CN102442996B - 多胺类小分子显像剂、其生产方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及多胺类小分子化合物，具有如下结构，其中，M^x+＝0，Zn²⁺，Ga³⁺，Gd³⁺，Ca²⁺或其它二、三价金属离子；S＝报告基团(包括核素标记辅基、顺磁性物质、荧光素或微泡)，如核素标记辅基：-¹¹CH₃，-CH₂CH₂ ¹⁸F，-CH₂CH₂(OCH₂CH₂)₂NHCOC₆H₄ ¹⁸F-p或-CH₂CH₂(OCH₂CH₂)₂NH-CH₂CH₂ ¹⁸F；R＝-H，-OCH₃，-OCH₂CH₃或-Cl；R1、R2、R3和R4为氢、羧基、烷烃基、烯烃基或杂烷基。本发明还涉及该类化合物在制备靶向磷脂酰丝氨酸(PS)和/或凋亡细胞早期游离Zn²⁺的细胞死亡或细胞凋亡显像剂中的应用。本发明的化合物，为靶向磷脂酰丝氨酸(PS)或凋亡细胞早期游离Zn²⁺的特异性多胺类小分子显像剂，可用于与PS有关的抗肿瘤化学治疗、放射治疗、生物治疗等疗效监测；可用于神经退行性疾病(老年性痴呆、帕金森氏病)、脑中风、艾滋病、血栓、动脉粥样斑、以及心肌梗塞的早期鉴别诊断；也可用于其他与细胞死亡或细胞凋亡过程中表达PS有关疾病的鉴别诊断与疗效监测，如炎症显像与抗炎症治疗显像。

Description

多胺类小分子显像剂、其生产方法及其应用

【技术领域】

本发明涉及正电子发射断层(PET)显像剂(药物)、其生产方法及其应用，尤其涉及细胞凋亡偶合多价多胺类小分子化合物、其生产方法及其在制备PET显像剂中的应用。 

【背景技术】

肿瘤治疗机制之一就是干扰DNA的合成及细胞的分裂，诱导肿瘤细胞凋亡，从而达到抑制或清除肿瘤的目的。而恶性肿瘤细胞对化疗、放疗或某些激素治疗会产生耐药性，这与其逃避诱导凋亡的能力有关，肿瘤治疗后最初的肿瘤细胞凋亡程度也可反映治疗的敏感性。因此，检测细胞凋亡在恶性肿瘤治疗评估中具有非常重要的作用。传统观念认为抗肿瘤治疗是引起癌症细胞凋亡，但最近研究表明细胞凋亡并不是固体实瘤治疗引起的主要死亡形式。抗肿瘤治疗主要通过两种途径导致细胞死亡，即细胞凋亡死亡途径和非细胞凋亡死亡途径，非细胞凋亡死亡包括细胞坏死、有丝分裂障碍、自吞噬、衰老等细胞死亡形式^[1-4]。通常抗肿瘤治疗在引起细胞凋亡的同时，也会伴随非细胞凋亡死亡(如细胞坏死、有丝分裂障碍、自吞噬和衰老)发生，两者有时无严格界限。可见，检测细胞凋亡和细胞死亡同样重要，均可能准确评估肿瘤治疗效果。 

细胞凋亡(Apoptosis)，又称为程序性细胞死亡(Programmed cell death，PCD)，是一种区别于细胞坏死由多种基因调控的主动性细胞死亡过程，通过死亡受体途径或通过线粒体途径启动之后，凋亡细胞自身均会产生一系列的病理生理改变，在这一过程中凋亡细胞将产生(或暴露、结合)多种可识别的、特异性的化学信号(靶标)。磷脂酰丝氨酸(Phosphatidyl serine，PS)就是研究较为 深入的凋亡细胞表面重要信号(靶标)之一^[4，5]。PS是一种带负电荷的磷脂，正常状态下分布于细胞膜脂双层的内层，主要靠翻转酶(floppase)和移位酶(translocase)这两种ATP依赖性酶的作用来维持其内向性。细胞凋亡早期，细胞内Ca²⁺水平增加，这两种ATP酶失活及爬行酶(scramblase)的激活使PS由内膜移向外膜，暴露于细胞表面。AnnexinV是一种人体内源性Ca²⁺依赖性磷脂结合蛋白家族，分子量为36000，在钙离子存在下，Annexin V可与凋亡早期细胞外在表达的PS快速结合，具有高亲和力^[6]。由于PS从细胞膜脂双层内层迁移至外层是细胞凋亡级联反应的初始事件，亦即PS的外翻在细胞凋亡过程中出现的时间要明显早于DNA的降解及可辨认的细胞形态学改变。因此，利用AnnexinV和PS的高度亲和作用可早期检测细胞凋亡的发生，具有较高的时效性。另外，PS外翻不仅发生于凋亡细胞，也会在非凋亡细胞死亡时发生，PS外翻通常也伴随着坏死细胞、有丝分裂障碍、自吞噬、衰老等死亡形式的发生^[5，7]。可见，PS可作为细胞死亡的靶点，靶向PS显像剂(标记AnnexinV)可测定抗肿瘤治疗总的死亡细胞，从而可望准确评估抗肿瘤治疗效果。其中，^99mTc-Annexin V是应用较广的细胞凋亡显像剂，已应用于单光子发射计算机断层成像(SPECT)临床试验，显示很好应用前景^[8]。¹⁸F-Annexin V^[9]也已研制成功并用于临床前动物PET显像实验研究。然而，标记Annexin V也存在以下严重不足：(1)分子量较大(3.6×10⁴)，血液清除较慢，较低的靶/非靶放射性比值，早期显像效果不佳^[1，9]；(2)标记Annexin V成本高，价格昂贵；(3)具有免疫原性^[5]。另外，突触结合蛋白I的C2A片段^[10]及分子量较少的蛋白质AFIM^[11]的标记化合物也有报道，尽管它们与PS具有较强的特异性结合能力，且分子量比Annexin V少，但仍具有与Annexin V相类似的缺陷^[5]。 

靶向磷脂PS非多肽蛋白质类小分子显像剂的研制是细胞凋亡分子显像极其重要发展方向^[5]。目前，在半胱天冬酶(Caspase)小分子抑制剂和诱导剂、检测线粒体膜电位下降显像剂和凋亡细胞膜印迹显像剂等细胞凋亡小分子PET显像剂研发方面有了较大发展，但至今尚没发现靶向磷脂PS非多肽蛋白质类小分子PET显像剂的研究报道^[9]。现有两类与磷脂PS有关的小分子化合物引起人们强烈 研究兴趣：一类是ApoSense小分子化合物(凋亡细胞膜印迹显像剂)。这类化合物作用机理可能涉及靶向细胞膜，通过细胞膜电位不可逆损失、外部细胞膜单张和细胞质永久酸化以及膜磷脂爬行酶系统活化而选择性地被凋亡细胞摄取，从而保持膜的完整性。目前，ApoSense小分子化合物包括丹酰化衍生物和烷基丙二酸衍生物。丹酰化衍生物不能区分坏死细胞和凋亡细胞，但只有体外实验研究报道；烷基丙二酸衍生物如¹⁸F-ML-10能区分坏死细胞和凋亡细胞，已用于动物细胞凋亡PET显像，并已初步用于临床PET显像的研究报道^[9]。另一类是靶向磷脂PS的小分子Annexin V模拟物。这类化合物已用于体外实验研究，并取得较好实验结果。最有应用前景的是二-(Zn²⁺-2，2’-二吡啶甲基胺)类配合物(DPAZn2)配合物，属于依赖Zn²⁺型小分子化合物，其作用机制与Annexin V相类似，靶向带负电荷磷脂PS^[6，12]。目前，含有报告要素荧光素的DPAZn2配位物(指的是二价含锌离子DPA，即含两个Zn²⁺-DPA基团，简写为DPAZn2)，已用于体外细胞凋亡实验和动物细胞凋亡光学显像研究^[13]，但尚无放射性核素标记Zn²⁺-DPA配位物的研究报道。此外，尚有一类非靶向磷脂PS的环多胺类小分子荧光配合物(Dansylamidoethylcyclen，Cyclen)特别引人关注。其结构与丹酰化DPA有些类似，它用于细胞凋亡测定的可能机理是：通常情况下，Zn²⁺与金属蛋白质牢固结合在一起，但在细胞凋亡早期，细胞内游离Zn²⁺流出量显著增加，Cyclen与细胞内Zn²⁺有很高亲和力，它们的结合可形成含Zn²⁺强荧光配合物，从而可用体外荧光法测定。体外实验表明，Dansylamidoethylcyclen可区分坏死细胞和早期凋亡细胞，并优于Annexin V类探针^[14]。但是，如果早期肿瘤凋亡细胞内游离Zn²⁺浓度较低时，Dansylamidoethylcyclen很难检出凋亡细胞，目前也无放射性核素标记Dansylamidoethylcyclen的研究报道。 

参考文献： 

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【发明内容】

1、本发明设计了以下化合物，可作为细胞凋亡偶合多胺类小分子显像剂，包括多价多胺类小分子显像剂和杂交多胺类小分子显像剂，其一般结构式为： 

其中M^x+＝0，Zn²⁺，Ga³⁺，Gd³⁺，Ca²⁺或其它二、三价金属离子； 

S＝报告基团，为核素标记辅基、顺磁性物质、荧光素或微泡； 

R＝-H，-OCH₃，-OCH₂CH₃或-Cl； 

R1、R2、R3、R4为氢、羧基、烷烃基、烯烃基或杂烷基等，其中苯环右侧的多胺类取代基可以在R取代基的邻位，也可以在其间位；可按以下方式连接构成： 

(1)含两个2，2’-二吡啶甲基胺(DPA)类配合物(三胺类化合物)，一般结构式： 

(2)含两个三氮杂环九烷基(NOTA)类配合物(环三胺类化合物)，一般结构式： 

(3)含两个四氮杂环十二烷基(Cyclen)类配合物(环四胺类化合物)，一般结构式为： 

(4)含两个四氮杂环十四烷基(Cyclam)类配合物(环四胺类化合物)，一般结构式为： 

多胺类小分子显像剂报告基团核素标记辅基可采用：-¹¹CH₃，-CH₂CH₂ ¹⁸F， -CH₂CH₂OCH₂CH₂)₂NHCOC₆H₄ ¹⁸F-p或-CH₂CH₂(OCH₂CH₂)₂NH-CH₂CH₂ ¹⁸F。 

2、本发明优选以下化合物，可以作为细胞凋亡偶合多胺类小分子显像剂。 

(1)二价DPA类显像剂。 

Zn²⁺-2，2’-二吡啶甲基胺(DPA)类结构式： 

¹¹C或¹⁸F标记DPA2(二价DPA)或DPAZn2(二价Zn²⁺-DPA)化合物有： 

系列化合物A                            系列化合物B 

二价光学显像剂有Dansyl-DPAZn2(丹酰化二价Zn²⁺-DPA)和Dansyl-DPA： 

系列化合物C 

系列化合物C是光学显像剂，无放射性同位素。 

(2)二价NOTA类、Cyclen类和Cyclam类显像剂。 

NOTA(三氮杂环九烷基)类、Cyclen(四氮杂环十二烷基)类和Cyclam(四氮杂环十四烷基)类结构式： 

¹¹C或¹⁸F标记NOTA、Cyclen和Cyclam化合物： 

系列化合物D 

系列化合物E                  系列化合物F 

(3)杂交多价多胺类小分子显像剂。 

杂交型不含锌配合物显像剂¹¹C(或¹⁸F)-DPA2-Cyclen2： 

系列化合物G 

杂交型含锌配合物显像剂¹¹C(或¹⁸F)-DPAZn2-CyclenZn2： 

系列化合物H 

3、本发明化合物的合成方法 

1)偶合多胺类小分子显像剂采用以下两种方法合成。 

(1)酚羟基前体(A)与标记中间体发生烷基化反应。 

①含酚羟基前体(A)在碱性溶液分别与¹¹C-三氟甲磺酸甲酯(¹¹CH₃OSO₂CF₃)和对甲苯磺酸-2-¹⁸F-氟乙基酯(¹⁸FCH₂CH₂OTs)反应，生成不含锌离子PET显像剂(B)。 

②不含锌离子PET显像剂(B)与Zn(NO₃)₂反应生成含锌离子PET显像剂(C)。 

(2)苯氧基乙氧基乙基胺前体(D)与标记中间体的烷基化或酰化反应。 

①含酚羟基前体(A)在碱性溶液与2-(2-(2-(叔丁氧羰基)乙氧基)乙氧基)对甲磺酸乙酯(TsOCH₂CH₂(OCH₂CH₂)₂NHBoc)反应后，经三氟乙酸(TFA)水解得含游离氨基化合物(D)。 

②含游离氨基化合物(D)经烷基化或酰化反应生成不含锌离子PET显像剂(E)。 

③不含锌离子PET显像剂(E)与Zn(NO₃)₂反应生成含锌离子PET显像剂(F)。 

2)细胞凋亡二价DPA类小分子显像剂¹⁸F-FEN-DPA、¹⁸F-FEN-DPAZn2、 ¹⁸F-FB-DPA、¹⁸F-FB-DPAZn2、Dansyl-DPA和Dansyl-DPAZn2(DPAZn2指的是二二价含锌离子DPA，即含两个Zn²⁺-DPA基团，简写为DPAZn2)、二价环状多胺类小分子显像剂(NOTA类、Cyclen类和Cyclam类)、以及杂交多价多胺类小分子显像剂的合成路线如下： 

(1)¹⁸F-FEN-DPA、¹⁸F-FEN-DPAZn2、¹⁸F-FB-DPA和¹⁸F-FB-DPAZn2的合成。 

①5-羟基间苯二甲酸二甲酯(1)经四氢铝锂还原成3，5-二羟甲基苯酚(2)。 

②3，5-二羟甲基苯酚(2)与2-(2-(2-(叔丁氧羰基)乙氧基)乙氧基)对甲磺酸乙酯(3)反应生成(2-{2-[2-(3，5-二羟甲基-苯氧基)-乙氧基]-乙氧基}乙基)-氨基甲酸叔丁酯(4)。 

③(4)与甲磺酰氯(MsCl)反应生成(2-{2-[2-(3，5-二甲磺酰氧基甲基-苯氧基)-乙氧基]-乙氧基}乙基)-氨基甲酸叔丁酯(5)。 

④(5)与二甲基吡啶胺反应生成(2-{2-[2-(3，5-二-N，N-二(2-甲基吡啶)胺甲基-苯氧基)乙氧基]-乙氧基}乙基)-氨基甲酸叔丁酯(6)。 

⑤(6)经三氟乙酸(TFA)水解后生成前体(2-{2-[2-(3，5-二-N，N-二-(2-甲基吡啶)胺甲基-苯氧基)乙氧基]-乙氧基}乙基)-氨基(7)。 

⑥前体(7)与含报告基团化合物反应，如与对甲苯磺酸-2-氟乙酯(TsOCH₂CH₂ ¹⁹F)或1-溴-2-氟乙烷(BrCH₂CH₂ ¹⁹F)反应生成标准品¹⁹F-FEN-DPA2。前体 (7)与N-琥珀酰亚胺-4-[¹⁹F]氟代苯甲酸酯(¹⁹F-SFB)反应生成标准品 ¹⁹F-FB-DPA2。前体(7)分别与TsOCH₂CH₂ ¹⁸F(或BrCH₂CH₂ ¹⁸F)、¹⁸F-SFB或¹¹CH₃I得 ¹⁸F-FEN-DPA2、¹⁸F-FB-DPA2或¹¹C-Methy1-DPA2。 

⑦不含锌化合物¹⁸F-FEN-DPA2和¹⁸F-FB-DPA2进一步分别与硝酸锌反应生成含锌配合物PET显像剂¹⁸F-FEN-DPAZn2和¹⁸F-FB-DPAZn2。 

(2)二价DPA类光学显像剂Dansy1-DPA和Dansy1-DPAZn2的合成。 

①前体(7)与丹磺酰氯反应生成丹磺酰化-N-(2-{2-[2-(3，5-二-N，N-二(2-甲基吡啶)胺甲基-苯氧基)乙氧基]-乙氧基}乙基)氨基(Dansyl-DPA2)。 

②不含锌化合物Dansyl-DPA2与硝酸锌反应生成含锌配合物光学显像剂Dansy1-DPAZn2(11)。 

(3)二价环状多胺类(NOTA类、Cyclen类和Cyclam类)显像剂的合成。 

①叔丁氧羰基(Boc)或羧基叔丁酯(COOtBu)保护的二价环状多胺类前体(12)，在碱性溶液中分别与¹¹C-三氟甲磺酸甲酯(¹¹CH₃OSO₂CF₃)、对甲苯磺酸-2-¹⁸F-氟乙基酯(¹⁸FCH₂CH₂OTs)反应，生成¹¹C或¹⁸F标记二价环状多胺类化合物(13)。 

②化合物(13)在盐酸中水解生成不含锌离子二价环状多胺类化合物(14)。 

③化合物(14)与硝酸锌反应生成¹¹C或¹⁸F标记含锌配合物二价环状多胺类(NOTA类、Cyclen类和Cyclam类)显像剂。 

(4)杂交多价多胺类小分子显像剂的合成。 

①杂交多胺类小分子前体(15)，分别与¹¹C-三氟甲磺酸甲酯(¹¹CH₃OTf)、对甲苯磺酸-2-¹⁸F-氟乙基酯(¹⁸FCH₂CH₂OTs)或¹⁸F-SFB反应，生成¹¹C或¹⁸F标记不含锌杂交多价多胺类(DPA类与Cyclen类)显像剂(16)。 

②化合物(16)与硝酸锌反应生成¹¹C或¹⁸F标记含锌配合物杂交多价多胺类(DPA类与Cyclen类)显像剂(17)。 

体外细胞凋亡实验表明，肿瘤细胞经抗肿瘤治疗后除能产生凋亡细胞，也会伴随坏死细胞的产生；丹酰基有可能是与死亡细胞作用的药效基团。本发明的¹⁹F-FEN-DPAZn2和¹⁹F-FEN-DPA2均可与死亡细胞作用；Dansyl-DPAZn2与Annexin-V-FITC作用机理相类似，均与磷脂酰丝氨酸(PS)有高结合力，DPAZn2可能优于Annexin V，但它与Annexin-V-FITC也不能区分坏死细胞和凋亡细胞，只能用于死亡细胞的测定。Dansyl-DPA2作用机理可能涉及凋亡细胞内游离Zn²⁺和PS，它与死亡细胞作用较弱的原因，可能与肿瘤凋亡细胞内游离Zn²⁺浓度较低，且只能形成较低浓度Dansyl-DPAZn2有关。可见，DPA-Zn²⁺及其类似结构可能是一种与死亡细胞作用的药效基团。本发明的DPA-Zn²⁺类显像剂可能比烷基丙二酸ApoSense类小分子显像剂(可区分凋亡细胞和坏死细胞)能更全面评估抗肿瘤治疗效果，也可用于心脑血管某些疾病的早期诊断和抗肿瘤治疗监测。 

抗肿瘤治疗体内PET显像实验表明，含锌DPA显像剂¹⁸F-FB-DPAZn2和 ¹⁸F-CyclenZn2分别与不含锌显像剂¹⁸F-FB-DPA2和¹⁸F-Cyclen2相比，抗肿瘤治疗 后肿瘤组织可高度摄取¹⁸F-FB-DPAZn2，但摄取¹⁸F-FB-DPA2较低；治疗后与治疗前比较，肿瘤组织摄取¹⁸F-FDG略有降低。这些实验结果，说明多胺类显像剂(¹⁸F-FB-DPAZn2和¹⁸F-CyclenZn2)是很有前景的细胞死亡二价小分子PET显像剂，且在治疗监测方面优于¹⁸F-FDG。 

进一步的实验表明，本发明的化合物，均为靶向磷脂酰丝氨酸(PS)或凋亡细胞早期游离Zn²⁺的特异性多胺类小分子显像剂，因而可用于以下与PS有关的疾病诊疗方面研究。1)抗肿瘤化学治疗、放射治疗、生物治疗等疗效监测；2)神经退行性疾病(老年性痴呆、帕金森氏病)、脑中风、艾滋病、血栓、动脉粥样斑、以及心肌梗塞的早期鉴别诊断；3)其他，与细胞死亡或细胞凋亡过程中表达PS有关病变的鉴别诊断与疗效监测，如炎症显像与抗炎症治疗显像。 

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。 

【附图说明】

图1为¹⁸F-FEN-DPA2放化合成工艺示意图。 

图2为¹⁸F-FB-DPA2放化合成工艺示意图。 

图3为HPLC测定¹⁸F-FEN-DPA和¹⁸F-FB-DPA2的放射化学纯度结果图。 

图4为丹酰化DPA(Dansyl-DPA2)及丹酰化Zn²⁺-DPA(Dansyl-DPAZn2)染色Hela细胞体外凋亡试验结果图。 

图5为¹⁹F-FEN-DPAZn2和¹⁹F-FEN-DPA对Annexin-V-FITC/PI体外凋亡抑制试验结果图。 

图6为荷瘤裸鼠经抗肿瘤治疗前后，¹⁸F-FB-DPAZn2、¹⁸F-FB-DPA2、¹⁸F-FDGPET显像图像。 

图7为炎症小鼠模型¹⁸F-FDG PET显像图像。 

图8为炎症小鼠模型¹⁸F-FB-DPAZn2PET显像图像。 

图9为荷瘤小鼠模型经抗肿瘤治疗后，¹⁸F-CyclenZn2PET显像图像。 

图10为炎症小鼠模型¹⁸F-CyclenZn2PET显像图像。 

【具体实施方式】

【实施例1】¹⁸F-FEN-DPAZn2和¹⁸F-FB-DPAZn2前体的合成 

1.15-羟基间苯二甲酸二甲酯(1)的合成 

5-羟基间苯二甲酸(10g，54.9mmol)溶于100mL甲醇，加入5mL浓硫酸，加热回流反应12小时。将体系冷却，有白色固体析出，过滤，滤饼用甲醇洗涤，干燥得到白色固体10.93g，收率94％。熔点：102-104℃。 

1.23，5-二羟甲基苯酚(2)的合成 

将5-羟基间苯二甲酸二甲酯(1)(5g，23.8mmol)，加入100mL干燥的四氢呋喃，分批加入四氢铝锂(2.7g，71.4mmol)，加热回流反应3小时。将体系冷却至室温，滴加蒸馏水至无气泡产生。加稀盐酸调pH＝3，乙酸乙酯萃取(50mL×3)，合并有机相后无水硫酸钠干燥，浓缩，乙酸乙酯重结晶，得到浅黄色方形晶体。抽滤，干燥，得到固体3.34g，收率91％，熔点71.8-72.4℃。¹H NMR(CDCl₃，400MHz)δ：4.38(d，J＝6Hz，4H)，5.08(t，J＝6Hz，2H)，6.59(s，2H)，6.66(s，1H)，9.21(s，1H)。 

1.3(2-{2-[2-(3，5-二羟甲基-苯氧基)-乙氧基]-乙氧基}乙基)-氨基甲酸叔丁酯(4)的合成 

将2-(2-(2-(叔丁氧羰基)乙氧基)乙氧基)对甲磺酸乙酯(3)(2.3g，7.34mmol)，3，5-二羟甲基苯酚(2)(1.13g，7.34mmol)，无水碳酸钾(3.04g，22.02mmol)，20mL乙腈加入到烧瓶中，加热回流反应11小时。将反应体系中的乙腈蒸干，加入20mL蒸馏水，氢氧化钠调pH＝13，乙酸乙酯萃取(20mL×3)。合并有机层，无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶柱层析分离(石油醚∶乙酸乙酯＝1∶8)，得到黄色油状液体1.32g，收率47％。 

1.4(2-{2-[2-(3，5-二甲磺酰氧基甲基-苯氧基)-乙氧基]-乙氧基}乙基)-氨基甲酸叔丁酯(5)的合成 

(2-{2-[2-(3，5-二羟甲基-苯氧基)-乙氧基]-乙氧基}乙基)-氨基甲酸叔丁酯(4)(1.32g，3.42mmol)溶于10mL干燥的二氯甲烷中，冰浴冷却至0℃， 加入三乙胺(2.08g，20.54mmol)，滴入甲磺酰氯(2.35g，20.54mmol)，室温反应1小时。减压蒸出溶剂，加入20mL蒸馏水，二氯甲烷萃取(20mL×3)，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，浓缩，柱层析(石油醚∶乙酸乙酯＝1∶2)，得到无色液体1.23g，收率66％。 

1.5(2-{2-[2-(3，5-二-N，N-二(2-甲基吡啶)胺甲基-苯氧基)乙氧基]-乙氧基}乙基)-氨基甲酸叔丁酯(6)的合成 

将(2-{2-[2-(3，5-二甲磺酰氧基甲基-苯氧基)-乙氧基]-乙氧基}乙基)-氨基甲酸叔丁酯(5)(1.15g，2.12mmol)溶于25mL乙腈中，加入无水碳酸钾(1.17g，8.46mmol)，二甲基吡啶胺(1.06g，5.3mmol)，氩气保护，室温反应过夜。先将乙腈蒸出，加入蒸馏水15mL，乙酸乙酯萃取(20mL×3)，合并有机相。无水硫酸钠干燥，蒸干溶剂，得到棕黄色油状液体1.71g。 

1.6(2-{2-[2-(3，5-二-N，N-二-(2-甲基吡啶)胺甲基-苯氧基)乙氧基]-乙氧基}乙基)-氨基(7)的合成 

将(2-{2-[2-(3，5-二-N，N-二(2-甲基吡啶)氨甲基-苯氧基)乙氧基]-乙氧基}乙基)-氨基甲酸叔丁酯(6)粗品1.71g，加入10mL二氯甲烷充分溶解，冰浴冷却，滴加三氟乙酸的二氯甲烷溶液(50％，v/v)10mL，室温反应4小时。减压蒸出溶剂，加入饱和碳酸钠溶液调pH＝10，二氯甲烷萃取(20mL×4)，合并有机相。干燥，浓缩，得到棕红色油状液体，硅胶柱层析分离(乙酸乙酯∶氨的甲醇溶液＝5∶1，氨的甲醇溶液浓度为4.11mol/L)，得到纯品0.69g，两步反应收率50％。¹H NMR(CDCl₃，400MHz)δ：8.51(d，4H，J＝4.2Hz)，7.56-7.85(m，8H)，7.11-7.14(m，4H)，7.07(s，1H)，6.89(s，2H)，4.08-4.15(m，2H)，3.86-3.89(m，2H)，3.80(s，8H)，3.70-3.74(m，2H)，3.64(s，4H)，3.53(t，2H，J＝5.2Hz)，2.87(t，2H，J＝5.2Hz)，2.08(s，2H)。 

1.7标准品¹⁹F-FEN-DPA的合成[即化合物(7)与对甲苯磺酸-2-氟乙酯反应得化合物(8)部分的反应式] 

(2-{2-[2-(3，5-二-N，N-二(2-甲基吡啶)氨甲基-苯氧基)乙氧基]-乙氧基}乙基)-氨基(7)(340mg，0.52mmol)溶于15mL乙腈中，加入无水碳酸钾(100 mg，0.72mmol)，对甲苯磺酸-2-氟乙酯(140mg，0.63mmol)，室温搅拌24h，反应完毕。先将溶剂蒸除，加入20mL蒸馏水，乙酸乙酯萃取(20mL×4)，合并有机相，无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶柱层析(乙酸乙酯∶氨的甲醇溶液＝4∶1)，得到90mg纯品，反应收率25％。¹H NMR(CDCl₃，400MHz)δ：8.51(d，4H，J＝4.8Hz)，7.64-7.56(m，8H)，7.06-7.14(m，4H)，7.06(s，1H)，6.89(s，2H)，4.46-4.58(m，2H)，4.14-4.13(m，2H)，3.87-3.84(m，2H)，3.79(s，8H)，3.62-3.67(m，2H)，3.73-3.71(m，2H)，2.95(td，2H，J＝4.8Hz，J＝28.2Hz)，2.84(t，2H，J＝5.2Hz)，2.01(s，2H)。 

【实施例2】¹⁸F-FEN-DPAZn2和¹⁸F-FB-DPAZn2的放射合成 

2.1¹⁸F-FEN-DPA2的放化合成[见化合物(7)转化为化合物(8)的反应式] 

如图1所示，用PET-MF-2V-IT-I型氟-18多功能合成模块(派特(北京)科技有限公司生产，Tang G*，Tang X，Wen F，Wang M，Li B.A facile and rapid automated synthesis of 3’-deoxy-3’-[¹⁸F]fluorothymidine.Appl Radiat Isot，2010，68：1734-1739.)进行¹⁸F标记，具体标记操作如下： 

2.1.1¹⁸F^-由Cyclone 10/5型IBA公司生产的加速器，通过¹⁸O(p，n)¹⁸F反应生产。应用2.0mL H₂ ¹⁸O靶，用10.5MeV、25μA的质子束流连续轰击靶10-60min生产¹⁸F^-，取一定活度¹⁸F^-的靶水过QMA柱； 

2.1.2¹⁸F-被QMA捕获后，用瓶a中的1.5mL K₂CO₃和相转移催化剂氨基聚醚K₂₂₂混合液(30mg/mL K₂CO₃溶液-13mg/mL K₂₂₂乙腈溶液)将其洗脱，进入反应管I中； 

2.1.3在116℃加热反应管6min，蒸发溶剂；冷却后加入b中的乙腈，116℃蒸干溶剂，干燥反应管至无液体残留，得复合物[K/K222]⁺¹⁸F^-； 

2.1.4瓶c中加入二对甲苯磺酸乙二醇酯(8mg)的乙腈(1mL)溶液，100℃下密闭反应6min，浓缩反应溶液后，冷却反应管； 

2.1.5瓶d加入中的乙醚(5mL)到反应管I； 

2.1.6将反应液通过V7与V10之间相连的Sep Pak SiO₂小柱，液体进入反应管II中(已经装有碳酸钾固体8mg)，并在90℃下将乙醚蒸除； 

2.1.7重复2.1.5和2.1.6中的操作； 

2.1.8瓶g中加入的前体(2-{2-[2-(3，5-二-N，N-二(2-甲基吡啶)氨甲基-苯氧基)乙氧基]-乙氧基}乙基)-氨基(7)(5mg)的DMF溶液至反应管II，135℃下密闭反应30min，反应结束后冷却反应管； 

2.1.9瓶h中加入的15mL水，将反应液通过V15和V17之间的Sep Pak Al₂O₃和Sep Pak C18小柱后进入废液，并用氮气吹干小柱； 

2.1.10加入瓶i中的1ml无水乙醇到反应管II，经Sep Pak Al₂O₃和Sep Pak C18至乙醇完全蒸干，加入生理盐水配置溶液，过无菌滤膜后接入产品瓶中。 

经过以上的操作合成得到¹⁸F-FEN-DPA2，放化合成时间是196min，未校正的放化收率为2.6％。 

2.2¹⁸F-FB-DPA2的放化合成[见化合物(7)转化为化合物(8)的反应式] 

¹⁸F-FB-DPA2合成在PET-MF-2V-IT-I型氟-18多功能合成模块中完成，其合成流程示意如图2所示，具体操作如下： 

2.2.1¹⁸F-由Cyclone 10/5通过¹⁸O(p，n)¹⁸F反应生产； 

2.2.2¹⁸F-被QMA捕获后，用V1中的K₂CO₃和K222混合液将其洗脱，进入第一个反应管； 

2.2.3反应管中的溶液在116℃蒸发干燥6min；加入V2中的乙腈，116℃蒸发干燥至反应管中无液体残留； 

2.2.4加入V3中4-N，N，N-三甲基胺基苯甲酸乙酯三氟甲磺酸盐乙腈溶液，108℃下密闭反应10min，浓缩反应溶液后冷却反应管； 

2.2.5加入V4中的四甲基氢氧化铵的乙腈溶液，120℃下密闭反应3min，将乙腈蒸除，并减压下将反应管中的溶剂蒸干； 

2.2.6冷却反应管后，加入V5中的HSTU乙腈溶液，105℃下密闭反应5min； 

2.2.7然后95℃下浓缩反应液，冷却后加入V6中的水10mL稀释反应液，将反应液通过V7与V10之间相连的Sep Pak SCX小柱、氧化铝和plus C18小柱后，进入废液； 

2.2.8重复2.2.7中稀释和转移反应液的操作；使用氮气吹干Sep Pak SCX，氧化铝和plus C18小柱； 

2.2.9分别将G3-2和G4中的溶液分别转入到V6和V2中； 

2.2.10重复2.2.7中稀释和转移反应液的操作；使用氮气吹干Sep Pak SCX，氧化铝和plus C18小柱； 

2.2.11将从G4中转入到V2中的乙腈转入到第一反应管中，然后将吸附在Sep Pak C18小柱上的[¹⁸F]SFB洗脱至第二反应管； 

2.2.12浓缩第二反应管中¹⁸F-SFB的乙腈溶液，冷却后加入V11中的前体(2-{2-[2-(3，5-二-N，N-二(2-甲基吡啶)氨甲基-苯氧基)乙氧基]-乙氧基}乙基)-氨基(7)的硼酸缓冲溶液和乙腈(体积分别为0.2和0.1mL)的混合溶液，50℃下反应10min； 

2.2.13反应结束后，加入V12中的12mL 10％乙腈水溶液，将反应液通过V15和V17之间的Sep Pak C18小柱后进入废液，并用氮气吹干C18小柱； 

2.2.14加入V13中的无水乙醇到第二反应管，经Sep Pak C18小柱后将产品洗脱到样品瓶中，浓缩后加入适量的生理盐水配置成乙醇浓度小于10％的 ¹⁸F-FB-DPA2注射液，然后过无菌滤膜后进入产品瓶中。 

经过以上的操作合成得到¹⁸F-FB-DPA2的放化合成时间是120min，未校正的放化收率为6-14％。 

2.3¹⁸F-FEN-DPAZn2和¹⁸F-FB-DPAZn2的放射合成 

在¹⁸F-FEN-DPA2或¹⁸F-FB-DPA2的乙醇溶液中，加入适量的硝酸锌水溶液(1.6mM，硝酸锌稍过量)，然后70℃下浓缩反应溶液，至乙醇完全蒸发后，加入适量的生理盐水配置成乙醇浓度小于10％的¹⁸F-FEN-DPAZn2和¹⁸F-FB-DPAZn2注射液，过无菌滤膜后即可用于小鼠静脉注射。 

2.4¹⁸F-FEN-DPA2放射化学纯度测定 

HPLC分析条件：分析柱，Kromasil 100-5C18，4.6mm×250mm，5μm(瑞典AKZONOBEL公司生产)。流动相，0.1M甲酸铵水溶液/乙腈(1/1，v/v)；流速，1mL/min；波长，254nm。图3中，A为[¹⁸F]FEDPA(¹⁸F-FEN-DPA2)的HPLC放射图谱，B为标准品[¹⁹F]FEDPA(¹⁹F-FEN-DPA2)的HPLC紫外图谱，C为¹⁸F-FB-DPA2的HPLC放射图谱，D为¹⁸F-FB-DPA2注射液的HPLC紫外图谱。标准品¹⁹F-FEN-DPA2的保留时间(Rt)为 11.5min，¹⁸F-FEN-DPA2的Rt为11.7min；前体DPA2(7)保留时间(Rt)＝1.72min， ¹⁸F-FB-DPA2的Rt＝6.6min。 

【实施例3】荧光显像剂Dansy1-DPA2和Dansy1-DPAZn2的有机合成 

丹磺酰化-N-(2-{2-[2-(3，5-二-N，N-二(2-甲基吡啶)胺甲基-苯氧基)乙氧基]-乙氧基}乙基)氨基)(Dansy1-DPA2)的制备[合成路线见化合物(7)转化为(10)部分]。 

将(2-{2-[2-(3，5-二-N，N-二(2-甲基吡啶)氨甲基-苯氧基)乙氧基]-乙氧基}乙基)-氨基(7)(300mg，0.46mmol)溶于15mL乙腈中，加入三乙胺(56.7mg，0.56mmol，1.2eq.)，加入20ml干燥的二氯甲烷，冰浴冷却至0℃，丹磺酰氯(149mg，0.56mmol，1.2eq.)，氩气保护，室温搅拌3h。TLC监测，已经反应完毕。先将溶剂蒸除，加入20ml蒸馏水，乙酸乙酯萃取(20ml×4)，合并有机相，无水硫酸钠干燥，浓缩，然后柱层析(乙酸乙酯∶甲醇氨＝15∶1)，得到绿色油状荧光液体320mg，产率79％。¹H NMR(CDCl₃，400MHz)(ppm)：8.51(d，5H，J＝4Hz)，8.30(d，1H)，8.24(d，1H)，7.60-7.48(m，8H)，7.48(t，2H)，7.06-7.14(m，4H)，7.07(s，1H)，6.89(s，2H)，4.14-4.13(m，2H)，3.78(s，10H)，3.67(s，2H)，3.55-3.54(m，2H)，3.39(m，4H)，3.11(d，2H)，2.89(s，6H)，2.04(s，1H)，2.00(s，1H) 

含锌离子DPA(Dansyl-DPAZn2)以Dansyl-DPA2为原料，按上述【实施例2】中¹⁸F-FEN-DPAZn2和¹⁸F-FB-DPAZn2相类似方法进行合成。 

【实施例4】¹¹C或¹⁸F标记Cyclen类显像剂(¹¹C-CyclenZn2和¹⁸F-CyclenZn2)的有机合成 

按二价环状多胺类(NOTA类、Cyclen类和Cyclam类)显像剂的合成路线进行放射合成。 

¹¹C-CyclenZn2的放射合成。称取0.8mg的Boc基保护前体Cyclen2(12)，溶于0.35mL的丙酮并置于冰水浴中，通入¹¹CH₃OSO₂CF₃(¹¹C-CH₃OTf)进行反应。反应完毕后，用3mL的丙酮将反应产物¹¹C-Boc-Cyclen2(13)淋洗至反应管中，加热将丙酮蒸除。加入0.2mL的6M HCl，100℃下加热10min，脱去Boc保护基， 冷却后加入6N NaOH中和酸溶液，经C18小柱纯化后，得不含锌化合物¹¹C-Cyclen2(14)。然后加入50微升(μL)的15mM的Zn(NO₃)₂溶液，70℃下加热10min，得含锌配合物¹¹C-CyclenZn2，稀释后用于动物实验。 

¹⁸F-CyclenZn的放射合成。如图1所示，用PET-MF-2V-IT-I型氟-18多功能合成模块生产¹⁸F-CyclenZn。将TsOCH₂CH₂OTs(二对甲苯磺酸乙二醇酯)的乙腈溶液加入到干燥的复合物[K/K222]⁺¹⁸F^-中，100℃下密闭反应8min，90℃下浓缩反应溶液后冷却反应管。加入瓶d中的水(10mL)到反应管I中，反应液通过V7与V10之间相连的Al₂O₃和plus C18小柱，液体进入废液，¹⁸FCH₂CH₂OTs被捕获在C18小柱上，未反应的氟离子被Al₂O₃小柱吸附。经氮气吹干小柱后，加入瓶e中的2ml乙腈，将¹⁸FCH₂CH₂OTs从C18柱上淋洗至反应管II中，然后在85℃下蒸发乙腈。加入瓶g中的Boc基保护前体Cyclen2(12)的DMSO溶液(Cyclen 12先用1M NaOH 30μL溶解后，再加入0.3mL的DMSO)至反应管II中，110℃下密闭反应30min，然后升温到120℃继续反应10min，反应结束后冷却反应管，经C18小柱纯化后，得¹⁸F-Boc-Cyclen2(13)。加入0.3mL 6M HCl，加热至100℃密闭反应10min，去Boc保护基，冷却后加入0.3ml 6M NaOH中和反应液，得不含锌化合物¹⁸F-Cyclen2(14)。最后，加入50μL的15mM的Zn(NO₃)₂溶液，70℃下加热10min，得含锌配合物¹⁸F-CyclenZn2，稀释后用于动物实验。 

【实施例5】本发明化合物的HeLa细胞凋亡的体外实验 

HeLa细胞培养于含100mL/L(10％)新生牛血清、碳酸氢钠、100μg/ml链霉素、100U/ml青霉素的DMEM(含多种氨基酸和葡萄糖的培养基的缩写)培养基中，置于37℃含50mL/L(5％)CO₂的细胞培养箱中培养。取对数生长期HeLa细胞，以DMEM培养基调整细胞浓度至2×10⁵/L，在96孔培养板中分别加入1ml细胞悬液，在5％CO₂的细胞培养箱中于37℃培养24h。空白对照组加入PBS缓冲液，阿霉素组(细胞凋亡组)加入阿霉素浓度为4.3μmol/L，培养48h后，显微镜下观察，拍摄。取1×10⁶待测阿霉素处理的细胞用PBS洗涤二次，立即用PI(碘化丙啶)(5μl)、FITC(异硫氰酸荧光素)-Annexin V(靶向磷酯酰丝氨酸PS的一种蛋白质配体) (5μl)与Dansyl-DPA2(丹酰化DPA)或Dansyl-DPAZn2(丹酰化Zn²⁺-DPA)(5μl)的两重或三重染色法染色细胞。两重法用Dansyl-DPAZn2/PI、Dansyl-DPA2/PI、丹酰氯/PI、Annexin-V-FITC/PI染色细胞；三重法用Dansyl-DPAZn2/Annexin-V-FITC/PI、Dansyl-DPA2/Annexin-V-FITC/PI、丹酰氯/Annexin-V-FITC/PI共同染色细胞。避光放置15min，用荧光显微镜观察，或用流式细胞仪检测，Cell Quest软件进行数据分析，计算细胞凋亡率。并计算T/C＝实验组(凋亡和死亡的细胞)/对照组(凋亡和死亡的细胞)，绘制细胞T/C示意图。另外，按上述方法，培养的HeLa细胞经阿霉素处理后，加入5μl氟乙基DPA(或氟乙基Zn²⁺-DPA)，立即用PI和FITC-Annexin V共染色或丹酰化Zn²⁺-DPA染色法测定。 

为了便于清晰说明，现将实验方法列于表1。 

表1：实验方法列表 

HeLa细胞经细胞培养和阿霉素处理后形成凋亡细胞，用三重染色法：Dansyl-DPAZn2/Annexin-V-FITC(异硫氰酸荧光素)/碘化丙啶(PI)、Dansyl-DPA2/Annexin-V-FITC/PI和丹酰氯/Annexin-V-FITC/PI，测定凋亡 细胞和坏死细胞。Annexin-V-FITC可使坏死细胞和凋亡细胞都染色，PI只使坏死细胞染色，与Annexin-V-FITC/PI染色比较，从而可判断Dansyl-DPAZn2和Dansyl-DPA2在肿瘤凋亡细胞中染色状况。结果判定：Annexin V阴性/PI阴性为正常细胞，Annexin V阳性/PI阴性为凋亡细胞，Annexin V阳性/PI阳性为坏死细胞或晚期凋亡细胞。结果发现，丹酰氯、Dansyl-DPAZn2和Dansyl-DPA2均可使早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞和坏死细胞染色，但Dansyl-DPA2染色程度不如Dansyl-DPAZn2，Dansyl-DPAZn2与Annexin-V-FITC染色相类似，如图4所示，上排为Dansyl-DPA2细胞染色图，下排为Dansyl-DPAZn2细胞染色图，丹酰氯染色最弱(资料没有表示出来)。另外，阿霉素处理后的HeLa细胞用二重染色法(Annexin-V-FITC/PI)测定作为对照组，经¹⁹F-FEN-DPAZn2或¹⁹F-FEN-DPA2处理后用Dansyl-DPAZn2染色作为实验组，与对照组相比，实验组染色细胞数目明显减少。因为Dansyl-DPAZn2和Dansyl-DPA2与Annexin-V-FITC染色相类似，说明¹⁹F-FEN-DPAZn2和¹⁹F-FEN-DPA对Annexin-V-FITC/PI染色都有抑制作用，如图5所示。这些结果表明，肿瘤细胞经抗肿瘤治疗后除能产生凋亡细胞，也会伴随坏死细胞的产生；丹酰基有可能是与死亡细胞作用的药效基团； ¹⁹F-FEN-DPAZn2和¹⁹F-FEN-DPA2均可与死亡细胞作用；Dansyl-DPAZn2与Annexin-V-FITC一样，均与磷脂酰丝氨酸(PS)有高结合力，DPAZn2可能优于Annexin V，但它也不能区分坏死细胞和凋亡细胞，只能用于死亡细胞的测定。Dansyl-DPA2与死亡细胞作用较弱的原因，可能与肿瘤凋亡细胞内游离Zn²⁺浓度较低，且只能形成较低浓度Dansyl-DPAZn2有关。由此可以推断，DPA-Zn²⁺及其类似结构可能是一种与死亡细胞作用的药效基团，DPA-Zn²⁺类显像剂可能比烷基丙二酸ApoSense类小分子显像剂(可区分凋亡细胞和坏死细胞)更全面评估抗肿瘤治疗效果。 

图5为体外凋亡抑制试验结果。(A)为阿霉素处理的Hela细胞经Annexin-V-FITC/PI双染色红-绿色荧光图像；(B)为阿霉素处理的Hela细胞，加抑制剂¹⁹F-FEN-DPA2后，用Dansyl-DPAZn2染色图像；(C)为阿霉素处理的Hela细胞，加抑制剂¹⁹F-FEN-DPAZn2后，用Dansyl-DPAZn2染色图像。结果表 明，¹⁹F-FEN-DPA2和¹⁹F-FEN-DPAZn2对Annexin-V-FITC/PI染色都有抑制作用，说明它们均可与死亡细胞作用。 

【实施例6】本发明化合物的体内生物分布实验 

C57BL/6J小鼠40只，雌雄各半，5周龄，体质量20～25g。尾静脉注射0.2mL的¹⁸F-FB-DPA2或¹⁸F-FB-DPAZn2(约100μCi，3.7MBq)，分别于注射后10、30、45、60和90min，从眼部取血后，立即断头处死，解剖取出心、脑、肌肉、肝、肺和肾脏等脏器，称重后测量放射性计数，计算每克组织注射放射性剂量百分率(ID％/g)。每个时相为4只小鼠。 

经尾静脉注射后，¹⁸F-FB-DPA2和¹⁸F-FB-DPAZn2在小鼠体内的生物分布示于表2和表3。从表2可知，在注射后10min时¹⁸F-FB-DPA2在血液、肝和肾脏摄取率较高，其次为心脏、肺和小肠。从表3可知，在注射后10min时¹⁸F-FB-DPAZn2在血液、肝、小肠和肾脏摄取率较高，其次为肺。在整个给药时间内，脑摄取 ¹⁸F-FB-DPA2和¹⁸F-FB-DPAZn2最低，且血液和绝大多数组织器官放射性清除较快。肾脏和小肠放射性摄取率较高表明，¹⁸F-FB-DPA2和¹⁸F-FB-DPAZn2在小鼠体内经小肠吸收，主要排泄器官为肾脏，这一点也可从PET显像图中膀胱摄取放射性较高得以证实。 

表2：¹⁸F-FB-DPA2在正常小鼠体内生物分布(ID％/g，n＝4， ) 

组织器官	10min	45min	60min	90min
					血	9.99±2.73	5.54±2.32	1.32±0.35	1.17±0.32
脑	1.94±0.78	0.76±0.08	0.60±0.07	0.57±0.10
					心	5.04±0.81	2.21±0.21	1.52±0.21	1.11±0.13
肝脏	9.80±2.16	3.85±0.57	2.06±0.37	1.75±0.25
					肺	6.68±1.14	3.73±0.64	1.74±0.05	1.54±0.29
肾脏	10.34±0.38	9.56±3.69	2.99±0.78	1.58±0.25
					胃	2.73±0.73	2.00±0.57	1.40±0.21	1.11±0.34
小肠	7.58±3.70	6.81±4.01	3.86±3.14	0.93±0.15
					肌肉	2.23±0.41	3.22±2.88	1.31±0.20	0.91±0.35
胰腺	3.30±0.29	2.55±0.11	2.42±0.58	1.82±0.57

表3：¹⁸F-FB-DPA2在正常小鼠体内生物分布(ID％/g，n＝4， ) 

组织器官

10min

30min

45min

60min

90min

血	9.17±0.93	4.28±0.95	2.27±0.95	1.48±0.36	0.45±0.03
						脑	1.45±0.05	1.86±0.73	1.22±0.44	0.85±0.26	0.36±0.07
心	3.44±2.08	3.59±0.75	3.80±1.19	1.89±0.83	1.00±0.45
						肝脏	9.04±0.31	6.00±1.13	3.00±0.47	1.95±0.56	1.16±0.07
肺	7.67±0.63	4.22±0.96	4.27±1.04	2.10±1.17	1.10±0.37
						肾脏	14.47±1.44	6.74±0.46	3.08±1.03	1.95±0.25	1.08±0.13
胃	3.29±0.68	3.08±0.70	2.45±0.50	1.60±0.67	0.93±0.11
						小肠	12.90±3.34	9.66±3.80	2.68±0.49	3.83±2.82	0.69±0.12
肌肉	3.59±0.35	2.93±0.16	1.80±0.60	1.34±0.29	0.48±0.12
						胰腺	4.85±0.41	3.20±1.87	5.57±1.95	3.94±1.59	0.68±0.25

【实施例7】本发明二价DPA类化合物细胞凋亡动物模型PET显像 

C57BL/6J裸鼠6只，雌雄各半，5周龄，体质量20～25g。将Hepa 1-6肝癌细胞株常规传代培养，收集对数生长期的细胞，用1×PBS溶液配成2×10⁷个/mL的细胞悬液，在无菌条件下在裸鼠右腋窝内注射0.1mL瘤细胞悬液。7d后可扪及皮下结节，待肿瘤长径长至15～25mm时进行实验。将肝细胞癌模型裸鼠经阿霉素处理后，随机分为三组，¹⁸F-FB-DPA2组、¹⁸F-FB-DPAZn2组和¹⁸F-脱氧葡萄糖(¹⁸F-FDG)组。由尾静脉注射经生理盐水稀释的¹⁸F-FDG3.7MBq(0.2mL)，而尾静脉注射¹⁸F-FB-DPA2和¹⁸F-FB-DPAZn2较困难，腹腔注射经生理盐水稀释的的¹⁸F-FB-DPA2和¹⁸F-FB-DPAZn23.7MBq(0.2mL)。给药1h后将模型动物固定于小鼠架上，行全身PET/CT扫描，经衰减矫正后，迭代重建获得横断面、矢状面、冠状面断层图像及MIP(最大强度投影)图像。 

图6为抗肿瘤治疗前后细胞凋亡PET显像图，其中左、中、右分别为 ¹⁸F-FB-DPAZn2、¹⁸F-FB-DPA2、¹⁸F-FDG PET显像结果，上图为抗肿瘤治疗后(凋亡模型)PET显像图，下图为治疗前(肿瘤模型)PET显像图。荷瘤裸鼠经阿霉素治疗前(肿瘤模型)后(凋亡模型)，腹腔注射¹⁸F-FB-DPA2和¹⁸F-FB-DPAZn2后，经PET-CT显像。结果表明，凋亡模型鼠肿瘤处可高度摄取¹⁸F-FB-DPAZn2，但几乎不摄取¹⁸F-FB-DPA2；而肿瘤模型鼠肿瘤处几乎不摄取¹⁸F-FB-DPA2和 ¹⁸F-FB-DPAZn2。另外，经抗肿瘤治疗后，肿瘤处摄取¹⁸F-FDG略有减少，但治疗前后没有明显变化。由此可见，¹⁸F-FB-DPAZn2与¹⁸F-FB-DPA2相比，是一种更 有前景的细胞死亡二价小分子PET显像剂，且在治疗监测方面优于¹⁸F-FDG。由于模型裸鼠尾静脉经多次注射后，尾静脉注射困难，改为腹腔注射¹⁸F-FB-DPA2和¹⁸F-FB-DPAZn2，这样会造成腹部摄取放射性高，放射性清除也慢。 

【实施例8】本发明二价DPA类化合物炎症动物模型PET显像 

C57BL/6J小鼠数只，雌雄各半，5周龄，体重20～25g。在小鼠大腿肌肉处用松节油(0.2mL)诱导炎症模型，炎症组织长至10～25mm时即可进行实验。将模型动物分为两组：¹⁸F-脱氧葡萄糖(¹⁸F-FDG)组和¹⁸F-FB-DPAZn2组。由尾静脉分别注射经生理盐水稀释的¹⁸F-FB-DPAZn2或¹⁸F-FDG注射液(3.7MBq，0.2mL)。将模型动物固定于小鼠架上，在不同时间内行全身PET/CT扫描。经衰减校正后，迭代重建获得横断面、矢状面、冠状面断层图像及MIP(最大强度投影)图像。在不同时间内炎症组织均可摄取¹⁸F-FDG(见图7)和¹⁸F-FB-DPAZn2(见图8)，但炎症组织对¹⁸F-FB-DPAZn2摄取相对较低。 

【实施例9】本发明二价环状多胺类化合物细胞凋亡动物模型PET显像 

将S-180纤维肉瘤细胞株常规传代培养，收集对数生长期的细胞，用1×PBS溶液配成2×10⁷个/mL的细胞悬液，在无菌条件下在小鼠右腋窝内注射0.1mL瘤细胞悬液。7d后可扪及皮下结节，待肿瘤长至直径15～25mm时，其中一部分小鼠用作对照实验，另一部分用环磷酰胺处理72小时后进行实验。将模型动物分为两组：¹⁸F-FB-DPA2组和¹⁸F-FB-DPAZn2组。由尾静脉分别注射经生理盐水稀释的¹⁸F-FB-DPA2组和¹⁸F-FB-DPAZn2注射液(3.7MBq，0.2mL)。将模型动物固定于小鼠架上，在不同时间内行全身PET/CT扫描。经衰减校正后，迭代重建获得横断面、矢状面、冠状面断层图像及MIP(最大强度投影)图像。 

图9为荷S180肉瘤小鼠模型经抗肿瘤(环磷酰胺)治疗后细胞凋亡¹⁸F-CyclenZn2PET显像图像，其中上图为抗肿瘤治疗后细胞死亡PET显像横断面图像，下图为PET显像冠状面图像。抗肿瘤治疗小鼠模型(右腋窝)，注射¹⁸F-CyclenZn2后，对模型动物进行PET显像。在不同时间内，抗肿瘤治疗后肿瘤组织摄取¹⁸F-CyclenZn2均明显增加，而摄取¹⁸F-Cyclen2很低(图像没表示出来)。结果表明，¹⁸F-CyclenZn2也有一种很有前景的细胞死亡二价小分子PET显像剂。 

【实施例10】本发明二价环状多胺类化合物炎症动物模型PET显像 

C57BL/6J小鼠数只，雌雄各半，5周龄，体重20～25g。在小鼠大腿肌肉处用松节油(0.2mL)诱导炎症模型，炎症组织长至10～25mm时即可进行实验。由尾静脉注射经生理盐水稀释的¹⁸F-CyclenZn2注射液(3.7MBq，0.2mL)。将模型动物固定于小鼠架上，在不同时间内行全身PET/CT扫描。经衰减校正后，迭代重建获得横断面、矢状面、冠状面断层图像及MIP（最大强度投影）图像。 

图10为松节油诱导的小鼠炎症模型(右侧大腿肌肉处)¹⁸F-CyclenZn2PET显像图像，其中，上图为小鼠炎症模型PET显像横断面图像，下图为PET显像冠状面图像。小鼠炎症模型注射¹⁸F-CyclenZn2后，对模型动物进行PET显像。在不同时间内，炎症组织可高度摄取¹⁸F-CyclenZn2，对侧正常肌肉组织几乎不摄取¹⁸F-Cyclen2。结果表明，¹⁸F-CyclenZn2也有一种很有前景的炎症PET显像剂。 

预试验表明，本发明的其余化合物与前述化合物具有与实施例5、6、7、8、9、10类似的结果。本发明的其他化合物的生产方法类似于实施例1、2、3、4的生产方法，为了节约篇幅，不再赘述，本发明不限于上述实施例。 

本专利申请说明书和权利要求书中的M^x+=0，Zn²⁺,Ga³⁺,Gd³⁺,Ca²⁺是指不含金属离子的多胺类，或含Zn²⁺,Ga³⁺,Gd³⁺,Ca²⁺的配合物，其中M^x+=0是指不含金属离子的多胺类。 

Claims (12)

1.多胺类小分子化合物，具有如下结构：

其中，S＝报告基团，为核素标记辅基；

R＝-H，-OCH₃，-OCH₂CH₃或-Cl；

2.根据权利要求1所述的多胺类小分子化合物，其特征在于所述化合物报告基团S结构为核素标记辅基，选自-¹¹CH₃，-CH₂CH₂ ¹⁸F，-CH₂CH₂(OCH₂CH₂)₂NHCOC₆H₄ ¹⁸F-p或-CH₂CH₂(OCH₂CH₂)₂NH-CH₂CH₂ ¹⁸F之一。

3.根据权利要求1所述的多胺类小分子化合物，其特征在于所述化合物为含两个三氮杂环九烷基类配合物，其结构式：

4.根据权利要求1所述的多胺类小分子化合物，其特征在于所述化合物为含两个四氮杂环十二烷基类配合物，其结构式为：

5.根据权利要求1所述的多胺类小分子化合物，其特征在于所述化合物为含两个四氮杂环十四烷基类配合物，其结构式为：

6.权利要求3所述的多胺类小分子化合物合成方法，主要包括如下步骤：叔丁氧羰基Boc保护的NOTA前体，在碱性溶液中与标记中间体TsOCH₂CH₂ ¹⁸F或¹¹CH₃OSO₂CF₃反应，在盐酸中水解获得¹⁸F或¹¹C标记NOTA类化合物，进一步与硝酸锌反应生成¹⁸F或¹¹C标记含锌NOTA类化合物：

7.权利要求4所述的多胺类小分子化合物合成方法，主要包括如下步骤：叔丁氧羰基Boc保护的Cyclen前体，在碱性溶液中分别与标记中间体TsOCH₂CH₂ ¹⁸F或¹¹CH₃OSO₂CF₃反应，在盐酸中水解获得¹⁸F或¹¹C标记Cyclen类化合物，进一步与硝酸锌反应生成¹⁸F或¹¹C标记含锌Cyclen类化合物：

8.权利要求5所述的多胺类小分子化合物合成方法，主要包括如下步骤：叔丁氧羰基Boc保护的Cyclam前体，在碱性溶液中分别与标记中间体TsOCH₂CH₂ ¹⁸F或¹¹CH₃OSO₂CF₃反应，在盐酸中水解获得¹⁸F或¹¹C标记Cyclam类化合物，进一步与硝酸锌反应生成¹⁸F或¹¹C标记含锌的Cyclam类化合物：

9.权利要求1所述的多胺类小分子化合物在制备靶向磷脂酰丝氨酸或凋亡细胞早期游离Zn²⁺的细胞死亡或细胞凋亡显像剂中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于其在制备抗肿瘤化学治疗、放射治疗、生物治疗疗效监测的显像剂中的应用。

11.根据权利要求9所述的应用，其特征在于其在制备神经退行性疾病、脑中风、艾滋病、血栓、动脉粥样斑、以及心肌梗塞的早期鉴别诊断的显像剂中的应用。

12.根据权利要求9所述的应用，其特征在于其在制备与细胞死亡或细胞凋亡过程中产生PS有关病变的鉴别诊断与疗效监测的显像剂中的应用。