的细胞样品随后用AutoMACSTM分离系统（Miltenyi Biotec）分离并收集阳性细胞部分。
为评估群的纯化，样品与荧光偶联的抗体（抗CD3-FITC、抗CD14-APC（都来自Miltenyi Biotec, Bisley, UK），及抗CD16- Alexa700 （BioLegend, San Diego, California））温浴。细胞温浴30分钟接着如上清洗。在所有的情况中匹配的同种型对照品作为对照被包括。细胞样品在FACSAria （Becton Dickinson）上分析。
在用根据本发明的实施方案的微细胞计数器分析前，细胞被悬浮在 PBS（包含2 mM EDTA和0.5 % BSA）中达到～1 x 106细胞每ml的终浓度。所述纯化的细胞群被单独和作为三种细胞类型的混合物分析。所述悬浮介质是等压的、传导率1.6 Sm-1、pH = 7.4及渗透压=290 mOs。
全血分析（用皂苷 / 甲酸裂解红细胞）：
全血被收集到如上描述的抗凝血剂中。50 µl的新鲜全血和荧光偶联的CD14（FITC）和CD16（Alexa700）的直接单克隆抗体在暗处在4℃温浴15分钟。红细胞裂解通过在所述被标记的全血中加入600 µl裂解溶液（0.12% v/v甲酸、0.05% w/v皂苷）。所述样品在室温温浴6秒并不断搅拌以增强血液和裂解试剂的混合。这种裂解反应通过加入265 µl淬灭溶液（0.6% w/v碳酸钠、3 % w/v氯化钠）停止。所述样品随后不再进行进一步的处理而用FACSAria和微流体阻抗细胞计数器分析。
整合
所述样品在被稀释（1:1.4）进淬灭试剂之前，被1:13稀释到裂解溶液（如上）中6秒。最终稀释比例（关于全血）是1:18。大约25µL溶液被泵入根据本发明的实施方案的阻抗细胞计数器芯片并且数据同时在500 kHz和1.7 MHz被测量。
微芯片
芯片用光刻法和全水热压焊法制作。与芯片的电的和流体的相互联接用从PEEK聚合物加工成的连接块（connection block）制作。流体的和电的连接通过在块中夹合芯片进行。装载了弹簧的电连接器被用于构成与芯片电极和微型O环的联系，所述微型O环被用于密封块和芯片间的流体连接。所述连接器块被装置在PCB上，所述PCB具有前端阻抗检测电路。整个组装被置于x-y-z台上，所述x-y-z台在光具座上位于定做的显微镜之上，以允许排列芯片和精确定位光学检测区域和在微流体通道中的激光光点。
芯片通过将包含2%BSA和2mM EDTA的PBS流过装置30分钟来引发。这样用蛋白质包被通道和管壁以降低细胞粘附。细胞悬液样品被移液进入位于芯片进口的小池内并使用注射泵以恒定的速率被吸入装置。5 µl 每分钟的体积流速被用于整个实验工作。在实验之间，所有的设备以10%次氯酸钠和4M氢氧化钠清洗。
阻抗检测
两个在固定频率的正弦电压（一个在503 kHz及第二个在0.5 - 30 MHz @ 2.5Vpp之间变化）被用于两对检测电极（也参见图1）。微分电流用订制的电子设备和两个锁定放大器（SR844，Stanford Research Instruments, USA）测量，每一个用于一个频率。从锁定的输出油在每一个特定频率的电阻的实分量（real component）（同相的）和想象分量（imaginary component）（90º异相的）组成。输出与光电倍增管信号一起在120 kHz用16-bit A-D卡（NI6034E，National Instruments）取样，数据被捕获并用LabVIEWTM （National Instruments，USA）写的软件分析。低频同相的阻抗信号被用于触发数据的获得。所述数据被处理并绘制为散点图用于随后在MATLAB （Mathworks Inc.，Natick, USA）上分析。
光学系统
为了比较的原因，光学测量在进行电测量的同时进行。来自488nm（50mW晶体管）和633nm（20mW HeNe）激光的光用分色镜（Chroma Technologies，Rockingham，VT，USA）组合。光束用一对透镜展开并被传递进无限修正的物镜（x20，NA = 0.7，Nikon）的背面。在物镜的焦点平面上形成的点被置于穿过通道的中心。荧光通过相同物镜被收集。分色镜和带通滤波器（Chroma Technologies，Rockingham，VT，USA）在用透镜和小孔（pinhole）（100 µm，Thorlabs）空间过滤之前光谱地过滤光，所述透镜和小孔安置在光电倍增管（H7710-13，Hamamatsu）之前。电源供应器(power supply)（C7169，Hamamatsu）被用于调节PMT的增益并且信号被调节并用Hamamatsu放大器（C7319，Hamamatsu）放大。三个发射波长同时被测量，515 nm, 675 nm 和>715 nm。
流式细胞术
传统细胞流式细胞计数分析用FACSAria（Becton Dickinson）进行，所述FACSAria装备了两种激光：488nm晶体管（20 mW，Coherent® SapphireTM）和633nm HeNe（20 mW，JDS UniphaseTM）。FACSFlow鞘液（sheath fluid）（Becton Dickinson）被使用并且样品流在70 psi的压力下通过70µm的管口。设备由PC运行的FACSDiVaTM软件控制（Becton Dickinson）。
虽然本发明已经在附图和现有技术描述中被详细说明和描述，这样的说明和描述应被理解为说明性的或示例性的而不是限制性的。本发明不限于所述公开的实施方案。
例如，有可能的是以一种实施方案操作本发明，其中细胞群可被检测，例如CD3、CD4、CD8、CD14、CD16、CD19、CD21、CD45或者任何其他细胞表面受体、活化标志物。细胞可以是人类的和/或哺乳动物的。本发明的实施方案也可以被用于非哺乳动物细胞，例如细菌和酵母细胞。
其他实施例可为中性粒细胞上的CD64以检测败血症或EpCam用于检测血液中循环的癌症细胞或对于干细胞检测CD34。
在实践要求保护的发明中，从研究附图、公开内容和附加的权利要求中，对于公开的实施方案的其他变化可被本领域技术人员理解和实现。在权利要求中，单词“包含”不排除其他要素或步骤，以及不定冠词“一”或“一个”不排除复数。单独的处理器或其他单位可实现权利要求中所述的几个项目的功能。某些方法在相互不同的从属权利要求中被描述的单纯事实不表明这些方法的组合不可以用于获得优势。计算机程序可被储存/分布在适当的介质上，例如与其他硬件的部分一起或作为其他硬件的一部分的光学存储介质或晶体管介质，但是也可被分布在其他形式中，例如通过网络或其他有线或无线电子通讯系统。权利要求中任何参考标记不应被解释为限制所述范围。
以上描述详述了本发明的某些实施方案。但应理解的是，无论本文中前述的多么详细，本发明可以以很多方式实践，且因此不被限制于公开的实施方案。应注意的是当描述本发明的某些特征或方面时，具体术语的使用不应被认为是暗示所述术语在此被重新定义以受限于包括与术语相关联的本发明的特征或方面的任何特定特征。

Claims (13)

1.一种用于鉴定和计数表达特定标志物的颗粒的分析方法，所述方法包括：
获得包含颗粒的样品，
用阻抗标记物标记表达特定标志物的颗粒，使用复频系统测量被标记的样品以鉴别至少表达特定标志物的被标记的颗粒。
2.根据权利要求1所述的分析方法，其中标记表达特定标志物的颗粒在微流体系统内进行。
3.根据权利要求1所述的分析方法，其中测量被标记的样品以鉴别至少表达特定标志物的被标记的颗粒的步骤包括：
使所述被标记的样品分离为包含单个颗粒的液滴，
测定至少在第一频率和第二频率的所述单个颗粒的阻抗，所述第一频率低于第二频率，
将在所述第一频率的阻抗与不透明度关联，所述不透明度为所述第二频率阻抗与所述第一频率阻抗的比值，
从该关联鉴别至少表达特定标志物的被标记的颗粒。
4.根据权利要求1所述的分析方法，其中标记样品包括使所述样品与用针对所述特定标志物的抗体包被的珠子温育。
5.根据权利要求1所述的方法，其另外包括在测量所述被标记的样品之前进行裂解步骤。
6.根据权利要求5所述的方法，所述样品为血液样品，其中进行裂解步骤是进行红细胞裂解步骤，其包括使所述血液样品暴露于皂苷的有机酸溶液。
7.根据权利要求1所述的方法，其中测量所述被标记的样品在样品流中进行。
8.根据权利要求1所述的方法用于鉴定和计数CD4+ T-淋巴细胞的用途。
9.一种用于鉴定和计数表达特定标志物的颗粒的装置，其包含：
用于包含样品流的微通道，所述样品流包含表达特定标志物的被标记的颗粒，
至少一对电极，
电子电路，用于将至少在第一频率的第一AC信号和至少在第二频率的第二AC信号施加至所述至少一对电极，所述第一频率低于第二频率，
计算单元，用于测定所述电极对之间存在的颗粒的阻抗，所述计算单元被配置为适于测定至少在第一频率和第二频率的所述单个颗粒的阻抗，适于将在所述第一频率的阻抗与不透明度关联，所述不透明度为所述第二频率阻抗与所述第一频率阻抗的比值，以及适于从该关联鉴别至少表达特定标志物的被标记的颗粒。
10.根据权利要求9所述的装置，其另外包含第二对电极，被配置为适于发挥参考电极的功能。
11.根据权利要求10所述的装置，其另外包含放大电路，被配置为适于对在电极对中的一对之间存在的颗粒进行差异测量。
12.根据权利要求9所述的装置，其中所述微通道被配置为适于接收悬液中的颗粒流并将所述悬液中的颗粒流导向所述至少一对电极之间，以鉴定和计数在悬液中的颗粒流中表达特定标志物的颗粒。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品的阻抗标记在微流体装置中进行。
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Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104075977A (zh) * 2014-07-18 2014-10-01 苏州大学 一种细胞吸吐测量装置
CN105940294A (zh) * 2014-01-30 2016-09-14 惠普发展公司，有限责任合伙企业 具有交流电频率控制的阻抗测试
CN106777870A (zh) * 2016-11-18 2017-05-31 邹欣 一种针对单细胞转录组数据的降噪声算法
CN108344678A (zh) * 2018-04-25 2018-07-31 北京怡天佳瑞科技有限公司 一种颗粒物检测装置及检测方法
CN108700499A (zh) * 2016-01-12 2018-10-23 伊利诺伊大学评议会 流体中悬浮粒子的无标记表征
CN109863399A (zh) * 2016-08-26 2019-06-07 朱诺治疗学股份有限公司 计数存在于细胞组合物中的颗粒的方法
CN109852542A (zh) * 2018-12-18 2019-06-07 北京化工大学 一种用于单细胞阻抗流式检测的微流控芯片及其加工方法
CN111537401A (zh) * 2020-05-19 2020-08-14 北京林业大学 一种测定颗粒物分形维数的方法
CN112384804A (zh) * 2018-06-05 2021-02-19 克洛诺斯健康公司 用于控制液体运动和分析生物样品的装置、盒和传感器
CN113567326A (zh) * 2021-07-19 2021-10-29 清华大学 一种高通量实时单细胞电学本征参数测量系统及方法
CN114144664A (zh) * 2019-04-24 2022-03-04 辛辛那提大学 基于介电性质的纳米囊泡的无标记表征方法
CN115524276A (zh) * 2022-10-18 2022-12-27 四川成电医联科技咨询有限公司 一种多频阻抗学的血细胞分类计数芯片及计数方法
US12208392B2 (en) 2018-02-28 2025-01-28 Shanghai Sglcell Biotech Co., Ltd. Particulate matter detection device and detection method

Families Citing this family (46)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2956645A1 (en) 2003-07-12 2005-03-31 David A. Goldberg Sensitive and rapid biodetection
US20120077206A1 (en) 2003-07-12 2012-03-29 Accelr8 Technology Corporation Rapid Microbial Detection and Antimicrobial Susceptibility Testing
EP2638393B1 (en) * 2010-11-09 2019-03-06 The General Hospital Corporation Counting particles using an electrical differential counter
US10254204B2 (en) 2011-03-07 2019-04-09 Accelerate Diagnostics, Inc. Membrane-assisted purification
ES2551922T3 (es) 2011-03-07 2015-11-24 Accelerate Diagnostics, Inc. Sistemas rápidos de purificación celular
CN107012078B (zh) * 2011-05-05 2020-11-06 安派科生物医学科技有限公司 肿瘤细胞检测仪
US9677109B2 (en) 2013-03-15 2017-06-13 Accelerate Diagnostics, Inc. Rapid determination of microbial growth and antimicrobial susceptibility
US9464994B2 (en) 2013-07-30 2016-10-11 Clemson University High sensitivity tunable radio frequency sensors
WO2015051372A1 (en) * 2013-10-04 2015-04-09 Michigan Technological University Methods and systems for identifying a particle using dielectrophoresis
WO2015156876A2 (en) 2014-01-17 2015-10-15 Massachusetts Institute Of Technology Integrated electrical profiling system for measuring leukocytes activation from whole blood
WO2016122559A1 (en) 2015-01-30 2016-08-04 Hewlett-Packard Development Company, L.P. Microfluidic chip for coagulation sensing
WO2016122577A1 (en) * 2015-01-30 2016-08-04 Hewlett-Packard Development Company, L.P. Diagnostic chip
EP3274091B1 (en) * 2015-03-23 2020-12-02 The University of North Carolina at Chapel Hill Universal molecular processor for precision medicine
US10253355B2 (en) 2015-03-30 2019-04-09 Accelerate Diagnostics, Inc. Instrument and system for rapid microorganism identification and antimicrobial agent susceptibility testing
WO2016161022A2 (en) 2015-03-30 2016-10-06 Accerlate Diagnostics, Inc. Instrument and system for rapid microorganism identification and antimicrobial agent susceptibility testing
ES2794840T3 (es) 2015-09-30 2020-11-19 Semen Refinement B V Dispositivo microfluídico para la selección de semen
WO2017132132A1 (en) * 2016-01-28 2017-08-03 Beckman Coulter, Inc. Infection detection and differentiation systems and methods
DE102016203576A1 (de) * 2016-03-04 2017-09-07 Hamilton Bonaduz Ag Verfahren zur Kalibration von impedanzspektroskopischen Biomassesensoren und Verwendung einer Suspension zur Durchführung eines solchen Verfahrens
US11566994B2 (en) 2017-04-05 2023-01-31 The Regents Of The University Of California Device for continuous focusing and rotation of biological cells and its use for high throughput electrorotation flow cytometery
WO2018217802A1 (en) * 2017-05-22 2018-11-29 Bioelectronica Corporation Assay systems and methods for processing sample entities
US11852640B2 (en) 2017-10-27 2023-12-26 Beckman Coulter, Inc. Hematology analyzers and methods of operation
EP3759490A1 (en) 2018-02-28 2021-01-06 Juno Therapeutics, Inc. Methods for detecting particles present in a cell composition
US11521706B2 (en) 2018-04-20 2022-12-06 Beckman Coulter, Inc. Testing and representing suspicion of sepsis
CN112041938A (zh) 2018-04-20 2020-12-04 拜克门寇尔特公司 败血症感染确定系统和方法
LU100795B1 (en) * 2018-05-14 2019-11-14 Diatron MI PLC Immunoassay for whole blood samples
EP3673269B1 (en) * 2018-06-01 2023-10-25 Colgate-Palmolive Company Methods, devices and systems for quantifying biomarkers
CN111989032B (zh) 2018-06-15 2024-07-19 拜克门寇尔特公司 存在母细胞标志时确定败血症的方法
KR102083514B1 (ko) * 2018-06-22 2020-03-02 광주과학기술원 적혈구 변형성 측정장치 및 측정방법
WO2020076872A1 (en) 2018-10-08 2020-04-16 Bioelectronica Corporation Systems and methods for optically processing samples
EP3911783A4 (en) * 2019-01-17 2022-11-09 Genecapture, Inc. METHODS AND SYSTEMS FOR DETERMINING TARGET SENSITIVITY TO A THERAPEUTIC FORMULA
WO2020154566A1 (en) 2019-01-24 2020-07-30 University Of Virginia Patent Foundation Method and system for impedance-based quantification and microfluidic control
US12023178B2 (en) 2019-07-12 2024-07-02 Beckman Coulter, Inc. Method of detecting sepsis using vital signs, including systolic blood pressure, hematology parameters, and combinations thereof
EP3997461A1 (en) 2019-07-12 2022-05-18 Beckman Coulter, Inc. Systems and methods for evaluating immune response to infection
US12019040B2 (en) 2019-09-30 2024-06-25 Cornell University System and devices for monitoring cell-containing materials and methods of their use
KR102275395B1 (ko) * 2019-11-19 2021-07-08 대구대학교 산학협력단 마이크로 스트립 공진기의 다중공진모드를 이용한 병원성 세균검출장치
JP7343412B2 (ja) * 2020-01-23 2023-09-12 日置電機株式会社 均一度評価装置、均一度評価方法及びプログラム
WO2021154561A1 (en) 2020-01-31 2021-08-05 Becton, Dickinson And Company Methods and systems for classifying fluorescent flow cytometer data
GB202004021D0 (en) * 2020-03-19 2020-05-06 Sec Dep For Health And Social Care Rapid screen for antibiotic resistance and treatment regimen
KR102456455B1 (ko) * 2020-06-25 2022-10-19 원광대학교산학협력단 유전체 분광법을 이용한 바이러스 검출 장치 및 그 검출 방법
EP3940377A1 (en) 2020-07-16 2022-01-19 3M Innovative Properties Company Method, data set and sensor to sense a property of a liquid
EP3978912A1 (en) * 2020-10-02 2022-04-06 Nokia Technologies Oy Apparatus, methods and computer programs for analysing cellular samples
KR102515752B1 (ko) * 2020-12-31 2023-03-30 주식회사 바이오소닉스 다중 주파수를 이용한 바이오 센서 장치의 항원 검출 방법
CN117546004A (zh) * 2021-05-04 2024-02-09 赛博泰仪器有限公司 检测目标微粒的方法
KR102672881B1 (ko) * 2022-03-14 2024-06-07 주식회사 오렌지바이오메드 용액 내 입자 측정 방법 및 이를 수행하는 장치
US11852577B2 (en) 2021-09-29 2023-12-26 Orange Biomed Ltd., Co. Apparatus for measuring properties of particles in a solution and related methods
EP4407307A1 (en) 2021-09-29 2024-07-31 Orange Biomed Ltd.,Co Red blood cell glycation measurement using mechanical and electrical characteristics, and method for measuring values of glycated hemoglobin by using same and apparatus for performing same

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1043566A (zh) * 1988-12-16 1990-07-04 科特电子公司 筛选具有表示所选特性的种群的细胞或成型体的方法和设备
US20090051372A1 (en) * 2006-10-30 2009-02-26 Palaniappan Sethu 3D fluid confined sample stream coulter flow cytometry

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4485175A (en) 1983-01-03 1984-11-27 Coulter Electronics, Inc. Method for three-volume differential determination of lymphocyte, monocyte and granulocyte populations of leukocytes
US4751179A (en) * 1984-05-31 1988-06-14 Coulter Electronics, Inc. Method and reagents for differential determination of four populations of leukocytes in blood
US5155044A (en) 1987-03-13 1992-10-13 Coulter Electronics, Inc. Lysing reagent system for isolation, identification and/or analysis of leukocytes from whole blood samples
US8993487B2 (en) * 2005-04-30 2015-03-31 Samsung Electronics Co., Ltd. Bio disc, bio-driver apparatus, and assay method using the same

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1043566A (zh) * 1988-12-16 1990-07-04 科特电子公司 筛选具有表示所选特性的种群的细胞或成型体的方法和设备
US20090051372A1 (en) * 2006-10-30 2009-02-26 Palaniappan Sethu 3D fluid confined sample stream coulter flow cytometry

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHENG XUANHONG ET AL: "Cell detection and counting through cell lysate impedance spectroscopy in microfluidic devices", 《LAB ON ACHIP,ROYAL SOCIETY OF CHEMISTRY》 *
HOLMES ET AL: "Label-Free Differential Leukocyte Counts Using a Microfabricated , Single-Cell Impedance Spectrometer", 《IEEE SENSSORS》 *

Cited By (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10473605B2 (en) 2014-01-30 2019-11-12 Hewlett-Packard Development Company, L.P. Fluid testing system
CN105940294A (zh) * 2014-01-30 2016-09-14 惠普发展公司，有限责任合伙企业 具有交流电频率控制的阻抗测试
CN105992946A (zh) * 2014-01-30 2016-10-05 惠普发展公司，有限责任合伙企业 微流体感测装置
CN105992946B (zh) * 2014-01-30 2021-07-13 惠普发展公司，有限责任合伙企业 微流体感测装置
CN105940294B (zh) * 2014-01-30 2020-01-21 惠普发展公司，有限责任合伙企业 具有交流电频率控制的阻抗测试
US10495594B2 (en) 2014-01-30 2019-12-03 Hewlett-Packard Development Company, L.P. Impedance testing with alternating current frequency control
CN104075977A (zh) * 2014-07-18 2014-10-01 苏州大学 一种细胞吸吐测量装置
CN108700499A (zh) * 2016-01-12 2018-10-23 伊利诺伊大学评议会 流体中悬浮粒子的无标记表征
CN109863399A (zh) * 2016-08-26 2019-06-07 朱诺治疗学股份有限公司 计数存在于细胞组合物中的颗粒的方法
CN106777870A (zh) * 2016-11-18 2017-05-31 邹欣 一种针对单细胞转录组数据的降噪声算法
US12208392B2 (en) 2018-02-28 2025-01-28 Shanghai Sglcell Biotech Co., Ltd. Particulate matter detection device and detection method
CN108344678A (zh) * 2018-04-25 2018-07-31 北京怡天佳瑞科技有限公司 一种颗粒物检测装置及检测方法
CN108344678B (zh) * 2018-04-25 2021-03-26 北京怡天佳瑞科技有限公司 一种颗粒物检测装置及检测方法
US11467081B2 (en) 2018-04-25 2022-10-11 Nanjing Yitian Biotechnology Co., Ltd. Particle detection device and detection method
CN112384804A (zh) * 2018-06-05 2021-02-19 克洛诺斯健康公司 用于控制液体运动和分析生物样品的装置、盒和传感器
CN109852542A (zh) * 2018-12-18 2019-06-07 北京化工大学 一种用于单细胞阻抗流式检测的微流控芯片及其加工方法
CN114144664A (zh) * 2019-04-24 2022-03-04 辛辛那提大学 基于介电性质的纳米囊泡的无标记表征方法
CN111537401A (zh) * 2020-05-19 2020-08-14 北京林业大学 一种测定颗粒物分形维数的方法
CN113567326A (zh) * 2021-07-19 2021-10-29 清华大学 一种高通量实时单细胞电学本征参数测量系统及方法
CN115524276A (zh) * 2022-10-18 2022-12-27 四川成电医联科技咨询有限公司 一种多频阻抗学的血细胞分类计数芯片及计数方法

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