CN102433015B - 蓝藻色素的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于食品添加剂的技术领域，提供一种蓝藻色素的制备方法，该方法包括对蓝藻的酶解步骤和高压匀质步骤。具体地说，本发明的蓝藻色素的制备方法包括使用酶制剂对蓝藻细胞进行酶解，破碎蓝藻细胞壁，再采用高压匀质的方式对酶处理后的蓝藻细胞液进行循环处理，最后离心、用硫酸铵沉淀，得到蓝藻色素。通过本发明的方法可以获得可食用的、高纯度、高色价、并保留蓝藻色素蛋白固有营养的天然蓝色素。
Description
技术领域
本发明属于食品添加剂的技术领域，涉及食用色素的制备方法，特别涉及蓝藻色素的制备方法。
背景技术
食用色素包括天然色素和合成色素。合成色素具有色泽鲜艳、性质稳定、着色力强等特点，但其多来自于化工原料，发色物质多含有苯环、萘环等基团，摄入一定量会对人体产生危害，甚至会致毒、致癌和致畸，所以合成色素在适用的范围和用量上有严格的限制，某些品种已被禁用。食用天然色素是从动物、植物或微生物的组织中提取得到的有色物质，色泽自然，色调更接近天然食品，容易被人们接受，更重要的是无毒副作用，因而倍受消费者的欢迎。因此，食用天然色素的开发研制已越来越受到人们的重视，以天然色素取代合成色素是必然的趋势。
藻蓝色素即藻蓝素，异名为蓝藻色素，螺旋藻蓝色素，螺旋藻蛋白色素，其主要成分是藻蓝素、藻蓝蛋白和多糖，藻蓝蛋白属蛋白质结合色素，与蛋白质有相同性质，为蓝色颗粒或粉末，溶于水，不溶于醇和油脂，在弱酸和中性条件(pH＝4.5至8)下稳定，酸性(pH＝4.2)时发生沉淀，强碱可致脱色，等电点pH＝3.4，对金属离子的稳定性差，对热、光、酸不稳定。
藻蓝蛋白是一种重要的生理活性物质，能促进免疫系统抵抗多种疾病，具有抗衰老，防癌抑癌，促进动物对铁的利用，促进造血等重要功能(见[1]胡鸿钧.螺旋藻生物学及生物技术原理[M].北京：科学出版社，2003：81-97；[2]李定梅.螺旋藻-全球人类最理想的食品[M].北京：警官教育出版社，1997；[3]张成武，刘宇峰，王习霞.螺旋藻藻蓝蛋白对人血癌细胞株HL-60，K562和U937的生长影响[J].海洋科学，2000，24(1)：45-48)。藻胆蛋白具有亮丽的天蓝色，是一种很好的天然色素(见[4]何佳，赵启美，田娟，等.螺旋藻藻蓝素稳定性的研究[J].生物学杂志，1998，15(5)：10；[5]王书玲，刘焕云.螺旋藻色素稳定性的初步研究[J].食品工业，2000(5)：35-37；[6]张昆，方言雄，梁智彪.螺旋藻蓝色素研究[J].食品与机械，1995(4)：21-23；[7]张少斌，燕安，刘慧，等.pH值对螺旋藻突变株(SP-Dz)生长及藻胆蛋白含量的影响[J]，安徽农业科学，2005，33(8)：1562-1563)。从其氨基酸组成可知，它可以作为人和动物必需氨基酸的重要蛋白质来源(见[8]汤朝晖，蒋加伦.钝顶螺旋藻藻胆蛋白的提取及其特性初报[J].东海海洋，1993，11(4)：49-53；[9]沈蓓英，贺玉衡.螺旋藻的藻胆蛋白提取、分离和纯化[J].粮食与油脂，1999(4)：38-40)。藻胆蛋白发射强烈的荧光，其荧光强度比常用的荧光素强30倍，因其突出的荧光特性而使藻胆蛋白荧光探针的开发尤其引人注目(见[10]吴萍，顾铭，戚艺华，等.藻胆蛋白荧光探针及其标记[J].生命科学研究，2001，5(2)：109-113.)。同时，藻蓝蛋白用于食品研究方面尤其是功能性食品的研究取得了较大的进展，我国已有10多种螺旋藻片和胶囊，根据不同的功能通过了卫生部批准为保健品。
因藻胆蛋白与有很大的应用价值，不少人试图将藻胆蛋白基因转入微生物中以实现藻胆蛋白的大规模生产，但由于各种原因，用转基因方法生产藻胆蛋白还有很长的一段路要走，目前从海藻中提取分离藻胆蛋白仍是获得藻胆蛋白的主要途径。
藻蓝蛋白的提取常分为蛋白溶出和蛋白沉淀两个过程。藻蓝蛋白是属于胞内蛋白质，要使其溶出首先要破碎细胞的细胞壁、细胞膜使其以溶解的状态溶于提取液中，再采用适宜的方法将其沉淀，在提取过程应保持蛋白的活性。
本发明之前，对蓝藻色素的提取还处于单一采用机械破碎细胞壁的做法，如CN1210122号专利申请所公开的，是采用5-20倍体积的磷酸缓冲液，反复冻融，离心，收集上清液，冷冻干燥得藻蓝色素干品。但由于机械破碎的方式简单、效率低，因此存在工艺路线较长、提取不彻底、收率过低的缺点，最终色素产品纯度低，色价也较低。
CN1035425A也公开了一种蓝藻色素的提取方法，该方法是先将蓝藻磨细后，用水浸提，在调节pH在4至9的范围，进行酶解处理，所使用的酶是木瓜酶、胰蛋白酶、米曲霉、菠萝酶、或从枯草杆菌中提取的蛋白酶和淀粉酶。但由于受到所使用的酶的限制，仍然无法达到对蓝藻色素和蛋白的有效提取并保持蓝藻蛋白的活性。
此外还有化学试剂处理法、溶胀法、超声波法和组织捣碎法等提取方法，这些方法均较繁琐，后处理过程亦比较麻烦，不仅增加了生产成本，同时还造成了环境污染。
发明内容
本发明的目的在于提供一种蓝藻色素的制备方法，该方法包括对蓝藻的酶解步骤和高压匀质步骤。
上述制备方法中的酶解步骤使用的酶制剂为溶菌酶、果胶酶或这两种酶的任意组合。
本发明的蓝藻色素的制备方法包括如下步骤：
a)用浓度为0.01M-0.03M的EDTA水溶液浸泡蓝藻；
b)用酶制剂酶解处理步骤a)的蓝藻溶液；
c)将经过步骤b)酶解处理的蓝藻溶液进行高压匀质处理；
d)将经过步骤c)高压匀质处理获得的蓝藻溶液离心分离，取上清液；在该上清液中加入硫酸铵，沉淀蓝藻色素，再进行离心分离，得沉淀物蓝藻色素。
上述方法的步骤c)是在20kPa至40kPa的压力范围进行的，并循环进行2次至3次。高压均质速度为100L/h至400L/h(升/小时)，温度为10℃至25℃。
上述方法还包括将步骤d)获得的蓝藻色素沉淀物干燥成粉末的步骤。所述干燥为于60℃以下真空干燥。
上述方法的步骤a)中，所述干蓝藻粉与EDTA溶液的用量比为100克至300克：1000毫升(ml)；浸泡温度为10℃至25℃，浸泡时间1小时(h)至10小时。
上述方法的步骤b)中，所述酶解处理温度为30℃至50℃，恒温处理时间为2-6小时，相对于1千克蓝藻，溶菌酶的加入量为1克至2.5克；果胶酶的加入量为2克至6克；或者，溶菌酶与果胶酶组合使用，相对于1千克蓝藻，溶菌酶0.5克至1.25克，果胶酶1克至3克。
上述方法的步骤d)中加入的硫酸铵为硫酸铵晶体，所述干蓝藻原料与硫酸铵晶体的重量比为1∶0.05-0.5，优选为1∶0.1。
本发明的蓝藻色素的制备方法包括使用酶制剂对蓝藻细胞进行酶解，破碎蓝藻细胞壁，再采用高压匀质的方式对酶处理后的蓝藻细胞液进行循环处理，最后离心、用硫酸铵沉淀，得到蓝藻色素。
通过本发明的方法可以获得可食用的、高纯度、高色价、并保留蓝藻色素蛋白固有营养的天然蓝色素。
附图说明
图1是本发明蓝藻色素制备方法的工艺流程图。
具体实施方式
本发明的方法可通过以下步骤实现：
a)以浓度为0.01M至0.03M的EDTA蒸馏水溶液浸泡蓝藻，按照干蓝藻∶EDTA蒸馏水溶液＝100克至300克(g)∶1000毫升(ml)的比例搅拌混匀，于10℃至25℃的温度浸泡，浸泡时间1小时至10小时，优选2小时至4小时。该处理步骤使蓝藻充分溶胀，并且在此条件下可以保证蓝藻蛋白不产生降解，为酶解处理步骤创造了条件。
b)在上述浸泡蓝藻的溶液中加入酶制剂，进行恒温酶解处理，其中所述酶制剂为溶菌酶、果胶酶或这两种酶的任意组合；所述恒温范围为30℃至50℃，恒温酶解处理时间为2-6小时，以保证对蓝藻细胞的细胞壁充分溶解破碎。其中，溶菌酶加入量为1g至2.5g酶∶1千克(kg)蓝藻；果胶酶加入量为2g至6g酶∶1kg蓝藻；如两酶组合使用，则比例应为溶菌酶0.5g至1.25g∶果胶酶1g至3g∶蓝藻1kg。
c)将经酶解处理后的蓝藻液在20kPa至40kPa的压力范围在高压均质机中进行均质处理，控制均质速度为100升/小时(L/h)至400L/h，温度保持于10℃至25℃，将均质液循环均质处理2-3次。
d)将高压均质后的蓝藻液进行离心处理，去除沉淀物，沉淀物可回收作为饲料，在上清液中加入硫酸铵晶体，加入量为所述干蓝藻原料与硫酸铵晶体的重量比为1∶0.05-0.5，优选为1∶0.1，使之溶解、静置、沉淀出粗藻蓝素，离心得沉淀物，为所要的蓝藻色素产物。
通过上述方法得到的沉淀物可直接使用，也可以根据需要进行干燥或纯化。所述干燥可选用任何可行的干燥方法，但干燥温度应不高于60℃，以避免色素成分被破坏，所以最好采用真空干燥。
本发明蓝藻色素的制备方法中所用的蓝藻来源广泛，可采用螺旋藻、蓝球藻、发菜等多种蓝藻，提取色素后的蓝藻浆中其余蛋白质不会被破坏，同样能够作为饲料蛋白，不影响蛋白含量，物尽其用，使副产品增值。
蓝藻色素的传统提取工艺的路线太长，大部分过程需在低温下进行，提取周期长，因而成本高、效率低、生产应用价值不高。本发明蓝藻色素的制备方法是以蓝藻为主要原料，结合利用生物技术方法对蓝藻进行深加工，进而获得可食用的高纯度的天然蓝色素，同时还保留了蓝藻的固有营养，本发明制备方法得到的蓝藻色素粗产物得率＞40％，远高于一般低温冻融机械性方法的20％左右。
根据国家标准，A620/A280的比值大于0.7，可作为食品级，大于2.5可作为药品级。本发明方法得到的粗产品纯度较好，A620/A280可达到1.0-1.5，可直接作为食品色素使用。此外，产品还具有色泽自然、性质稳定、着色力强等特点，实验表明干粉状态下的蓝藻色素在室温下保存1年，其620nm特征吸光值基本未产生变化。
下面通过实验例说明本发明的酶溶法、高压均质法、酶溶-均质法正交试验的条件选择。
实验例1、高压均质法
(1)分别称取9份(每份100g)螺旋藻于1000ml含0.02M EDTA的蒸馏水，25℃搅拌浸泡4小时；
(2)将螺旋藻液在不同的压力(20，30，40kPa)和不同的循环次数(1、2、3次)的条件下进行均质，控制均质速度为200L/h，温度保持于25℃；
(3)将均质液在12000r/min条件下离心20分钟(min)，去除沉降物，得上清液。
(4)在上清液中加入10g硫酸铵晶体，使之溶解，静置，沉淀出粗藻蓝素。
(5)在10000r/min条件下离心15min，得沉淀物。
(6)结果与分析
高压均质法的循环次数对目标产物(藻蓝素)提取率影响比均质压力的影响大。可以得出，随着压力的增加和循环次数的增多，螺旋藻破碎越好，目标产物(藻蓝素)的得率也越高。
表1、高压均质实验结果
实验例2、酶溶法
(1)分别称取9份(每份100g)螺旋藻，溶于1000ml含0.02M EDTA的蒸馏水中，25℃搅拌浸泡4小时；
(2)在9份试样中分别加入不同总量(100、200、300mg)溶菌酶、果胶酶(溶菌酶∶果胶酶＝1∶2)并在不同的温度(30、40、50℃)下恒温不同的时间(2、4、6h)处理：
(3)将酶解后的螺旋藻液在10000r/min的条件下离心15min，去除沉淀物；
(4)在上清液中分别加入10g硫酸铵晶体，使之溶解，静置，沉淀出粗藻蓝素；
(5)在10000r/min的条件下离心15min，得沉淀物。
由下表2极差分析可见，酶处理温度对目标产物(藻蓝素)的影响最大，而酶用量及酶溶时间的影响相对而言要小些。从分析结果可以看出，酶用量为20mg(溶菌酶∶果胶酶＝1∶2)/10g(螺旋藻)、酶溶时间为4h、温度为40℃时，目标产物(藻蓝素)提取率最高。
表2、酶溶实验结果
实验例3、酶溶法和高压匀质法的结合
(1)分别称取9份(每份100g)螺旋藻，溶于1000ml含0.02M EDTA的蒸馏水中，25℃搅拌浸4小时；
(2)在9份试样中分别加入不同总量(100、200、300mg)溶菌酶、果胶酶(溶菌酶∶果胶酶＝1∶2)并在不同的温度(30、40、50℃)下恒温不同的时间(2、4、6h)处理。
(3)将螺旋藻液在不同的压力(20，30，40kPa)和不同的循环次数(1、2、3次)的条件下进行均质，控制均质速度为200L/h，温度保持于25℃；
(4)将酶解后的螺旋藻液在10000r/min的条件下离心15min，去除沉淀物；
(5)在上清液中分别加入10g硫酸铵晶体，使之溶解，静置，沉淀出粗藻蓝素；
(6)在10000r/min的条件下离心15min，得沉淀物。
参照上述处理方法的分析结果，可知高压均质法中均质压力、循环次数对目标产物(藻蓝素)提取率的影响比较大，而酶处理的三个因子中，温度对目标产物(藻蓝素)的提取率影响最大。故在酶溶-高压均质法中采用配料比和时间固定不改变(即定值，分别为30mg/10g、酶溶时间为4h)，只对温度、均质压力、循环次数的影响进行研究。
表3酶溶高压均质正交实验结果
由以上极差分析可见，高压均质循环的次数是影响藻蓝色素提取率的主要因素，酶处理温度的次之。与方法1和方法2的试验结果相符，但酶溶-高压均质法中藻蓝素提取率要比单一的酶溶法或高压均质结合法高。
因此，酶溶-均质法提取蓝藻色素的最优条件为：
(1)称取100g螺旋藻，溶于1000ml含0.02M EDTA的蒸馏水中，25℃搅拌浸泡4小时；
(2)在试样中分别加入总量约200mg溶菌酶、果胶酶混合酶，其中溶菌酶：果胶酶＝1∶2，并在不同的温度40℃下恒温4小时处理。
(3)将螺旋藻液在不同的压力40kPa和循环次数3次的条件下进行均质，控制均质速度为200L/h，温度保持于25℃；
(4)将酶解后的螺旋藻液在10000r/min的条件下离心15min，去除沉淀物；
(5)在上清液中分别加入10g硫酸铵晶体，使之溶解，静置，沉淀出粗藻蓝素；
(6)在10000r/min的条件下离心15min，得沉淀物。
下面结合附图，通过实施例进一步详细说明本发明，但这些实施例不构成对本发明范围的限定。
实施例1固态蓝藻色素的制备
于20℃，将1000g蓝藻浸泡于0.02M EDTA的10升(L)蒸馏水溶液中，并搅拌混匀，浸泡使蓝藻充分溶胀，在40℃条件下加入溶菌酶1g，(保持40℃温度，反应4小时。将经酶解处理的蓝藻液在40kPa压力下通过高压均质机均质处理，均质液循环均质2次，均质处理速度200L/h、温度为25℃。以1000r/min转速离心处理液30分钟(min)，过滤弃去沉淀物，在上清液中加入硫酸铵晶体100克，使之溶解、静置、沉淀出粗藻蓝素。以1000r/min转速离心处理后得沉淀物。真空干燥机中于真空度0.09MPa下，料层厚度5mm抽干沉淀物，同时保证加热板温度范围为45℃-55℃，得蓝藻色素粉末粗产物447.2g，粗产品得率为44.72％，测定A620/A280为1.1。
实施例2固态蓝藻色素的制备
于20℃，将1000g蓝藻浸泡于0.02MEDTA的10L蒸馏水溶液中，并搅拌混匀，浸泡使蓝藻充分溶胀，在40℃条件下加入溶菌酶0.5g，果胶酶1.0g，保持温度40℃，反应4小时。将经酶解处理的蓝藻液在40kPa压力下通过高压均质机均质处理，均质液循环均质3次，均质处理速度200L/h、温度为25℃。以1000r/min转速离心处理液30分钟(min)，过滤弃去沉淀物，在上清液中加入硫酸铵晶体100克，使之溶解、静置、沉淀出粗藻蓝素。以1000r/min转速离心处理后得沉淀物。真空干燥机中于真空度0.09MPa下，料层厚度7mm抽干沉淀物，同时保证加热板温度范围为45℃-55℃，得蓝藻色素粉末粗产物682.3g，粗产品得率为68.2％，测定A620/A280为1.3。
实施例3精制蓝藻色素的制备
将实施例1中所得的蓝藻色素粉末产物400g以5000ml，0.01mol/L，pH＝7.0的磷酸盐缓冲液溶解后静置，将粗品溶液通过10mmol/L的PBS与平衡了的DEAE-Sophadex A-25和羟基磷灰石吸附上柱梯度洗脱(在洗脱中不断增加PBS离子强度(分别以10、20、40、100、200mmol/L、pH＝7.0的PBS缓冲液，并加以0.3mol/L的NaCL溶液洗脱)，将特征吸收峰620nm藻蓝蛋白部分洗脱液合并，浓缩，在真空干燥箱中于真空度0.09MPa下，料层厚度5-7mm抽干沉淀物，同时保证加热板温度范围为45℃-55℃，得蓝藻色素粉末精制产物237.2g，得率为59％，测定A620/A280为2.986，获得试剂级标准藻蓝色素。
蓝藻色素粗品的稳定性试验
一、方法
取上述实施例2获得的蓝藻色素粗品500g，于25℃±2℃，相对湿度60％±5％、避光处保存的条件进行稳定性实验，与考察的1、3、6、9、12个月取样，行紫外分析，考察样品A620/A280变化情况，同时配制溶液，考察液体变色情况。
二、结果
1、样品A620/A280变化情况(详见下表)
1-12个月取样，A620/A280值均大于1.0，符合食品级色素要求，纯度较高。
表1、样品A620/A280变化情况
| 1 | 3 | 6 | 9 | 12 | |
| A620/A280 | 1.3 | 1.2 | 1.2 | 1.1 | 1.0 |
2、样品水溶液颜色变化情况(详见下表)
1、3、6月蓝藻色素水溶液呈蓝绿色、透明液体，pH稳定于6.0以上；9个月时颜色未见明显变化，pH有所下降；12月时产生少许浑浊物，pH下降至5.0左右。
表2、样品水溶液颜色变化情况
Claims (5)
1.一种蓝藻色素的制备方法，该方法包括对蓝藻的酶解步骤和高压匀质步骤，其中所述酶解步骤使用的酶制剂为溶菌酶、果胶酶或这两种酶的任意组合，该方法包括如下步骤：
a）用浓度为0.01M-0.03M的EDTA水溶液浸泡蓝藻，其中干蓝藻粉与EDTA溶液的用量比为100克至300克：1000毫升；浸泡温度为10℃至25℃，浸泡时间1小时至10小时；
b）用酶制剂酶解处理步骤a)的蓝藻溶液，所述酶解处理温度为30℃至50℃，恒温处理时间为2-6小时，相对于1千克蓝藻，溶菌酶的加入量为1克至2.5克；果胶酶的加入量为2克至6克；或者，溶菌酶与果胶酶组合使用，相对于1千克至2千克蓝藻，溶菌酶0.5克至1.25克，果胶酶1克至3克；
c）将经过步骤b)酶解处理的蓝藻溶液进行高压匀质处理，均质速度为100L/h至400L/h，温度为10℃至25℃；
d）将经过步骤c)高压匀质处理获得的蓝藻溶液离心分离，取上清液；在该上清液中加入硫酸铵，沉淀蓝藻色素，再进行离心分离，得沉淀物蓝藻色素，其中加入的硫酸铵为硫酸铵晶体，所述干蓝藻原料与硫酸铵晶体的重量比为1:0.05-0.5。
2.如权利要求1所述的蓝藻色素的制备方法，其中所述步骤c)是在20kPa至40kPa的压力范围进行的，并循环进行2次至3次。
3.如权利要求2所述的蓝藻色素的制备方法，该方法还包括将步骤d)获得的蓝藻色素沉淀物干燥成粉末的步骤。
4.如权利要求3所述的蓝藻色素的制备方法，其中所述干燥为于60℃以下真空干燥。
5.如权利要求1所述的蓝藻色素的制备方法，其中，所述步骤d)中干蓝藻原料与硫酸铵晶体的重量比为1:0.1。
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