CN102448487B - 疫苗接种方法 - Google Patents
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Abstract
一方面，本文提供治疗哺乳动物的癌症的方法。所述方法包括给予哺乳动物溶瘤载体，所述溶瘤载体表达哺乳动物对之具有预存免疫力的肿瘤抗原。另一方面，本文提供加强哺乳动物的免疫应答的方法，所述哺乳动物对抗原具有预存免疫力，所述方法包括静脉内给予哺乳动物表达抗原的感染B细胞的载体。
Description
发明领域
本发明总的来讲涉及给哺乳动物接种疫苗的方法，具体地讲，涉及可用于加强免疫应答的疫苗接种方法以及可用于治疗疾病的方法。
发明背景
虽然许多成功的疫苗接种方案根除或完全控制了感染性疾病，例如天花和脊髓灰质炎，但是越来越明显的是，现有的疫苗接种方法不容易控制某些病原体。例如HIV、结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)和疟原虫等病原体全都抵抗由传统疫苗特别产生的体液免疫。已对开发可促进对这些病原体和相关病原体的有效细胞免疫的疫苗做出了相当的努力。同样，用肿瘤抗原的免疫接种主要依靠T细胞(尤其是CD8+CTL)识别和破坏癌细胞，因为许多肿瘤相关抗原是胞内蛋白质。然而，细胞免疫的诱导很复杂，给疫苗学家提出了大量问题。这些包括产生具有足够强度和寿命的细胞免疫的困难。
克服这些问题的一种潜在方法是通过使用异源载体序贯给予疫苗。虽然典型的初免-加强免疫方案包括DNA型疫苗和牛痘型疫苗，但是也已在动物模型中对使用细菌-病毒或两种不同病毒的其它组合进行了研究。用于疫苗接种最常使用的痘病毒是牛痘病毒，其用于针对天花的疫苗接种。重组牛痘可将外源抗原递送至哺乳动物细胞的胞质中，从而使它们直接进入抗原加工途径，这会导致与MHCI类和II类分子缔合的抗原衍生肽呈递到细胞表面上。这种性质使牛痘可用作重组疫苗，特别是用于刺激CD8+和CD4+T细胞免疫应答。有关对牛痘病毒在哺乳动物细胞中复制的能力的顾虑限制了其临床应用，并导致了对更安全替代品的寻找。
至于利用病毒治疗疾病例如癌症，已经发现，如果溶瘤病毒(OV)感染肿瘤并大量复制以介导彻底破坏，则可治愈动物模型的癌症。然而，大量的临床应用需要治疗可具有部分完整抗病毒机制的有免疫能力的荷恶性肿瘤宿主。针对病毒的快速清除病毒复制的活跃的宿主免疫应答(这导致不完全或短暂肿瘤破坏)，代表了通往成功的重大障碍。研究表明在幼稚动物中，获得性免疫应答的发生通常需时不到一周，给溶瘤载体发挥作用留下了小的机会窗。为了使所给予的病毒或再次给予的病毒的复制最大化，已测试了从彻底的免疫抑制到使用传递细胞(所谓的“特洛伊木马”)和病毒掩蔽的多种方法。
尽管前面提到的克服与现行疫苗接种方法有关问题的努力，但是仍需要开发在哺乳动物中产生免疫应答的更有效的方法。
发明概述
目前正在开发新的疫苗接种方法。
因此，本发明的一个方面，提供治疗哺乳动物的癌症的方法，所述方法包括给予哺乳动物溶瘤载体，其中所述载体表达哺乳动物对之具有预存免疫力的肿瘤抗原。
另一方面，提供用于治疗癌症的药盒，所述药盒包括适于诱导哺乳动物的免疫应答的量的肿瘤抗原或表达肿瘤抗原的载体以及适于提高免疫应答的量的表达肿瘤抗原的溶瘤载体。
本发明的另一个方面，提供加强对抗原具有预存免疫力的哺乳动物的免疫应答的方法。所述方法包括静脉内给予哺乳动物表达所述抗原的载体，其中所述载体能够感染B细胞。
又一方面，提供加强对抗原具有预存免疫力的哺乳动物的免疫应答的方法，所述方法包括静脉内给予哺乳动物荷载抗原的B细胞。
再一方面，提供用于加强哺乳动物的免疫应答的药盒。所述药盒包括呈合适给药形式的抗原或表达抗原的载体和呈适于静脉内给药的形式的表达抗原的载体。
在下面的详细描述中以及通过参考附图，本发明的这些和其它方面将会是显而易见的。
附图简述
图1阐述体内VSV-GFP(A)、Ad-hDCT(B和C)和VSV-hDCT对肿瘤的作用；
图2表示用Ad-hDCT和VSV-hDCT进行组合治疗的时间线(A)、CD8+T细胞概况(B)和对存活的作用(C)；
图3表示在用Ad-hDCT和VSV-hDCT组合治疗后DCT特异性CD8+T细胞概况(A)、存活与肿瘤抗原特异性T细胞频率的相关性(B)、DCTT细胞数目(C)和gp100T细胞的频率(D)；
图4表示在Ad-hDCT疫苗接种随后用VSV-hDCT治疗后荷瘤小鼠的病毒滴度(A)和脑重(B)；
图5表示在Ad-hDCT致敏宿主进行VSV-hDCT治疗后血液(A)、脾(B)和颈部淋巴结(C)中DCT特异性CD8+T细胞扩繁的时程；
图6概括了短间隔和长间隔治疗方案的时程(A)及在短间隔(B)和长间隔(B)时程免疫接种和治疗方案后小鼠肺和脑的VSV滴度；
图7表示在Ad-hDCT免疫接种后14天或100天用VSV-hDCT治疗时血液的DCT特异性CD8+T细胞的百分比(A)和数目(B)；
图8阐述用Ad-hDCT疫苗接种和溶瘤Maraba-hDCT组合治疗对肿瘤治疗后的免疫分析(A)和存活数据(B)；
图9阐述使用树突细胞载体递送DCT抗原(DChDCT)的组合治疗的存活数据(A)和生存中值(B)；
图10阐述组合治疗中利用双缺失牛痘载体递送DCT抗原(ddVV-hDCT)对肿瘤体积(A)和存活(B)的作用；
图11表示初免加强免疫方案递送途径的比较；
图12表示不同间隔的加强免疫能力；
图13表示静脉内给予VSV和牛痘病毒在加强免疫应答中的能力之间的比较；
图14表示G-less(突变体)形式的VSV加强免疫应答的能力；
图15表示由初免加强免疫方案诱导的T细胞的质量；
图16表示与用牛痘载体加强免疫相比，用VSV加强免疫诱导的T细胞的质量；
图17表示使用不同抗原和宿主品系的加强免疫方案的T细胞应答；
图18表示由静脉内VSV介导的加强免疫作用不依赖于CD4+T细胞；
图19表示二次免疫应答的耐久性和转化成记忆细胞的效应细胞的比例；
图20表示减毒的干扰素诱导突变型VSV疫苗等同于野生型VSV地加强免疫；
图21对利用基于VSV的载体和基于Maraba的载体递送DCT抗原时所加强的免疫应答进行比较；
图22阐述当使用Ad载体和Maraba载体递送抗原以及使用Maraba载体和VSV载体加强抗原免疫力时，血液(A与B)和脾(C)中的免疫应答；
图23阐述用不同剂量的抗原(A)以建立预存免疫力的免疫应答以及VSV加强免疫对每一种的作用(B)；
图24对野生型与B细胞缺陷型小鼠中对抗原的初次免疫应答(A)以及抗原加强免疫后血液和脾中的免疫应答(B)进行比较；和
图25阐述B细胞重建(A)对抗原加强免疫(B)的作用。
发明详述
本发明提供可用于治疗哺乳动物的癌症的疫苗接种方法，其中将表达哺乳动物对之具有预存免疫力的肿瘤抗原的溶瘤载体给予哺乳动物。本发明提供一种方法，其中哺乳动物对肿瘤抗原的免疫应答胜过哺乳动物对溶瘤病毒的免疫应答，因此产生对癌症的有效治疗。
本发明的疫苗接种方法可用于治疗哺乳动物的癌症。本文使用的术语“癌症”包括任何癌症，包括但不限于黑素瘤、肉瘤、淋巴瘤、癌(例如脑癌、乳癌、肝癌、胃癌和结肠癌)及白血病。
术语“哺乳动物”是指人以及非人类哺乳动物。
所述方法包括将表达哺乳动物对之具有预存免疫力的肿瘤抗原的溶瘤载体给予哺乳动物。本文使用的术语“预存免疫力”意指包括通过用抗原接种诱导的免疫力以及哺乳动物内天然存在的免疫力。
因此，在一个实施方案中，为了建立预存免疫力，本发明的方法包括用适于诱导针对目标癌细胞的免疫反应的肿瘤抗原给哺乳动物接种疫苗的步骤。例如，肿瘤抗原可以是肿瘤相关抗原(TAA)，例如在引发哺乳动物的免疫应答的肿瘤细胞中产生的物质。这类抗原的实例包括癌胚抗原(oncofetalantigen)(例如甲胎蛋白(AFP))和癌胚抗原(carcinoembryonicantigen，CEA)、表面糖蛋白(例如CA125)、癌基因(例如Her2)、黑素瘤相关抗原(例如多巴色素互变异构酶(DCT))、GP100和MART1、癌-睾丸抗原(cancer-testesantigen)(例如MAGE蛋白和NY-ESO1)、病毒癌基因(例如HPVE6和E7)、在通常限于胚胎组织或胚外组织的肿瘤中异位表达的蛋白质(例如PLAC1)。正如本领域技术人员应理解的一样，可根据待采用本发明的方法治疗的癌症的类型选择抗原，因为一种或多种抗原可能特别适用于治疗某些癌症。例如对于治疗黑素瘤，可以使用黑素瘤相关抗原，例如DCT。
可以给予抗原本身，或者优选通过载体给予抗原，例如腺病毒(Ad)载体、痘病毒载体或反转录病毒载体、质粒或荷载的抗原呈递细胞，例如树突细胞。将抗原引入载体的方法为本领域技术人员所知。一般而言，可对载体进行修饰以表达抗原。在这一方面，使用广为接受的重组技术，将编码选定抗原的核酸整合到选定载体上。
用以下若干方法的任一种将抗原给予哺乳动物，包括但不限于静脉内、肌内或鼻内。正如本领域技术人员应理解的一样，可在合适的溶媒(例如盐水或其它合适的缓冲液)中给予抗原或掺有抗原的载体。在用选定肿瘤抗原接种后，在免疫应答间隔期内例如约4天内并延长达数月、数年或可能终身，哺乳动物产生免疫应答。
建立对抗原的免疫应答，采用广为接受的技术，进行使用抗原的疫苗接种。因此，可以足以产生免疫应答的量将选定抗原或表达抗原的载体给予哺乳动物。正如本领域技术人员应理解的一样，产生免疫应答所需要的量将随多种因素而变化，包括例如选定抗原、递送抗原所使用的载体和待治疗的哺乳动物，例如品种、年龄、体型等。在这一方面，例如，肌内给予小鼠腺病毒载体至少约107PFU的最低量足以产生免疫应答。对于给予人，相应的量应足够产生免疫应答。
在另一个实施方案中，对抗原的免疫应答可在哺乳动物内天然发生，不需要第一疫苗接种步骤以诱导免疫应答。对抗原的天然存在的免疫应答可由任何既往暴露于抗原而产生。
一旦在适当的免疫应答间隔期内在哺乳动物中产生免疫应答，例如至少约24小时，优选至少约2-4天或更久，例如至少约1周，则以适于溶瘤病毒疗法的量将表达肿瘤抗原的溶瘤病毒给予哺乳动物，正如本领域技术人员应理解的一样，这可随选定的溶瘤病毒和待治疗的哺乳动物而变化。例如，静脉内给予小鼠108PFU溶瘤VSV的最低量足以用于溶瘤疗法。相应的量可足以用于人。
可通过采用标准重组技术，将编码抗原的转基因整合到病毒中来制备表达选定肿瘤抗原的溶瘤病毒。例如，可将转基因整合到病毒基因组，或者可采用整合转基因的质粒将转基因整合到病毒中。本发明的方法对于可利用的溶瘤病毒没有特别限制，可包括能够破坏肿瘤同时适于给予哺乳动物的任何溶瘤病毒。可用于本发明方法的溶瘤病毒的实例包括棒状病毒，例如水泡性病毒，例如水泡性口炎病毒(VSV)和Maraba病毒、短暂热病毒属(Ephemerovirus)病毒、质型弹状病毒属(Cytorhabdovirus)病毒、核型弹状病毒属(Nucleorhabdovirus)病毒和狂犬病病毒属(Lyssavirus)病毒以及麻疹病毒、牛痘病毒、疱疹病毒、粘液瘤病毒、细小病毒(parvoviral)、新城疫病毒、腺病毒和semliki病毒(semlikiforestvirus)。
这种组合疫苗接种方法通过将目标肿瘤抗原给予哺乳动物，从而刺激对靶抗原的免疫应答，接着通过将也表达该肿瘤抗原的溶瘤病毒给予哺乳动物以加强免疫应答，从而对哺乳动物癌症提供有效治疗。还发现这种方法大大降低哺乳动物抗病毒反应，使溶瘤病毒成为有关肿瘤退化的有用的促进因素。
本发明的另一个方面还提供可用于治疗癌症的药盒。药盒包括适于诱导哺乳动物的免疫应答的量的肿瘤抗原或表达肿瘤抗原的载体以及适于提高免疫应答的量的表达肿瘤抗原的溶瘤载体。上文描述了适合包括在药盒中的肿瘤抗原和溶瘤载体。
本发明的另一个方面，提供加强对抗原具有预存免疫力的哺乳动物的免疫应答的方法。所述方法包括静脉内给予哺乳动物抗原，优选通过能够感染B细胞的载体。术语“预存免疫力”如上定义，并且可按照上述方法实现。
可利用这种方法加强对任何抗原的免疫力，包括例如肿瘤抗原、病毒抗原和特别是来源于病毒性致病生物(例如HIV、HepC、FIV、LCMV、依波拉病毒)以及细菌病原体(例如结核分枝杆菌)的抗原。正如本领域技术人员应理解的一样，可采用广为接受的重组技术制备载体以表达选定抗原。
用于将抗原递送到哺乳动物中的合适载体是能够感染B细胞的载体，包括例如上文给出的棒状病毒，包括水泡性病毒和Maraba型病毒。突变型病毒载体也适用于本发明的方法。突变型减毒病毒(包括无能力复制形式)对用于本发明的方法是特别有利的。还可将荷载于抗原呈递细胞(例如B细胞)中的抗原给予哺乳动物。
一旦制备表达选定抗原的载体，便将其静脉内给予哺乳动物用于最佳免疫强化。所给予的载体的量也随所选择的载体以及哺乳动物而变化。有关预存免疫力，可在预存免疫力的峰值免疫应答之前或同时，将抗原表达载体给予哺乳动物。最好在初免预存免疫力的效应期之后，将抗原表达载体给予哺乳动物以加强预存免疫力。
与包括肌内、腹膜内、皮下和鼻内在内的其它给予途径相比，抗原表达载体(例如加强免疫载体)的这种静脉内给予导致对抗原的免疫应答显著加强。与其它给予途径相比，该方法提供的免疫应答增加至至少约4倍。
本发明还提供用于加强哺乳动物的免疫应答的药盒。该药盒包括适于诱导对抗原的免疫应答的量的抗原或表达抗原的载体。本发明以合适的给药形式提供抗原或载体，例如适于静脉内、肌内或鼻内给予的形式。药盒还包括表达相同抗原的载体，其呈适于静脉内给予的形式，例如在盐水或缓冲溶液中。上文描述了适合包括在药盒中的抗原和载体。
又一方面，提供加强对抗原具有预存免疫力的哺乳动物的免疫应答的方法，所述方法包括静脉内给予哺乳动物荷载抗原的B细胞。如所表明的，静脉内给予荷载抗原的B细胞导致对抗原的预存免疫应答显著加强。
在不得解释为限制性的下列具体实施例中描述了本发明的实施方案。
实施例1
材料与方法
小鼠。把雌性年龄相当的小鼠(研究开始时8-10周龄)，包括C57BL/6(H-2b)和BalB/c(H-2d)小鼠(CharlesRiverLaboratories，Wilmington，MA)关养在特殊的无病原体的设施中。动物研究遵守加拿大动物管理委员会(CanadianCouncilonAnimalCare)准则，并经麦克马斯特大学动物研究伦理理事会(McMasterUniversity′sAnimalResearchEthicsBoard)批准。
细胞。使B16-F10鼠黑素瘤细胞和CT26结肠癌细胞在含有10％FBS、2mML-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、维生素溶液、0.01mM非必需氨基酸、50μM2-巯基乙醇、100U/ml青霉素和100μg/mL链霉素(全部得自Invitrogen，GrandIsland，NY，USA)的F11-极限必需培养基中生长。使HEK293T细胞在D-MEM加10％FBS中生长，而使Vero细胞在α-MEM加10％FBS中生长。
载体。Ad-hDCT是表达全长hDCT基因的E1/E3缺失的人5型Ad，AdBHG是不含转基因的E1/E3缺失的病毒(Lane，C等，CancerRes64，1509-1514(2004)；Ng等，MolTher3，809-815(2001))。按照Stojdl，D.F.等，CancerCell4，263-275(2003)中所述，通过将hDCTPCR片段亚克隆至质粒pVSV-XN(由JohnRose，YaleUniversity，NewHaven，Connecticut提供)以及在基质基因中携带ΔM51突变的病毒基因组的G和L基因之间的XhoI和NheI位点，对印第安纳血清型的重组VSV进行改造以表达hDCT。采用相同策略构建类似的Maraba载体。采用标准技术拯救重组基因组(Lawson等，ProcNatlAcadSciUSA1995年9月12日；92(19)：9009)以产生有复制能力的hDCT表达VSV(VSV-hDCT)。对于一些实验，拯救不含转基因的亲本VSV作为对照病毒(VSV-MT)。携带绿色荧光蛋白(GFP)的VSV之前披露于Stojdl，D.F.等，CancerCell4，263-275(2003)，并在本研究中用于监测感染(VSV-GFP)。表达SIFNFEKL-萤光素酶融合物的病毒也用来诱导针对这种卵清蛋白衍生表位的应答。还构建了表达LCMV表位的病毒以针对该病毒接种疫苗。由HEK293T细胞产生VSV储备液，并通过蔗糖梯度离心纯化。通过Vero细胞的噬斑测定法测定病毒滴度。
肽。与H-2Kb结合的DCT的免疫显性肽(DCT180-188，SVYDFFVWL；人和鼠DCT共有)通过PepScan系统(Lelystad，Netherlands)合成。来源于VSV的N蛋白的H-2Kb限制性表位(RGYVYQGL)和Db结合鼠gp100肽(mgp10025-33；EGSRNQDWL)购自BiomerTechnologies(Hayward，CA)。
立体定位外科。为了建立脑肿瘤，小鼠接受颅内注射含1x103个B16-F10细胞的2μlPBS。将小鼠置于立体定位仪(XymotechBiosystemsInc，Quebec，Canada)上，在麻醉下切开头皮暴露颅骨。将装在10μlHamilton注射器(HamiltonCompany，Reno，NV)上的针定位在大脑前囟外侧2.25mm的右半球处。经由颅骨钻出一个小钻孔，将针斜面插入3mm深的脑实质中。在1分钟时间内注射细胞。将针留在原处2分钟后抽出以使沿注射道的回流减到最低。头皮切口用不锈钢夹子闭合，7-10天后取下夹子。
BalB/c小鼠的肺转移性肿瘤。通过尾静脉注射，给BalB/c小鼠接种2x105个CT26细胞的200μlPBS溶液。所有未治疗小鼠在24天内达到终点。
疫苗接种方案。通过肌内(i.m.)注射1x108pfuAd载体的100μlPBS溶液(50μl/腘绳肌腱)或注射2-10x108pfuVSV的200μlPBS溶液到尾静脉(i.v.)，给经麻醉的小鼠免疫接种。
组织匀浆物中的病毒滴定。为了测定肿瘤内的病毒复制，在静脉内接种VSV载体后3天收集脑或肺，称重，匀浆后滴定。通过Vero单层培养物上的噬斑测定法定量测定病毒滴度，用每克组织的噬斑形成单位(PFU)表示。
抗体。在流式细胞术测定法中使用下列单克隆Ab：抗CD16/CD32(克隆2.4G2)以封闭Fc受体、用于检测细胞表面标记的抗CD3(克隆145-2C11)、抗CD8(克隆53-6.7)和用于胞内染色的抗IFN-γ(克隆XMG1.2)(全部试剂得自BDPharmingen，SanDiego，CA，USA)。
T细胞制备和胞内染色。对于PBMC(外周血单核细胞)收集，从眶周窦采集血液，使红细胞裂解。对于TIL(肿瘤浸润性淋巴细胞)分离，从脑中切取CNS瘤，称重，切碎，随后在含有0.1％胶原酶I型(InvitrogenLifeTechnologies)和DNA酶(0.1mg/ml，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)的Hank缓冲盐水中，于37°温育1小时。在消化后，将释出的细胞通过70-μM滤器过滤，采用EasySepCD90-PE系统(STEMCELLTechnologies，Vancouver，BC)对TIL进行纯化。在布雷菲德菌素A(GolgiPlug，BDPharmingen，1μg/ml，温育1小时后加入)存在下，将得自血液的单核细胞和得自脑肿瘤的TIL用肽(1μg/ml)刺激。在总共5小时的温育时间后，细胞用抗CD16/CD32处理，并通过加入Ab对表面标记进行荧光标记。然后使细胞透化，用Cytofix/Cytoperm(BDPharmingen)固定，并对胞内细胞因子进行染色。采用备有FACSDiva5.0.2软件(BDPharmingen)的FACSCanto流式细胞仪获得数据后，用FlowJoMac6.3.4版软件(Treestar)进行分析。
四聚体染色和BrdU掺入测定法。收获前24小时，经免疫接种的小鼠接受1mgBrdU的腹膜内注射。不同器官的淋巴细胞先用APC缀合的四聚体H-2Kb/SVYDFFVWL染色，然后按照生产商的说明书，使用BrdU染色试剂盒(BDPharmingen)进行BrdU染色。
组织染色。对于脑石蜡切片的染色，将组织在10％福尔马林中固定过夜，转移到70％乙醇中，用石蜡包埋，并切成5μm的厚度。切片用苏木精和伊红(Sigma)染色。
统计分析。对于所有作图和统计分析均采用适用Windows的GraphPadPrism4.00版(GraphPadSoftware，SanDiego，California，USA)。通过斯氏双尾t检验(Student′stwo-tailedt-test)或单向或双向ANOVA分析，对T细胞应答进行分析。平均值间的差异为p＜0.05时视为显著。显示了平均值加标准误差棒。应用Kaplan-Meier方法和趋势logrank检验，对存活数据进行分析。
结果
幼稚宿主中溶瘤作用和肿瘤疫苗接种的影响
C57BL/6小鼠接受1x103个B16-F10细胞的颅内注射。一周后，小鼠用静脉内注射1x109pfuVSV-GFP治疗。荧光显微镜显示VSV治疗后3天收获的脑有肿瘤内GFP表达的证据。感染后4天收获的脑的肉眼检查显示VSV-GFP治疗脑中的肿瘤负荷大大降低。这些脑的苏木精和伊红染色切片也表明这种降低。如图1A所示，存活研究未能检出溶瘤VSV-GFP治疗(5只小鼠，2组，如上治疗并重复3次，结果类似)后延长的存活。或者，在移植后第5天，小鼠用一次肌内剂量的1x108PFUAd-hDCT或Ad-BHG治疗。在疫苗接种后第14天进行了外周血的免疫学分析。图1B给出了在用DCT的优势表位刺激后，对胞内IFNγ呈阳性的CD8+T细胞的百分比。收集存活数据，数据表明了Ad-hDCT疫苗接种的小鼠中存活的显著延长，见图1C。实验重复了3次，给出了代表性数据。在另一项实验中，在移植后第5天，荷有颅内B16肿瘤的小鼠用一次静脉内剂量的1x109PFUVSV-hDCT治疗。在给予VSV后第14天对外周血进行了免疫学分析。图1D给出了在用DCT的优势表位和VSV核衣壳的优势表位刺激后，对胞内IFNγ呈阳性的CD8+T细胞的百分比。在溶瘤VSV-hDCT治疗(5只小鼠，2组，重复3次，结果相似)后，存活研究未能检出存活延长，见图1E。
将针对溶瘤病毒(OV)的免疫应答转变为有益免的疫应答。
图2A中给出了用Ad-hDCT和VSV-hDCT组合治疗的时间线，其中在移植后第5天，给荷瘤小鼠接种疫苗以在第19天递送溶瘤病毒前产生抗DCT应答。VSV治疗后6天收集外周血，进行了响应DCT的优势表位和VSV-N的优势表位的IFNγ的ICS。幼稚小鼠显示针对VSV-hDCT的抗病毒应答占优势的应答，而接种疫苗的小鼠显示抗DCT应答占优势的应答，且抗VSV应答降低(参见图2B)。图2C给出了3次独立实验的汇总存活数据，其中小鼠用空Ad载体(Ad-BHG)治疗、仅Ad-hDCT治疗或用Ad-hDCT接着VSV-hDCT治疗(分别为n＝19、n＝18和n＝15)，清楚表明后一组合延长存活。
溶瘤病毒免疫加强的免疫学特征。
在VSV治疗后应答的高峰，荷瘤(TB)和无肿瘤(TF)C57BL/6小鼠外周血中DCT特异性IFNγ+CD8+T细胞数的比较(TBn＝7，TFn＝5)见图3A。表明外周血中抗DCT应答的幅度与存活之间的相关性的汇总数据见图3B。数据包括模拟接种疫苗(Ad-BHG，x)、接种Ad-hDCT疫苗(□)或用Ad-hDCT+VSV-hDCT组合(●)治疗的小鼠。水平线表示无肿瘤小鼠中获得的平均应答+/-SEM(短划线)。大多数与存活＞45天有关的应答只可在荷瘤动物中达到，这就表明了使用溶瘤病毒作为加强免疫载体的重要性。接种Ad-hDCT疫苗的荷有颅内B16-F10肿瘤的C57BL/6小鼠随后用PBS、VSV-MT(无转基因)或VSV-hDCT治疗。7天后收集肿瘤，并对DCT180-188肽产生应答的IFNγ+肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)计数，见图3C。通过IFNγ的ICS，对Gp100应答的CD8+T细胞计数，表明荷瘤(TB)动物的组合疗法诱导表位扩展(图3D)。
接种疫苗对OV复制的影响。
用Ad载体给无肿瘤(TF)或B16-F10荷瘤(TB)C57BL/6小鼠肌内免疫接种。Ad治疗后14天，通过静脉内注射给予小鼠VSV-hDCT，VSV接种后3天，将脑称重，并匀浆。在Vero单层培养物上通过噬斑测定法，定量测定病毒滴度，用PFU/克脑组织表示(图4A)。脑重概括于图4B。汇总每组5只小鼠两次实验的数据。
VSV-hDCT治疗后T细胞复制的动力学。
在VSV-hDCT接种前，无肿瘤C57BL/6小鼠用Ad-hDCT免疫接种14天。收获前24小时，经免疫接种的小鼠接受1mgBrdU的腹膜内注射。在7天内每24小时收获组织，监测T细胞增殖。通过用BrdU的抗体和四聚体H-2Kb/SVYDFFVWL共同染色来测定血液(图5A)、脾(图5B)和颈部淋巴结(图5C)中抗原特异性CD8+T细胞的增殖。各符号代表5只小鼠，实验重复两次，结果相似。
肺转移模型中疫苗接种对溶瘤作用的影响。
在时间线(图6A)所示CT26肿瘤植入(2x105个细胞，静脉内注射)的前14天(长间隔期)或同一天(短间隔期)，将BalB/c小鼠用108PFUAd-hDCT肌内免疫接种。肿瘤接种后14天，小鼠通过尾静脉注射，用2x108PFUVSV-hDCT或VSV-GFP治疗。在VSV治疗后4天，收获整个肺并匀浆。在Vero单层培养物上通过噬斑测定法定量测定病毒滴度，用PFU/克组织表示(分别见图6B和图6C)。从每组5只小鼠的两次实验中汇总数据。
初免和加强免疫之间间隔期的延长提高应答幅度。
C57BL/6小鼠最初用108PFUAd-hDCT的肌内剂量免疫接种。14或100天后，通过尾静脉注射给予小鼠109PFU的VSV-hDCT。VSV治疗后7天，通过FACS分析定量测定血液中DCT特异性分泌IFNγ的CD8+T细胞的百分比(图7A)或数目(图7B)。各个条代表5只小鼠。
Maraba型溶瘤疫苗载体
荷有颅内B16F10肿瘤的C57/B6小鼠用Ad-BHG(空载体，阴性对照)或Ad-hDCT(1x108PFU肌内)接种疫苗。一组随后接受一次静脉内剂量的Maraba-hDCT(2x109PFU)。5天后对外周血T细胞进行了免疫分析(每种治疗3个条，左边的条为IFNγ+，中为TNFα+，右边的条为每种情况的双阳性)(图8A)，记录了存活数据(图8B)。
用荷载抗原的树突细胞进行疫苗接种
静脉内给C57/B6小鼠植入B16F10细胞。用单独或与随后静脉内递送VSV-hDCT组合的Ad-hDCT或荷有hDCT的树突细胞(DC)给小鼠接种疫苗。收集存活数据，见图9A。用DChDCT+VSVhDCT的组合治疗的2只小鼠是长期存活者(植入后100天处死，肺部健全)。相对于PBS治疗组，Ad-接种疫苗组和DC-接种疫苗组全都具有显著较大的生存中值，而组合DC-hDCT+VSV-hDCT治疗组具有最大生存中值。(图9B)。
用荷有抗原的牛痘病毒载体进行的疫苗接种
第10天，皮下b16F10黑素瘤肿瘤用PBS、仅双缺失牛痘-hDCT(ddVV-hDCT，1x108PFUIT)或ddVV-hDCT接着4天后用VSV-hDCT(2x109PFU静脉内)治疗。提供了肿瘤体积(图10A)和存活数据(图10B)，并说明组合疗法的应答增加。
讨论
在使用黑素瘤相关抗原的有免疫能力的宿主中利用攻击性颅内(i.c.)B16黑素瘤模型。在该模型中，通过颅内注射将1x103个B16-F10细胞植入C57BL/6小鼠，肿瘤递送后的中位生存时间为15天(未治疗对照的积累数据，n＝41)。为了评价VSV治疗的功效，携带5天大的B16肿瘤的小鼠用1x109VSV-GFP的一次静脉内(i.v.)剂量治疗。与预期一样，用VSV感染肿瘤导致肿瘤体积明显下降。然而，这种效果是短暂的，不能解释为存活益处(图1a)。
在另一种方法中，对通过肿瘤疫苗接种治疗颅内B16黑素瘤进行了试验。给C57BL/6小鼠植入1x103个B16细胞的颅内剂量，植入后5天，将这些小鼠用1x108PFUAd-hDCT肌内(i.m.)进行治疗。疫苗接种后一周，外周血中针对优势免疫表位DCT180-188(人与小鼠之间相同)的CD8+T细胞应答显而易见，在第12-14天达到最大值(约3.5％IFN-γ+CD8+T细胞，图1b)。与VSV治疗相比，Ad-hDCT疫苗接种显著延长存活(中位死亡时间32天相对于19天，P＝0.0044)(图1c)，但是不能治愈任一小鼠。用对照载体Ad-BHG或PBS免疫接种的小鼠中未测到DCT特异性T细胞或保护。
在又一种方法中，对VSV进行改造以表达hDCT(VSV-hDCT)，且将荷有颅内B16-F10肿瘤的小鼠用VSV-hDCT载体治疗。该载体诱导小规模抗DCTCD8+T细胞应答(0.26％，图1d)，这为Ad-hDCT诱导的应答(3.2％，图1B)的1/12。然而，在VSV-hDCT治疗后，检测到针对VSV核蛋白的表位的高水平CD8+T细胞(14.0％，图1d)，这就表明抗病毒应答在免疫成果中占优势。与VSV-GFP的观察结果(图1A)类似，用VSV-hDCT治疗不提供任何存活益处(图1e)。因此，由溶瘤病毒诱导的强效抗病毒免疫应答不仅仅引起载体的溶瘤影响为短暂的，而且还在直接诱导针对肿瘤相关抗原(TAA)转基因的免疫应答的尝试中占优势。
在又一种方法中，诱导针对所规定的肿瘤抗原的免疫应答，接着用表达该同一抗原的溶瘤病毒治疗。通过1x108PFUAd-BHG或Ad-hDCT的肌内注射来治疗荷有7天大的颅内B16肿瘤的C57BL/6小鼠。14天后，将一次静脉内剂量的VSV-GFP或1x109PFUVSV-hDCT给予小鼠(图2a)。如图2b所概述，荷瘤小鼠中，Ad-hDCT免疫接种接着VSV-hDCT导致22％血液衍生的CD8+T细胞呈DCT特异性；为仅载体治疗的7倍(与图1B相比)或85倍(与图1d相比)。此外，与在幼稚小鼠暴露于这种OV后所观察到的相比，这种组合不仅确实显著提高对TAA的免疫应答，而且实际上还降低抗VSVCD8+T细胞应答的幅度(14％至4.7％血液衍生的CD8+T细胞；图2b)，这就表明针对溶瘤疫苗病毒的免疫应答的逆转，其中抗肿瘤应答此时的优势超过抗病毒免疫力。最重要的是，在仅仅一次剂量的各载体后，组合疗法导致生存中值进一步延长，即协同效应(仅用Ad-BHG为15天生存中值，仅用Ad-hDCT为30.5天生存中值，用组合治疗为54天生存中值)，且20％以这种方式治疗的小鼠表现出长期持久的治愈(图2c)。
荷瘤动物中的抗DCTT细胞应答的幅度比无肿瘤动物中的大，这就表明有肿瘤时利用复制的OV递送转基因的优势(图3a)。此外，存活与DCT特异性CD8+T细胞水平直接相关，其中当该免疫应答的幅度超过无肿瘤宿主可产生的幅度时，才能达到存活的最大延长(图3b)。因此最佳治疗效果通过加强肿瘤内的溶瘤载体复制而介导。同样，与用VSV-MT对照病毒治疗的动物相比，VSV-hDCT治疗的动物中，对DCT有特异性的肿瘤浸润性CD8+T细胞的频率显著较高，这就表明用VSV-hDCT进行治疗不仅仅导致外周抗原特异性CD8+T细胞数目的整体提高，而且还提高其募集到肿瘤中(图3c)。有趣的是，检测到针对GP100(未用其给小鼠接种疫苗的另一种TAA)的CD8+T细胞应答，这就提供了很可能由抗DCTCTL和病毒溶瘤作用两者增强的肿瘤破坏引起的表位扩展的证据，因为单独用任一治疗不能测得抗GP100应答(图3d)。
虽然上述观察结果表明，在针对载体转基因的免疫应答存在时VSV-hDCT保持溶瘤性，但是仍对这种预存免疫力对VSV复制的影响进行了评价。无肿瘤小鼠和荷有颅内B16-F10肿瘤的小鼠用Ad-hDCT或Ad-BHG治疗。14天后，给予小鼠1x109PFUVSV-hDCT的静脉内剂量。VSV递送后42小时，收获脑，并测定病毒滴度。在模拟接种疫苗小鼠中，无肿瘤和荷瘤脑两者均显示大量的VSV-hDCT复制，其中荷瘤脑的病毒滴度较高，为无肿瘤脑的50倍(图4a)。由于模拟疫苗接种不阻止肿瘤生长，因此这些小鼠具有大量肿瘤负荷(图4b)，并且非常接近安乐死时的终点。在Ad-hDCT接种疫苗的小鼠中，VSV滴度低得多，然而荷瘤脑仍然显示较高的VSV-hDCT滴度(图4a)，尽管在该时间点时这些脑具有最低的肿瘤负荷(图4b)。因此，尽管对载体转基因的预存免疫力，VSV在这种残留肿瘤中仍然能够感染和复制。为了测定DCT特异性CD8+T细胞经由VSV-hDCT的扩繁的时滞，将小鼠用VSV-hDCT加强免疫，并在包括脾和淋巴结在内的组织收获前24小时接受BrdU。图5中概括的数据表明，直到VSV-hDCT治疗后第3天才检出CD8+T细胞的扩繁。这些数据表明，在治疗后观察到的TAA特异性T细胞大量扩繁前，在针对TAA转基因的初次免疫应答存在时，溶瘤疫苗载体具有至少3天来复制。
由于Ad-hDCT对肿瘤负荷有大的影响，因此难以定量分析B16模型中针对转基因的预存免疫应答对病毒复制的影响。因此，在DCT不是肿瘤抗原的不同肿瘤模型中测定了这种影响。这允许在小鼠具有与疫苗接种无关的类似肿瘤负荷的情况下进行比较，而且还提供有关疫苗接种和病毒溶瘤作用之间的间隔期的机动性。为此，选择了其中DCT是不相关的CT26结肠癌肺转移模型。在同一天，给小鼠静脉内接种CT26细胞和用Ad-hDCT肌内接种疫苗。14天后，小鼠通过静脉内注射接受2x108PFUVSV-hDCT或VSV-GFP。为了测定病毒复制，在给予VSV后96小时，使小鼠安乐死，收集肺和脑用于通过噬斑测定法测定VSV滴度(图6a)。与VSV-GFP对照相比，用VSV-hDCT治疗动物的肺和脑两者中观察到病毒滴度降低约1.5log(图6b)。然而，有趣的是，如果在植入CT26前14天(VSV-hDCT治疗前27天)给小鼠免疫接种，则VSV-hDCT肺滴度的降低较少(图6c)，这就表明这两种治疗之间的间隔期延长可潜在地使溶瘤作用的减损降到最小。在VSV-DCT脑滴度中也观察到显著降低(图6c)，这就表明既往针对由溶瘤病毒(OV)编码的非结构转基因的疫苗接种在正常组织中降低OV复制，因此提高OV的安全特性。
可通过延长疫苗接种和给予OV之间的间隔期，使溶瘤作用的降低减到最小，因为抗原特异性效应物的频率随时间降低。如果Ad-hDCT后100天给予VSV-hDCT，则在无肿瘤动物中可证实，延长疫苗接种和病毒溶瘤作用之间的间隔期有更多益处，其中对DCT优势免疫表位有特异性的CD8+T细胞的平均频率达到37％(是在14天时间点进行时观察到的水平的两倍)(图7)。
鉴于上文所述，证实了这样的治疗策略，即有效利用肿瘤疫苗接种以按使得允许短暂的病毒溶瘤作用的这类方式改进针对工程改造的溶瘤病毒载体的免疫应答，所述短暂的病毒溶瘤作用直接引起大量的抗肿瘤免疫应答。通过操作系统，使得针对溶瘤病毒的占优势的免疫应答也碰巧是抗肿瘤免疫应答功能，以延长病毒载体通过这种免疫反应的影响。因此，对溶瘤病毒进行改造以表达天然肿瘤抗原可诱导针对肿瘤抗原的弱的T细胞应答，但是这种应答被针对病毒抗原的免疫应答完全遮蔽。虽然既往针对溶瘤载体转基因的免疫接种可能看上去是反直觉的，因为其可消弱病毒递送或复制，但是本发明的结果表明，溶瘤疫苗在这些情况下变得更有效，因为其极大地放大了预存的抗肿瘤免疫力，同时保持溶瘤活性，导致临床结果得到显著改善。出乎意料的是，预存免疫力不防止瘤内病毒复制，这种方法的众多免疫学益处使之合理平衡。虽然这种提高的抗原特异性应答还可降低OV的复制，但得自BrdU标记的小鼠的数据表明，对于病毒溶瘤作用至少有3天机会窗。实际上，在该点上将CTL募集至肿瘤中是需要的，并且提高病毒和肿瘤两者的清除率。
这种方法的其它益处是由溶瘤疫苗载体显示的安全特性得到提高。数据证实了静脉内递送后由VSV引起的颅内感染，然而，在免疫接种的动物的脑内，病毒滴度较低，最引人注目的是，即使使用野生型VSV，已针对病毒转基因疫苗接种的任何小鼠中都没有后肢麻痹。还用表达hDCT的VSV的干扰素诱导突变体对这种组合疗法进行了测试，在颅内B16模型中引起相当的存活(未显示)，这就表明这种方法可与其它病毒寻靶和减毒方法成功结合。
本发明的组合治疗方法可利用产生预存抗原免疫应答的各种方法(病毒、质粒和细胞)，并且还可利用各种溶瘤疫苗载体，包括VSV和Maraba。
实施例2
材料与方法
病毒-所使用的VSV载体使用携带野生型M基因(pVSV-XN)或印第安纳血清型的M蛋白突变体(M51-VSV)的质粒基因组构建，并通过亚克隆质粒pVSV-XN或pΔM5的XhoI和NheI位点之间的PCR片段产生。VSV/SIINFEKL-Luc(VSV/SIIN)含有萤光素酶的改进形式，其携带N端加标签的OVA(SIINFEKL)的优势免疫I类表位。VSV/hDCT携带人黑素瘤相关抗原多巴色素互变异构酶(DCT)。VSV/GFP带有绿色荧光蛋白，对照病毒VSV/MT不含转基因。使VSV载体在293T细胞培养物中增殖，并通过蔗糖梯度离心纯化。双缺失牛痘病毒-hDCT(ddVV-hDCT)是重组的胸苷激酶，牛痘生长因子双缺失牛痘病毒被工程改造以表达hDCT。使牛痘在CV1细胞中生长。
肽-通过PepScan系统(Lelystad，Netherlands)，合成与H-2Kb(DCT180-188，SVYDFFVWL；人和鼠DCT共有)结合的DCT的免疫显性肽(Parkhurst等，1998)和OVA的Kb结合肽(SIINFEKL)。
疫苗接种方案-通过肌内注射1x108pfuAd载体的100μlPBS溶液(50μl/腘绳肌腱)，接着通过静脉内注射1-2x109pfuVSV的200μlPBS溶液到尾静脉，给经麻醉的小鼠免疫接种。间隔期为8-233天。
抗体-在流式细胞术测定法中使用下列单克隆Ab：抗CD16/CD32(克隆2.4G2)以封闭Fc受体、用于测定细胞表面标记的抗CD3(克隆145-2C11)、抗CD4(克隆RM4-5)、抗CD8(克隆53-6.7)和用于胞内染色的抗IFN-γ(克隆XMG1.2)和抗TNF-α(克隆MP6-XT22)(全部试剂得自BDBiosciences，SanDiego，CA，USA)。用来源于ATCC的mAbGK1.5(抗CD4)和/或2.43(抗CD8)进行了免疫耗竭研究。隔两天腹膜内注射纯化的mAb(250μg，在500μl盐水中)，此后以200μg/治疗的维持剂量一周两次注射。通过流式细胞术测定，淋巴细胞亚类的特异性耗竭的效率＞98％。
T细胞制备和胞内染色-由眶周窦收集血液，并使红细胞裂解。将脾和淋巴结在含有0.05mg/ml胶原酶I型(InvitrogenLifeTechnologies)的Hank缓冲盐溶液(HBSS)中于37°温育30分钟，然后在显微镜玻片间挤压以产生单细胞悬液。对于TIL分离，从PBS-灌注小鼠脑上切取CNS瘤，然后称重，切碎，随后在含有0.5mg/ml胶原酶I型、0.2mg/mlDNA酶和0.02mg/ml透明质酸酶(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)的HBSS中于37°温育45分钟。消化后，将释出的细胞通过70-μM滤器过滤，采用EasySepCD90.2-PE系统(STEMCELLTechnologies，Vancouver，BC)，对TIL进行纯化。在布雷菲德菌素A(GolgiPlug，BDPharmingen，1μg/ml，温育1小时后加入)存在下，用肽(1μg/ml)刺激制备的单核细胞。在总共5小时的温育时间后，细胞用抗CD16/CD32处理，通过加入Ab对表面标记进行荧光标记。然后使细胞透化，用Cytofix/Cytoperm(BDPharmingen)固定，并对胞内细胞因子进行染色。采用配有FACSDiva5.0.2软件(BDPharmingen)的FACSCanto流式细胞仪获取数据，并用FlowJoMac6.3.4版软件(Treestar)进行了分析。
B细胞分离和培养-通过采用MACS试剂盒(Miltenyi)的阴性选择以除去no0-B细胞，来分离出脾B细胞。将B细胞在IMDM加FCS和muIL2中培养4天后，用Ad或VSV载体以25的MOI感染2小时，然后洗涤，并通过尾静脉给予受体小鼠。
结果
在第0天，C57BL/6小鼠(n＝5/组)接受1x108pfuAd-hDCT的肌内注射，接着在第14天接受通过不同途径(i.m.：肌内，s.c：皮下，i.p.：腹膜内，i.n.：鼻内，i.v.：静脉内)注射的1x109pfuVSV-hDCT。7天后，在用肽9重新刺激后，通过对干扰素-γ胞内染色的流式细胞分析，测定了对黑素瘤相关抗原多巴色素互变异构酶的优势免疫表位(DCT180-188)的血液衍生的T细胞应答(参见图11)。
在第0天，C57BL/6小鼠(n＝5/组)接受1x108pfuAd-hDCT的肌内注射，接着在第14天初次免疫应答的高峰(图12a)或高峰前第8天(图12b)接受1x109pfuVSV-hDCT的静脉内注射(注意：Ad诱导的高峰为第12-14天)。7天后，在用肽重新刺激后，通过干扰素-γ胞内染色的流式细胞分析，测定了对黑素瘤相关抗原多巴色素互变异构酶的优势免疫表位(DCT180-188)的血液衍生的T细胞应答。这种策略在无肿瘤(图12a)和荷瘤(图12b；在这种情况下，颅内B16-F10黑素瘤，已知是免疫抑制的)两种情况下均产生效果。
在第0天，C57BL/6小鼠(n＝5/组)接受1x108pfuAd-hDCT的肌内注射，接着在第232天接受1x107pfuVSV-hDCT或ddVV-hDCT的静脉内注射。在用肽重新刺激后，通过干扰素-γ胞内染色的流式细胞分析，测定了对黑素瘤相关抗原多巴色素互变异构酶的免疫显性(SVY)(图13a)和第二最显性(VIT)(图13b)表位的血液衍生的T细胞应答。
在第0天，C57BL/6小鼠(n＝5/组)接受1x108pfuAd-hDCT的肌内注射，接着在第35天接受1x107pfuVSV-hDCT或VSV-deltaG-hDCT(导致非生产性感染的载体形式；被认为极其安全)的静脉内注射。在用肽重新刺激后，通过干扰素-γ胞内染色的流式细胞分析，测定了对黑素瘤相关抗原多巴色素互变异构酶的免疫显性(SVY)、第二最显性(VIT)和第三最显性(STF)表位的血液衍生的T细胞应答(图14)。
在第0天，C57BL/6小鼠(n＝5/组)接受1x108pfuAd-hDCT的肌内注射，接着在第8天接受1x109pfuVSV-hDCT的静脉内注射。在Ad后第8、15、22和29天，在用肽重新刺激后，通过干扰素-γ胞内染色的流式细胞分析，测定了对黑素瘤相关抗原多巴色素互变异构酶的免疫显性(SVY)表位的血液衍生的T细胞应答。与在B16-F10脑黑素瘤存在或不存在时仅Ad-hDCT或Ad+对照VSV载体(VSV-GFP)相比，更多的T细胞响应VSV-hDCT加强免疫产生肿瘤坏死因子(TNF)-α(图15a)(用双细胞因子产生细胞与单细胞因子产生细胞的比率表示)。另外，来源于VSV-hDCT加强免疫的小鼠的各T细胞产生更多的干扰素-γ(图15b)。
在第0天，C57BL/6小鼠(n＝5/组)接受1x108pfuAd-hDCT的肌内注射，接着在第232天接受1x107pfuVSV-hDCT或ddVV-hDCT的静脉内注射。在用肽重新刺激后，通过干扰素-γ胞内染色的流式细胞分析，测定了对黑素瘤相关抗原多巴色素互变异构酶的免疫显性(SVY)(图16a、c)和第二最显性(VIT)(图16b、d)表位的血液衍生的T细胞应答。对在每个细胞基础上产生的干扰素(IFN)γ的量(图16a、b)和同时分泌肿瘤坏死因子(TNF)α的产IFN-γ细胞的比例(图16c、d)进行了评价。
在第0天，C57BL/6(图17a、b)或BALB/c(图17c)小鼠(n＝5/组)接受1x108pfuAd-hDCT的肌内注射，接着17天(图17a)或35天(图17b、c)后接受1x109pfuVSV-SIIN(图14a)或VSV-hDCT(图17b、c)或VSV-鼠DCT(VSV-mDCT)(图17b)的静脉内注射。VSV后5天，在用肽重新刺激后，通过干扰素-γ胞内染色的流式细胞分析，测定了对SIINFEKL(图17a)或黑素瘤相关抗原多巴色素互变异构酶(图17b、c)的血液衍生的T细胞应答。
在第0天，C57BL/6小鼠(n＝5/组)接受1x108pfuAd-SIIN的肌内注射，接着在第17天接受1x109pfuVSV-SIIN的静脉内注射。Ad后10天(1°应答)和VSV后5天(2°应答)，通过四聚体染色法，测定了对SIINFEKL的血液衍生的T细胞应答。结果表示这些应答的频率(图18a)、数目(图18b)和倍数增加。
在第0天，C57BL/6小鼠(n＝5/组)接受1x108pfuAd-SIIN的肌内注射，接着在第14天接受1x109pfuVSV-SIIN的静脉内注射。在第10、19、51和233天，通过四聚体染色法，测定了对SIINFEKL的血液衍生的T细胞应答。应答的寿命见(图19a)。在第51天，对效应记忆(定义为CD127+CD62L-)(图19b)和中枢记忆(CD127+CD62L+)(图19c)SIINFEKL特异性细胞的比例进行了评价。
在第0天，C57BL/6小鼠(n＝5/组)接受1x108pfuAd-SIIN的肌内注射，接着在第14天接受1x109pfuwtVSV-hDCT或deltaM51VSV-hDCT的静脉内注射。VSV后5天，在用肽重新刺激后，通过干扰素-γ胞内染色的流式细胞分析，测定了血液衍生T应答(图20)。
C57/B6小鼠用Ad-hDCT初次免疫，然后14天后，用VSV-hDCT或Maraba-hDCT的静脉内剂量加强免疫。对外周血中的CD8+T细胞应答进行了免疫分析。在相等剂量下，由Maraba疫苗接种诱导的应答是相对于转基因的VSV诱导应答的3-8倍(图21)。在又一个实验中，C57/B6小鼠用Maraba-hDCT(2x109PFU静脉内)初次免疫或用Ad-hDCT(1x108PFUIM)初次免疫，并用Maraba-hDCT(2x109PFU静脉内)加强免疫。5天后，测定了血液和脾中的免疫应答(每种治疗三个条，左边的条为IFNγ+，中为TNFα+，右边的条为每种情况的双阳性)，见图22A。Ad初次免疫后9或12天(在Ad诱导的效应期高峰)，静脉内给予的Maraba-hDCT仍可加强免疫应答(图22B)。在BalB-C小鼠(、鼠如A所述治疗，条对于各种治疗从左到右表示IFNγ+、TNFα+和双+)中，静脉内给予的Maraba-hDCT和VSV-hDCT两者显著加强免疫应答，见图22C。
C57/B6小鼠用不同剂量的表达SIINFEKL-萤光素酶的VSV和牛痘初免，以引发对于该OVA表位的应答(图23A)，随后用静脉内给予的VSV-hDCT加强免疫。测定了SIINFEKL特异性T细胞应答，图23中显示，该T细胞应答被随后的VSV加强免疫显著加强。
给予C57/B6小鼠一次静脉内剂量的2x109PFUVSV-GFP，24小时后，收集脾用于流式细胞分析。61.3％的大量脾细胞为表示B细胞的B220+CD19+。50.8％的GFP阳性细胞为B220+CD19+，并在B细胞部分中测出。
用Ad-hDCT给野生型C57-B6和B细胞-/-小鼠疫苗接种以引发抗DCT免疫应答，其通过血液中的DCT特异性CD8+T细胞测定(图24A)。在静脉内给予VSV-hDCT后测定了二次应答。通过胞内染色法测定的IFNγ+CD8+T细胞的数目表示为+/-SEM。(图24B)表示加强免疫对B细胞的依赖。
野生型小鼠和/或免疫血清的B细胞过继地转移到B细胞缺陷型小鼠中。测定下列中的B细胞，用外周血淋巴细胞的百分比表示：1)野生型对照，2)B-/-加VSV，3)B-/-加VSV加血清，4)B-/-加B细胞VSV，和5)B-/-加B细胞加血清加VSV，见图25A。在VSV加强免疫后，测定了重建的B细胞-缺陷型小鼠中的抗DCTT细胞应答。IFNγ+CD8+T细胞数表示为+/-SEM。显示B细胞中应答提高的柱：1)B-/-加VSV，2)B-/-加VSV加血清，3)B-/-加B细胞VSV，和4)B-/-加B细胞加血清加VSV(图25B)。
给C57/B6小鼠静脉内注射VSV-SIIN(2x109pfu)，24小时后，收获脾，从全部脾细胞中纯化出CD19阳性细胞。使CD19+细胞与DKL细胞系共培养。T细胞的活化在SIIN肽(阳性对照)和阴性对照存在下，与得自VSV-SIIN免疫接种小鼠的CD19+细胞、得自VSV-SIIN免疫接种小鼠的CD19-细胞、与DKL共培养的得自VSV-SIIN免疫接种小鼠的CD19+细胞共培养来进行。结果表明，病毒感染的B细胞可刺激T细胞产生IFN-γ。
将脾B细胞从C57/B6小鼠中分离，并在muIL2中培养4天，然后荷载VSV-SIINFEKL/萤光素酶或Ad-SIINFEKL/萤光素酶(2小时感染、洗涤和收集)。将这些荷载的B细胞静脉内给予幼稚或初免受体。5天后测定了T细胞应答。用牛痘-SIINFEKL/萤光素酶初免的小鼠的T细胞显示对SIINFEKL肽的应答。用荷载VSV-SIINFEKL/萤光素酶的B细胞初免的小鼠的T细胞显示对SIINFEKL肽的应答。用荷载vAd-SIINFEKL/萤光素酶的B细胞初免的小鼠的T细胞显示对SIINFEKL肽的最小应答。用牛痘-SIINFEKL/萤光素酶初免，然后用荷载VSV-SIINFEKL/萤光素酶的B细胞加强免疫的小鼠的T细胞显示对SIINFEKL肽的应答。用牛痘-SIINFEKL/萤光素酶初免，然后用荷载Ad-SIINFEKL/萤光素酶的B细胞加强免疫的小鼠的T细胞显示对SIINFEKL肽的应答(每种情况下，TNFα为Y轴，IFNγ为X轴)。
讨论
用腺病毒通过肌内注射14天给小鼠免疫接种。将单剂量的重组VSV通过肌内、皮下、腹膜内、鼻内或静脉内途径递送至小鼠作为初免加强免疫疫苗接种方案的加强免疫部分。7天后测定了抗原特异性T细胞应答，注意到当VSV经静脉内递送时，有显著较大的T细胞应答(参见图11)。
在这个初免加强免疫疫苗接种模型中，测定了由VSV诱导的免疫应答加强的时机。在初次免疫应答高峰时(第14天)或在高峰前的第8天(在效应期)静脉内给予加强免疫。7天后测定的T细胞应答显示，VSV加强免疫能够在初次免疫应答高峰时和之前加强免疫应答。在无肿瘤小鼠和荷瘤小鼠及由此的免疫抑制环境中证实了这一点(参见图12)。值得注意的是，在效应期内加强免疫是有效的。效应T细胞一般在这类加强免疫载体起作用前减少。
VSV的免疫加强能力与对照牛痘病毒的相当。初次免疫后232天进行了加强免疫(这种长间隔期允许VSV低至1/100的剂量便达到上述T细胞加强免疫的同一水平)，并测试了对2种不同的抗原特异性肽的T细胞应答。通过血液衍生的T细胞应答测定，发现对于所测试的2种抗原肽，VSV的加强免疫的能力明显大于牛痘病毒的加强免疫能力(参见图13)。
测定了VSV的突变体形式加强免疫应答的能力，所述突变体形式可在最初被感染的细胞内复制其基因组和表达基因，但无法产生感染性子代。用于初免加强免疫方案的抗原的3个优势表位的血液衍生的T细胞应答表明，突变型VSV与野生型形式一样有效地加强免疫应答(参见图14)。这就表明不能传播的病毒的更安全形式可用来加强免疫应答。
对于VSV加强免疫，通过对多种细胞因子的产生以及每个细胞产生的细胞因子的量的测定，对用VSV加强免疫诱导的T细胞的质量进行了评价。将该质量与仅初次疫苗接种或VSV对照载体(无插入的Ag转基因)加强免疫诱导的T细胞的质量进行了比较。由抗原特异性VSV加强免疫产生的T细胞产生多种细胞因子和较大量的干扰素-γ(参见图15)。还将含抗原的VSV加强免疫诱导的T细胞的质量与牛痘病毒加强免疫的质量进行了比较。VSV加强免疫群的T细胞也产生较大量的干扰素γ，并也分泌较大量的肿瘤坏死因子α(参见图16)。
用初免加强免疫VSV方案测试了两种不同的小鼠品系，按两种不同的抗原的方式。在所有情况下，在给予VSV后观察到大规模免疫加强(参见图17)。
测定了在VSV介导的免疫加强中对CD4+辅助T细胞的需要。在有和没有CD4细胞耗竭两种情况下，对加强免疫后的T细胞应答进行了分析。正如通过CD8+T细胞的百分比、数目和倍数增加测定的一样，耗竭对初次免疫应答产生影响，但对二次应答无影响(参见图18)。因此，VSV初免加强免疫方法为治疗无免疫应答的患者(例如患有AIDS/HIV感染的患者)提供了希望。
在加强免疫后10、19、51和233天测定了加强的免疫应答的耐久性。在这些时间点测定的T细胞应答表明，免疫应答长期保持。对第51天的效应记忆和中枢记忆细胞的比例的评价表明，与仅初免的应答相比，有较高比例的效应细胞转换成记忆表型(参见图19)。一旦抗原被清除，则不再需要效应细胞。在这点上，较大量的记忆细胞，尤其中枢记忆细胞，在再次遇到该抗原时，可确保更好的重新扩繁。
可以使用携带在基质蛋白中赋予其不能阻断干扰素产生的deltaM51突变的VSV载体(因此称为干扰素诱导性突变体)来产生类似的加强免疫效果。小鼠用Ad-hDCT初免，其随后用野生型VSV-hDCT(wtVSV-hDCT)或deltaM51VSV-hDCT(dM51VSV-hDCT)加强免疫，并且测定血液中的DCT特异性T细胞(参见图20)。deltaM51VSV载体通过体内引入干扰素而减毒，因此既是更安全的载体，又具有相关溶瘤性质。这就表明在静脉内递送后，可采用各种方法使VSV减毒，同时保持加强免疫应答的能力。
载有VSV的疫苗在静脉内给予时是特别有效的免疫加强剂。该方法独特显著的特征包括应答幅度、记忆耐久性、优选的递送途径、CD4T细胞独立性、早期加强免疫应答的能力(在效应期内)、诱导T细胞的一流质量的能力、加强对亚优势表位的应答和更安全的减毒载体的顺应性。可将这个策略应用于所需要的任何抗原中，包括例如来源于病原体的外源抗原以及自身抗原、靶向肿瘤的癌胚抗原和新抗原。对于预防性和治疗性疫苗接种两者，加强免疫可与任何初免策略联用以加强T细胞和抗体应答。同样，可使用水泡性病毒或棒状病毒科的其它成员替换VSV作为加强免疫载体。这些加强免疫病毒的各种非复制或突变体形式亦可用作加强免疫载体。
静脉内给予的VSV感染脾的B细胞。静脉内给予的VSV载体的加强免疫能力依赖于B细胞。静脉内给予的VSV感染脾中的B细胞。当在给予VSV后分离这些细胞时，它们表现为离体将转基因抗原呈递给特异性T细胞。荷载有VSV疫苗的B细胞离体是给幼稚和致敏动物疫苗接种的良好的疫苗接种平台。还可使用具有B细胞向性的其它病毒达到这些效果。
本文提及的参考文献的相关部分通过引用结合到本文中。
Claims (10)
1.复制型溶瘤棒状病毒载体在制备用于治疗哺乳动物的目标癌症的、静脉内给予的药物中的用途，其中所述载体表达哺乳动物对之具有预存免疫力的肿瘤抗原，其中所述肿瘤抗原是所述目标癌症相关的天然肿瘤抗原并诱导哺乳动物针对所述目标癌症细胞的免疫应答，并且其中所述哺乳动物未曾接触过所述棒状病毒载体；
其中所述哺乳动物在给予所述溶瘤载体前用所述肿瘤抗原免疫接种以对该抗原产生预存免疫力；和
其中所述棒状病毒载体为水泡性病毒。
2.权利要求1限定的用途，其中所述载体经修饰以表达所述肿瘤抗原。
3.权利要求1限定的用途，其中所述肿瘤抗原是肿瘤相关抗原。
4.权利要求1限定的用途，其中所述肿瘤抗原选自癌胚抗原、表面糖蛋白、细胞表面标记、黑素瘤相关抗原、癌-睾丸抗原、癌基因和病毒癌基因。
5.权利要求4限定的用途，其中所述肿瘤抗原选自多巴色素互变异构酶、GP100、MART1、甲胎蛋白和癌胚抗原。
6.权利要求1限定的用途，其中所述水泡性病毒选自水泡性口炎病毒和Maraba病毒。
7.权利要求1限定的用途，其中所述癌症是黑素瘤。
8.权利要求1限定的用途，其中以足以诱导免疫应答的量给予所述抗原。
9.权利要求1限定的用途，其中在给予所述溶瘤载体前，有至少约4天的产生免疫应答的间隔期。
10.一种用于治疗权利要求1-9中任一项限定的目标癌症的药盒，所述药盒包括：
1)适于诱导哺乳动物的免疫应答的量的肿瘤抗原或表达肿瘤抗原的载体，其中所述肿瘤抗原为目标癌症相关的天然肿瘤抗原，和
2)表达适于提高免疫应答的量的所述肿瘤抗原、并且为适于静脉内给药形式的溶瘤棒状病毒载体，其中所述哺乳动物未曾接触过所述棒状病毒载体；
其中所述棒状病毒载体为水泡性病毒。
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