CN102438646A - 转移性肿瘤的治疗 - Google Patents

Abstract

本发明针对用于治疗、抑制和/或减少转移性肿瘤的方法以及用于检测转移性肿瘤的方法。在一些实施例中，本发明方法包括全身(例如静脉内)投予经过标记或未经标记的蝎氯毒素试剂。在一些实施例中，本发明方法允许治疗、抑制和/或减小以及检测脑中的转移。在一些实施例中，新血管形成得到抑制和/或使新形成的血管退化。

Description

转移性肿瘤的治疗

相关申请案信息

本申请案主张美国临时申请案第61/053,651号(2008年5月15日申请)、第61/153,273号(2009年2月17日申请)和第61/173,121号(2009年4月27日申请)的优先权和权益，各申请案的内容都按全文引用并入本文中。

背景技术

癌细胞扩散或转移的能力被视为癌症最致命的方面。癌细胞可脱离原发肿瘤，并经由血流和/或淋巴系统行进到身体的其它部分，形成远处转移。部分由于可形成的转移的数量和转移从原发肿瘤部位行进的距离，这些转移性肿瘤的治疗和诊断成为一项挑战。最常见的转移部位包括肺、骨胳、肝和脑。定位于脑中的转移所造成的问题与在身体其它器官中形成的转移不同，因为血/脑屏障的神经保护性质阻止将许多可能有效的诊断剂和治疗剂递送到血管系统和神经组织。

蝎氯毒素(Chlorotoxin)是一种在巨型以色列黄蝎(Giant Yellow Israeli scorpion)以色列杀人蝎(Leiurus Quinqestriatus)的毒液中发现的肽，经过研究，在临床前作为用131-碘靶向神经胶质瘤的候选物(J.A.德宾(J.A.DeBin)等人，美国生理学杂志(Am.J.Physiol.)(细胞生理学(Cell Physiol))，1993，264，33：C361-C369；L.索罗恰努(L.Soroceanu)等人，癌症研究(Cancer Res.)，1998，58：4871-4879；S.申(S.Shen)等人，神经肿瘤学(Neuro-Oncol.)，2005，71：113-119)。根据蝎氯毒素结合神经外胚来源的肿瘤细胞的能力(索罗恰努等人，癌症研究，1998，58：4871-4879；阿尔德里奇(Ullrich)等人，神经学报道(Neuroreport)，1996，7：1020-1024；阿尔德里奇等人，美国生理学杂志，1996，270：C1511-C1521)，已经开发出诊断和治疗神经外胚肿瘤(例如神经胶质瘤和脑脊膜瘤)的组合物(参看美国专利第5,905,027号和第6,429,187号，各专利的内容都按全文引用并入本文中)和方法(参看美国专利第6,028,174号和第6,319,891号，各专利的内容都按全文引用并入本文中)。

发明内容

本发明发现，蝎氯毒素可靶向远处转移，包括在脑中所发现的转移。本发明还发现，蝎氯毒素能抑制新血管生成，和/或使现有的新形成的血管退化。不希望受任何特定理论的束缚，本发明者提出，蝎氯毒素在治疗转移性癌症方面的有效性可能至少部分上是因为其能够抑制新血管的形成，和/或使新形成的血管退化，而这些新血管被认为是转移所依赖的。

在一方面中，本发明提供用于治疗转移性癌症的方法，其包含对患有或易患至少一种转移的个体投予有效剂量的蝎氯毒素试剂，以致所述蝎氯毒素试剂结合于所述至少一种转移，其中所述转移是由至少一种原发肿瘤引起的。在一些实施例中，蝎氯毒素试剂是全身递送的；在一些实施例中，蝎氯毒素试剂是经静脉内递送。在一些实施例中，原发肿瘤是黑素瘤，例如皮肤和/或眼内黑素瘤。在一些实施例中，原发肿瘤是神经胶质瘤。

在另一方面中，本发明提供用于检测患有或曾罹患至少一种原发肿瘤的个体体内一种或多种转移的存在的方法，其包含对所述个体投予有效量的经过标记的蝎氯毒素试剂，和测量所述个体的体内经过标记的蝎氯毒素试剂的结合。在这些方面中，在除原发肿瘤部位外的体内一个或多个区域中结合水平比正常(无肿瘤)组织高，将指示一种或多种转移的存在。在一些实施例中，在第二时间段投予第二有效量的经过标记的蝎氯毒素试剂，和测量个体体内所述经过标记的蝎氯毒素试剂的结合，将允许评估结合的任何改变(例如结合程度和/或位置)，这可指示一种或多种转移的进展、稳定性或退化。

在治疗和/或检测转移的方法的一些实施例中，蝎氯毒素试剂是全身递送的。全身投药可包含静脉内投药。在一些实施例中，蝎氯毒素试剂结合脑中的至少一种肿瘤转移。在一些实施例中，新血管生成得到抑制和/或使新形成的血管(其可供养转移)退化。

附图说明

图1是显示生物素化蝎氯毒素结合已经转移到脑的黑素瘤细胞的显微照片。显微照片描述相邻切片的染色情况如下：“TM-601”，用生物素化蝎氯毒素染色(借助DAB与生物素的褐色反应产物检测)并进一步用甲基绿复染色的切片；“对照组”，只用甲基绿染色的切片；和“H&E”，用苏木精和伊红染色的切片。

图2是显示生物素化蝎氯毒素结合已经转移到肺的黑素瘤肿瘤细胞的显微照片。显微照片描述相邻切片的染色情况如下：“TM-601”，用生物素化蝎氯毒素染色(借助DAB与生物素的褐色反应产物检测)并进一步用甲基绿复染色的切片；“对照组”，只用甲基绿染色的切片；和“H&E”，用苏木精和伊红染色的切片。

图3是如下染色的正常皮肤的相邻切片的显微照片：“TM-601”，用生物素化蝎氯毒素染色(借助DAB与生物素的褐色反应产物检测)并进一步用甲基绿复染色的切片；“对照组”，只用甲基绿染色的切片；和“H&E”，用苏木精和伊红染色的切片。

图4是在患有复发性或难治愈性转移性实体肿瘤的患者中进行的静脉内¹³¹I-TM-601的I期成像和安全性研究中使用的给药方案。

图5是概述静脉内投药后患有不同类型实体肿瘤的患者体内¹³¹I-TM-601的肿瘤特异性吸收的表格。

图6显示在对患有转移性前列腺癌和已知的弥散性骨转移的患者静脉内注射¹³¹I-TM-601(30mCi/0.6mg)后3小时、24小时和7天记录的γ相机图像。

图7显示在对患有转移性非小细胞肺癌的患者静脉内注射¹³¹I-TM-601(30mCi/0.6mg)后3小时、24小时和48小时记录的γ相机图像。

图8(A)显示说明患有转移性黑素瘤的患者的左侧额叶病变的治疗前的MRI(左图)，以及在对此患者静脉内注射¹³¹I-TM-601(30mCi/0.2mg)后记录的SPECT图像(右图)。图8(B)显示说明患有转移性黑素瘤的患者的右侧枕叶病变的治疗前的磁共振成像(MRI)(左图)，以及在对此患者静脉内注射¹³¹I-TM-601(30mCi/0.2mg)后记录的SPECT图像(右图)。

图9显示说明患有恶性神经胶质瘤的患者的左侧额叶肿瘤的治疗前的MRI(左图)，以及在对此患者静脉内注射¹³¹I-TM-601后48小时获得的SPECT扫描(右图)。

图10描述治疗前(左图)和全身递送一剂30mCi ¹³¹I-TM-601后3周(右图)从神经胶质瘤患者取得的MRI图像。此患者呈现肿瘤体积和水肿增大的明显降低。

图11描述治疗前(上图)和全身递送一剂30mCi ¹³¹I-TM-601后3周(下图)从另一神经胶质瘤患者取得的MRI图像。此患者呈现肿瘤体积和水肿增大的明显降低。

图12显示在对患有转移性黑素瘤的患者静脉内注射¹³¹I-TM-601(30mCi/0.6mg)后24小时和48小时(前位和后位)记录的γ相机图像。在已知的到脑、肺、肝和皮下结节的远处转移中观察到¹³¹I-TM-601的吸收。

图13描述由在小鼠脉络膜新血管生成(choroidal neovascularization，CNV)模型中测试TM-601抑制血管形成的能力的实验得到的结果。显示接收TM-601或生理盐水媒剂的动物体内新血管(NV)的总面积(mm²×10^-3)。在布鲁赫氏膜(Bruch′s membrane)破裂当天和第7天，于眼内注射50μg TM-601的动物中观察到统计学显著的脉络膜新血管生成减少(^*p＜0.05)。第14天，分析脉络膜损伤。

图14描述由在小鼠CNV模型中测试TM-601引起现有新血管退化的能力的实验得到的结果。显示接收TM-601或生理盐水媒剂的动物体内新血管(NV)的总面积(mm²×10^-3)。“基线”是指在布鲁赫氏膜破裂后(即，用TM-601处理前)第7天时取得的测量值。第7天，在眼内注射50μg TM-601的动物中观察到脉络膜新血管生成的统计学显著的退化(^*p＜0.05)。对于“对照组”和“TM-601”值，在第14天分析脉络膜损伤。

图15是显示在小鼠脉络膜新血管生成模型中玻璃体内注射TM-601引起在激光诱导产生的血管部位处血管减少的代表性显微图像。当在激光诱导当天投予TM-601时，新血管生成受到抑制(上图)。当在激光诱导后7天投予TM-601时，现有的新血管系统退化(下图)。第14天，对所有小鼠灌注经荧光素标记的葡聚糖，制备脉络膜平片并利用荧光显微镜检查。

图16显示在布鲁赫氏膜破裂当天和第7天接收250μg TM-601眼周注射液的动物中统计学显著的脉络膜新血管生成减少(^*p＜0.05)的实验结果。第14天，分析脉络膜损伤。

图17显示在研究第1天和第7天眼周注射TM-601以剂量相关的方式抑制脉络膜新血管生成的实验结果。第14天，分析脉络膜损伤(^*p＜0.05)。

图18显示在接收TM-601静脉内注射液(每周3次，每次20mg/kg剂量)的动物中脉络膜新血管生成的统计学显著的退化的实验结果。第14天，分析脉络膜损伤(^*p＜0.05)。

图19显示在静脉内局部施用TM-601(每天3次滴眼液)的动物中脉络膜新血管生成减少的实验结果。第14天，分析脉络膜损伤。每天接收0.75mg剂量TM-601的眼与接收生理盐水对照的眼之间NV面积的差异达到0.059的p值。

图20是显示眼内注射TM-601后CNV区域中TM-601的定位的冷冻切片显微图像。在激光诱导布鲁赫氏膜破裂后第7天注射TM-601。第9天对小鼠实施安乐死。用兔抗-TM-601(A、B和C中的红色)和GSA凝集素(D、E和F中的绿色)对冷冻切片进行染色，以使内皮细胞可见。注射媒剂的眼(B、E和H)和未经注射的眼(C、F和I)在CNV区域内未显示阳性染色细胞。相反，来自经TM-601处理的眼的切片(A、D和G)在整个CNV区域中显示针对TM-601的明显染色(A和D)。底部的一行显示红色与绿色染色的配准(G、H和I)。箭头指示CNV区域。

图21是显示眼周注射TM-601后CNV区域中TM-601的定位的冷冻切片显微图像。注射TM-601，对小鼠实施安乐死，并如图16中所述对冷冻切片进行染色。(也参看实例6中的材料和方法)。利用兔抗-TM-601进行的染色如A、B和C中的红色所示，且利用GSA凝集素进行的染色(用于显现内皮细胞)如D、E和F中绿色所示。注射媒剂的眼(B、E和H)和未经注射的眼(C、F和I)在CNV区域内未显示阳性染色细胞。相反，来自经TM-601处理的眼的切片(A、D和G)在整个CNV区域中显示针对TM-601的明显染色(A和D)。底部的一行显示红色与绿色染色的配准(G、H和I)。箭头指示CNV区域。

图22是显示眼内注射TM-601对CNV病变内细胞凋亡的影响的冷冻切片的显微图像。注射TM-601，并如图16所述对小鼠实施安乐死。(也参看实例6中的材料和方法)。利用核染色(A、B)GSA(C、D)和TUNEL(E、F)对切片染色。底部的一行显示三种染色的配准(G、H)。在眼内注射TM-601的眼(A、C、E和G)中发现在CNV病变内存在TUNEL阳性细胞(E)。在注射媒剂(B、D、F和H)的眼中未观察到TUNEL阳性细胞。箭头指示CNV区域。

图23是显示眼周注射TM-601对CNV病变内细胞凋亡的影响的冷冻切片的显微图像。注射TM-601，并如图16所述对小鼠实施安乐死。(也参看实例6中的材料和方法)。利用核染色(A、B)、GSA(C、D)和TUNEL(E、F)对切片染色。底部的一行显示三种染色的配准(G、H)。在眼周注射TM-601的眼(A、C、E和G)中发现在CNV病变内存在TUNEL阳性细胞(E)。在注射媒剂(B、D、F和H)的眼中未观察到TUNEL阳性细胞。箭头指示CNV区域。

图24描述由测量在多种TM-601浓度存在下保持72小时或120小时时HUVEC细胞增殖的实验得到的结果。尽管在较高TM-601浓度下细胞增殖速率比在较低TM-601浓度下低，但其增殖速率不低于未经处理的对照细胞。

图25描述由显示脉络膜的新血管系统(由激光破裂布鲁赫氏膜所诱导)和视网膜的新血管系统(由氧诱发的局部缺血所诱导)中TM-601与膜联蛋白A2(Annexin A2)共定位的实验得到的结果。眼内注射TM-601，随后使用抗-TM-601抗体和抗-膜联蛋白A2抗体对组织切片进行免疫组织化学分析。

图26描述显示TM-601抑制HUVEC细胞迁移并降低MMP-2活性的实验结果。(A)利用50ng/ml VEGF刺激HUVEC细胞迁移。添加TM-601以剂量相关的方式抑制迁移(如在Transwell分析中由侵袭所评估)。使用姬氏染色液(Giemsa stain)显现在Transwell小室下表面上的侵袭的细胞。(B)借助视细胞计数计算由VEGF或bFGF(50ng/ml)所刺激的细胞迁移，且经显示，10μM TM-601可使Transwell小室中HUVEC侵袭抑制约50％。(C)在培养基中由未经处理、经bFGF处理或者经bFGF与10μM TM-601一起处理的经培养HUVEC细胞得到的MMP-2活性。误差棒指示标准误差。

图27描述显示TM-601降低U87人神经胶质瘤细胞所分泌的MMP-2活性的实验结果。测量培养基中由未经处理或添加10μM TM-601的经培养U87细胞得到的MMP-2活性。

图28显示在经过静脉内注射的非癌小鼠中聚乙二醇化蝎氯毒素(TM-601-PEG)与未经修饰的TM-601的半衰期的比较。聚乙二醇化使TM601的半衰期增加至约32倍。

图29显示在小鼠CNV模型中，聚乙二醇化TM-601可以比未经修饰的TM-601低的给药频率实现抗血管生成作用。绘制在CNV模型中对于未经修饰的TM-601或聚乙二醇化TM-601的不同给药方案的微血管密度的图。

具体实施方式

定义

以下段落中将定义本说明书通篇使用的数种术语。

除非另作说明，或另外从上下文中可显而易见，否则本文提到数字时使用的术语“约(about)”和“大约(approximately)”在本文中包括在所述数字的任一方向(大于或小于所述数字)的20％、10％、5％或1％范围内的数字(除所述数字超过可能值的100％的情形外)。

本文使用的术语“膜联蛋白A2”是指在Entrez基因库清单(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中官方代号为ANXA2(在智人(Homo sapiens)中)且官方全名为“膜联蛋白A2”的基因的蛋白质产物(ANXA2转录物的多种序列可例如见于基因库入藏登记号M62899、NM_001002857、NM_001002858、NM_004039下)。其中，膜联蛋白A2也称为“膜联蛋白II”和脂皮素2(lipocortin 2)。

术语“生物活性”当在本文中用于表征多肽时，是指一种分子与母体多肽共有足够的氨基酸序列一致性，由此展现与所述多肽类似或相同的特性(例如，特异性结合癌细胞，和/或内化进入癌细胞，和/或杀死癌细胞的能力)。

本文使用的术语“癌症”是指或描述哺乳动物中通常以不受调控的细胞生长为特征的生理学病况。癌症的实例包括(但不限于)癌瘤、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病。更具体点说，所述癌症的实例包括肺癌、骨癌、肝癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、皮肤或眼内黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门区域癌、胃癌、结肠癌、乳癌、子宫癌、性器官和生殖器官癌瘤、霍奇金氏病(Hodgkin′s Disease)、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌症、甲状腺癌、副甲状腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、膀胱癌、肾癌、肾细胞癌瘤、肾盂癌瘤、中枢神经系统(CNS)瘤、神经外胚层癌、脊柱肿瘤、神经胶质瘤、脑脊膜瘤和垂体腺瘤。

本文使用的术语“癌细胞”是指哺乳动物(例如人类)体内经历不合需要和不受调控的细胞生长或者异常存留或异常组织侵袭的细胞。在体外，此术语也指给予适宜的新鲜培养基和空间时会以不受调控的方式无限制增殖的细胞系，其是一种永久永生化的所建立的细胞培养物。

本文使用的术语“癌症患者”是指患有或易患癌症的个体。癌症患者可经确诊或可未经确诊患有癌症。此术语还包括先前经历癌症疗法的个体。

术语“化疗剂”与“抗癌剂或抗癌药”在本文中可互换使用。这些术语是指用于治疗癌症或癌性病况的药剂。抗癌药通常归为以下群组中的一者中：烷化剂类、嘌呤拮抗剂类、嘧啶拮抗剂类、植物碱类、插入性抗生素类(intercalating antibiotics)、芳香酶抑制剂类、抗代谢物类、有丝分裂抑制剂类、生长因子抑制剂类、细胞周期抑制剂类、酶类、拓扑异构酶抑制剂类、生物反应调节剂类、抗激素类和抗雄性激素类。所述抗癌剂的实例包括(但不限于)BCNU、顺铂(cisplatin)、吉西他宾(gemcitabine)、羟基脲(hydroxyurea)、紫杉醇(paclitaxel)、替莫唑胺(temozolomide)、拓扑替康(topotecan)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、长春新碱(vincristine)、长春花碱(vinblastine)、丙卡巴肼(procarbazine)、达卡巴嗪(decarbazine)、六甲密胺(altretamine)、甲氨喋呤(methotrexate)、巯基嘌呤(mercaptopurine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)、磷酸氟达拉滨(fludarabinephosphate)、克拉屈滨(cladribine)、喷司他丁(pentostatin)、阿糖胞苷(cytarabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(teniposide)、伊立替康(irinotecan)、多烯紫杉醇(docetaxel)、多柔比星(doxorubicin)、道诺霉素(daunorubicin)、更生霉素(dactinomycin)、依达比星(idarubicin)、普卡霉素(plicamycin)、丝裂霉素(mitomycin)、博来霉素(bleomycin)、他莫昔芬(tamoxifen)、氟他胺(flutamide)、亮丙立德(leuprolide)、戈舍瑞林(goserelin)、氨鲁米特(aminogluthimide)、阿那曲唑(anastrozole)、安吖啶(amsacrine)、天冬酰胺酶(asparaginase)、米托蒽醌(mitoxantrone)、米托坦(mitotane)和氨磷汀(amifostine)。

本文使用的术语“组合疗法”是指两种或两种以上不同药剂以重叠的方案投予，以致受检者同时暴露于双方药剂的情形。

本文使用的缩写“CTCAE”是指常见不良事件评价标准(Common TerminologyCriteria for Adverse Events)，它是由美国国家癌症研究所针对不良事件(AE)描述和分级所开发的标准，常用于临床试验中。

术语“细胞毒性”当在本文中用于表征一种部分、化合物、药物或试剂时，指一种部分、化合物、药物或试剂可抑制或阻止细胞的功能和/或引起细胞破坏。

术语“给药方案”当用于本文中时，指经若干时间段分开而独立投予一组单位剂量(通常一个以上剂量)。特定药剂的一组推荐剂量(即，投药量、时程、途径等)构成其给药方案。

本文使用的术语“有效量”和“有效剂量”是指足以在可接受的效益/风险比下实现预定目的(即，组织或受检者中所需的生物或医学反应)的化合物或组合物的任何量或剂量。举个例子，在本发明某些实施例中，所述目的可以是：特异性结合于目标组织；减缓或停止癌症症状的进展、加重或恶化；使癌症症状改善；和/或治愈癌症。相关预定目的可以是客观的(即，可通过一些测试或标记物测量)或主观的(即，受检者给出疗效的指征或感觉到疗效)。一般按可包含多个单位剂量的给药方案来投予治疗有效量。对于任何特定药剂，治疗有效量(和/或在有效给药方案内的适宜单位剂量)可例如取决于投药途径、与其它药剂的组合而变化。在一些实施例中，任何特定患者的具体治疗有效量(和/或单位剂量)将取决于多种因素，包括所治疗的病症和病症的严重程度；所用的特定药剂的活性；所用特定组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；投药时间；投药途径；和/或所用特定药剂的排泄或代谢速率；治疗持续的时间；以及医学领域中众所周知的类似因素。

本文使用的术语“荧光团”、“发荧光部分”、“荧光标记”、“荧光染料”与“荧光标记部分”在本文中可互换使用。这些术语是指在溶液中并且在用适宜波长的光激发后发射回光的分子。具有多种结构和特性的许多荧光染料适用于实践本发明。类似地，已知用于荧光标记核酸的方法和材料(参看例如R.P.霍格兰(R.P.Haugland)，″分子探针：荧光探针和研究化学手册1992-1994(Molecular Probes：Handbook of FluorescentProbes and Research Chemicals 1992-1994)″，第5版，1994，分子探针公司(MolecularProbes，Inc.))。在选择荧光团时，通常需要荧光分子高效地吸收光并发射荧光(即，分别以高摩尔吸收系数和荧光量子产率)，而且是耐光的(即，经光激发后，所述荧光分子在进行分析必需的时间内不会发生明显降解)。

本文使用的术语“融合蛋白”是指包含两种或两种以上蛋白质或其片段并利用共价键经各自肽主链连接的分子，所述蛋白质或其片段最优选是通过基因表达编码这些蛋白质的多聚核苷酸分子而产生。

本文使用的术语“同源”(或“同源性”)是指两个多肽分子之间或两个核酸分子之间的一致性程度。当两个比较序列中的一个位置由相同碱基或氨基酸单体亚基占据时，则个别分子在这个位置同源。两个序列之间的同源性百分比等于两个序列共有的匹配或同源位置的数量除以所比较的位置的数量，并乘以100。一般说来，当对准两个序列达到最大同源性时，进行比较。同源氨基酸序列共有一致或类似的氨基酸残基。类似残基是参照序列中相应氨基酸残基的保守性取代，或“容许的点突变”。参照序列中残基的“保守性取代”是物理上或功能上类似于相应参照残基的取代，例如，其具有类似尺寸、形状、电荷、化学特性，包括形成共价键或氢键的能力等。在一些实施例中，本发明所用的保守性取代是满足戴霍夫(Dayhoff)等人为“可接受的点突变”定义的标准的取代(″蛋白质序列和结构图册(Atlas of Protein Sequence and Structure)″，1978，自然—生物医学研究基础(Nat.Biomed.Res.Foundation)，华盛顿(Washington，DC)，第3增补版，22：354-352)。

术语“个体”和“受检者”在本文中可以互换使用。这些术语是指患有疾病或病症(例如癌症)，或者易患但可能已具有或不具有所述疾病或病症的人类或另一哺乳动物(例如小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、猪、绵羊、马或灵长类动物)。在许多实施例中，受检者为人类。在许多实施例中，受检者为患者。除非另作说明，否则术语“个体”和“受检者”不是指特定年龄，由此涵盖成人、儿童和新生儿。

本文使用的术语“抑制”是指预防某事发生、延缓某事发生的出现和/或降低某事发生的程度或可能性。因此，“抑制转移”与“抑制转移的形成”意在涵盖预防、延缓转移的发生和/或降低转移发生的可能性，以及降低转移的数量、生长速率、尺寸等。

本文中使用的术语“起始”当用于给药方案时，可用于指对先前未接收过药剂的受检者首次投予此药剂。或者或另外，术语“起始”可用于指在患者的疗法期间投予特定单位剂量的药剂。

术语“经标记”与“经可检测试剂或部分标记”在本文中可互换使用，特指一种实体(例如蝎氯毒素或蝎氯毒素连结物)例如在结合于另一实体(例如赘生性肿瘤组织)后可以目测观察。优选可检测试剂或部分经过选择，使得其产生能被测量的信号，而且信号强度与所结合的实体的量相关(例如成比例)。此项技术中已知多种用于标记和/或检测蛋白质和肽的系统。通过并入或连结至可利用分光镜、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学、化学或其它方式检测的标记，可以制得经标记的蛋白质和肽。标记或标记部分可以是直接检测(即，其不需要任何其它反应或操作来使其可检测，例如，荧光团是可以直接检测的)，或其可以是间接检测(即，通过与另一可检测实体反应或结合，来使其可检测，例如，半抗原在与包含如荧光团等报告者的适宜抗体反应后，可以通过免疫染色检测)。适合的可检测试剂包括(但不限于)放射性核素、荧光团、化学发光试剂、微粒、酶、色度标记、磁性标记、半抗原、分子信标(Molecular Beacon)、适体信标等。

本文使用的术语“转移”(有时缩写为“mets”)是指肿瘤细胞从一个器官或组织扩散至另一位置。此术语也指因转移而在新位置形成的肿瘤组织。“转移性癌症”是从初始位置或原发位置扩散的癌症，并且也可称为“继发癌症”或“继发肿瘤”。一般说来，转移性肿瘤是以所起源于的原发肿瘤的组织命名。因此，转移到肺部的乳癌即使一些癌细胞处在肺中，也可称为“转移性乳癌”。

本文使用的术语“新血管系统”是指尚未完全成熟的新形成的血管，即，其不具有完全形成的细胞连接紧密的内皮细胞内衬或完整的周围平滑肌细胞层。本文使用的术语“新血管”用于指新血管系统中的血管。

术语“正常”和“健康”在本文中可以互换使用。这些术语是指不具有肿瘤的一个个体或一组个体。术语“正常”在本文中也用于限定从健康个体分离的组织样品。

术语“药剂”、“治疗剂”与“药物”在本文中可互换使用。这些术语是指有效治疗、抑制和/或检测疾病、病症或临床病况的物质、分子、化合物、试剂、因子或组合物。

“药物组合物”在本文中定义为包含有效量的至少一种活性成分(例如，可经标记或可未经标记的蝎氯毒素或蝎氯毒素连结物)和至少一种药学上可接受的载剂的组合物。

本文中使用的术语“药学上可接受的载剂”是指不会干扰活性成分的生物活性的有效性且投药时的浓度不会对宿主产生过度毒性的载剂介质。此术语包括溶剂、分散介质、涂层、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂、吸收延迟剂等。此项技术中众所周知适于药物活性物质的此类介质和试剂的使用(参看例如″雷明顿氏药学大全(Remington′sPharmaceutical Sciences)″，E.W.马丁(E.W.Martin)，第18版，1990，默克出版公司(MackPublishing Co.)：宾夕法尼亚州伊斯顿(Easton，PA)，其按全文引用并入本文中)。

本文使用的术语“原发肿瘤”是指在肿瘤最初产生的初始位点的肿瘤，即，与已经扩散到别处者相对。

术语“蛋白质”、“多肽”与“肽”在本文中可互换使用，并且指各种长度的氨基酸序列，其可以是中性(未改变)形式或盐形式，且未经修饰或经糖基化、侧链氧化或磷酸化修饰。在某些实施例中，氨基酸序列是全长天然蛋白质。在其它实施例中，氨基酸序列是全长蛋白质的较小片段。在其它实施例中，氨基酸序列由连接至氨基酸侧链的额外取代基(例如糖基单元、脂质，或无机离子，如磷酸根)以及涉及链的化学转化(例如，巯基氧化)的修饰加以修饰。因此，术语“蛋白质”(或其相当的术语)打算包括经历过不改变其特定特性的修饰的全长天然蛋白质的氨基酸序列。具体地说，术语“蛋白质”涵盖蛋白质的同功异型物，即，由相同基因编码，但pI或MW或二者不同的变异体。此类同功异型物的氨基酸序列可不同(例如由替代性剪接或限制性蛋白水解产生)，或者所述同功异型物可源自于有差别的翻译后修饰(例如糖基化、酰基化或磷酸化)。

本文使用的术语“蛋白质类似物”是指功能与母体多肽相似或一致但未必包含与母体多肽相似或一致的氨基酸序列，或者结构与母体多肽相似或一致的多肽。优选在本发明上下文中，蛋白质类似物具有与母体多肽的氨基酸序列至少30％(更优选至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％)一致的氨基酸序列。此外，所属领域技术人员应理解，蛋白质序列一般容许不破坏活性的某些取代。因此，术语“蛋白质类似物)中涵盖保持母体多肽的活性且与母体多肽共有至少约30-40％、通常高于约50％、60％、70％或80％的整体序列一致性，且另外通常在一个或多个高度保守的区域中包括至少一个与母体多肽具有更高，通常高于90％、96％、97％、98％或99％一致性的区域(通常涵盖至少3到4个且通常多达20个或20个以上氨基酸)的任何多肽。

本文使用的术语“蛋白质片段”是指包含第二多肽的氨基酸序列中的至少5个氨基酸残基的氨基酸序列的多肽。蛋白质的片段可具有或可不具有母体多肽的功能活性。

术语“退化”在本文中当用于指血管和/或血管系统(包括新血管系统和/或新血管)时，用于指收缩、缩小等。

本文使用的术语“小分子”包括可起作用而影响生物过程的任何化学或其它部分。小分子可包括当前已知和使用的许多治疗剂，或者可以是出于筛选生物功能的目的而以分子文库形式合成的小分子。小分子在尺寸上与大分子相区别。适用于本发明中的小分子的分子量通常小于约5,000道尔顿(dalton，Da)、优选小于约2,500Da、更优选小于1,000Da，最优选小于约500Da。

本文使用的术语“易患”是指对于某些事物(即，疾病、病症或病况，例如转移性癌症)的风险和/或倾向性(通常是基于遗传诱因、环境因素、个体病史或其组合)高于在一般群体中所观察到的结果。此术语考虑到“易患”某种病况的个体可能从未确诊患有这种病况。

本文使用的术语“全身投药”是指药剂的投药使得大量所述药剂在体内广泛分布，并且在血液中具有生物作用(例如其预定作用)和/或通过血管系统到达其预定作用位点。典型的全身投药途径包括通过(1)将药剂直接引入血管系统或(2)经口、肺或肌肉内投予来投药，在(2)的情况下，所述药剂被吸收，进入血管系统并且经由血液载运至一个或多个预定作用位点。

术语“组织”在本文中以其广义使用。组织可以是包含(但非必需)肿瘤细胞的任何生物实体。在本发明的情况下，考虑体外、体内和离体组织。因此，组织可以是个体的一部分，或者可以从个体获得(例如借助活组织检查)。组织还可以包括组织切片，如出于组织学目的获取的冷冻切片；或者已知诊断、治疗和/或结果病史的存档样品。术语组织还涵盖通过处理组织样品衍生出的任何材料。衍生的材料包括(但不限于)从组织分离的细胞(或其子代)。组织样品的处理可涉及以下一种或多种：过滤、蒸馏、萃取、浓缩、干扰性组分的灭活、试剂的添加等。

术语“治疗”在本文中用于表征针对以下目的方法或过程：(1)延缓或预防疾病、病症或病况的发作；(2)减慢或停止疾病、病症或病况的一种或多种症状的进展、加重或恶化；(3)使疾病、病症或病况的症状缓解；(4)降低疾病、病症或病况的严重程度或发病率；或(5)治愈疾病、病症或病况。治疗可以在疾病、病症或病况发作前投予，实现预防或防止作用。或者或另外，治疗可以在疾病、病症或病况起始之后投予，实现治疗作用。

具体实施方式

如上文曾提到过的，本发明针对用于治疗和/或检测肿瘤转移的方法。本文中提供的方法大体上包含投予经可检测部分标记或未经可检测部分标记的蝎氯毒素试剂。在某些实施例中，蝎氯毒素试剂结合于肿瘤转移。在某些实施例中，蝎氯毒素试剂抑制和/或降低新转移形成的可能性。在某些实施例中，蝎氯毒素试剂是全身(例如静脉内)投予，和/或蝎氯毒素试剂跨过血/脑屏障。因此，在一些实施例中，本发明提供治疗、抑制和/或检测位于脑中的转移的方法。在某些实施例中，新血管的形成得以抑制和/或使现有的新血管系统退化。

根据本发明，可以使用此项技术中的常规分子生物学、微生物学和重组DNA技术。这些技术在文献中都已完整说明。参看例如曼妮提斯(Maniatis)，弗雷齐(Fritsch)和萨布鲁克(Sambrook)，″分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)″，1982；″DNA克隆：实践方法(DNA Cloning：A Practical Approach)，″第I和第II卷，D.N.格劳馥(D.N.Glover)(编)，1985；″低聚核苷酸的合成(Oligonucleotide Synthesis)″，M.J.盖特(M.J.Gait)(编)，1984；″核酸杂交(Nucleic Acid Hybridization)″，B.D.海姆斯(B.D.Hames)和S.J.海吉斯(S.J.Higgins)(编)，1985；″转录和翻译(Transcriptionand Translation)″，B.D.海姆斯和S.J.海吉斯(编)，1984；″动物细胞培养(Animal CellCulture)″，R.I.弗雷西丽(R.I.Freshney)(编)，1986；″固定的细胞和酶(Immobilized CellsAnd Enzymes)″，IRL出版社(IRL Press)，1986；B.佩宝(B.Perbal)，″分子克隆实践指南(A Practical Guide To Molecular Cloning)″，1984。

I.蝎氯毒素试剂

本发明的治疗和/或检测方法涉及对有需要的个体(例如，患有至少一种转移、曾患有至少一种转移、有发展至少一种转移的风险和/或易患至少一种转移的个体)投予有效剂量的至少一种蝎氯毒素试剂，以致所述蝎氯毒素试剂结合于所述至少一种转移。本文使用的术语“蝎氯毒素试剂”是指包含至少一个蝎氯毒素部分的化合物。在某些实施例中，蝎氯毒素试剂包含至少一个蝎氯毒素部分与至少一个治疗部分(例如抗癌剂)缔合。蝎氯毒素部分(和/或治疗部分)可与至少一个标记部分缔合。

A.蝎氯毒素部分

本文使用的术语“蝎氯毒素部分”是指蝎氯毒素、生物活性蝎氯毒素亚基或蝎氯毒素衍生物。

在某些实施例中，术语“蝎氯毒素”是指来源于以色列杀人蝎毒液的具有36个氨基酸的全长天然多肽(德宾(DeBin)等人，美国生理学杂志(Am.J.Physiol)，1993，264：C361-369)，其包含如国际申请案第WO 2003/101474号SEQ ID NO.1中所述的天然蝎氯毒素的氨基酸序列，所述申请案的内容按引用并入本文中。术语“蝎氯毒素”包括包含SEQ ID NO.1的多肽，其为合成或重组产生的，例如美国专利第6,319,891号(其全文按引用并入本文中)中公开的序列。

“生物活性蝎氯毒素亚基”是包含蝎氯毒素中不到36个氨基酸且保留蝎氯毒素至少一种特性或功能的肽。本文使用的蝎氯毒素的“特性或功能”包括(但不限于)使异常细胞生长停滞的能力；相比正常细胞，特异性结合于肿瘤/癌细胞的能力；相比正常细胞，特异性结合于正在转移的肿瘤/癌细胞或转移中的肿瘤/癌细胞的能力；内化至肿瘤/癌细胞中的能力；杀死肿瘤/癌细胞的能力；和/或抑制新血管形成和/或使新血管退化的能力。所述肿瘤/癌细胞可以是在体外、离体、体外、转移的一部分、来自个体的原代分离物、培养的细胞，或细胞系。

本文使用的术语“生物活性蝎氯毒素衍生物”是指蝎氯毒素和相关肽的多种衍生物、类似物、变异体、多肽片段和模拟物中的任一种，其保留蝎氯毒素的至少一种特性或功能(如上文所述)。蝎氯毒素衍生物的实例包括(但不限于)蝎氯毒素的肽变异体；蝎氯毒素的肽片段，例如包含国际申请案第2003/101474号中所述SEQ ID No.1、2、3、4、5、6或7中相邻10聚体(10-mer)肽或由其组成，或包含国际申请案第WO 2003/101474号中所述SEQ ID No.1的残基10-18或21-30的片段；核心结合序列；和肽模拟物。

蝎氯毒素衍生物的实例包括具有国际申请案第WO 2003/101474号的SEQ ID No.1中所述氨基酸序列的片段、具有至少约7、约8、约9、约10、约15、约20、约25、约30或约35个与蝎氯毒素活性相关的相邻氨基酸残基的肽。所述片段可含有蝎氯毒素肽的功能区，其被鉴别为对应于已知肽结构域的氨基酸序列区；以及具有明显亲水性的区域。所述片段还可以包括两个彼此以任何次序连接的核心序列，其中插入氨基酸已被去除或经连接剂置换。

蝎氯毒素衍生物包括当在最大限度上对准衍生物序列与蝎氯毒素序列时包含至少一个氨基酸残基的保守或非保守性取代的多肽。所述取代可以增强蝎氯毒素的至少一种特性或功能；抑制蝎氯毒素的至少一种特性或功能；或对蝎氯毒素的至少一种特性或功能中立。

适用于实践本发明的蝎氯毒素衍生物的实例描述于国际申请案第WO 2003/101474号中(其全文按引用并入本文中)。特定实例包括包含此国际申请案中所述的SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.13或由所述序列组成的多肽，以及其变异体、类似物和衍生物。

蝎氯毒素衍生物的其它实例包括含有借助于例如同源重组、定点诱变或PCR诱变引起的预定突变，及肽家族的等位基因或其它天然存在的变异体的多肽；以及所述肽已利用除天然存在氨基酸以外的部分(例如可检测部分，如酶或放射性同位素)通过取代、化学、酶或其它适宜的方式共价修饰的衍生物。

蝎氯毒素和其肽衍生物可以使用此项技术中已知的多种方法中的任一种制备，包括标准固相(或溶液相)肽合成方法。此外，编码这些肽的核酸可以使用市售的低聚核苷酸合成仪器合成，并且所述蛋白质可以使用标准重组制造系统重组产生。

其它适合的蝎氯毒素衍生物包括模拟蝎氯毒素的三维结构的肽模拟物。所述肽模拟物可具有优于天然存在的肽的明显益处，包括例如制造更为经济、化学稳定性更高、药理特性(半衰期、吸收、效力、功效等)增强、特异性改变(例如广谱生物活性、抗原性降低等)。

在某些实施例中，模拟物是模拟蝎氯毒素肽二级结构的元件的分子。蛋白质的肽主链主要用于以一定方式定向氨基酸侧链，以便促进分子的相互作用，例如抗体与抗原的相互作用。预期肽模拟物将允许与天然分子类似的分子相互作用。肽类似物普遍用于制药工业，如特性类似于模板肽的非肽药物。这些类型的化合物也称为肽模拟物(peptidemimetics)或拟肽类(peptidomimetics)(参看例如法切尔(Fauchere)，药物研究进展(Adv.Drug Res.)，1986，15：29-69；韦伯(Veber)和弗雷迪杰(Freidinger)，1985，神经科学趋势(Trends Neurosci.)，1985，8：392-396；伊万斯(Evans)等人，医药化学杂志(J.Med.Chem.)，1987，30：1229-1239)，并且通常借助于计算机分子模拟进行开发。

一般说来，肽模拟物的结构类似于范例多肽(paradigm polypeptide)(即，具有生化特性或药理活性的多肽)，但其中一个或多个肽键联任选经非肽键联置换。通过使用组合化学来产生药物库，可以增强肽模拟物的使用。通过鉴别增加或减少肽与例如肿瘤细胞的结合的氨基酸突变，可以辅助肽模拟物的设计。可用方法包括酵母双杂交法(yeasttwo hybrid method)(参看例如奇恩(Chien)等人，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，1991，88：9578-9582)以及使用噬菌体呈现法。所述双杂交法可检测酵母中的蛋白质-蛋白质相互作用(菲尔德(Field)等人，自然(Nature)，1989，340：245-246)。噬菌体呈现法可检测固定蛋白质与如λ和M13等噬菌体表面上所表达的蛋白质之间的相互作用(安伯格(Amberg)等人，策略(Strategies)，1993，6：2-4；霍格费(Hogrefe)等人，基因(Gene)，1993，128：119-126)。这些方法允许正选择和负选择肽-蛋白质相互作用和鉴别可以测定这些相互作用的序列。

在某些实施例中，蝎氯毒素试剂包含呈现与上述蝎氯毒素类似或相关的活性的另一种蝎子的多肽毒素。本文使用的术语“与蝎氯毒素类似或相关的活性”特指与肿瘤/癌细胞的选择性/特异性结合。适合的相关蝎子毒素的实例包括(但不限于)与蝎氯毒素具有氨基酸和/或核苷酸序列一致性的蝎子来源的毒素或相关肽。相关蝎子毒素的实例包括(但不限于)来自四川蝎(Mesobuthus martenssi)的CT神经毒素(基因库(GenBank)入藏登记号AAD473730)、来自东亚钳蝎(卡希)(Buthus martensii karsch)的神经毒素BmK 41-2(基因库入藏登记号A59356)、来自东亚钳蝎(Buthus martensii)的神经毒素Bm12-b(基因库入藏登记号AAK16444)、来自以色列黄蝎(Leiurus quinquestriatushebraeu)的可能毒素(Probable Toxin)LGH 8/6(基因库入藏登记号P55966)和来自印度红蝎(Mesubutus tamulus sindicus)的小毒素(Small toxin)(基因库入藏登记号P15229)。

适用于本发明中的相关蝎子毒素包含氨基酸序列与国际申请案第WO 2003/101474号(其全文按引用并入本文中)SEQ ID No.1中所述的完整蝎氯毒素序列具有至少约75％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％序列一致性的多肽。在某些实施例中，相关蝎子毒素包括序列与国际申请案第WO 2003/101474号中所述蝎氯毒素的SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.13同源的那些蝎子毒素。

在某些实施例中，在蝎氯毒素试剂内的蝎氯毒素部分经过标记。标记方法和标记部分的实例如下文中所述。

B.治疗部分

如上文曾提到的，在某些实施例中，蝎氯毒素试剂包含至少一个蝎氯毒素部分与至少一个治疗部分缔合。适合的治疗部分包括多种有效治疗疾病或临床病况的物质、分子、化合物、试剂或因子中的任一种。在某些实施例中，治疗部分是化疗剂(即抗癌药)。适合的抗癌药包括多种对癌细胞直接或间接有毒或有害的物质、分子、化合物、试剂或因子中的任一种。

一般技术人员将了解，治疗部分可以是合成或天然化合物：单一分子、不同分子的混合物或不同分子的复合物。适合的治疗部分可属于多类化合物中任一类，包括(但不限于)小分子类、肽类、蛋白质类、糖类、类固醇类、抗体类(包括其片段和变异体)、融合蛋白类、反义多聚核苷酸类、核糖酶类、小干扰RNA类、拟肽类、放射性核素类等。

当治疗部分包含抗癌药时，抗癌药可见于例如以下数类抗癌药之中：烷化剂类、抗代谢药物类、抗有丝分裂抗生素类、生物碱抗肿瘤剂类、激素类和抗激素类、干扰素类、非类固醇消炎药类，以及各种其它抗肿瘤剂类，例如激酶抑制剂、蛋白酶体抑制剂和NF-κB抑制剂。

抗癌药的实例包括(但不限于)例如烷化剂类药物(例如，氮芥(mechlorethamine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、美法仑(melphalan)、异环磷酰胺(ifosfamide)、替莫唑胺等)、抗代谢物类(例如，甲氨喋呤等)、嘌呤拮抗剂类和嘧啶拮抗剂类(例如，6-巯基嘌呤、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷(cytraribine)、吉西他宾等)、纺锤体毒素类(例如，长春花碱、长春新碱、长春瑞宾(vinorelbine)、紫杉醇等)、鬼臼毒素类(例如，依托泊苷、伊立替康、拓扑替康等)、抗生素类(例如，多柔比星、博来霉素、丝裂霉素等)、硝基脲类(例如，卡莫司汀(carmustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nomustine)等)、无机离子类(例如，顺铂、卡铂(carboplatin)等)、酶类(例如，天冬酰胺酶等)和激素类(例如，他莫昔芬、亮丙立德、氟他胺、甲地孕酮(megestrol)等)。有关最新癌症疗法更为详尽的论述，参看http://www.cancer.gov/；FDA批准的肿瘤药物清单http://www.fda.gov/cder/cancer/druglistframe.htm；以及默克诊疗手册(The Merck Manual)，第17版，1999，所述参考的完整内容都按引用并入本文中。

一些抗癌药是通过阻滞癌细胞生长和/或复制起作用。此类药物一般归为“细胞生长抑制剂类”。在某些实施例中，治疗部分包含细胞生长抑制剂。细胞生长抑制剂类的实例包括烷化剂类、抗代谢物类、植物碱类和类萜(包括长春生物碱(vinca alkaloid)、鬼臼毒素(podophyllotoxin)、紫杉烷(taxane)等；VP-16是植物碱的实例)、拓扑异构酶抑制剂类、抗肿瘤抗体类、激素类等。

在某些实施例中，治疗部分包含细胞毒性剂。细胞毒性剂的实例包括毒素、其它生物活性蛋白、常规化疗剂、酶和放射性同位素。

适合的细胞毒性剂的实例包括(但不限于)细菌和植物毒素，例如白树素、蓖麻毒素、皂素、绿脓杆菌(Pseudomonas)外毒素、美洲商陆(pokeweed)抗病毒蛋白、白喉毒素等。

适合的细胞毒性生物活性蛋白的实例包括(但不限于)补体系统的蛋白质(或补体蛋白)。补体系统是有助于清除生物体中的病原体并促进愈合的复杂生化级联(B.P.莫根(B.P.Morgan)，临床实验室科学鉴定性评论(Crit.Rev.Clin.Lab.Sci.)，1995，32：265)。补体系统是由35种以上可溶性细胞结合蛋白组成，其中12种直接涉及补体路径。

适合的细胞毒性化疗剂的实例包括(但不限于)紫杉烷类(例如多烯紫杉醇、紫杉醇等)、美登素(maytansine)类、度卡霉素(duocarmycin)类、CC-1065、奥瑞他汀(auristatin)类、加里刹霉素(calicheamincin)类和其它烯二炔抗肿瘤抗生素类。其它实例包括抗叶酸类(例如氨基喋呤(aminopterin)、甲氨喋呤、培美曲塞(pemetrexed)、雷替曲赛(raltitrexed)等)、长春生物碱类(例如长春新碱、长春花碱、依托泊苷、长春地辛、长春瑞宾等)和蒽环霉素类(例如道诺霉素、多柔比星、表柔比星、依达比星、米托蒽醌、伐柔比星(valrubicin)等)。

适合的细胞毒性酶的实例包括(但不限于)溶核酶。

适合的细胞毒性放射性同位素的实例包括当定位于肿瘤部位时导致细胞破坏的任何α、β或γ发射体(S.E.沃德(S.E.Order)，″放射性标记的抗体在癌症疗法中的治疗应用的分析、结果和未来前景(Analysis，Results，and Future Prospective of the TherapeuticUse of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy)″，用于癌症检测和疗法的单克隆抗体(Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy)，R.W.博文(R.W.Baldwin)等人(编)，学术出版社(Academic Press)，1985)。此类放射性同位素的实例包括(但不限于)碘-131(¹³¹I)、碘-125(¹²⁵I)、铋-212(²¹²Bi)、铋-213(²¹³Bi)、砹-211(²¹¹At)、铼-186(¹⁸⁶Re)、铼-186(¹⁸⁸Re)、磷-32(³²P)、钇-90(⁹⁰Y)、钐-153(¹⁵³Sm)和镥-177(¹¹⁷Lu)。

或者或另外，适用于本发明中的治疗部分可以是2007年8月7日申请的题为“作为药物载剂的蝎氯毒素(Chlorotoxins as Drug Carriers)”(USSN 60/954,409)和2007年10月12日申请的题为“蝎氯毒素试剂全身投药用于诊断和治疗肿瘤(SystemicAdministration of Chlorotoxin Agents for the Diagnosis and Treatment of Tumors)”(USSN60/)的共有临时申请案中所述的任何治疗部分，所述申请案的完整内容按全文引用并入本文中。所述治疗部分类别的实例包括(但不限于)弱水溶性抗癌剂、与耐药性有关的抗癌剂、反义核酸、核糖酶、三联体试剂(triplex agent)、短干扰RNA(siRNA)、光敏剂、放射增敏剂、超抗原、前药活化酶和抗血管生成剂。

在某些实施例中，在蝎氯毒素试剂内的治疗剂(例如抗癌剂)是核酸试剂。

已经证实，多种癌症和肿瘤与不同程度的遗传损伤有关，例如点突变、基因缺失或重复(duplication)。已经开发出许多治疗癌症的新策略，如“反义”、“反基因”和“RNA干扰”，来调节基因的表达(A.卡洛塔(A.Kalota)等人，肿瘤生物学与治疗(Cancer Biol.Ther.)，2004，3：4-12；Y.中田(Y.Nakata)等人，真核基因表达评论综述(Crit.Rev.Eukaryot.Gene Expr.)，2005，15：163-182；V.瓦奇克(V.Wacheck)和U.泽美斯特-维柯(U.Zangmeister-Wittke)，肿瘤学与血液学评论(Crit.Rev.Oncol.Hematol.)，2006，59：65-73；A.柯洛塔(A.Kolata)等人，药理学实验手册(Handb.Exp.Pharmacol.)，2006，173：173-196)。这些方法例如利用反义核酸、核糖酶、三联体试剂或短干扰RNA(siRNA)，以通过用反义核酸掩蔽目标基因的特定mRNA或用三联体试剂掩蔽其DNA，通过用核糖酶裂解核苷酸序列，或通过涉及RNA干扰的复杂机制破坏mRNA，来阻断所述mRNA或DNA的转录或翻译。在所有这些策略中，低聚核苷酸主要用作活性剂，但也曾经应用小分子和其它结构。尽管基于低聚核苷酸的基因表达调节策略对于某些癌症的治疗具有巨大潜力，但低聚核苷酸的药理学应用的主要阻碍在于，无法将这些化合物有效递送到其在癌细胞内的作用位点。(P.赫德威金(P.Herdewijn)等人，反义核酸药物的开发(Antisense Nucleic Acids Drug Dev.)，2000，10：297-310；Y.庄司(Y.Shoji)和H.中岛(H.Nakashima)，当代药物设计(Curr.Charm.Des.)，2004，10：785-796；A.W.童(A.W Tong)等人，分子疗法新进展(Curr.Opin.Mol.Ther.)，2005，7：114-124)。

本文提供的蝎氯毒素试剂包含毒素部分(例如蝎氯毒素部分)以及适用作治疗剂(例如抗癌剂)的核酸分子。多种化学类型和结构形式的核酸可以适用于此类策略。其包括(作为非限制性实例)DNA，包括单链DNA(ssDNA)和双链DNA(dsDNA)；RNA，包括(但不限于)ssRNA、dsRNA、tRNA、mRNA、rRNA、酶RNA；RNA:DNA杂交体、三联体DNA(例如dsDNA与短低聚核苷酸缔合)等。

在本发明一些实施例中，蝎氯毒素试剂中存在的核酸试剂的长度介于约5与2000个核苷酸之间。在一些实施例中，核酸试剂为至少约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50个或50个以上核苷酸长。在一些实施例中，核酸试剂的长度小于约2000、1900、1800、1700、1600、1500、1400、1300、1200、1100、1000、900、800、700、600、500、450、400、350、300、250、200、150、100、50、45、40、35、30、25、20或20个以下核苷酸。

在一些实施例中，本发明蝎氯毒素试剂中存在的核酸试剂包含启动子和/或其它调控转录的序列。在一些实施例中，本发明蝎氯毒素试剂中存在的核酸试剂包含复制起点和/或其它调控复制的序列。在一些实施例中，本发明蝎氯毒素试剂中存在的核酸试剂不包括启动子和/或复制起点。

适用于实践本发明的核酸抗癌剂包括靶向以下基因的那些药剂：与肿瘤发生和细胞生长或细胞转化有关的基因(例如原癌基因，其编码刺激细胞分裂的蛋白质)、血管生成/抗血管生成的基因、肿瘤抑制基因(其编码抑制细胞分裂的蛋白质)、编码与肿瘤生长和/或肿瘤迁移有关的蛋白质的基因，和诱导细胞凋亡或其它形式细胞死亡的自杀基因(suicide gene)，尤其是在迅速分裂的细胞中活性最强的自杀基因。

与肿瘤发生和/或细胞转化有关的基因序列的实例包括MLL融合基因、BCR-ABL、TEL-AML1、EWS-FLI1、TLS-FUS、PAX3-FKHR、Bcl-2、AML1-ETO、AML1-MTG8、Ras、Fos PDGF、RET、APC、NF-1、Rb、p53、MDM2等；过度表达的序列，如多药耐药性基因；细胞周期素；β-连环素蛋白(beta-Catenin)；端粒酶基因；c-myc、n-myc、Bcl-2、Erb-B1和Erb-B2；和突变序列，如Ras、Mos、Raf和Met。肿瘤抑制基因的实例包括(但不限于)p53、p21、RB1、WT1、NF1、VHL、APC、DAP激酶、p16、ARF、神经纤维瘤蛋白(Neurofibromin)和PTEN。可由适用于抗癌疗法中的核酸分子靶向的基因的实例包括编码与肿瘤迁移有关的蛋白质(如整合素、选择素(selectin)和金属蛋白酶)的基因；编码促进新血管形成的蛋白质(如血管内皮生长因子(VEGF)或VEGFr)的抗血管生成基因；编码抑制新血管生成的蛋白质(如内皮细胞阻断剂、血管新生阻断剂和VEGF-R2)的抗血管生成基因；和编码例如以下蛋白质的基因：白细胞介素、干扰素、成纤维细胞生长因子(α-FGF和β-FGF)、类胰岛素生长因子(例如IGF-1和IGF-2)、血小板源性生长因子(PDGF)、肿瘤坏死因子(TNF)、转化生长因子(例如TGF-α和TGF-β)、表皮生长因子(EGF)、角化细胞生长因子(KGF)、干细胞因子和其受体c-Kit(SCF/c-Kit)配体、CD40L/CD40、VLA-4VCAM-1、ICAM-1/LFA-1、透明质酸(hyalurin)/CD44等。所属领域技术人员将认识到，前述实例是不详尽的。

本发明蝎氯毒素试剂中的核酸可具有多种活性中的任一种，包括例如作为抗癌剂或其它治疗剂、探针、引物等。本发明蝎氯毒素试剂中的核酸可具有酶活性(例如核糖酶活性)、基因表达抑制活性(例如作为反义试剂或siRNA试剂等)和/或其它活性。本发明蝎氯毒素试剂中的核酸本身可以具有活性，或者可以作为载体递送活性核酸试剂(例如，通过所递送核酸的复制和/或转录)。出于本说明书的目的，如果此类载体核酸编码或以其它方式递送治疗活性剂，那么即使其本身不具有治疗活性，也可将其视为“治疗剂”。

在某些实施例中，蝎氯毒素试剂包含核酸治疗剂，所述核酸治疗剂包含或编码反义化台物。术语“反义化合物或试剂”、“反义低聚物”、“反义低聚核苷酸”与“反义低聚核苷酸类似物”在本文中可互换使用，并且指核苷酸碱基和亚基至亚基主链的序列，其允许反义化合物通过沃特森-克里克(Watson-Crick)碱基配对与RNA中的目标序列杂交，由此在目标序列内形成RNA低聚物杂化双链(heteroduplex)。所述低聚物可在目标序列内具有精确的序列互补性或接近的互补性。所述反义低聚物可阻断或抑制含有目标序列的mRNA的翻译，或抑制基因转录。反义低聚物可结合于双链或单链序列。

适用于实践本发明的反义低聚核苷酸的实例包括例如以下综述中提到的那些：R.A斯戴尔(R.A Stahel)等人，肺癌(Lung Cancer)，2003，41：S81-S88；K.F.派尔洛(K.F.Pirollo)等人，药理学与治疗学(Pharmacol.Ther.)，2003，99：55-77；A.C.史蒂芬斯(A.C.Stephens)和R.P.瑞文斯(R.P.Rivers)，分子治疗新进展(Curr.Opin.Mol.Ther.)，2003，5：118-122；N.M.狄恩(N.M.Dean)和C.F.本纳特(C.F.Bennett)，致癌基因(Oncogene)，2003，22：9087-9096；N.斯奇翁(N.Schiavone)等人，当代药物设计(Curr.Pharm.Des.)，2004，10：769-784；L.维德尔(L.Vidal)等人，欧洲癌症杂志(Eur.J.Cancer)，2005，41：2812-2818；T.埃波-法德尔(T.Aboul-Fadl)，当代药物化学(Curr.Med.Chem.)，2005，12：2193-2214；M.E.格里夫(M.E.Gleave)和B.P.蒙娜(B.P.Monia)，癌症自然评论(Nat.Rev.Cancer)，2005，5：468-479；Y.S.卓中(Y.S.Cho-Chung)，当代药物设计，2005，11：2811-2823；E.雷伯恩(E.Rayburn)等人，药物设计与发现通讯(Lett.Drug Design&Discov.)，2005，2：1-18；E.R.雷伯恩(E.R.Rayburn)等人，新兴药物的专家观点(ExpertOpin.Emerg.Drugs)，2006，11：337-352；I.泰姆(I.Tamm)和M.瓦格纳(M.Wagner)，分子生物技术(Mol.Biotechnol.)，2006，33：221-238(各自按全文引用并入本文中)。

适合的反义低聚核苷酸的实例包括例如奥利默森钠(olimerson sodium)(也称为Genasense^TM或G31239，吉特纳公司(Genta，Inc.)开发，新泽西州伯克利海茨(BerkeleyHeights，NJ))，即一种靶向bcl-2 mRNA的起始密码子区的硫代磷酸酯(phosphorothioate)低聚物，所述bcl-2 mRNA是一种有效的细胞凋亡抑制剂，并且在包括滤泡性淋巴瘤、乳癌、结肠癌和前列腺癌以及中度/高度淋巴瘤在内的许多癌症中过度表达(C.A.斯塔恩(C.A.Stein)等人，肿瘤学论文集(Semin.Oncol)，2005，32：563-573；S.R.弗兰克尔(S.R.Frankel)，肿瘤学论文集，2003，30：300-304)。其它适合的反义低聚核苷酸包括GEM-231(HYB0165，海伯顿公司(Hybridon，Inc.)，马萨诸塞州剑桥(Cambridge，MA))，其为针对cAMP依赖性蛋白激酶A(PKA)的混合主链低聚核苷酸(S.高尔(S.Goel)等人，临床癌症研究(Clin.Cancer Res.)，203，9：4069-4076)；Affinitak(ISIS 3521或阿皮诺卡森(aprinocarsen)，ISIS制药公司(ISIS pharmaceuticals，Inc.)，加利福尼亚州卡尔斯巴德(Carlsbad，CA))，一种PKC-α的反义抑制剂；OGX-011(Isis 112989，Isis制药公司(Isis Pharmaceuticals、Inc.))，一种2′-甲氧基乙基修饰过的针对丛生蛋白(clusterin)的反义低聚核苷酸，所述丛生蛋白是涉及细胞周期调控、组织重建、脂质运输和细胞死亡的糖蛋白，并且在乳癌、前列腺癌和结肠癌中过度表达；ISIS 5132(Isis 112989，Isis制药公司)，一种与c-raf-1 mRNA的3′-非翻译区序列互补的硫代磷酸酯低聚核苷酸(S.P.亨利(S.P.Henry)等人，抗癌药物设计(Anticancer Drug Des.)，1997，12：409-420；B.P.莫尼亚(B.P.Monia)等人，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，1996，93：15481-15484；C.M.鲁丁(C.M.Rudin)等人，临床癌症研究(Clin.Cancer Res.)，2001，7：1214-1220)；ISIS 2503(Isis制药公司)，一种人H-ras mRNA表达的硫代磷酸酯低聚核苷酸反义抑制剂(J.库雷克(J.Kurreck)，欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)，2003，270：1628-1644)；靶向细胞凋亡蛋白的X连锁抑制剂(X-linked inhibitor of apoptosisprotein，XIAP；其阻断相当大部分的细胞凋亡路径)的低聚核苷酸，如GEM 640(AEG35156，艾吉纳治疗剂公司(Aegera Therapeutics Inc.)和海伯顿公司(Hybridon、Inc.))或靶向生存素(survivin，一种细胞凋亡蛋白抑制剂(IAP))的低聚核苷酸，如ISIS 23722(Isis制药公司)，一种2′-O-甲氧基乙基嵌合低聚核苷酸；MG98，其靶向DNA甲基转移酶；以及GTI-2040(罗鲁斯治疗剂公司(Lorus Therapeutics，Inc.)，加拿大多伦多(Toronto，Canada))，一种20聚体低聚核苷酸，其与人核糖核苷酸还原酶R2小亚基组分的mRNA中的编码区互补。

其它适合的反义低聚核苷酸包括针对Her-2/neu、c-Myb、c-Myc和c-Raf正开发的反义低聚核苷酸(参看例如A.比罗西(A.Biroccio)等人，致癌基因(Oncogene)，2003，22：6579-6588；Y.李(Y.Lee)等人，癌症研究(Cancer Res.)，2003，63：2802-2811；B.卢(B.Lu)等人，癌症研究，2004，64：2840-2845；K.F.皮埃罗(K.F.Pirollo)等人，药物学与治疗学(Pharmacol.Ther.)，2003，99：55-77；和A.瑞特(A.Rait)等人，纽约科学院年鉴(Ann.N.Y.Acad.Sci.)，2003，1002：78-89)。

在某些实施例中，本发明蝎氯毒素试剂包含核酸抗癌剂，所述核酸抗癌剂包含或编码干扰RNA分子。术语“干扰RNA”与“干扰RNA分子”在本文中可互换使用，并且指可以例如通过介导RNA干扰(RNAi)抑制或下调基因表达，或者以序列特异性方式使基因沉默的RNA分子。RNA干扰(RNAi)是一种由双链RNA(dsRNA)触发的在进化中保守的序列特异性机制，其诱导互补目标单链mRNA的降解以及对应翻译序列的“沉默”(麦克曼斯(McManus)和夏普(Sharp)，2002，遗传学自然评论(Nature Rev.Genet.)，2002，3：737)。RNAi通过将较长的dsRNA链酶法裂解成约21到23个核苷酸长的生物活性“短干扰RNA”(siRNA)序列来起作用(埃尔巴萨(Elbashir)等人，基因研究(Genes Dev.)，2001，15：188)。RNA干扰已成为一种颇具前景的癌症治疗途径。

适用于实践本发明的干扰RNA可以按数种形式中的任一种提供。例如，所提供的干扰RNA可以是经分离的短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)或短发夹RNA(shRNA)中的一种或多种。

适用于本发明中的干扰RNA分子的实例包括例如以下综述中所提到的iRNA：O.米尔哈维(O.Milhavet)等人，药理学研究(Pharmacol.Rev.)，2003，55：629-648；F.比利(F.Bi)等人，当代基因治疗(Curr.Gene.Ther.)，2003，3：411-417；P.Y.卢(P.Y.Lu)等人，分子治疗新进展(Curr.Opin.Mol.Ther.)，2003，5：225-234；I.弗雷德里奇(I.Friedrich)等人，癌症生物学研究文辑(Semin.Cancer Biol)，2004，14：223-230；M.埃兹奎托(M.Izquierdo)，癌症基因疗法(Cancer Gene Ther.)，2005，12：217-227；P.Y.卢(P.Y.Lu)等人，遗传学进展(Adv.Genet.)，2005，54：117-142；G.R.戴维(G.R.Devi)，癌症基因疗法，2006，13：819-829；M.A.贝霍克(M.A.Behlke)，分子治疗(Mol.Ther.)，2006，13：644-670；和L.N.普托尔(L.N.Putral)等人，药物新闻与展望(Drug NewsPerspect)，2006，19：317-324(各文献都按全文引用并入本文中)。

适合的干扰RNA分子的其它实例包括(但不限于)p53干扰RNA(例如，T.R.布鲁蒙坎普(T.R.Brummelkamp)等人，科学(Science)，2002，296：550-553；M.T.赫曼(M.T.Hemman)等人，自然遗传学(Nat.Genet.)，2003，33：396-400)；靶向bcr-abl融合基因的干扰RNA，所述bcr-abl融合基因与慢性骨髓性白血病和急性淋巴细胞性白血病的发展有关(例如，M.斯奇尔(M.Scherr)等人，血液学(Blood)，2003，101：1566-1569；M.J.李(M.J.Li)等人，低聚核苷酸(Oligonucleotides)，2003，13：401-409)；抑制NPM-ALK的表达的干扰RNA，所述NPM-ALK是一种在75％的间变性大细胞淋巴瘤中发现的蛋白质，其会引起与肿瘤形成有关的组成性活性激酶的表达(U.瑞特(U.Ritter)等人，低聚核苷酸，2003，13：365-373)；靶向致癌基因的干扰RNA，所述致癌基因如Raf-1(T.F.楼(T.F.Lou)等人，低聚核苷酸，2003，13：313-324)、K-Ras(T.R.布鲁蒙坎普等人，癌细胞(Cancer Cell)，2002，2：243-247)、erbB-2(G.杨(G.Yang)等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，2004，279：4339-4345)；靶向b-连环素蛋白的干扰RNA，所述b-连环素蛋白的过度表达将引起T-细胞因子目标基因的转活化(transactivation)，而这一转活化被认为是结肠直肠癌中的主要转化事件(M.范德维特灵(M.van de Wetering)等人，EMBO报告(EMBO Rep.)，2003，4：609-615)。

C.标记部分

在某些实施例中，蝎氯毒素试剂经至少一种标记部分标记。例如，可以用标记部分标记蝎氯毒素试剂内的一个或多个蝎氯毒素部分和/或一个或多个治疗部分。

标记部分的作用是便利蝎氯毒素试剂在结合于待测试组织后的检测。优选地，标记部分经过选择，使得其产生能被测量的信号并且信号强度与结合于组织的诊断剂的量相关(例如成比例)。

优选地，标记不会实质上干扰蝎氯毒素试剂的所要生物或药物活性。在某些实施例中，标记涉及将一个或多个标记部分连接至或并入蝎氯毒素部分，优选连接至或并入蝎氯毒素部分的肽序列上的非干扰位置。所述非干扰位置是不参与蝎氯毒素部分与肿瘤细胞的特异性结合的位置。

标记部分可以是允许在蝎氯毒素试剂结合于相关组织或系统后进行检测的任何实体。多种可检测试剂中任一者都可用作本发明蝎氯毒素试剂中的标记部分。标记部分可以直接检测或间接检测。标记部分的实例包括(但不限于)：各种配体、放射性核素(例如，³H、¹⁴C、¹⁸F、¹⁹F、³²P、³⁵S、¹³⁵I、¹²⁵I、¹²³I、⁶⁴Cu、¹⁸⁷Re、¹¹¹In、⁹⁰Y、^99mTc、¹⁷⁷Lu等)、荧光染料(有关具体的例示性荧光染料，参看下文)、化学发光试剂(例如吖啶酯(acridinum ester)、稳定化的二氧杂环丁烷(stabilized dioxetane)等)、生物发光试剂、光谱上可分辨的无机荧光半导体纳米晶体(即，量子点)、金属纳米粒子(例如，金、银、铜、铂等)纳米团簇、顺磁性金属离子、酶类(有关酶类的具体实例，参见下文)、色度标记(例如染料、胶体金等)、生物素、地高辛(dioxigenin)、半抗原以及有抗血清或单克隆抗体可用的蛋白质。

在某些实施例中，标记部分包含荧光标记。许多已知的具有多种化学结构和物理特性的荧光标记部分适用于实践本发明的诊断方法。适合的荧光染料包括(但不限于)荧光素(fluorescein)和荧光素染料(例如，异硫氰酸荧光素或FITC、萘并荧光素(naphthofluorescein)、4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基荧光素、6-羧基荧光素或FAM等)、羰花青(carbocyanine)、部花青(merocyanine)、苯乙烯基染料、氧杂菁(oxonol)染料、藻红蛋白(phycoerythrin)、赤藓红(erythrosin)、伊红(eosin)、罗丹明(rhodamine)染料(例如，羧基四甲基-罗丹明或TAMRA、羧基罗丹明6G、羧基-X-罗丹明(ROX)、丽丝胺罗丹明B(lissamine rhodamine B)、罗丹明6G、罗丹明绿、罗丹明红、四甲基罗丹明(TMR)等)、香豆素(coumarin)和香豆素染料(例如，甲氧基香豆素、二烷基氨基香豆素、羟基香豆素、氨甲基香豆素(AMCA)等)、俄勒冈绿(Oregon Green)染料(例如，俄勒冈绿488、俄勒冈绿500、俄勒冈绿514等)、德州(Texas)红、德州红-X、Spectrum Red^TM、Spectrum Green^TM、菁(cyanine)类染料(例如，Cy-3^TM、Cy-5^TM、Cy-3.5^TM、Cy-5.5^TM等)、Alexa Fluor系列染料(例如，Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680等)、BODIPY染料(例如，BODIPY FL、BODIPY R6G、BODIPY TMR、BODIPY TR、BODIPY 530/550、BODIPY 558/568、BODIPY 564/570、BODIPY 576/589、BODIPY 581/591、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665等)、IRD染料(IRDyes)(例如，IRD40、IRD 700、IRD 800等)等。有关适合的荧光染料以及将荧光染料与如蛋白质和肽等其它化学实体偶联的方法的更多实例，参看例如″荧光探针和研究产物手册(The Handbook of Fluorescent Probes and Research Products)″，第9版，分子探针公司(Molecular Probes，Inc.)，俄勒冈州尤金(Eugene，OR)。荧光标记试剂的有利特性包括高摩尔吸收系数、高荧光量子产率和耐光性。在某些实施例中，标记荧光团合意地展现在光谱的可见光范围(即，介于400nm与750nm之间)而非在紫外光范围(即，低于400nm)内的吸收和发射波长。

在某些实施例中，标记部分包含酶。适合的酶的实例包括(但不限于)ELISA中所用的酶，例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶等。其它实例包括β-葡糖醛酸酶、β-D-葡糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶等。可以使用连接基，如碳化二亚胺、二异氰酸酯、戊二醛等，将酶连结至蝎氯毒素部分。

在某些实施例中，标记部分包含可利用单光子发射计算机体层成像(Single PhotonEmission Computed Tomography，SPECT)或正电子发射计算机体层成像(PositionEmission Tomography，PET)检测的放射性同位素。此类放射性核素的实例包括(但不限于)碘-131(¹³¹I)、碘-125(¹²⁵I)、铋-212(²¹²Bi)、铋-213(²¹³Bi)、砹-221(²¹¹At)、铜-67(⁶⁷Cu)、铜-64(⁶⁴Cu)、铼-186(¹⁸⁶Re)、铼-186(¹⁸⁸Re)、磷-32(³²P)、钐-153(¹⁵³Sm)、镥-177(¹¹⁷Lu)、锝-99m(^99mTc)、镓-67(⁶⁷Ga)、铟-111(¹¹¹In)和铊-201(²⁰¹T1)。

在某些实施例中，标记部分包含可利用γ相机检测的放射性同位素。此类放射性同位素的实例包括(但不限于)碘-131(¹³¹I)和锝-99m(^99mTc)。

在某些实施例中，标记部分包含顺磁性金属离子，其是磁共振成像(MRI)中良好的对比增强剂。此类顺磁性金属离子的实例包括(但不限于)钆III(Gd³⁺)、铬III(Cr³⁺)、镝III(Dy³⁺)、铁III(Fe³⁺)、锰II(Mn²⁺)和镱III(Yb³⁺)。在某些实施例中，标记部分包含钆III(Gd³⁺)。钆是FDA批准用于MRI的对比剂，其可积累于异常组织中，使这些异常区域在磁共振图像上变得很亮(变强)。已知钆可使身体不同区域中，尤其是脑中的正常组织与异常组织之间产生强对比。

在某些实施例中，标记部分包含可利用核磁共振波谱(MRS)检测的稳定顺磁性同位素。适合的稳定顺磁性同位素的实例包括(但不限于)碳-13(¹³C)和氟-19(¹⁹F)。

D.形成蝎氯毒素试剂

在某些实施例中，蝎氯毒素试剂包含至少一个蝎氯毒素部分与至少一个治疗部分缔合。因此，蝎氯毒素试剂是由至少两个其它分子缔合(例如结合、相互作用、融合或偶联)而成。

在蝎氯毒素试剂内蝎氯毒素部分与治疗部分之间的缔合可以是共价或非共价的。不管蝎氯毒素部分与治疗部分之间的结合、相互作用或偶联的性质如何，二者之间的缔合优选具有选择性、特异性，而且足够强，以致蝎氯毒素试剂不会在运输/递送到肿瘤并进入肿瘤中之前或期间解离。在蝎氯毒素试剂内蝎氯毒素部分与治疗部分之间的缔合可以使用所属领域技术人员已知的任何化学、生物化学、酶或基因偶联方法实现。

在某些实施例中，蝎氯毒素部分与治疗部分之间的缔合是非共价的。非共价相互作用的实例包括(但不限于)疏水相互作用、静电相互作用、偶极相互作用、范德华相互作用(van der Waals interaction)和氢键。

在某些实施例中，蝎氯毒素部分与治疗部分之间的缔合是共价的。所属领域技术人员将了解，所述部分可彼此直接或间接(例如通过连接剂，如下文所描述)连接。

在某些实施例中，蝎氯毒素部分与治疗部分彼此直接共价连接。直接共价结合可以通过如酰胺、酯、碳-碳、二硫键、氨基甲酸酯、醚、硫醚、脲、胺或碳酸酯键联等键联实现。共价结合可以利用蝎氯毒素部分和/或治疗部分上存在的官能团实现。或者，可以用能引入适于偶联目的的有用基团(氨基、羧基或巯基)的另一氨基酸置换非关键氨基酸。或者，可以将额外氨基酸添加到蝎氯毒素部分中，以引入适于偶联目的的有用基团(氨基、羧基或巯基)。适用于将各部分连接在一起的官能团包括(但不限于)胺、酸酐、羟基、羧基、硫醇等。可以使用如碳化二亚胺等活化剂形成直接键联。多种活化剂在此项技术中已知并且适用于连接治疗剂与蝎氯毒素部分。

在其它实施例中，在蝎氯毒素试剂内蝎氯毒素部分与治疗部分经由连接基彼此间接共价连接。这可以使用此项技术中众所周知的许多稳定双官能试剂(包括同官能(homofunctional)试剂和杂官能(heterofunctional)试剂；有关所述试剂的实例，参看例如皮尔斯目录和手册(Pierce Catalog and Handbook))实现。使用双官能连接剂与使用活化剂的不同之处在于，前者使得连接部分存在于所得蝎氯毒素试剂中，而后者使得反应涉及的两个部分直接偶联。双官能连接剂的作用可以是允许两个另外呈惰性的部分之间发生反应。或者或另外，可以选择成为反应产物的一部分的双官能连接剂，以致其赋予蝎氯毒素试剂某种程度的构象灵活性(例如，所述双官能连接剂包含具有数个原子的直链烷基，例如所述直链烷基含有2与10个之间的碳原子)。或者或另外，双官能连接剂可经选择，使得蝎氯毒素部分与治疗部分之间形成的键联是可裂解的，例如可水解(有关此类连接剂的实例，参看例如美国专利第5,773,001号、第5,739,116号和第5,877,296号，各专利按全文引用并入本文中)。此类连接剂例如优选用于蝎氯毒素部分与治疗部分的连结物水解后，观察到蝎氯毒素部分和/或治疗部分的较高活性的情形。可将治疗部分从蝎氯毒素部分裂解的例示性机制包括在溶酶体(腙、缩醛和类顺乌头酸酯的酰胺(cis-aconitate-like amide))的酸性pH下水解、利用溶酶体酶的肽裂解(组织蛋白酶和其它溶酶体酶类)和二硫键还原。另一用于将治疗部分从蝎氯毒素试剂裂解的机制包括在生理pH下进行细胞外或细胞内水解。此机制适用于所用来将治疗部分与蝎氯毒素部分偶联的交联剂是如葡聚糖凝胶(polydextran)等可生物降解/可生物消化实体的情形。

例如，可以利用所引入的提供预定释放特性的羰基，制备出含腙的蝎氯毒素试剂。利用包含一端具有二硫基而另一端具有肼衍生物的烷基链的连接剂，也可以制备出蝎氯毒素试剂。含有除腙外的官能团的连接剂也有可能在溶酶体的酸性环境中被裂解。例如，可以由硫醇反应性连接剂制备蝎氯毒素试剂，所述硫醇反应性连接剂含有除腙外其它可以在细胞内裂解的基团，如酯、酰胺和缩醛/缩酮。

另一类pH敏感性连接剂的实例是顺乌头酸酯类，其羧酸基团与酰胺基相邻。羧酸可以加速酰胺在酸性溶酶体中水解。也可以使用能实现类似类型的水解速率加速且具有其它类型结构的连接剂。

蝎氯毒素试剂的另一潜在的释放方法是利用溶酶体酶进行肽的酶促水解。在一个实例中，肽毒素经由酰胺键连接至对氨基苯甲醇，随后苯甲醇与治疗部分之间形成氨基甲酸酯或碳酸酯。肽裂解会使氨基苯甲基氨基甲酸酯或碳酸酯断裂，并释放出治疗部分。在另一实例中，酚可通过连接剂而非氨基甲酸酯的断裂而裂解。在另一变化形式中，使用二硫键还原来起始对巯基苯甲基氨基甲酸酯或碳酸酯的断裂。

在蝎氯毒素试剂内的治疗部分是蛋白质、多肽或肽的实施例中，蝎氯毒素试剂可以是融合蛋白。如上文曾定义过的，融合蛋白是一种包含两种或两种以上蛋白质或肽并利用共价键经各自肽主链连接的分子。本发明方法中所用的融合蛋白可以借助此项技术中已知的任何适合的方法制备。例如，其可以使用多肽合成仪，利用直接蛋白质合成方法制备。或者，可以使用锚定引物(anchor primer)进行基因片段的PCR扩增，这些锚定引物在两个连续的基因片段之间产生互补的突出序列，其随后可退火并再扩增，由此产生嵌合基因序列。融合蛋白可以借助标准重组方法得到(参看例如曼妮提斯(Maniatis)等人，″分子克隆：实验手册(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)″，第2版，1989，冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory)，纽约冷泉市(Cold Spring，N.Y.))。这些方法一般包含(1)构建编码预定融合蛋白的核酸分子；(2)将所述核酸分子插入重组表达载体中；(3)用所述表达载体转化适合的宿主细胞；和(4)在宿主细胞中表达所述融合蛋白。如此项技术中所知，由所述方法制备的融合蛋白可以直接从培养基回收和分离，或通过细胞的溶解来回收和分离。此项技术中众所周知许多用于纯化由经过转化的宿主细胞产生的蛋白质的方法。这些方法包括(但不限于)沉淀、离心、凝胶过滤和(离子交换、反相和亲和)柱色谱法。其它纯化方法也有所描述(参看例如德切尔(Deutscher)等人，″蛋白质纯化指南(Guide to Protein Purification)″，酶学方法(Methodsin Enzymology)，1990，第182卷，学术出版社(Academic Press))。

所属领域技术人员易于了解，本发明方法中使用的蝎氯毒素试剂可包含诸多蝎氯毒素部分和诸多治疗部分，其利用诸多不同方式彼此缔合。连结物的设计将受其预定目的以及特定应用环境中所需的特性影响。使蝎氯毒素部分与治疗部分缔合或结合形成蝎氯毒素试剂的方法的选择处在所属领域技术人员的技能范围内，而且一般取决于各部分间所需的相互作用的性质(即，共价对非共价和/或可裂解对不可裂解)、治疗部分的性质、所涉及的部分上化学官能团的存在和性质等。

对于经过标记的蝎氯毒素试剂，蝎氯毒素部分(或治疗部分)与标记部分之间的缔合可以是共价或非共价的。在共价缔合的情况下，蝎氯毒素(或治疗)部分与标记部分可如上文所述彼此直接或间接连接。

在某些实施例中，蝎氯毒素部分(或治疗部分)与标记部分之间的缔合是非共价的。非共价缔合的实例包括(但不限于)疏水相互作用、静电相互作用、偶极相互作用、范德华相互作用和氢键。例如，标记部分可通过螯合作用非共价连接至蝎氯毒素部分(或治疗部分)(例如，金属同位素可与连接(例如融合)至蝎氯毒素部分的多聚组氨酸区(polyHis region)螯合)。

在某些实施例中，蝎氯毒素部分(或治疗部分)经同位素标记(即，其中一个或多个原子经原子质量或质量数不同于通常在自然界发现的原子质量或质量数的原子置换)。或者或另外，同位素可以连接至蝎氯毒素部分和/或治疗部分。

所属领域技术人员易于了解，本发明某些方法中使用的经过标记的蝎氯毒素试剂可包含诸多蝎氯毒素部分、诸多治疗部分和诸多标记部分，其利用诸多不同方式彼此缔合。经过标记的蝎氯毒素试剂的设计将受其预定目的、其应用环境中所需的特性以及所选检测方法影响。

E.修饰

在某些实施例中，通过将蝎氯毒素试剂共价连接至大分子(如聚合物)来进行修饰。不希望受任何特定理论束缚，例如聚合物的共价连接可以掩蔽蝎氯毒素试剂的抗原性，以致动物体中此试剂的生物利用率和/或耐受性得到改进。此类聚合物的实例是聚乙二醇(PEG)，其通常共价连接至肽和/或多肽的N和/或C末端和/或半胱氨酸。“聚乙二醇化(PEGylation)”是指PEG共价加成至一分子。在一些实施例中，蝎氯毒素试剂未在任何位点进行修饰。在一些实施例中，蝎氯毒素试剂中每一分子有一个位点经修饰(例如聚乙二醇化)。在一些实施例中，蝎氯毒素试剂中每一分子有一个以上位点经修饰(例如聚乙二醇化)。

在一些实施例中，所述修饰增加蝎氯毒素试剂的体内半衰期。举个例子，半衰期可以为至少约10小时、至少约16小时等(参看例如实例9)。在一些实施例中，所述生物利用率的改进有利于涉及较低给药频率的给药方案。(给药方案如本文所论述。)

II.治疗和/或检测方法

本发明的治疗方法包括对有需要的个体(例如患有至少一种肿瘤转移、曾患有至少一种肿瘤转移、有发展至少一种肿瘤转移的风险和/或易患至少一种肿瘤转移的个体)投予有效剂量的蝎氯毒素试剂或其药物组合物。因此，本发明的治疗方法可用于减小肿瘤转移的尺寸和/或数量、抑制转移的生长和/或形成，和/或延长患有转移性癌症和转移性癌症病况的哺乳动物(包括人类)的存活时间。

不希望受任何特定理论的束缚，我们注意到，新血管的形成(血管生成)对于发展和/或保持转移很重要。如实例4中所证实，蝎氯毒素可抑制新血管的形成。蝎氯毒素也可使新产生的血管(新血管系统)退化。在本发明一些实施例中，至少一种转移的新血管系统退化。在本发明一些实施例中，新血管生成得到抑制。

A.适应症

在本说明书通篇，使用在原发起源部位后命名转移性肿瘤的惯例。因此，例如“转移性前列腺癌”是指从前列腺起源并已经扩散到其它器官的癌症，不管转移位置如何。转移可在多种器官中形成，包括例如脑、肺、骨胳、肝、淋巴结、卵巢等。某些种类的肿瘤通常会转移到某些器官。举例来说，黑素瘤常转移到脑，前列腺癌常转移到骨胳，女性的胃癌常转移到卵巢，乳癌常转移到骨胳，而结肠癌常转移到肝。本发明方法可用于治疗上述多种器官中的转移，包括远离原发肿瘤部位的转移。此外，由于蝎氯毒素试剂可跨血/脑屏障(参看例如实例2和3)，使得本发明方法可用于治疗脑中的转移。

原发肿瘤常会扩散到邻近的淋巴结。本发明方法也可用于控制或消除至淋巴结的扩散。癌症/肿瘤细胞可脱离原发肿瘤，并通过经由血流或淋巴通道行进而发生转移。在本发明某些实施例中，例如在全身递送蝎氯毒素试剂的一些实施例中，蝎氯毒素试剂将结合并靶向这些转移的细胞以将其破坏。

在一些实施例中，本发明的治疗方法进一步包含在投予蝎氯毒素试剂之前检测至少一种转移。在一些这样的实施例中，检测至少一种转移包含投予有效剂量经过标记的蝎氯毒素试剂。

不过，应了解，本发明方法可用于治疗患有一种或多种转移、曾患有一种或多种转移或有患一种或多种转移的风险的个体，即使所述一种或多种转移的位置或存在可能未知。患者可能根本未诊断为患有任何转移，或者患者体内只有一小组转移已经得到鉴别和/或定位。在本发明一些实施例中，全身递送蝎氯毒素试剂，使得蝎氯毒素试剂在整个体内递送。因此，没有必要将蝎氯毒素试剂的递送靶向于特定的一个组织或一组组织来实现蝎氯毒素试剂到转移的递送。

可发展成能根据本发明治疗的转移性癌症的原发癌症和癌症病况的实例包括(但不限于)脑和中枢神经系统肿瘤(例如脑膜、脑、脊髓、颅神经和CNS其它部分的肿瘤，例如胶质母细胞瘤或髓母细胞瘤)；头和/或颈癌、乳房肿瘤、循环系统肿瘤(例如，心脏、纵隔和胸膜以及其它胸内器官、血管肿瘤，和肿瘤相关的血管组织)；血液和淋巴系统肿瘤(例如霍奇金氏病、非霍奇金氏病淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt′slymphoma)、AIDS相关性淋巴瘤、恶性免疫增生性疾病、多发性骨髓瘤和恶性浆细胞赘瘤、淋巴性白血病、骨髓性白血病、急或慢性淋巴细胞性白血病、单核细胞白血病、其它特定细胞类型的白血病、未指明细胞类型的白血病，未指明的恶性淋巴性、造血和相关组织赘瘤，例如弥散性大细胞淋巴瘤、T-细胞淋巴瘤或皮肤T-细胞淋巴瘤)；排泄系统(例如肾、肾盂、输尿管、膀胱和其它泌尿器官)肿瘤；胃肠道(例如食管、胃、小肠、结肠、结直肠、直肠乙状结肠连结(rectosigmoid junction)、直肠、肛门和肛管)肿瘤；涉及肝和肝内胆管、胆囊和胆道其它部分、胰腺和其它消化器官的肿瘤；口腔(例如唇、舌、齿龈、口腔底、上腭、腮腺、唾液腺、扁桃体、口咽、鼻咽、梨状窝、下咽部和口腔其它部位)肿瘤；生殖系统(例如阴门、阴道、子宫颈、子宫、卵巢以及与雌性生殖器官相关的其它部位、胎盘、阴茎、前列腺、睾丸以及与雄性生殖器官相关的其它部位)肿瘤；呼吸道肿瘤(例如鼻腔、中耳、副鼻窦、喉、气管、支气管和肺肿瘤，例如小细胞肺癌和非小细胞肺癌)；骨骼系统(例如肢体骨骼和关节软骨、骨关节软骨和其它部位)肿瘤；皮肤肿瘤(例如皮肤的恶性黑素瘤、非黑素瘤皮肤癌、皮肤的基底细胞癌瘤、皮肤的鳞状细胞癌瘤、间皮瘤、卡波济氏肉瘤(Kaposi′s sarcoma))；和涉及包括周围神经和自主神经系统、结缔组织和软组织、腹膜后腔和腹膜、眼和附件、甲状腺、肾上腺以及其它内分泌腺和相关结构在内的其它组织的肿瘤，淋巴结未指明的继发性恶性赘瘤、呼吸和消化系统继发性恶性赘瘤，及其它部位的继发性恶性赘瘤。

在本发明某些实施例中，本发明组合物和方法用于治疗转移性肉瘤。在一些实施例中，本发明的组合物和方法用于治疗由以下疾病起源的转移性癌症：膀胱癌、乳癌、慢性淋巴瘤白血病、头颈癌、子宫内膜癌、非霍奇金氏淋巴瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、胰腺癌和前列腺癌。

在本发明某些实施例中，组合物和方法用于治疗神经外胚层源性转移性肿瘤。人类患者中存在的任何神经外胚层源性转移性肿瘤一般都可以使用本发明的组合物/方法来治疗。在某些实施例中，影响患者的神经外胚层源性转移性肿瘤是由以下组成的群组的成员：神经胶质瘤、脑脊膜瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、神经母细胞瘤、神经节瘤、嗜铬细胞瘤、黑素瘤、外周原始神经外胚层肿瘤、小细胞肺癌、尤文氏肉瘤(Ewing′s sarcoma)和脑中的神经外胚层源性转移性肿瘤。在一些实施例中，神经外胚层源性转移性肿瘤是黑素瘤。在一些这样的实施例中，黑素瘤是皮肤或眼内黑素瘤。

在某些实施例中，神经外胚层源性转移性肿瘤影响患者的脑部。在某些实施例中，脑肿瘤是神经胶质瘤。所有原发脑肿瘤中约一半是神经胶质瘤。神经胶质瘤有4种主要类型：星形细胞瘤(在成人和儿童二者中最常见的神经胶质瘤类型)、室管膜瘤、少突胶质细胞瘤和混合神经胶质瘤。神经胶质瘤可根据其位置分类：天幕下(infratentorial)(即，位于脑的下半部中，主要见于儿童患者)或天幕上(supratentorial)(即，位于脑的上半部中，主要见于成年患者。)

还可根据等级对神经胶质瘤进一步分类，所述等级是由肿瘤的病理学评价确定。世界卫生组织(World Health Organization，WHO)已经开发出一种分级系统，从倾向于具有最小侵袭性的I级神经胶质瘤到倾向于最具侵袭性和恶性的IV级神经胶质瘤。低级(即I级或II级)神经胶质瘤的实例包括(但不限于)毛细胞型星形细胞瘤(也称为青少年毛细胞型星形细胞瘤)、纤维性星形细胞瘤、多形性黄色星形细胞瘤和胚胎发育不良性神经上皮瘤。高级神经胶质瘤涵盖III级神经胶质瘤(例如间变性星形细胞瘤，AA)和IV级神经胶质瘤(例如多形性胶质母细胞瘤，GBM)。间变性星形细胞瘤最常见于30岁到50岁的男性和女性，并且占所有脑肿瘤的4％。多形性胶质母细胞瘤是侵袭性最强的一类神经胶质肿瘤，最常见于50岁到70岁的男性和女性，并且占所有原发脑肿瘤的23％。IV级神经胶质瘤的预后最差，平均存活时间为12个月。在某些实施例中，本发明方法用于治疗高级神经胶质瘤。

尽管采用了侵袭性治疗，但神经胶质瘤通常复发，常呈现更高等级，有时具有不同的形态。尽管复发率不同，但IV级神经胶质瘤总是复发。因此，在某些实施例中，本发明方法用于治疗转移性复发神经胶质瘤，尤其是复发性高级神经胶质瘤。

可使用本发明组合物和方法治疗的转移性肿瘤也包括用其它化疗剂治疗难治性的转移性肿瘤。当本文提到肿瘤时使用的术语“难治性”意思指，在用至少一种非本发明组合物的化疗剂治疗时，肿瘤(和/或其转移)在用所述化疗剂治疗后不显示或仅显示较弱的抗增殖反应(即，不抑制或仅较弱地抑制肿瘤生长)，也就是说，用其它(优选标准)化疗剂完全不能治疗肿瘤，或只能得到不令人满意的结果。在提到难治性肿瘤等的治疗时，本发明应理解为不仅涵盖(i)在患者的治疗期间一种或多种化疗剂已经失败的肿瘤，而且还涵盖(ii)在化疗剂存在下借助其它方式(例如活组织检查和培养)显示出难治性的肿瘤。

接收本发明的治疗的患者一般包括诊断或曾经诊断患有肿瘤的任何患者。在一些实施例中，患者被诊断为患有一种或多种转移。在一些实施例中，患者被诊断为患有已知发生转移的肿瘤。在一些实施例中，患者被诊断为患有已经确定或许或者可能发生的转移所处的阶段的肿瘤。在一些实施例中，患者曾患有肿瘤，但不再展现具有原发肿瘤的病征；在一些此类实施例中，患者具有转移，其仍可用本发明方法治疗。所属领域技术人员将认识到，可根据肿瘤和/或转移的位置和性质进行不同的诊断方法，包括成像、活组织检查等。

B.剂量和投药

在本发明的治疗方法中，蝎氯毒素试剂或其药物组合物一般会以为实现至少一个预定结果所必需或足以实现至少一个预定结果的量和时间投予。例如，所投予的蝎氯毒素试剂的量和时间应使其杀死癌细胞、减小肿瘤尺寸、减小一种或多种转移的尺寸、抑制或延迟肿瘤生长或转移、延长患者的存活时间，或另外得到临床益处。

本发明的治疗可由单剂或持续一段时间的多剂组成。投药可以每日、每周(或其它一些数天的间隔)一次或多次或根据间歇性时程进行。待投予的蝎氯毒素试剂或其药物组合物的确切量将随受检者不同而变化，而且取决于数个因素(参看下文)。

蝎氯毒素试剂或其药物组合物可以使用有效实现预定治疗作用的任何投药途径投予。在本发明某些实施例中，蝎氯毒素试剂(或其药物组合物)是全身递送。典型的全身投药途径包括(但不限于)肌肉内、静脉内、肺部和口服途径。也可以例如通过输注或推注，或通过表皮或皮肤粘膜内层吸收(例如口服、粘膜、直肠和肠粘膜等)，进行全身投药。在某些实施例中，蝎氯毒素试剂经静脉内投予。实例2中描述在人类患者中静脉内投予蝎氯毒素试剂的例示性程序。

视投药途径而定，可以根据体重；体表面积；原发器官/肿瘤尺寸；和/或待治疗受检者体内转移的数量、尺寸和/或类型，计算有效剂量。所属领域技术人员根据在人临床试验中观察的药物动力学数据可易于优化适宜剂量。最终剂量方案将由主治医师根据各种改良药物作用的因素决定，如药物的具体活性；患者的损伤的严重程度和反应性；患者的年龄、健康情况、体重、性别和饮食；任何存在的感染的严重程度；投药时间；其它疗法的使用(或不使用)；以及其它临床因素。当使用蝎氯毒素试剂进行研究时，将出现其它关于适宜剂量水平和治疗持续时间的信息。

典型剂量包含每公斤体重1.0pg到每公斤体重100mg。例如，对于全身投药，剂量可以是每公斤体重100.0ng到每公斤体重10.0mg。

更具体点说，在经静脉内投予蝎氯毒素试剂的某些实施例中，所述试剂的给药可包含投予一剂或多剂，其包含约0.005mg/kg到约5mg/kg，例如，约0.005mg/kg到约5mg/kg、约0.01mg/kg到约4mg/kg、约0.02mg/kg到约3mg/kg、约0.03mg/kg到约2mg/kg，或约0.03mg/kg到约1.5mg/kg蝎氯毒素。例如，在某些实施例中，所投予的一剂或多剂蝎氯毒素试剂各含有约0.03mg/kg、约0.04mg/kg、约0.05mg/kg、约0.06mg/kg、约0.07mg/kg、约0.09mg/kg、约1.0mg/kg或超过1.0mg/kg蝎氯毒素。在其它实施例中，投予的一剂或多剂蝎氯毒素试剂各含有约0.05mg/kg、约0.10mg/kg、约0.15mg/kg、约0.20mg/kg、约0.25mg/kg、约0.30mg/kg、约0.35mg/kg、约0.40mg/kg、约0.45mg/kg、约0.50mg/kg、约0.55mg/kg、约0.60mg/kg、约0.65mg/kg、约0.70mg/kg、约0.75mg/kg、约0.80mg/kg、约0.85mg/kg、约0.90mg/kg、约0.95mg/kg、约1.0mg/kg或超过约1mg/kg蝎氯毒素。又在其它实施例中，投予的一剂或多剂蝎氯毒素试剂各含有1.0mg/kg、约1.05mg/kg、约1.10mg/kg、约1.15mg/kg、约1.20mg/kg、约1.25mg/kg、约1.3mg/kg、约1.35mg/kg、约1.40mg/kg、约1.45mg/kg、约1.50mg/kg或超过约1.50mg/kg蝎氯毒素。在这些实施例中，治疗可包含投予一剂蝎氯毒素试剂，或投予2剂、3剂、4剂、5剂、6剂或超过6剂。连续的两剂可间隔1天、间隔2天、间隔3天、间隔4天、间隔5天、间隔6天、间隔7天或间隔超过7天(例如10天、2周或超过2周)投予。

C.组合疗法

应了解，本发明的治疗方法可与额外疗法组合使用(即，本发明的治疗可与一种或多种所需治疗剂或医学程序同时、在所述治疗剂或医学程序之前或之后投予)。用于所述组合方案中的疗法(治疗剂或程序)的特定组合应考虑所需治疗剂和/或程序的相容性以及待实现的预定治疗作用。

例如，本发明的治疗方法可与其它程序一起使用，取决于待治疗的肿瘤，所述其它程序包括手术、放射疗法(例如γ-辐射、中子束放射疗法、电子束放射疗法、质子疗法、近距离疗法(brachytherapy)、系统性放射性同位素)、内分泌疗法、高温(hyperthermia)和冷冻疗法(cryotherapy)。

在许多转移性脑肿瘤情形中，本发明的治疗经常会在手术去除原发肿瘤后投予。在治疗脑肿瘤时，手术的主要目标是实现完全手术切除(gross-total resection)，即，去除所有可见的原发肿瘤。实现此目标的一个难点在于，这些肿瘤是浸润性的，即，其倾向于在正常脑结构之间进进出出。此外，可以安全地从患者的脑部去除的肿瘤的量存在极大变化。如果全部或一部分肿瘤位于脑部控制关键功能的区域，那么一般不可能去除。而且，仅用手术去除和/或破坏远端部位的转移不太可能或不太实际。

在许多转移性脑肿瘤情形中，本发明的治疗经常会与放射疗法组合(即，与其同时、在其之前或之后)投予。在常规治疗中，放射疗法一般是在手术后进行。辐射一般是以历时数周的一系列每日治疗(称为分割(fraction))给予。这种投予辐射的“分割式”方法对于最大限度地破坏肿瘤细胞和最小化对相邻正常脑的副作用很重要。被投予辐射的区域(称为辐射场)应小心计算，以尽可能避免包括较多的正常脑。

或者或另外，本发明的治疗方法可与其它治疗剂(如削弱任何不良作用的药剂，例如止吐剂等)和/或其它获批准的化疗药物组合投予。化疗剂的实例包括(但不限于)烷化剂类药物(例如，氮芥、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、美法仑、异环磷酰胺等)、抗代谢物类(例如，甲氨喋呤等)、嘌呤拮抗剂类和嘧啶拮抗剂类(例如，6-巯基嘌呤、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、吉西他宾等)、纺锤体毒素类(例如，长春花碱、长春新碱、长春瑞宾、紫杉醇等)、鬼臼毒素类(例如，依托泊苷、伊立替康、拓扑替康等)、抗生素类(例如，多柔比星、博来霉素、丝裂霉素等)、硝基脲类(例如，卡莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀等)、无机离子类(例如，顺铂、卡铂等)、酶类(例如，天冬酰胺酶等)和激素类(例如，他莫昔芬、亮丙立德、氟他胺、甲地孕酮等)等。有关最新癌症疗法更为详尽的论述，参看http://www.cancer.gov/；FDA批准的肿瘤药物清单，http://www.fda.gov/cder/cancer/druglistframe.htm；以及默克诊疗手册，第17版，1999，所述参考的完整内容都按引用并入本文中。

本发明方法也可与作为治疗方案的一部分的一种或多种其它的细胞毒性剂组合一起使用，其中所述其它的细胞毒性剂组合选自：CHOPP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱、强的松(prednisone)和丙卡巴肼)；CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和强的松)；COP(环磷酰胺、长春新碱和强的松)；CAP-BOP(环磷酰胺、多柔比星、丙卡巴肼、博来霉素、长春新碱和强的松)；m-BACOD(甲氨喋呤、博来霉素、多柔比星、环磷酰胺、长春新碱、德沙美松(dexamethasone)和亚叶酸(leucovorin))；ProMACE-MOPP(强的松、甲氨喋呤、多柔比星、环磷酰胺、依托泊苷、亚叶酸、氮芥(mechloethamine)、长春新碱、强的松和丙卡巴肼)；ProMACE-CytaBOM(强的松、甲氨喋呤、多柔比星、环磷酰胺、依托泊苷、亚叶酸、阿糖胞苷、博来霉素和长春新碱)；MACOP-B(甲氨喋呤、多柔比星、环磷酰胺、长春新碱、强的松、博来霉素和亚叶酸)；MOPP(氮芥、长春新碱、强的松和丙卡巴肼)；ABVD(阿霉素(adriamycin)/多柔比星、博来霉素、长春花碱和达卡巴嗪)；MOPP(氮芥、长春新碱、强的松和丙卡巴肼)与ABV(阿霉素/多柔比星、博来霉素和长春花碱)交替；MOPP(氮芥、长春新碱、强的松和丙卡巴肼)与ABVD(阿霉素/多柔比星、博来霉素、长春花碱和达卡巴嗪)交替；ChlVPP(苯丁酸氮芥、长春花碱、丙卡巴肼和强的松)；IMVP-16(异环磷酰胺、甲氨喋呤和依托泊苷)；MIME(丙脒腙(methyl-gag)、异环磷酰胺、甲氨喋呤和依托泊苷)；DHAP(德沙美松、高剂量阿糖胞苷和顺铂)；ESHAP(依托泊苷、甲基泼尼松龙(methylpredisolone)、高剂量阿糖胞苷和顺铂)；CEPP(B)(环磷酰胺、依托泊苷、丙卡巴肼、强的松和博来霉素)；CAMP(洛莫司汀、米托蒽醌、阿糖胞苷和强的松)；CVP-1(环磷酰胺、长春新碱和强的松)、ESHOP(依托泊苷、甲基泼尼松龙、高剂量阿糖胞苷、长春新碱和顺铂)；EPOCH(依托泊苷、长春新碱和多柔比星持续96小时，以及推注剂量环磷酰胺和口服强的松)、ICE(异环磷酰胺、环磷酰胺和依托泊苷)、CEPP(B)(环磷酰胺、依托泊苷、丙卡巴肼、强的松和博来霉素)、CHOP-B(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱、强的松和博来霉素)、CEPP-B(环磷酰胺、依托泊苷、丙卡巴肼和博来霉素)，和P/DOCE(表柔比星或多柔比星、长春新碱、环磷酰胺和强的松)。

所属领域技术人员将了解，待与本发明治疗方法组合投予的一种或多种治疗剂的选择将取决于待治疗的转移性肿瘤。

例如，用于脑肿瘤处方中的化疗药包括(但不限于)替莫唑胺(Temodar

)、丙卡巴肼(Matulane)和洛莫司汀(CCNU)，这些药物为口服的；长春新碱(Oncovin

或Vincasar PFS

)、顺铂(Platinol

)、卡莫司汀(BCNU、BiCNU)和卡铂(Paraplatin

)，这些是静脉内投药的；以及甲氨蝶呤(Rheumatrex或Trexall

)，这种药物可经口、静脉内或鞘内(即，直接注射到脊髓液中)投予。BCNU还可以在手术期间以聚合物圆片植入物(Giadel

圆片)形式给予。对于脑肿瘤的一种最常用处方组合疗法是PCV(丙卡巴肼、CCNU和长春新碱)，其通常每6周给予一次。

在待治疗的肿瘤是神经外胚层源性脑肿瘤的实施例中，本发明方法可与处理如痉挛和脑水肿等症状的药剂组合使用。投药后成功控制与脑肿瘤有关的痉挛的抗痉挛剂的实例包括(但不限于)苯妥英(phenytoin)(Dilantin

)、卡马西平(Carbamazepine)(Tegretol)和双丙戊酸钠(divalproex sodium)(Depakote

)。脑肿胀可以用类固醇(如德沙美松(Decadron))治疗。

D.药物组合物

如上文所提到的，本发明的治疗、抑制和/或减小和/或检测方法包括投予蝎氯毒素试剂本身或其药物组合物形式。药物组合物一般包含有效量的至少一种蝎氯毒素试剂和至少一种药学上可接受的载剂或赋形剂。

药物组合物可以使用此项技术中众所周知的常规方法配制。最佳的药物制剂可视投药途径和所需剂量而变化。所述制剂可能影响所投予的化合物的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。配制可产生固体、液体或半液体药物组合物。

为便利投药和剂量均匀，药物组合物可配制成剂量单位形式。本文使用的表述“单位剂型”是指用于待治疗患者的蝎氯毒素试剂的物理离散单元。各单元含有经过计算会产生所需治疗效果的预定量的活性物质。然而，应了解，组合物的总剂量将由主治医师在合理医学判断的范围内确定。

如上文所提到的，在某些实施例中，蝎氯毒素试剂通过注射或输注经静脉内投予。适于通过注射或输注投予的药物组合物可以根据已知技术，使用适合的分散剂或润湿剂和悬浮剂配制。药物组合物也可以是于无毒稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液、悬浮液或乳液，例如于2，3-丁二醇中的溶液。可以使用的可接受的媒剂和溶剂有水、林格氏溶液(Ringer′s solution)、U.S.P.和等渗氯化钠溶液。此外，通常将无菌非挥发性油用作溶解或悬浮介质。为此，可以使用任何温和的非挥发性油，包括合成单酸甘油酯或二酸甘油酯。如油酸等脂肪酸也可用于可注射制剂的制备中。

可例如通过滤过细菌截留过滤器，或通过并入可在使用前溶解或分散于无菌水或其它无菌可注射介质中的无菌固体组合物形式的灭菌剂，来对可注射制剂进行灭菌。

为延长药物的作用，通常需要减慢注射的药物的吸收。这可以通过将活性成分溶解或悬浮于油媒剂中实现。通过以生物可降解聚合物(如聚丙交酯-聚乙交酯)形成药物的微胶囊基质来制得可注射积存形式。取决于药物对聚合物的比率以及所用特定聚合物的性质，可以控制药物释放的速率。积存式可注射制剂也可通过将药物包嵌在与身体组织相容的脂质体或微乳液中来制备。

III.检测方法

A.投药

在另一方面中，本发明提供在体内检测肿瘤转移的方法。例如，可能需要使用本发明的方法检测患有或曾患有至少一种原发肿瘤的个体体内的肿瘤转移。所述方法包括投予患者有效量的本文描述的经过标记的蝎氯毒素试剂或其药物组合物，以致所述经过标记的蝎氯毒素试剂与原发肿瘤组织和/或转移性肿瘤组织中的细胞可发生特异性结合。

一般说来，经过标记的蝎氯毒素试剂的剂量将取决于如患者的年龄、性别和体重、待检查的身体区域以及投药途径等考虑而变化。也应考虑如禁忌症、伴随疗法和其它变量等因素来调整待投予的经过标记的蝎氯毒素试剂的剂量。不过，这可以由受过训练的医生容易地完成。总的说来，经过标记的蝎氯毒素试剂的适合剂量对应于足以允许检测患者体内的赘生性肿瘤组织的药剂最低量。

举个例子，在用¹³¹I标记蝎氯毒素试剂并经静脉内投药的实施例中，经过标记的蝎氯毒素试剂的给药可包含投予一剂或多剂，其各包含约5mCi到约50mCi，例如约5mCi到约40mCi，或约10mCi到约30mCi¹³¹I。例如，所投予的一剂或多剂经¹³¹I放射性标记的蝎氯毒素试剂可各含有约10mCi、约20mCi或约30mCi ¹³¹I。在这些实施例中，诊断程序可包含投予单剂经¹³¹I放射性标记的蝎氯毒素试剂，或投予多剂，例如2剂、3剂或4剂。连续的两剂可间隔1天、间隔2天、间隔3天、间隔4天、间隔5天、间隔6天、间隔7天或间隔超过7天投予。

在使用经¹³¹I放射性标记的蝎氯毒素试剂的实施例中，可在投予经¹³¹I放射性标记的蝎氯毒素之前(例如，在根据本发明进行治疗前1天、2天或3天)，对患者投予过饱和的碘化钾。投予过饱和的碘化钾阻止甲状腺吸收¹³¹I，从而预防如甲状腺机能减退等病况。

投予经过标记的蝎氯毒素试剂之后，并且在发生特异性结合的足够时间过去后，检测经结合的经过标记的蝎氯毒素试剂。

在一些实施例中，在第二时间段投予第二有效量的经过标记的蝎氯毒素试剂，并测量个体体内所述经过标记的蝎氯毒素试剂的结合。对于在第二次投予经过标记的蝎氯毒素试剂后结合的测量可允许评估结合(例如结合程度和/或位置)的任何改变，这可以指示一种或多种转移的进展、稳定性和/或退化。在随后的时间段内，再(即第三次、第四次等)投予有效量的经过标记的蝎氯毒素试剂可以获得额外的测量结果。这可能是(例如)在一段较长的时间里评估一种或多种转移的进展、稳定性和/或退化所需要的。

在一些实施例中，有效量的经过标记的蝎氯毒素试剂的连续投药之间的时间长度可变化。在一些实施例中，以大致有规律的时间间隔投予经过标记的蝎氯毒素试剂。在一些实施例中，投药时程与患者经历治疗的给药方案的时程相配或相应。

B.转移的检测和定位

所属领域技术人员将认识到，经过标记的蝎氯毒素试剂与相关组织的结合的检测可借助多种方法中的任一种进行，所述方法包括(但不限于)光谱、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或化学方式。检测方法的选择一般是基于所述试剂的标记部分(即，荧光部分、放射性核素、顺磁性金属离子等)的性质。在某些实施例中，患者体内一种或多种转移的检测和定位是使用成像技术进行。

可根据标记部分的性质而使用不同的成像技术。例如，如果标记部分包含顺磁性金属离子(例如Gd³⁺)，那么可以使用磁共振成像法(MRI)检测结合。如果标记部分包含放射性同位素(例如¹³¹I等)，那么可以使用单光子发射计算机体层成像(SPECT)和/或正电子发射计算机体层成像(PET)进行结合检测。其它成像技术包括γ相机成像。

根据本发明的监测方法，如果经过标记的蝎氯毒素试剂与相关组织的结合水平相比经过标记的蝎氯毒素试剂与正常组织的结合水平有所升高，那么将除原发肿瘤组织外的组织鉴别为转移。如上文曾提到的，正常组织在本文中定义为非赘生性组织。例如，当在体内执行所述方法时，可将在相关器官(例如脑)的某一区域中测量的经过标记的蝎氯毒素试剂的结合水平与在同一器官的正常区域中测量的经过标记的蝎氯毒素试剂的结合水平相比较。

在某些实施例中，如果所测量的结合水平高于与正常组织的结合水平，那么将相关组织鉴别为赘生性组织。例如，所述结合水平可能是与正常组织的结合水平的至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约25倍、至少约50倍、至少约75倍、至少约100倍、至少约150倍、至少约200倍或200倍以上。

实例

以下实例描述形成和实践本发明的一些模式。然而，应了解，这些实例只是出于说明的目的，而不打算限制本发明的范围。此外，除非实例部分中的描述以过去式提供，否则文本如本说明书其余部分一样，不意在暗示实验是实际进行的或数据是实际获得的。

实例1：蝎氯毒素结合转移到脑和肺的黑素瘤

本实例中描述的实验表明，在活组织切片中，蝎氯毒素结合于已经转移到脑和/或肺的黑素瘤。

材料与方法

利用化学合成型蝎氯毒素(TM-601)对人活检组织的冷冻或石蜡切片进行组织化学染色，所述蝎氯毒素含有以化学方法附接到N末端的可检测的生物素基团。人组织样品是来自两种性别以及不同的年龄和种族。大部分样品都是通过人类组织合作网(Cooperative Human Tissue Network)、UAB(伯明翰的阿拉巴马大学(University ofAlabama at Birmingham))的组织采集机构(Tissue Procurement)、UAB医院和加拿大伦敦的人脑组织库(Human Brain Tissue Bank)获得。将包埋于冷冻凝胶中的急冻组织和新鲜组织切成8微米的薄片，并捡取到带正电荷的载玻片上。随后，根据染色方案，在4％多聚甲醛或Milloniqs溶液(由含4％甲醛、0.4％NaOH和7％甲醇的磷酸钠缓冲溶液构成)中固定这些切片。将石蜡块切成片，并根据标准程序进行准备。

在含10％正常山羊血清的PBS中阻断活检切片1小时，并在4℃下用生物素化蝎氯毒素的稀释液处理过夜。在彻底冲洗后，借助抗生物素蛋白-生物素复合物(avidin-biotincomplex，ABC)系统(Vectastain Elite ABC试剂盒，来自加利福尼亚州伯灵顿的维克特实验公司(Vector Laboratories，Burlignton，California))使染色显现，并利用DAB(3，3′-二氨基联苯胺，维克特实验公司)与ABC复合物的比色反应观察。

用甲基绿(一种核染料)对活检切片进行复染色，以观察未染色的细胞。由于标记的有效浓度、组织状况或反应持续时间随实验而变化，使得非特异性背景标记可能改变。因此，利用甲基绿但不用生物素化的蝎氯毒素，对对照切片进行相同的染色。当与相邻的对照切片相比较时蝎氯毒素标记超出背景外定义为阳性细胞染色。含有大量内源过氧化物酶的细胞因DAB与过氧化物酶的反应而在对照组中展现较深的背景染色。

用苏木精(对细胞核染色)和伊红(对细胞质染色)二者对第三相邻的切片染色。因此，对于每一分析组织，都染色三个相邻的切片。

结果

图1是显示生物素化蝎氯毒素使已经转移到脑的黑素瘤染色的显微照片。11个黑素瘤脑转移中11个都为TM-601阳性，而且5个原发黑素瘤肿瘤中5个都呈阳性。此外，蝎氯毒素还结合转移到肺的黑素瘤(图2)。另一方面，正常的皮肤对TM-601不起反应(6/6个都呈阴性)(图3)，尽管甚至在对照组中的黑素细胞中存在部分背景染色。

实例2：在患有复发性或难治性体和/或脑转移性实体肿瘤的患者中静脉内¹³¹I-TM-601的I期成像和安全性研究。

本实例描述由在5个临床现场进行的I期试验得到的初步结果。在本临床试验中，对48名患者静脉内投予TM-601。此多中心、开放性、非随机化连续“受检者内”增量研究包括患有经组织学确定的恶性原发性实体肿瘤(复发性或难治性)的患者，其已表明具有不受标准疗法作用的可检测转移灶的明确证据。

所述I期研究的目的在于：a)评价静脉内¹³¹I-TM-601是否能在患有复发性或难治性转移性(包括脑转移)实体肿瘤的患者中肿瘤特异性定位；b)确定静脉内投予的¹³¹I-TM-601的分布和剂量测定；和c)确定静脉内投予的¹³¹I-TM-601的安全性和耐受性。

患者和治疗方案

本研究中登记48名受检者。对这些受检者使用下文描述的方案。使受检者经历1到2次递增静脉内剂量的¹³¹I-TM-601，随后一系列全身扫描，以确定¹³¹I-TM-601是否已经定位于目标肿瘤细胞，并且在显示¹³¹I-TM-601的肿瘤特异性吸收后，即给予一次静脉内治疗剂量的¹³¹I-TM-601。图4中的图解说明给药流程。

研究患者接收经静脉内(IV)输注的多达3剂¹³¹I-TM-601(范围为10mCi/0.2mg到30mCi/0.6mg)。只对在投予10或20mCi剂量后24小时借助成像显示¹³¹I-TM-601的肿瘤特异性吸收的患者投予30mCi剂量的¹³¹I-TM-601。

¹³¹I-TM-601的制备

最终的TM-601药品是装入用塞子塞紧的玻璃小瓶中的无菌的白色到灰白色冻干粉。本试验中使用的成像和治疗剂量都是经放射性标记的TM-601的剂量。

使最终的TM-601药品在0.56mL放射性标记缓冲液中复原，得到1mg/mL经¹³¹I放射性标记的溶液，并将其递送到临床现场。注射器中含有约4mL输注溶液，并按照内含物和放射量进行大致标记。在现场接收后，辐射安全官员或其他适合的现场工作人员即确认¹³¹I-TM-601的辐射计数在处方的规格标准内。屏蔽含有最终经过放射性标记的药品的注射器，随后将其转移到适合的医院区域，以对患者投药。在2-8℃下避光保存¹³¹I-TM-601溶液并屏蔽待用。在用¹³¹I放射性标记后，推荐在24小时内使用此产品。

¹³¹I-TM-601的投药和成像研究

使所有接收放射性标记的测试剂量¹³¹I-TM-601的患者口服接收每天300mg剂量的过饱和碘化钾(supersaturated potassium iodide，SSKI)，从输注放射性标记的¹³¹I-TM-601当天即将开始输注前开始，持续最少3天，以阻止甲状腺和其它器官吸收¹³¹I。在投予研究药物之前，将SSKI分发给患者，同时向患者提供有关不在诊所/医院中时正确使用药物的说明。

将含有¹³¹I-TM-601的注射器以“背载(piggy-back)”方式插入在6英寸静脉留置针/导管内的输注口中。在以每小时100mL输注0.9％氯化钠的同时，经约5到10分钟借助“缓慢静脉内推注(slow IV push)”方式投予产品。如果观察到以下任一情形，就终止¹³¹I-TM-601输注：(1)收缩压降低＞25mmHg；(2)由研究人员证明的明显的呼吸窘迫；(3)体温＞102℉；(4)痉挛；(5)意识水平改变或新神经损伤的发作，或其它原因，例如临床医生的判断或患者的要求。

在投予¹³¹M-TM-601后24小时，借助γ相机且在一些情况下借助SPECT成像，以确定接收30mCi剂量¹³¹I-TM-601的定位和资格。

安全性结果

到2008年5月止，17名患者报告总计22件严重不良事件。研究人员判断，所有SAE“不太可能”由研究药物引起或与研究药物“不相关”，而且这些事件中有4件是在同意不继续接收¹³¹I-TM-601研究药物之后的两名患者中发生。第5件事件是在接收研究药物之前的患者中发生，其稍后被成功给药。

功效结果

静脉内投药后，在多种肿瘤类型中观察到肿瘤特异性吸收，包括8名恶性神经胶质瘤患者中的7名；2名转移性前列腺癌患者中全部，包括1名弥散性骨转移患者；5名转移性非小细胞肺癌患者中的3名；8名转移性黑素瘤患者中的7名；8名转移性结肠癌患者中的6名；3名转移性胰腺癌患者中的2名；4名转移性乳癌患者中的1名；1名转移性移行细胞癌瘤患者；1名转移性副神经节瘤患者；和1名多形性黄色星形细胞瘤患者(如图5中所概述；也参看图6-9)。

所有患者都经静脉内接收测试剂量的10mCi(0.2mg肽)¹³¹I-TM-601。在注射¹³¹I-TM-601后立即(小于等于60分钟)、3小时、24小时、48-72小时和168小时获取5个连续的全身γ相机图像，以进行肿瘤定位和剂量测定分析。1周后，使利用γ相机或SPECT成像法显示肿瘤定位的患者接收第二治疗剂量的30mCi(0.6mg肽)¹³¹I-TM-601。1周后，用20mCi(0.4mg肽)¹³¹I-TM-601再治疗未显示吸收的患者，以在较高剂量下确定可能的定位。

在第28天进行评价时，于8名神经胶质瘤患者中2名的磁共振成像(MRI)中看到肿瘤反应(由钆增强病灶的体积降低所定义)，表明肿瘤体积由基线可测量的降低(参看图10和11)。

这些结果表明了在体内全身递送的蝎氯毒素试剂(例如¹³¹I-TM-601)的治疗作用。这些结果还表明，静脉内投予的¹³¹I-TM-601将跨血脑屏障，并且可引起不宜动手术的神经胶质瘤患者的MRI成像的改善。此外，在患有转移性癌症的患者中，静脉内递送的¹³¹I-TM-601能够靶向远处的转移(例如参看图12)。

实例3：在转移性黑素瘤患者中静脉内¹³¹I-蝎氯毒素(¹³¹I-TM-601)的肿瘤特异性靶向

在先前的临床试验中，将¹³¹I-蝎氯毒素局部投予到患有复发性多形性胶质母细胞瘤的患者的肿瘤切除腔中。在本实例中，检查静脉内(IV)投予的¹³¹I-蝎氯毒素的分布，以确定静脉内投药途径对于患有转移性黑素瘤(包括进入CNS的转移)的患者是否可行并且能引起肿瘤内吸收。本实例中描述的实验表明，静脉内递送的¹³¹I-蝎氯毒素定位于全身的肿瘤部位以及脑中的转移。因此，静脉内投予的¹³¹I-蝎氯毒素跨血脑屏障，并且可用于靶向远处的转移。

材料与方法

在实例2中论述的全身投予¹³¹I-蝎氯毒素的预期临床试验中登记7名转移性黑素瘤的患者。本实例较为详细地论述由这7名患者得到的结果。所有患者都经静脉内接收测试剂量的10mCi(0.2mg肽)¹³¹I-蝎氯毒素。在注射¹³¹I-蝎氯毒素后立即(小于等于60分钟)以及3小时、24小时、48-72小时和168小时获取5个连续的全身γ相机图像，以进行肿瘤定位和剂量测定分析。1周后，使利用γ相机或SPECT成像法显示肿瘤定位的患者接收第二治疗剂量的30mCi(0.6mg肽)¹³¹I-蝎氯毒素。1周后，用20mCi(0.4mg肽)¹³¹I-蝎氯毒素再治疗未显示吸收的患者，以在较高剂量下确定可能的定位。

结果

在静脉内投予¹³¹I-蝎氯毒素后，登记的7名黑素瘤患者中有6名在跟踪的γ相机或SPECT成像上显示肿瘤特异性定位。在中枢神经系统中和颅外部位观察到肿瘤定位。(实例参看图13。)在第一次测试剂量(10mCi/0.20mg肽)后从研究中撤出剩下的1名患者，且认为其不能进行评价。未观察到剂量限制性毒性。对在伯明翰的阿拉巴马大学接收治疗的3名患者实行完全的剂量测定分析。针对全身的平均辐射剂量为约0.24cGy/mCi(范围为约0.21到约0.27cGy/mCi)，并且针对肿瘤的平均辐射剂量为约2.56cGy/mCi(范围为约1.36到约4.43cGy/mCi)，其中计算的治疗比率为约10(肿瘤剂量/全身剂量)。

结果表明，静脉内投予的¹³¹I-蝎氯毒素跨血脑屏障，并且产生较高的肿瘤特异性靶向率。因此，可以使用¹³¹I-蝎氯毒素靶向远处的转移，包括脑中的转移。未来的临床试验将评价在多种肿瘤类型中静脉内投予较高剂量的¹³¹I-蝎氯毒素的安全性和功效。

实例4：TM-601对脉络膜新血管生成的抑制和使之退化

新血管的形成(血管生成)以及这些血管的维持被认为是转移的重要要素。在本实例中，使用脉络膜新血管生成分析，来评价蝎氯毒素抑制血管生成和/或引起现有的新形成的血管退化的能力。在诱导血管形成的时间左右开始投予TM-601时，TM-601使新血管形成明显减少。在诱导血管形成后数天投予TM-601的实验范例中，TM-601使脉络膜新血管生成明显退化。

材料与方法

借助于光凝术，利用530nm激光，诱导脉络膜新血管生成(CNV)。在各视网膜后极部9点、12点和3点位置产生3处烧伤。如果在激光诱导时产生气泡，那么判断布鲁赫氏膜成功破裂。本研究中只包括观察到气泡的烧伤。

在第一个实验中，在激光光凝术后，于一只眼中经玻璃体内注射1μL 50mg/mLTM-601溶解于生理盐水中得到的溶液(n＝17只动物，49处可以计量的烧伤)，且在对侧眼中注射1μL生理盐水(n＝17只动物，44处可以计量的烧伤)。7天后，重复注射。研究第14天，对小鼠灌注经荧光素标记的葡聚糖(平均分子量为2×10⁶，西格玛公司(Sigma))，制备脉络膜平片并利用荧光显微镜检查。

在第二个实验中，于第1天执行激光光凝术。对于处理开始前CNV的基线测量值，在第7天，对一组10只小鼠(30处可以计量的烧伤)灌注经荧光素标记的葡聚糖。剩余小鼠一只眼接收眼内注射的1μL 50mg/mL TM-601溶液(n＝12只动物，34处可以计量的烧伤)，而对侧眼接收生理盐水(n＝13只动物，32处可以计量的烧伤)。第14天，对所有剩余小鼠灌注经荧光素标记的葡聚糖，制备脉络膜平片并利用荧光显微镜检查。

测量脉络膜平片中脉络膜新血管生成损伤的尺寸。灌注经荧光素标记的葡聚糖后，取出眼睛，并在10％福尔马林(formalin)缓冲液中固定1小时。去除角膜和晶状体，并从眼窝中切下整个视网膜。在脉络膜中从边缘到中纬线(equator)作出径向切口，并平铺眼窝。利用荧光显微镜检查平片，并将图像数字化。使用Image-Pro Plus软件(麦登赛博尼克公司(Media Cybernetics))测量与各烧伤有关的脉络膜新血管生成的总面积。

结果

在小鼠中用激光光凝术破裂布鲁赫氏膜引起脉络膜新血管生成(CNV)，其模拟在患有新血管性年龄相关性黄斑变性的患者中所发生的CNV的许多情况。为了确定TM-601在本模型中是否影响新血管的形成，在激光光凝术当天(第1天)和第7天，经玻璃体内注射50μg TM-601。在相同时间点，将生理盐水注入对照眼。布鲁赫氏膜破裂后14天，分析各眼的脉络膜平片。发现利用眼内50μg剂量TM-601时，TM-601处理显著减少新血管的形成(图13和图15)。

为了评估TM-601对本模型中预先存在的新血管系统的作用，延迟通过眼内注射50μg TM-601的处理，直到布鲁赫氏膜破裂后7天。此时，已经存在较大的新血管生成部位(参看图14中的基线)。第14天测量时，在第7天单次注射生理盐水对新血管的形成无影响(图14中的对照组)，而单次注射TM-601使CNV显著退化(图14和图15)。

讨论/结论

本实例表明，局部投予的TM-601可显著抑制CNV，并使CNV退化。CNV小鼠模型模拟湿性形式的黄斑变性的疾病状态。本研究中使用的玻璃体内投药途径为临床上相关的，因为它是用于投予Lucentis(临床上批准用于黄斑变性的疗法)的途径。

实例5：经由各种递送途径的TM-601抑制小鼠CNV模型中血管生成

本实例中描述的实验是用于评价借助各种投药途径递送的TM-601抗血管生成的能力。使用脉络膜新血管生成分析来测量在激光诱导的布鲁赫氏膜破裂的位置周围新血管的生长，并确定局部或全身投予TM-601是否引起血管生成减少。测试了三条新的投药途径：眼周(也称为结膜下)、静脉内和局部(滴眼液)。

材料与方法

借助于利用530nm激光的光凝术，诱导小鼠中脉络膜新血管生成(CNV)。在各视网膜后极部9点、12点和3点位置产生3处烧伤。如果在激光诱导时产生气泡，那么布鲁赫氏膜明显成功破裂。本研究中只包括观察到气泡的烧伤。

给药

眼周注射5μL TM-601溶液，其中溶解于生理盐水中的TM-601的浓度为2、10、50和200mg/mL。在实行激光光凝术后，于对侧眼中注射5μL生理盐水。7天后，重复注射。研究第14天，对小鼠灌注经荧光素标记的葡聚糖(平均分子量为2×10⁶，西格玛公司)，制备脉络膜平片并利用荧光显微镜检查。

每周3次通过尾静脉注射20mg/kg剂量TM-601，来执行静脉内给药。

通过每天3次施用滴眼液来实现TM-601的局部施用，每一滴眼液含有10μL体积的TM-601。将TM-601溶解于非处方药人工泪(Artificial Tears)(瑞特爱德制药公司(RiteAide))中，其含有70％葡聚糖和0.3％羟丙甲纤维素作为活性成分。非活性成分包括0.1％苯甲烃铵(benzalkonium)、乙二胺四乙酸二钠、氯化钾、纯水和氯化钠。TM-601的最终浓度为1、5和25mg/mL，得到每10μL滴眼液分别10、50和250μg的单次剂量。

组织学和成像

测量脉络膜平片中脉络膜新血管生成损伤的尺寸。灌注经荧光素标记的葡聚糖后，取出眼睛，并在10％福尔马林缓冲液中固定1小时。去除角膜和晶状体，并从眼窝中切下整个视网膜。在脉络膜中从边缘到中纬线作出径向切口，并平铺眼窝。利用荧光显微镜检查平片，并将图像数字化。使用Image-Pro Plus软件(麦登赛博尼克公司)测量与各烧伤有关的脉络膜新血管生成的总面积。

结果

在小鼠中用激光光凝术破裂布鲁赫氏膜引起脉络膜新血管生成(CNV)，其模拟在患有新血管性年龄相关性黄斑变性的患者中所发生的CNV的许多情况。使用此模型，本发明者先前已证实，眼内注射TM-601明显减少新血管生成，而且还使新血管退化。(参看实例4)。

在当前的研究中，检查其它投药途径(眼周、静脉内和局部)。在第一个眼周研究中，于激光光凝术当天(第1天)和第7天眼周注射250μg TM-601。在相同时间点，将生理盐水注入对照眼。布鲁赫氏膜破裂后14天，分析各眼的脉络膜平片。发现利用眼周250μg剂量的TM601时，TM-601处理显著减少新血管的形成(图16)。

为了确定对于眼周注射的剂量反应，注射10μg、50μg、250μg或1000μg剂量的TM-601。10μg剂量不能明显减少脉络膜新血管生成，但50μg或更高剂量使CNV减少到类似的程度(图17)。有趣的是，接收眼周注射的动物的对侧眼也展现CNV的减少(图17中的绿色曲线)。

为了确定全身注射的TM-601是否也会渗入脉络膜中并抑制血管生成，每周3次经尾静脉注射20mg/kg剂量的TM-601，持续两周的研究时间。利用静脉内注射时，发现TM-601使CNV明显减少(图18)。

也测试局部滴眼液施用，这是本实例中所检查的三种投药途径中侵袭性最小的途径。将TM-601再悬浮于非处方药滴眼液润滑剂中，并每天3次经10μL滴眼液施用。以最高剂量递送时(每滴0.25mg，每天3次)，观察到CNV降低，但与生理盐水对照组没有统计学差异(图19)。

讨论/结论

CNV小鼠模型模拟湿性形式的黄斑变性的疾病状态。如实例4中所示，玻璃体内投药途径可显著减少脉络膜新血管生成。这是与投予Lucentis(临床上批准用于黄斑变性的疗法)所使用相同的途径。然而，本发明者认识到，侵袭性较小的递送模式可能有益，并且测试了TM-601的眼周、静脉内和局部递送。在所有情况下都显示TM-601减少CNV，但据观察，利用局部滴液所见到的降低没有达到统计学意义。眼周注射TM-601可能优于需要眼内递送的药物(例如，Lucentis)。

在图17中观察到的“对侧眼效应(fellow-eye effect)”可能引起关注。眼周注射的TM-601使相邻眼(未接收注射者)中的CNV显著减少。不希望受任何特定理论的束缚，针对此现象的可能的解释是，注射的材料进入全身循环，由此导致药物暴露于对侧眼。利用局部滴眼液没有观察到类似的对侧眼效应。

这些结果表明，借助不同投药途径递送的TM-601显示出抗血管生成作用，由此为蝎氯毒素作为转移性癌症的治疗剂的效用提供进一步支持。

实例6：TM-601定位于新血管和TM-601诱导的新血管内皮细胞凋亡

实例4和5中所述的实验表明，在小鼠脉络膜新血管生成(CNV)模型中，蝎氯毒素可抑制血管生成，并且使新血管退化。本实例中描述的实验旨在了解如实例4和5中所表明的蝎氯毒素抗血管生成作用的机制。本实例中的结果表明，在小鼠CNV模型中，TM-601定位于新血管中，并诱导新血管内皮细胞的凋亡。此外，本实例中的结果还表明，在CNV模型和视网膜病模型二者中的新血管生成区域中，TM-601与膜联蛋白A2共定位，本发明者在先前研究中已经观察到膜联蛋白A2结合于TM-601。

尽管已经显示，TM-601在眼中可抑制脉络膜新血管生成并使新形成的血管退化，但先前并不知道TM-601是直接结合于眼中的特定细胞类型，还是以非特异性方式呈现药理学活性。在静脉内注射¹³¹I-TM-601后，在全身的平面图像中没有观察到与血管系统的普遍结合。因此，在不希望受任何特定理论束缚的情况下，假定TM-601只选择性结合于新血管形成部位的活化的或增殖的一小群细胞。

在小鼠CNV模型中诱导新血管形成，并在玻璃体内或结膜下注射后，确定此模型中TM-601的位置。此外，使用TUNEL分析来确定新血管的退化是否是由脉络膜新血管生成部位的内皮细胞凋亡所引起。

为了进一步了解TM-601的抗血管生成作用的机制，借助免疫组织化学法检查在新血管生成的区域中TM-601与蝎氯毒素的可能的细胞受体膜联蛋白A2的共定位。据本发明者观察，膜联蛋白A2结合于TM-601。膜联蛋白A2在内皮细胞表面上表达，并且在某些肿瘤类型中过度表达。膜联蛋白A2已经被表征为调控促血管生成蛋白和/或抗血管生成蛋白(例如纤溶酶原和纤溶酶)转化的对接台(docking station)。

材料与方法

借助于利用530nm激光的光凝术，诱导小鼠中脉络膜新血管生成(CNV)。在各视网膜后极部9点、12点和3点位置产生3处烧伤。如果在激光诱导时产生气泡，那么布鲁赫氏膜明显成功破裂。本研究中只包括观察到气泡的烧伤。

给药

在CNV损伤后第7天，眼内注射1μL TM-601(50μg/μL溶解于生理盐水中)。第7天和第8天，使用溶解于生理盐水中的10μg/μL TM-601浓度进行5μL的结膜下注射。对侧眼未进行注射。第9天，处死动物，取出眼睛，并经CNV损伤切出切片。如下文所述，对冷冻切片染色。

免疫组织化学

在TM-601定位研究中，使用兔抗TM-601(图20A、B和C以及图21A、B和C中的红色)初级抗体。使用荧光标记的抗兔IgG二次抗体进行荧光检测。也利用荧光标记的GSA凝集素对切片染色(图20D、E和F以及图21D、E和F中的绿色)以鉴别内皮细胞。对于凋亡细胞的检测，针对末端脱氧核苷酸转移酶dUTP切口末端标记(Terminaldeoxynucleotidyl Transferase dUTP Nick End Labeling，TUNEL)对切片染色。本分析用于检测展现DNA片断化(凋亡细胞死亡的标志)的细胞核。还利用核染色剂对切片染色。在与膜联蛋白A2的共定位研究中，也利用抗-膜联蛋白A2对切片染色。

内皮细胞增殖分析

使用来自普洛麦格公司(Promega)的CellTiter 96

Aqueous单溶液细胞增殖检测试剂盒(Aqueous One Solution Cell Proliferation Kit；目录号#G3582)进行内皮细胞增殖分析。简单地说，在96孔盘的每一孔中铺涂4,000个细胞(72小时分析)或1,000个细胞(120小时分析)过夜。次日，将TM-601或稀释剂添加到孔中。随后在37℃培养细胞72小时或120小时。根据试剂盒方案，通过用MTS四唑氮(tetrazolium)化合物染色，测定细胞数量。由在490nm下的吸光度所测量的甲臜(formazan)产物的量与培养物中活细胞的数量成正比。

结果

为了研究在小鼠CNV模型中TM-601的抗血管生成作用的机制，通过在激光诱导的光凝术后第7天于小鼠眼中眼内注射TM-601或在第7天和第8天眼周注射TM-601，来研究TM-601的定位。研究第9天，针对TM-601对眼进行免疫染色。利用两种投药途径时，发现TM-601特异性定位于脉络膜中的内皮细胞中(图20和21)。没有观察到可检测的TM-601与视网膜层下方预先存在的血管缔合，表明TM-601选择性结合于脉络膜中新形成的血管。

如实例4中所述，借助激光光凝术引起新血管形成后一周，单次眼内注射TM-601使CNV明显退化。然而，此作用的机制尚未知。为了测试在此模型中TM-601是否能引起有助于新形成血管系统的细胞的凋亡，针对TUNEL对经CNV损伤切出的切片染色。凋亡的细胞(如由阳性TUNEL染色所鉴别)与内皮染色剂共定位，表明在眼内或眼周TM-601治疗后，在脉络膜新血管生成的区域中的内皮细胞经历细胞凋亡(图22和23)。在注射生理盐水的眼中未检测到细胞凋亡。由于在体外利用TM-601对培养的内皮细胞的处理在多种TM-601浓度上无细胞毒性，故未预料到在体内经过处理的眼中出现内皮细胞的凋亡(图24)。

为进一步了解TM-601的抗血管生成作用的机制，利用TM-601和蝎氯毒素的可能的细胞受体膜联蛋白A2进行共定位研究。在两种不同模型中，在眼中诱导新血管生成：由激光破裂布鲁赫氏膜所诱导的脉络膜新血管生成，和由氧气诱导的局部缺血所诱导的视网膜病变新血管生成。如本文关于类似实验所述，眼内注射TM-601。在两个新血管生成模型中，TM-601与膜联蛋白A2共定位(图25)。

讨论/结论

本实例中呈现的结果支持与蝎氯毒素的抗血管生成作用有关的数个重要发现。第一，在激光诱导布鲁赫氏膜破裂后，眼内或眼周注射的TM-601选择性结合于脉络膜层中新形成的血管系统中的内皮细胞。TM-601不结合于预先存在的成熟血管。这些结果与观察到¹³¹I-TM-601在静脉内注射后不会无差别地结合于体内所有血管相符。而是，因肿瘤特异性和/或新血管特异性结合，主要在肿瘤区域中检测到放射性标记。第二，TM-601结合于内皮细胞引起在激光损伤部位周围形成的新血管选择性细胞凋亡，但预先存在的血管不会。第三，TM-601与膜联蛋白A2共定位，膜联蛋白A2涉及促血管生成蛋白和/或抗血管生成蛋白(例如纤溶酶原和纤溶酶)转化的调控，由此提高了蝎氯毒素经由膜联蛋白A2发挥其至少部分抗血管生成作用的可能性。

实例7：在体外TM-601对肿瘤细胞迁移的影响

本实例中所述的实验旨在阐明蝎氯毒素对细胞迁移的作用，细胞迁移在转移过程中起重要作用。如借助Transwell侵袭分析所评估的，TM-601对细胞迁移显示出剂量相关性抑制作用。

材料与方法

一式三份，利用约5×10⁴个血清饥饿的细胞进行人脐静脉内皮细胞(Human UmbilicalVein Endothelial Cell，HUVEC)跨Transwell(康宁公司(Corning)，8μm)的迁移。在含有0.4％FBS的培养基中，在底部孔中的化学引诱剂包括VEGF或bFGF(50ng/ml)。室温下，将10微摩尔浓度TM-601与细胞一起培育30分钟，随后将细胞装载到Transwell小室中。在37℃下22小时后，使用Q-tip棉签去除上表面上未迁移的细胞。将迁移通过膜的细胞固定于甲醇中，并利用姬氏染色液观察。通过将Transwell叠放到血细胞计数器上，并计算5个区域中每一个的细胞数量，来进行侵袭的细胞的定量计数。

结果

如图26A中所示，TM-601以剂量相关的方式抑制细胞迁移。在TM-601存在下，无论是用VEGF还是bFGF刺激细胞，约50％以下的细胞发生迁移(图26B)。

实例8：TM-601对MMP2活性的影响

如前文所论述的，细胞迁移在转移过程中起主要作用。细胞外基质的降解促进细胞移动，而且是细胞迁移的关键步骤。在本实例中，利用两种不同细胞类型研究TM-601对基质金属蛋白酶2(MMP2；一种降解细胞外基质的酶)的影响：HUVEC和U87神经胶质瘤细胞系。这些实验的结果表明，TM-601抑制MMP2活性。

在由未经处理、经bFGF处理或经bFGF与10μM TM-601一起处理的培养的HUVEC细胞取得的培养基中测量MMP-2活性。(如实例7中所述培养HUVEC细胞。)如图26C中所述，用TM-601处理近乎消除由bFGF所诱导的MMP2活性增加。

也在由经10μM TM-601处理或未用TM-601处理的培养的U87细胞取得的培养基中测量MMP-2活性。如图27中所述，TM-601使U87人神经胶质瘤细胞所分泌的MMP-2活性降低。

这些结果表明，TM-601对MMP-2活性具有抑制作用。

实例6到8的讨论：

总的说来，实例6到8中呈现的数据提供对TM-601的抗血管生成作用的更好的了解。在细胞培养中，已经显示，TM-601结合于增殖的内皮细胞，并阻止细胞迁移(参看实例7)，而细胞迁移是新血管形成的关键步骤。不希望受任何特定理论的束缚，可以看出，TM-601在体内结合于内皮细胞需要某种形式的细胞活化，因为只有新形成的血管结合TM-601，而成熟血管系统中的静止细胞不会。此外，培养物中的增殖的HUVEC细胞不会模拟新血管系统中活化的内皮细胞，因为TM-601不减少HUVEC细胞的增殖(如在体外发生细胞凋亡时所预期的)。因此，这些数据表明，TM-601对新形成的血管系统的一个作用是通过阻止内皮细胞迁移来抑制新血管形成。据观察，TM-601在CNV模型中发挥第二个作用：结合TM-601的新形成血管经历细胞凋亡。

概括起来，体外证据表明，TM-601阻止内皮细胞迁移，由此防止血管生成过程的关键早期步骤的发生。此外，已经显示，在CNV模型中，TM-601经由细胞凋亡作用引起新形成的血管退化。

这些实例中描述的结果有助于说明蝎氯毒素的抗血管生成特性的机制，而这些特性对于蝎氯毒素作为针对转移性肿瘤的治疗剂的效用是特别有吸引力的品质。

实例9：静脉内递送的未经标记的TM-601对人类患者中的肿瘤的影响

本实例中呈现的人临床数据检验静脉内递送的未经标记的TM-601治疗癌症的能力。如先前所论述的，体外数据表明，TM-601结合于血管内皮细胞，并阻止内皮细胞迁移。本发明者还获得了体内数据，这些数据表明，静脉内输注TM-601降低新血管生成。这些观察结果促使启动I期试验，以评价在具有已知多血管(hypervascularity)的侵袭性癌症恶性神经胶质瘤中静脉内递送未经标记的TM-601的用途。本研究的主要目的是：a)确定TM-601在患有复发性恶性神经胶质瘤的成人患者中的安全性和耐受性；b)确定当根据磁共振(MR)灌注成像改变静脉内投药时TM-601的目标推荐II期剂量和生物活性剂量；和c)确定在每一剂量水平下TM-601的药物动力学。

患者和治疗方案

借助静脉内(IV)输注对符合本研究条件的复发性恶性神经胶质瘤患者投予10mCi/0.2mg ¹³¹I-TM-601以显示肿瘤特异性定位(成像剂量)。在研究中仅使在脑部SPECT扫描上显示¹³¹I-TM-601的肿瘤特异性吸收的患者接收利用未经标记的TM-601的治疗。投予成像剂量后1周，在4周的周期中，每周1次对研究患者静脉内输注6种剂量水平(0.04mg/kg、0.08mg/kg、0.16mg/kg、0.3mg/kg、0.6mg/kg和1.2mg/kg)中的一种的未经标记的TM-601，持续3周。在接下来的周期中投予未经标记的TM-601，只要没有疾病进展迹象，而且患者没有经历剂量限制性毒性即可。在每一周期的第4周，借助常规的动态敏感对比MRI评价患者，以评估灌注。

到2009年1月止，本研究中已经登记6名复发性恶性神经胶质瘤患者，而且其成像数据可用于分析。在安全性方面，有一件被认为可能与疗法相关的肿瘤内出血事件。还有三件被认为与疗法无关的严重不良事件包括治疗过程中疾病进展、髋部骨折和有肾结石病史的患者出现肾结石。在此第一给药组中，6名患者中的2名显示相对脑血流率(rCBF)和/或相对脑血容量(rCBV)相比治疗前的基线降低超过25％。如多个治疗周期所显示，灌注MRI参数改善的2名患者对静脉内TM-601具有扩大的反应，而无肿瘤进展迹象。

这些结果表明，未经标记的蝎氯毒素显示出作为针对具有强转移可能的侵袭性癌症(在本实例中为恶性神经胶质瘤)的治疗剂的前景。

实例10：聚乙二醇化蝎氯毒素的生物利用率和抗血管生成作用

在本实例中，研究聚乙二醇化蝎氯毒素，以确定蝎氯毒素的体内半衰期是否可增加。还检查了聚乙二醇化蝎氯毒素的抗血管生成作用。

材料与方法

聚乙二醇化

使用多分散性、线性40kDa PEG-丙醛(道尔制药公司(DowPharma))，经由还原氨化将TM-601肽的N末端聚乙二醇化。

TM-601半衰期的测量

通过单次尾静脉注射，将TM-601(剂量为约2mg/kg)经静脉内注射到无肿瘤C57BL/6小鼠中。在不同时间点取得血样，并借助ELISA，使用抗-TM-601抗体测定TM-601的含量。

小鼠基质胶塞

4℃下，将高浓度型基质胶基质(BD生物科技公司)与100ng/ml VEGF、100ng/mlbFGF和3ng/ml肝素混合。将8周龄的雌性C57BL/6小鼠随机分配到各组中，每组6只小鼠。各小鼠接收2份500μL基质胶塞，经双侧注射到皮下组织中。为了形成圆形的塞子，在常规皮下插入程序后，左右移动针尖，形成一个宽的皮下囊袋。利用21-25G针迅速进行注射，以确保整个内含物被递送到塞子中。研究第0天植入基质胶塞，并在第1天开始处理。对动物静脉内注射媒剂(生理盐水)、TM-601或聚乙二醇化TM-601。使用三种给药方案：每周1次，持续两周(第1天1次和第8天1次；“Q7Dx2”)；每周2次，持续2周(第1天、第4天、第8天和第11天；“Q3Dx2/2”)；和每周5次，持续2周(第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第8天、第9天、第10天、第11天和第12天；“Q1Dx5/2”)。14天后收集塞子。对小鼠实施安乐死，并将塞子上方的皮肤向后拉。切下塞子，固定，并包埋于石蜡中，以供组织学分析。利用CD31抗体对来自各可估值塞子的3个5μm厚的切片进行免疫染色，并用苏木素和伊红进行复染色。在显微镜下，分析各基质胶塞的横截面面积中血管的数量。

结果/讨论

如图28所示，与未经修饰的TM-601比较，聚乙二醇化TM-601的体内半衰期增加。聚乙二醇化使TM-601的半衰期增加约32倍，即，约25分钟(TM-601)对约16小时(TM-601-PEG)。

半衰期增加在血管生成模型中转化成以更低频率对动物给药的能力。在小鼠基质胶塞分析中，根据多种时程，给予动物TM-601或聚乙二醇化TM-601(TM-601-PEG)。测量微血管密度，并解释所述密度的降低以表示抗血管生成作用。

利用所测试的两个频率最高的给药时程(每周2次，持续2周，“Q3DX2/2”；和每周5次，持续2周，“Q1Dx5/2”)时，TM-601和TM-601-PEG都具有抗血管生成作用(图29)。利用所测试的频率最低的给药时程(每周1次，持续2周，“Q7DX2”)时，TM-601不显示任何抗血管生成作用，而利用此给药时程时，用TM-601-PEG的处理引起微血管密度显著降低(图29)。

不希望受任何特定理论的束缚，以更低频率对动物给药的能力可能是因为TM-601-PEG的可利用时间比TM-601长。这一利用率增加可能使暴露于新血管形成部位的时间变长，从而允许更为持久的作用。这些特性(例如利用率增加、作用延长等)可有益于治疗转移性肿瘤。

实例11：TM-601对肺转移的影响

在本实例中，使用小鼠模型(在小鼠中注入黑素瘤细胞)研究TM-601抑制肺中转移的能力。计算在用或不用TM-601治疗的情况下小鼠体内由此产生的肺转移的数量。

B16/F10小鼠黑素瘤细胞系是从ATCC获得，并根据推荐的规范培养。经静脉内用0.2mL含有肿瘤细胞悬浮液(1×10⁵个细胞/小鼠)的0.9％NaCl溶液接种各小鼠。

根据下表1，同时投予药物注射液和肿瘤细胞。如下表1所述，动物接收多种剂量的测试物品。每周5次使动物接收每日剂量，持续2周。无菌PBS用作媒剂对照品。使TM-601在无菌PBS溶液中复原。开始治疗后，每周2次记录下小鼠的体重测量值，并且每天至少1次进行总体观察。第14天(或在确定濒死状态后)处死所有组的所有小鼠，并计算B16/F10肺群落的数量。利用经气管滴注的包音氏固定液(Bouin fixativesolution)，计数的群落显示为在膨胀的肺中可见的黄色背景上可见的黑色肺结节。

表1：单一药剂形式的TM-601与B16/F10小鼠黑素瘤的肺部转移的关系的评价

^*第0天，同时投予第一剂与肿瘤细胞。

其它实施例

考虑到本文所揭露的发明的说明或实践，本发明其它实施例对所属领域技术人员来说是很明显的。所述说明和实例应仅视为例示性的，而本发明的真实范围将由随附权利要求书说明。

Claims (71)

1.一种治疗患有或易患至少一种转移的个体的方法，其中所述转移是由至少一种原发肿瘤引起，所述方法包含对所述个体投予有效剂量的蝎氯毒素试剂以致所述蝎氯毒素试剂结合于所述至少一种转移的步骤。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述蝎氯毒素试剂是全身投予。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述蝎氯毒素试剂经静脉内投予。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述蝎氯毒素试剂结合于至少一种位于脑中的肿瘤转移。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述蝎氯毒素试剂选择性靶向癌细胞而非正常细胞。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述蝎氯毒素试剂包含选自由以下组成的群组的蝎氯毒素部分：蝎氯毒素、生物活性蝎氯毒素亚基和蝎氯毒素衍生物。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述蝎氯毒素试剂包含蝎氯毒素部分与至少一个治疗部分缔合。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述蝎氯毒素部分和治疗部分直接共价缔合。

9.根据权利要求7所述的方法，其中所述蝎氯毒素部分与治疗部分融合形成融合蛋白。

10.根据权利要求7所述的方法，其中所述蝎氯毒素部分与治疗部分经由连接剂共价缔合。

11.根据权利要求7所述的方法，其中所述治疗部分包含抗癌剂。

12.根据权利要求7所述的方法，其中所述治疗部分包含细胞生长抑制剂。

13.根据权利要求7所述的方法，其中所述治疗部分包含细胞毒性剂。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述细胞毒性剂选自由以下组成的群组：毒素、生物活性蛋白、化疗用抗生素、溶核酶和放射性同位素。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述细胞毒性剂包含放射性同位素。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述放射性同位素包含碘-131(¹³¹I)。

17.根据权利要求11所述的方法，其中所述抗癌剂选自由以下组成的群组：烷化剂类、嘌呤拮抗剂类、嘧啶拮抗剂类、植物碱类、插入性抗生素类、芳香酶抑制剂类、抗代谢物类、有丝分裂抑制剂类、生长因子抑制剂类、细胞周期抑制剂类、酶类、拓扑异构酶抑制剂类、生物反应调节剂类、抗激素类和抗雄性激素类。

18.根据权利要求11所述的方法，其中所述抗癌剂包含长度介于约5与2000个核苷酸之间的核酸试剂。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述核酸试剂包含反义试剂。

20.根据权利要求18所述的方法，其中所述核酸试剂编码反义试剂。

21.根据权利要求18所述的方法，其中所述核酸试剂充当载体，以在引入细胞中时递送反义试剂。

22.根据权利要求18所述的方法，其中所述核酸试剂包含抑制性RNA。

23.根据权利要求18所述的方法，其中所述核酸试剂编码抑制性RNA。

24.根据权利要求18所述的方法，其中所述核酸试剂包含载体，以在引入细胞中时递送抑制性RNA。

25.根据权利要求1所述的方法，其中所述原发肿瘤是实体肿瘤。

26.根据权利要求1所述的方法，其中所述原发肿瘤是难治性肿瘤。

27.根据权利要求1所述的方法，其中所述原发肿瘤是复发性肿瘤。

28.根据权利要求1所述的方法，其中所述原发肿瘤是由以下组成的群组的成员：肺癌、骨癌、肝癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、皮肤或眼内黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门区域癌、胃癌、结肠癌、乳癌、子宫癌、性器官或生殖器官癌瘤、霍奇金氏病(Hodgkin′s Disease)、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌症、甲状腺癌、副甲状腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、慢性或急性白血病、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾癌、肾细胞癌瘤、中枢神经系统(CNS)瘤、神经外胚层癌、脊柱肿瘤、神经胶质瘤、脑脊膜瘤和垂体腺瘤。

29.根据权利要求28所述的方法，其中所述原发肿瘤是皮肤或眼内黑素瘤。

30.根据权利要求1所述的方法，其中所述原发肿瘤是神经外胚层源性肿瘤。

31.根据权利要求30所述的方法，其中所述神经外胚层源性肿瘤是由以下组成的群组的成员：神经胶质瘤、脑脊膜瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、神经母细胞瘤、神经节瘤、嗜铬细胞瘤、黑素瘤、外周原始神经外胚层肿瘤、小细胞肺癌和尤文氏肉瘤(Ewing′s sarcoma)。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述神经外胚层源性肿瘤是神经胶质瘤。

33.根据权利要求1所述的方法，其中所述投药步骤包含投予至少一个剂量的蝎氯毒素试剂，其中所述剂量介于约0.01mg/kg与约5mg/kg之间。

34.根据权利要求1所述的方法，其进一步包含在对所述个体投予所述蝎氯毒素试剂之前检测至少一种转移的步骤。

35.根据权利要求34所述的方法，其中检测所述至少一种转移包含以下步骤：

对所述个体投予有效量的经过标记的蝎氯毒素试剂；和

在所述个体体内除所述至少一种原发肿瘤的位置外的至少一个位置中测量所述体内所述经过标记的蝎氯毒素试剂的结合，其中结合水平相对于正常组织升高指示一种或多种转移的存在。

36.根据权利要求35所述的方法，其中所述经过标记的蝎氯毒素试剂是全身投予。

37.根据权利要求36所述的方法，其中所述经过标记的蝎氯毒素试剂经静脉内投予。

38.根据权利要求35所述的方法，其中所述经过标记的蝎氯毒素试剂经至少一个选自由以下组成的群组的标记部分标记：荧光团、放射性同位素和顺磁性金属离子。

39.根据权利要求38所述的方法，其中所述标记部分包含碘-131(¹³¹I)或碘-125(¹²⁵I)。

40.根据权利要求38所述的方法，其中所述标记部分包含锝-99m(^99mTc)。

41.根据权利要求38所述的方法，其中所述标记部分包含铜-64(⁶⁴Cu)。

42.根据权利要求38所述的方法，其中所述测量所述经过标记的蝎氯毒素试剂与组织的结合的步骤是使用选自由以下组成的群组的技术进行：激光诱导的荧光光谱法、γ相机、单光子发射计算机体层成像(SPECT)和正电子发射计算机体层成像(PET)。

43.根据权利要求1所述的方法，其进一步包含对所述个体投予化疗剂。

44.根据权利要求43所述的方法，其中所述化疗剂选自由以下组成的群组：烷化剂类、嘌呤拮抗剂类、嘧啶拮抗剂类、植物碱类、插入性抗生素类、芳香酶抑制剂类、抗代谢物类、有丝分裂抑制剂类、生长因子抑制剂类、细胞周期抑制剂类、酶类、拓扑异构酶抑制剂类、生物反应调节剂类、抗激素类和抗雄性激素类。

45.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种转移的新血管系统退化。

46.根据权利要求1所述的方法，其中新血管生成得到抑制。

47.根据权利要求1所述的方法，其中所述原发肿瘤中至少一个细胞的迁移得到抑制。

48.根据权利要求1所述的方法，其中所述蝎氯毒素试剂共价连接至聚合物。

49.根据权利要求48所述的方法，其中所述聚合物是聚乙二醇(PEG)。

50.一种检测患有或曾患至少一种原发肿瘤的个体中一种或多种转移的存在的方法，所述方法包含以下步骤：

对所述个体投予有效量的经过标记的蝎氯毒素试剂；和

在所述个体体内除所述至少一种原发肿瘤的位置外的至少一个位置中测量所述经过标记的蝎氯毒素试剂的结合，其中结合水平相对于正常组织升高指示一种或多种转移的存在。

51.根据权利要求50所述的方法，其中所述经过标记的蝎氯毒素试剂是全身投予。

52.根据权利要求51所述的方法，其中所述经过标记的蝎氯毒素试剂经静脉内投予。

53.根据权利要求50所述的方法，其中所述蝎氯毒素试剂结合于至少一种位于脑中的肿瘤转移。

54.根据权利要求50所述的方法，其中所述经过标记的蝎氯毒素试剂选择性靶向癌细胞而非正常细胞。

55.根据权利要求50所述的方法，其中所述经过标记的蝎氯毒素试剂包含选自由以下组成的群组的蝎氯毒素部分：蝎氯毒素、生物活性蝎氯毒素亚基和蝎氯毒素衍生物。

56.根据权利要求50所述的方法，其中所述经过标记的蝎氯毒素试剂经至少一个标记部分标记，其中所述标记部分选自由荧光团、放射性同位素和顺磁性金属离子组成的群组。

57.根据权利要求56所述的方法，其中所述标记部分包含碘-131(¹³¹I)或碘-125(¹²⁵I)。

58.根据权利要求56所述的方法，其中所述标记部分包含锝-99m(^99mTc)。

59.根据权利要求56所述的方法，其中所述标记部分包含铜-64(⁶⁴Cu)。

60.根据权利要求56所述的方法，其中所述测量所述经过标记的蝎氯毒素试剂与组织的结合的步骤是使用选自由以下组成的群组的技术进行：激光诱导的荧光光谱法、γ相机、单光子发射计算机体层成像(SPECT)和正电子发射计算机体层成像(PET)。

61.根据权利要求50所述的方法，其中所述至少一种原发肿瘤是实体肿瘤。

62.根据权利要求50所述的方法，其中所述至少一种原发肿瘤是难治性肿瘤。

63.根据权利要求50所述的方法，其中所述至少一种原发肿瘤是复发性肿瘤。

64.根据权利要求50所述的方法，其中所述至少一种原发肿瘤是选自由以下组成的群组的肿瘤：肺癌、骨癌、肝癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、皮肤或眼内黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门区域癌、胃癌、结肠癌、乳癌、子宫癌、性器官或生殖器官癌瘤、霍奇金氏病、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌症、甲状腺癌、副甲状腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾癌、肾细胞癌瘤、中枢神经系统(CNS)瘤、神经外胚层癌、脊柱肿瘤、神经胶质瘤、脑脊膜瘤和垂体腺瘤。

65.根据权利要求50所述的方法，其中所述至少一种原发肿瘤是皮肤或眼内黑素瘤。

66.根据权利要求50所述的方法，其中所述至少一种原发肿瘤是神经外胚层源性肿瘤。

67.根据权利要求66所述的方法，其中所述神经外胚层源性肿瘤是由以下组成的群组的成员：神经胶质瘤、脑脊膜瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、神经母细胞瘤、神经节瘤、嗜铬细胞瘤、黑素瘤、外周原始神经外胚层肿瘤、小细胞肺癌、尤文氏肉瘤和脑中神经外胚层源性转移性肿瘤。

68.根据权利要求67所述的方法，其中所述神经外胚层源性肿瘤是神经胶质瘤。

69.根据权利要求50所述的方法，其中所述投药步骤包含全身投予至少一个剂量的经过标记的蝎氯毒素试剂。

70.根据权利要求69所述的方法，其中所述投药步骤包含全身投予第一剂量和第二剂量的经过标记的蝎氯毒素试剂，其中所述第二剂量高于所述第一剂量。

71.根据权利要求69所述的方法，其中所述投药步骤包含全身投予第一剂量、第二剂量和第三剂量的经过标记的蝎氯毒素试剂，其中所述第二剂量高于所述第一剂量，且所述第三剂量高于所述第二剂量。

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