CN102432420B - 从马缨丹中提取分离β-榄香烯的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物提取领域，目的是提供一种利用恶性杂草植物马缨丹为原料，从中提取分离β-榄香烯的方法。本发明方法如下：A、原料准备：以马缨丹的茎、叶为原料，鲜品打浆或干燥粉碎；B、挥发油提取：从步骤A所得原料中得到挥发油；C、柱层析：将步骤B得到的挥发油进行柱层析，收集洗脱液，除去洗脱液中的溶剂，得到β-榄香烯粗品；D、精制：将步骤B得到的挥发油或步骤C得到的粗品，采用分子蒸馏或制备型高效液相色谱系统进行精制获得高纯度的β-榄香烯。本发明提取所得β-榄香烯产品纯度高，产率高，成本低，为马缨丹开发利用和治理以及获得β-榄香烯提供一种全新的、廉价的、有效的途径。
Description
技术领域
本发明属于植物提取领域，具体涉及从植物马缨丹中提取分离β-榄香烯的方法。
背景技术
马缨丹(Lantana camara Linn.)，别名五色梅、山大丹、臭牡丹、杀虫花、毛神花、臭草、五色花、穿墙风等，为马鞭草科马缨丹属植物。该植物在我国云南、广西、四川等地分布广泛，资源极为丰富，属于热带、亚热带入侵杂草植物，给当地农牧业生产造成极大危害，对当地生态安全造成极大威胁。
β-榄香烯，拉丁名为β-Elemenum，英文名为β-elemene，化学名为(1S，2S，4R)1-甲基-1-乙烯基-2，4-二异丙烯基环己烷。结构式如下：
β-榄香烯为我国通过“七五”、“八五”、“九五”等一系列国家科技攻关计划项目，是从传统中药中自主研发出的抗肿瘤新药，已应用于临床，并被列入国家基本药物和全国医保用药目录。临床应用表明，β-榄香烯不仅具有很强的杀灭肿瘤细胞和抑制肿瘤生长作用，还可以通过激活免疫系统使机体获得明显的免疫保护效应，具有抗癌谱广、高效、无肝肾损害、无骨髓抑制、副作用少等特点，是人类今后一个时期内治疗肿瘤的首选药物，国内外市场需求量大。目前，β-榄香烯主要依赖于从中药莪术、没药、香茅、一枝黄花中提取，尚未发现有从紫茎泽兰中提取分离得到β-榄香烯的报道。由于中药莪术、没药、香茅、一枝黄花均为中药，成本相对较高，并且其中β-榄香烯的含量不高，提取纯化的成本较高，故造成该药的价格极为昂贵，严重妨碍了该药的推广应用。
本发明的发明人发现马缨丹中β-榄香烯含量和中药莪术、没药、香茅相当，而远高于一枝黄花，但马缨丹为入侵杂草植物，资源丰富，其原料成本远比这些植物低。故本发明欲提供一种从马缨丹中有效提取β-榄香烯的方法，为大幅度降低β-榄香烯的生产成本、以及开发、利用、治理马缨丹这种世界性恶性杂草植物开辟了新的途径。
发明内容
本发明所解决的技术问题是提供一种从马缨丹中提取分离β-榄香烯的方法。
经发明人检测发现：马缨丹中的β-榄香烯主要分布于其叶和茎中(占总量的90％以上)。其中，以叶中含量最高(约为0.1-0.3％)，而在根、花等其他器官中含量极低或基本没有。并且对比分析结果表明，马缨丹中β-榄香烯含量与中药莪术、没药、香茅相差不大，但远高于一枝黄花的含量。
本发明提取方法中所使用的原料主要为马缨丹的茎、叶中的至少一种或其混合，若原料中混有根、花、果实等其他器官也不会影响提取分离β-榄香烯，但会影响提取方法的收率，故优选以马缨丹兰的茎、叶中的至少一种或其混合为原料。
本发明提取方法如下：
A、原料准备：以马缨丹的茎、叶中的至少一种或其混合为原料，鲜品打浆或干燥粉碎；
B、提取挥发油：从步骤A所得原料中得到挥发油；
C、柱层析：将步骤B得到的挥发油进行柱层析，收集洗脱液，除去洗脱液中的溶剂，得到β-榄香烯粗品。
进一步的，还可以将步骤B得到的挥发油或步骤C得到的β-榄香烯粗品进行进一步精制，得到纯度更高的β-榄香烯精制品。
即精制步骤D为：将步骤B得到的挥发油或步骤C得到的β-榄香烯粗品，采用分子蒸馏或制备型高效液相色谱系统进行精制获得高纯度的β-榄香烯。
采用上述方法处理马缨丹的茎、叶步骤B提取通常可获得β-榄香烯含量大于20％的挥发油；采用柱层析等方法处理通常可获得β-榄香烯含量大于40％，甚至高达60％的β-榄香烯粗品；最终，进一步精制挥发油或β-榄香烯粗品，依据“目标含量”收集含β-榄香烯的纯化成分，通常可获得β-榄香烯含量大于90％，甚至高达98％的β-榄香烯精制品。
其中，提取挥发油时可采用以下五种方法之一提取挥发油：
方法一：水蒸气蒸馏法：
(1)经步骤A处理的原料进行常压蒸馏，得到馏出液；
(2)在馏出液中加入沸点小于60℃的非极性有机溶剂，萃取，收集上层有机相，除去上层有机相中的有机溶剂，即得挥发油。其中，蒸馏时优选以水为主要溶剂，加入提高提取系统沸点和防止皂化起泡，爆沸的材料。如，加入乙二醇是提高蒸馏恒沸液的温度，加入乙醇是消除蒸馏中产生的皂化起泡现象，加入沸石是防止蒸馏时爆沸。故可利用现有的、已知的、常规的、可预料的、具有上述功用的材料替换乙二醇、乙醇、沸石以达到相同的目的。
方法二：浸渍法：
(1)经步骤A处理的原料加入丙酮、石油醚或甲醇中的至少一种或其任意比例混合的有机溶剂浸提、过滤，得浸提液；
(2)浸提液除去溶剂后加入浓度20-80％v/v的乙醇，加入沸点小于60℃的非极性有机溶剂萃取，收集上层有机相，除去上层有机相中的有机溶剂，即得挥发油。
方法三：连续逆流提取法：
(1)经步骤A处理的原料加入丙酮、石油醚或甲醇中的至少一种或其任意比例混合的有机溶剂连续逆流提取，得提取液；
(2)去除提取液中的溶剂后加入浓度20-80％v/v的乙醇，加入沸点小于60℃的非极性有机溶剂萃取，收集上层有机相，除去上层有机相中的有机溶剂，即得挥发油。
方法四：微波萃取法：
(1)经步骤A处理的原料加入丙酮、石油醚或甲醇中的至少一种或其任意比例混合的有机溶剂，在微波萃取装置中，采用功率300-800W萃取300-800s，得提取液；
(2)提取液去除溶剂后加入浓度20-80％v/v的乙醇，加入沸点小于60℃的非极性有机溶剂萃取，收集上层有机相，除去上层有机相中的有机溶剂，即得挥发油。
方法五：超临界萃取法：
(1)经步骤A处理的原料，用超临界CO2流体萃取器进行萃取，萃取压力20-30MPa，萃取温度30-50℃，萃取时间1.5-3h，得萃取产物；
(2)萃取产物中加入浓度20-80％v/v的乙醇，加入沸点小于60℃的非极性有机溶剂萃取，收集上层有机相，除去上层有机相中的有机溶剂，即得挥发油。
上述五种挥发油提取法萃取时采用沸点小于60℃的非极性有机溶剂是因为若沸点高于60℃，除去溶剂时会将β-榄香烯一并除去，故选择沸点小于60℃的非极性有机溶剂萃取分离β-榄香烯。
其中，步骤C柱层析可采用的方法如下：
方法1：将步骤B得到的挥发油上大孔树脂层析柱，用水、甲醇、乙醇、丙酮中的至少一种或其任意比例混合的溶剂洗脱，流速为1-4％柱体积/min，收集含β-榄香烯的洗脱液，去除溶剂，加入浓度20-80％v/v的乙醇后，用沸点小于60℃的非极性有机溶剂萃取，收集上层有机相，除去上层有机相中的有机溶剂，即得β-榄香烯粗品；
或方法2：将步骤B得到的挥发油上硅胶层析柱或银离子硅胶层析柱，用石油醚洗脱，流速为1-4％柱体积/min，收集含β-榄香烯的洗脱液，除去溶剂，得到β-榄香烯粗品。
其中，获得β-榄香烯精制品时，可将步骤B得到的挥发油或步骤D得到的粗品采用下列方法之一进行精制，获得高纯度的β-榄香烯。精制时通常是依据“目标含量”收集含β-榄香烯的纯化成分，通常可获得β-榄香烯含量大于90％，甚至高达98％的β-榄香烯精制品。
方法1：分子蒸馏法时：将步骤B得到的挥发油或步骤C得到的β-榄香烯粗品进行分子蒸馏，收集β-榄香烯达到目标含量的馏出液，即得β-榄香烯精制品。
方法2：高效液相色谱系统制备法：将步骤B得到的挥发油或步骤C得到的β-榄香烯粗品通过制备型高效液相色谱系统进行分离，收集β-榄香烯达到目标含量的流出液，除去溶剂即得β-榄香烯精制品。
本发明提取方法所得β-榄香烯精品纯度至少大于90％，甚至可高达98％，产率可高达60％，为有效利用恶性杂草植物马缨丹提供了一种新的途径，更为获得β-榄香烯提供一种全新的、便宜的、有效的方法。
具体实施方式
发明人采用高效液相色谱精密测定发现：马缨丹中的β-榄香烯主要分布于其叶和茎中(占总量的90％以上)。其中，以叶中含量最高(约为0.1-0.3％)，而在根、花等其他器官中含量极低或基本没有。并且对比分析结果表明，马缨丹中β-榄香烯含量与中药莪术、没药、香茅相差不大，但远高于一枝黄花的含量。
本发明提取方法如下：
A、原料准备：以马缨丹的茎、叶中的至少一种或其混合为原料，鲜品打浆或干燥粉碎；
B、提取挥发油：从步骤A所得原料中得到挥发油；
C、柱层析：将步骤B得到的挥发油进行柱层析，收集洗脱液，除去溶剂，得到β-榄香烯粗品。
精制步骤D为：将步骤B得到的挥发油或步骤C得到的β-榄香烯粗品，采用分子蒸馏或制备型高效液相色谱系统进行精制获得高纯度的β-榄香烯。
一、提取挥发油时可采用以下五种方法之一提取挥发油：
方法一、水蒸气蒸馏法：经步骤A处理的原料加入水为主的溶剂进行常压蒸馏，得到含β-榄香烯的馏出液；在所得馏出液中加入石油醚、环己烷、正己烷、苯、乙醚等沸点小于60℃的非极性有机溶剂，萃取至少2次，收集上层有机相，除去上层有机相中的有机溶剂，即得挥发油。其中，蒸馏时优选以水为主要溶剂，加入乙二醇、乙醇。因地区原因沸点低，加入乙二醇可提高蒸馏恒沸液的温度；加入乙醇是为了消除蒸馏中产生的皂化起泡现象；还可加入沸石是以防止蒸馏时爆沸。故可利用现有的、已知的、常规的、可预料的、具有上述功用的材料替换乙二醇、乙醇、沸石以达到相同的目的。
方法二、浸渍法：经步骤A处理的原料加入丙酮、石油醚、或甲醇等有机溶剂浸提2-4次、过滤，合并提取液并去除溶剂，加入20-80％的乙醇溶液，用石油醚、环己烷、正己烷、苯、乙醚等沸点小于60℃的非极性有机溶剂萃取至少2次，收集上层有机相，除去上层有机相中的有机溶剂，即得挥发油。
方法三、连续逆流提取法：经步骤A处理的原料加入丙酮、石油醚、或甲醇等有机溶剂连续逆流提取3-4次，得到提取液。去除提取液中的溶剂，加入20-80％的乙醇溶液，用石油醚、环己烷、正己烷、苯、乙醚等沸点小于60℃的非极性有机溶剂萃取至少2次，收集上层有机相，除去上层有机相中的有机溶剂，即得挥发油。
方法四、微波萃取法：经步骤A处理的原料加入丙酮、石油醚、或甲醇等有机溶剂，在微波萃取装置中，300-800W的功率下萃取300-800s，萃取2-4次，过滤合并提取液。去除提取液中的溶剂，加入20-80％的乙醇溶液，用石油醚、环己烷、正己烷、苯、乙醚等沸点小于60℃的非极性有机溶剂萃取至少2次，收集上层有机相，除去上层有机相中的有机溶剂，即得挥发油。
方法五、超临界萃取法：经步骤A处理的原料，用超临界CO2流体萃取器进行萃取，萃取压力20-30MPa，萃取温度30-50℃，萃取时间1.5-3h。在萃取产物中，加入20-80％的乙醇溶液，用石油醚、环己烷、正己烷、苯、乙醚等沸点小于60℃的非极性有机溶剂，至少萃取2次，收集上层有机相，除去上层有机相中的有机溶剂，即得挥发油。
经比较，上述五种方法均可从原料中得到挥发油(β-榄香烯含量＞20％)。但最佳的提取方法为连续逆流提取法和水蒸气蒸馏法，其中：连续逆流提取法具有提取率高，溶剂用量较少等优点，但提取所得挥发油中β-榄香烯含量较低；水蒸气蒸馏法具有操作简便、提取所得挥发油中β-榄香烯含量较高的优点，挥发油纯度通常为30％，甚至可达40％，但提取率偏低。萃取溶剂中，因石油醚成本低、环境安全、对人体安全，优先采用石油醚为萃取溶剂。
其中，连续逆流提取条件为：加入原料量(g)3-7倍体积(mL)的丙酮做溶剂，室温下浸泡至少1h，恒温(20-30℃)气浴振荡(100-140r/min)连续逆流提取至少1次，每次不少于1.5h。优化参数为：加入原料量(g)5倍体积(mL)的丙酮做溶剂，室温下浸泡4h，恒温(25℃)气浴振荡(120r/min)连续逆流提取3次，第1次提取2.5h，第2次提取3.5h，第3次提取3h。
水蒸气蒸馏法提取条件为：取步骤A得到的原料，放入蒸馏瓶中，加入原料量(g)3-7倍量(mL)的水、1-3倍量(mL)的乙二醇、少量乙醇、沸石，加温常压蒸馏，收集80-150℃的馏出液。优化参数为：取步骤A得到的原料，放入蒸馏瓶中，加入原料量(g)5倍量(mL)的水、2倍量(mL)的乙二醇、少量乙醇、沸石，加温常压蒸馏，收集80-150℃的馏出液。
二、柱层析方法如下：
柱层析时，发明者采取硅胶、银离子硅胶、D101大孔树脂、HP20大孔树脂做层析介质均可从马缨丹的挥发油中分离得到β-榄香烯粗品，β-榄香烯纯度通常可＞40％。可采用的方法如下：
方法一、大孔树脂法：将步骤B得到的挥发油上大孔树脂层析柱，用水、甲醇、乙醇、丙酮等溶剂或其混合溶液洗脱，流速为1-4％柱体积/min，收集含β-榄香烯的洗脱液，去除溶剂，加入20-80％的乙醇溶液，用石油醚等有机溶剂萃取至少2次，分离上层有机相，除去上层有机相中的有机溶剂，即得β-榄香烯粗品。
方法二、硅胶法：将步骤B得到的挥发油上硅胶层析柱或银离子硅胶层析柱，用石油醚洗脱，流速为1-4％柱体积/min，收集含β-榄香烯的洗脱液，除去溶剂，得到β-榄香烯粗品。
具体的，优化的层析条件为：以HP20为层析介质，先后分别以2倍柱体积的蒸馏水、80％乙醇、85％乙醇、90％乙醇、95％乙醇、无水乙醇进行洗脱，流速2％柱体积/min。按此条件进行柱层析，β-榄香烯粗品的纯度＞60％，回收率＞85％。
三、精制方法如下：
精制时，发明人发现采取分子蒸馏法、高效液相色谱系统制备法均可从挥发油或粗品中，分离获得高纯度的β-榄香烯。
分子蒸馏优选的方法为：将步骤B得到的挥发油或步骤C得到的粗品进行减压分馏，收集76-78℃/40Pa的馏分，即为纯品(纯度＞90％，产率＞70％)。
高效液相色谱系统制备优选的方法之一为：将步骤B得到的挥发油或步骤C得到的粗品用下列高效液相色谱系统进行分离：岛津高效液相色谱仪LC-10A，C18制备柱(10mm×150mm)，洗脱剂为乙醇/水/乙腈＝70/20/10(V/V)，流速为2mL/min，检测波长为210nm；进样体积1mL。收集β-榄香烯流出液，按1∶1比例加入石油醚，反复萃取三次。分离合并石油醚层，加入Na2SO4干燥10-24h，60℃真空旋转抽干溶剂，得到纯品(纯度＞98％，产率＞75％)。
以下通过本发明制备实例说明本发明的有益效果。
实施例1蒸馏法从马缨丹中提取分离β-榄香烯
A、原料准备：收集马缨丹茎和叶，太阳下自然晒干，粉碎，过40目筛。
B、挥发油的提取：取步骤A得到的原料100g，放入蒸馏瓶中，加入去离子水或蒸馏水500mL、乙二醇200mL、乙醇50mL、沸石3-5粒，加温常压蒸馏，收集80-150℃的馏出液。在得到的馏出液中，按1∶1比例加入石油醚(沸程30-60℃)，反复萃取三次。分离合并石油醚层，60℃真空旋转抽干溶剂，得到挥发油(纯度＞20％)。
C、高效液相制备：将步骤B得到的挥发油用下列高效液相色谱系统进行分离：岛津高效液相色谱仪LC-10A，C18制备柱(10mm×150mm)，洗脱剂为乙醇/水/乙腈＝70/20/10(V/V)，流速为2mL/min，检测波长为210nm；进样体积1mL。收集β-榄香烯流出液，按1∶1比例加入石油醚，反复萃取三次。分离合并石油醚层，加入Na2SO4干燥10-24h，60℃真空旋转抽干溶剂，得到纯品(纯度＞95％，产率＞55％)。
实施例2蒸馏法从马缨丹中提取分离β-榄香烯
A、原料准备：收集马缨丹茎和叶，太阳下自然晒干，粉碎，过40目筛。
B、挥发油的提取：取步骤A得到的原料100g，放入蒸馏瓶中，加入去离子水或蒸馏水500mL，乙二醇200mL、乙醇50mL，沸石3-5粒，加温常压蒸馏，收集80-150℃的馏出液。在得到的馏出液中，按1∶1比例加入石油醚(沸程30-60℃)，反复萃取三次。分离合并石油醚层，60℃真空旋转抽干溶剂，得到挥发油(纯度＞30％)。
C、高效液相制备：将步骤B得到的挥发油用下列高效液相色谱系统进行分离：岛津高效液相色谱仪LC-10A，C18制备柱(10mm×150mm)，洗脱剂为乙醇/水/乙腈＝70/20/10(V/V)，流速为2mL/min，检测波长为210nm；进样体积1mL。收集β-榄香烯流出液，按1∶1比例加入石油醚，反复萃取三次。分离合并石油醚层，加入Na2SO4干燥10-24h，60℃真空旋转抽干溶剂，得到纯品(纯度＞95％，产率＞50％)。
实施例3蒸馏法从马缨丹中提取分离β-榄香烯
A、原料准备：收集马缨丹茎和叶，用粉碎机打成浆状。
B、挥发油的提取：取步骤A得到的原料100g，放入蒸馏瓶中，加入去离子水或蒸馏水500mL，乙二醇200mL、乙醇50mL，沸石3-5粒，加温常压蒸馏，收集80-150℃的馏出液。在得到的馏出液中，按1∶1比例加入苯，反复萃取三次。分离合并石油醚层，60℃真空旋转抽干溶剂，得到挥发油(纯度＞30％)。
C、柱层析：将步骤B得到的挥发油，上300mL HP20大孔树脂层析柱，先后分别以600mL的蒸馏水、80％乙醇、85％乙醇、90％乙醇、95％乙醇、无水乙醇进行洗脱，流速6mL/min。收集β-榄香烯含量＞60％的洗脱液，按1∶1比例加入石油醚(沸程30-60℃)，反复萃取三次。分离合并石油醚层，60℃真空旋转抽干溶剂，得到粗品(纯度＞60％)。
D、分子蒸馏：将步骤C得到的粗品进行减压分馏，收集76-78℃/40Pa的馏分，即为纯品(纯度＞92％，产率＞60％)。
实施例4蒸馏法从马缨丹中提取分离β-榄香烯
A、原料准备：收集马缨丹茎和叶，用粉碎机打成浆状。
B、挥发油的提取：取步骤A得到的原料100g，放入蒸馏瓶中，加入去离子水或蒸馏水500mL，乙二醇200mL、乙醇50mL，沸石3-5粒，加温常压蒸馏，收集80-150℃的馏出液。在得到的馏出液中，按1∶1比例加入环己烷，反复萃取三次。分离合并石油醚层，60℃真空旋转抽干溶剂，得到挥发油(纯度＞30％)。
C、分子蒸馏：将步骤B得到的挥发油进行减压分馏，收集76-78℃/40Pa的馏分，即为纯品(纯度＞90％，产率＞55％)。
实施例5连续逆流提取法从马缨丹中提取分离β-榄香烯
A、原料准备：收集新鲜马缨丹茎和叶，用粉碎机打成浆状。
B、连续逆流提取：取步骤A原料100g，放入三角瓶中，连续逆流提取三次，每次加入丙酮500mL，震荡(转速60-100r/min)提取4-8h，温度20-25℃。过滤合并提取液，减压浓缩除去溶剂，加入50％乙醇100mL，再用100mL石油醚(沸程30-60℃)萃取3次。分离合并石油醚层，60℃真空旋转蒸干溶剂，得到挥发油(纯度＞10％)。
C、柱层析：将步骤B得到的挥发油，上300mL HP20大孔树脂层析柱，先后分别以600mL的蒸馏水、80％乙醇、85％乙醇、90％乙醇、95％乙醇、无水乙醇进行洗脱，流速6mL/min。收集β-榄香烯含量＞60％的洗脱液，按1∶1比例加入石油醚(沸程30-60℃)，反复萃取三次。分离合并石油醚层，60℃真空旋转抽干溶剂，得到粗品(纯度＞52％)。
D、分子蒸馏：将步骤C得到的粗品进行减压分馏，收集76-78℃/40Pa的馏分，即为纯品(纯度＞90％，产率＞62％)。
实施例6连续逆流提取法从马缨丹中提取分离β-榄香烯
A、原料准备：收集新鲜马缨丹茎和叶，用粉碎机打成浆状。
B、连续逆流提取：取步骤A原料100g，放入三角瓶中，连续逆流提取三次，每次加入石油醚500mL，震荡(转速60-100r/min)提取4-8h，温度20-25℃。过滤合并提取液，减压浓缩除去溶剂，加入50％乙醇100mL，再用100mL石油醚(沸程30-60℃)萃取3次。分离合并石油醚层，60℃真空旋转蒸干溶剂，得到挥发油(纯度＞10％)。
C、柱层析：将步骤B得到的挥发油，上300mL HP20大孔树脂层析柱，先后分别以600mL的蒸馏水、80％乙醇、85％乙醇、90％乙醇、95％乙醇、无水乙醇进行洗脱，流速6mL/min。收集β-榄香烯含量＞60％的洗脱液，按1∶1比例加入石油醚(沸程30-60℃)，反复萃取三次。分离合并石油醚层，60℃真空旋转抽干溶剂，得到粗品(纯度＞52％)。
D、分子蒸馏：将步骤C得到的粗品进行减压分馏，收集76-78℃/40Pa的馏分，即为纯品(纯度＞90％，产率＞60％)。
实施例7连续逆流提取法从马缨丹中提取分离β-榄香烯
A、原料准备：收集新鲜马缨丹茎和叶，用粉碎机打成浆状。
B、连续逆流提取：取步骤A原料100g，放入三角瓶中，连续逆流提取三次，每次加入甲醇500mL，震荡(转速60-100r/min)提取4-8h，温度20-25℃。过滤合并提取液，减压浓缩除去溶剂，加入50％乙醇100mL，再用100mL石油醚(沸程30-60℃)萃取3次。分离合并石油醚层，60℃真空旋转蒸干溶剂，得到挥发油(纯度＞10％)。
C、柱层析：将步骤B得到的挥发油，上300mL HP20大孔树脂层析柱，先后分别以600mL的蒸馏水、80％乙醇、85％乙醇、90％乙醇、95％乙醇、无水乙醇进行洗脱，流速6mL/min。收集β-榄香烯含量＞60％的洗脱液，按1∶1比例加入石油醚(沸程30-60℃)，反复萃取三次。分离合并石油醚层，60℃真空旋转抽干溶剂，得到粗品(纯度＞52％)。
D、分子蒸馏：将步骤C得到的粗品进行减压分馏，收集76-78℃/40Pa的馏分，即为纯品(纯度＞90％，产率＞60％)。
实施例8连续逆流提取法从马缨丹中提取分离β-榄香烯
A、原料准备：收集新鲜马缨丹茎和叶，太阳下自然晒干，粉碎，过40目筛。
B、连续逆流提取：取步骤A原料100g，放入三角瓶中，连续逆流提取三次，每次加入甲醇500mL，震荡(转速60-100r/min)提取4-8h，温度20-25℃。过滤合并提取液，减压浓缩除去溶剂，加入50％乙醇100mL，再用100mL石油醚(沸程30-60℃)萃取3次。分离合并石油醚层，60℃真空旋转蒸干溶剂，得到挥发油(纯度＞20％)。
C、高效液相制备：将步骤B得到的挥发油用下列高效液相色谱系统进行分离：岛津高效液相色谱仪LC-10A，C18制备柱(10mm×150mm)，洗脱剂为乙醇/水/乙腈＝70/20/10(V/V)，流速为2mL/min，检测波长为210nm；进样体积1mL。收集β-榄香烯流出液，按1∶1比例加入石油醚，反复萃取三次。分离合并石油醚层，加入Na2SO4干燥10-24h，60℃真空旋转抽干溶剂，得到纯品(纯度＞95％，产率＞60％)。
实施例9浸渍法从马缨丹中提取分离β-榄香烯
A、原料准备：收集新鲜马缨丹茎和叶，太阳下自然晒干，粉碎，过40目筛。
B、浸渍法：步骤A处理的原料100g，，加入500ml丙酮浸提3次，每次2小时，过滤，合并提取液并去除丙酮，加入50％乙醇100mL，再用100mL石油醚(沸程30-60℃)萃取2次。分离合并石油醚层，60℃真空旋转蒸干溶剂，得到挥发油(纯度＞20％)。
C、高效液相制备：将步骤B得到的挥发油用下列高效液相色谱系统进行分离：岛津高效液相色谱仪LC-10A，C18制备柱(10mm×150mm)，洗脱剂为乙醇/水/乙腈＝70/20/10(V/V)，流速为2mL/min，检测波长为210nm；进样体积1mL。收集β-榄香烯流出液，按1∶1比例加入石油醚，反复萃取三次。分离合并石油醚层，加入Na2SO4干燥10-24h，60℃真空旋转抽干溶剂，得到纯品(纯度＞95％，产率＞55％)。
其中，步骤B采用石油醚或甲醇浸提时，纯品纯度及产率与采用丙酮浸提相当。
实施例10微波萃取法从马缨丹中提取分离β-榄香烯
A、原料准备：收集新鲜马缨丹茎和叶，太阳下自然晒干，粉碎，过40目筛。
B、微波萃取：步骤A处理的原料100g，，在微波萃取装置中，功率800W萃取400s，加入丙酮萃取3次，过滤合并提取液。去除提取液中的溶剂，加入50％乙醇100mL，再用100mL石油醚(沸程30-60℃)萃取2次。分离合并石油醚层，60℃真空旋转蒸干溶剂，得到挥发油(纯度＞20％)。
C、分子蒸馏：将步骤B得到的挥发油进行减压分馏，收集76-78℃/40Pa的馏分，即为纯品(纯度＞90％，产率＞55％)。
其中，步骤B采用石油醚或甲醇浸提时，纯品纯度及产率与采用丙酮浸提相当。
实施例11超临界萃取法从马缨丹中提取分离β-榄香烯
A、原料准备：收集新鲜马缨丹茎和叶，太阳下自然晒干，粉碎，过40目筛。
B、超临界萃取：步骤A处理的原料100g，，用超临界CO2流体萃取器进行萃取，控制萃取压力20-30MPa，萃取温度30-50℃，萃取时间2h。在萃取产物中，加入50％乙醇100mL，再用100mL石油醚(沸程30-60℃)萃取2次。分离合并石油醚层，60℃真空旋转蒸干溶剂，得到挥发油(纯度＞20％)。
C、分子蒸馏：将步骤B得到的挥发油进行减压分馏，收集76-78℃/40Pa的馏分，即为纯品(纯度＞90％，产率＞55％)。
Claims (4)
1.从马缨丹中提取分离β-榄香烯的方法，其特征在于：步骤如下：
A、原料准备：主要以马缨丹的茎、叶中的至少一种或其混合为原料，鲜品打浆或干燥粉碎；
B、挥发油提取：从步骤A所得原料中提取得到挥发油；
C、柱层析：将步骤B得到的挥发油进行柱层析，收集洗脱液，除去洗脱液中的溶剂，得到β-榄香烯粗品；
其中，步骤B采用水蒸气蒸馏提取挥发油，方法如下：
（1）经步骤A处理的原料进行常压蒸馏，得到馏出液；
（2）在馏出液中加入沸点小于60℃的非极性有机溶剂，萃取，收集上层有机相，除去上层有机相中的有机溶剂，即得挥发油；
步骤C中柱层析采用如下方法分离纯化：
方法1：将步骤B得到的挥发油上大孔树脂层析柱，用水、甲醇、乙醇、丙酮中的至少一种或其任意比例混合的溶剂洗脱，流速为1-4%柱体积/min，收集含β－榄香烯的洗脱液，去除溶剂，加入浓度20-80%v/v的乙醇后，用沸点小于60℃的非极性有机溶剂萃取，收集上层有机相，除去上层有机相中的有机溶剂，即得β-榄香烯粗品；
或采用方法2：将步骤B得到的挥发油上硅胶层析柱或银离子硅胶层析柱，用石油醚洗脱，流速为1-4%柱体积/min，收集含β－榄香烯的洗脱液，除去溶剂，得到β-榄香烯粗品；
蒸馏时以水为主要溶剂，溶剂系统中加入提高溶剂系统沸点和防止皂化起泡，爆沸的材料；其中，所述提高溶剂系统沸点的材料为乙二醇；所述防止皂化起泡的材料为乙醇；所述防止爆沸的材料为沸石；
水蒸气蒸馏法提取条件为：取步骤A得到的原料，放入蒸馏瓶中，按下述比例配制：每1g原料加入3-7mL水、1-3mL乙二醇、少量乙醇、沸石，加温常压蒸馏，收集80-150℃的馏出液。
2.根据权利要求1所述的从马缨丹中提取分离β-榄香烯的方法，其特征在于：水蒸气蒸馏法提取条件为：取步骤A得到的原料，放入蒸馏瓶中，按下述比例配制：每1g原料加入5mL水、2mL乙二醇、少量乙醇、沸石，加温常压蒸馏，收集80-150℃的馏出液。
3.从马缨丹中提取分离β-榄香烯的方法，其特征在于：步骤如下：
A、原料准备：以马缨丹的茎、叶中的至少一种或其混合为原料，鲜品打浆或干燥粉碎；
B、挥发油提取：从步骤A所得原料中提取得到挥发油；
C、柱层析：将步骤B得到的挥发油进行柱层析，收集洗脱液，除去洗脱液中的溶剂，得到β-榄香烯粗品；
D、精制：将步骤B得到的挥发油或步骤C得到的β-榄香烯粗品，采用制备型高效液相色谱系统进行精制获得β-榄香烯精制品；
其中，步骤B采用水蒸气蒸馏提取挥发油，方法如下：
（1）经步骤A处理的原料进行常压蒸馏，得到馏出液；
（2）在馏出液中加入沸点小于60℃的非极性有机溶剂，萃取，收集上层有机相，除去上层有机相中的有机溶剂，即得挥发油；
步骤C中柱层析采用如下方法分离纯化：
方法1：将步骤B得到的挥发油上大孔树脂层析柱，用水、甲醇、乙醇、丙酮中的至少一种或其任意比例混合的溶剂洗脱，流速为1-4%柱体积/min，收集含β－榄香烯的洗脱液，去除溶剂，加入浓度20-80%v/v的乙醇后，用沸点小于60℃的非极性有机溶剂萃取，收集上层有机相，除去上层有机相中的有机溶剂，即得β-榄香烯粗品；
或采用方法2：将步骤B得到的挥发油上硅胶层析柱或银离子硅胶层析柱，用石油醚洗脱，流速为1-4%柱体积/min，收集含β－榄香烯的洗脱液，除去溶剂，得到β-榄香烯粗品；
步骤D采用高效液相色谱系统制备法方法如下：将步骤B得到的挥发油或步骤C得到的β－榄香烯粗品通过制备型高效液相色谱系统进行分离，收集β－榄香烯达到目标含量的流出液，除去流出液中的溶剂即得β－榄香烯精制品，条件如下：
岛津高效液相色谱仪LC-10A；C18制备柱：10mm×150mm，洗脱剂为乙醇/水/乙腈，其体积比为70/20/10；流速为2mL/min；检测波长为210nm；进样体积1mL；收集β－榄香烯流出液，按1:1比例加入石油醚，反复萃取三次；分离合并石油醚层，加入Na2SO4干燥10-24h，60℃真空旋转抽干溶剂，得到纯品；
蒸馏时以水为主要溶剂，溶剂系统中加入提高溶剂系统沸点和防止皂化起泡，爆沸的材料；其中，所述提高溶剂系统沸点的材料为乙二醇；所述防止皂化起泡的材料为乙醇；所述防止爆沸的材料为沸石；
水蒸气蒸馏法提取条件为：取步骤A得到的原料，放入蒸馏瓶中，按下述比例配制：每1g原料加入3-7mL水、1-3mL乙二醇、少量乙醇、沸石，加温常压蒸馏，收集80-150℃的馏出液。
4.根据权利要求3所述的从马缨丹中提取分离β-榄香烯的方法，其特征在于：水蒸气蒸馏法提取条件为：取步骤A得到的原料，放入蒸馏瓶中，按下述比例配制：每1g原料加入5mL水、2mL乙二醇、少量乙醇、沸石，加温常压蒸馏，收集80-150℃的馏出液。
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| CN101531563A (zh) * | 2009-02-16 | 2009-09-16 | 沈阳万爱普利德医药科技有限公司 | 化学络合定向分离纯化法制备高纯度的β-榄香烯原料药 |
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2011
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| CN101531563A (zh) * | 2009-02-16 | 2009-09-16 | 沈阳万爱普利德医药科技有限公司 | 化学络合定向分离纯化法制备高纯度的β-榄香烯原料药 |
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| Chemical composition of leaf and flower essential oil of Lantana camara from India;M.Khan et al.;《Flavour and Fragrance Journal》;20020228;第17卷(第1期);第75页实验部分，表1 * |
| M.Khan et al..Chemical composition of leaf and flower essential oil of Lantana camara from India.《Flavour and Fragrance Journal》.2002,第17卷(第1期),第75页实验部分，表1. |
| 周红等.桂产新鲜马缨丹叶及花的香气成分的HS-SPME-GC-MS分析.《广西大学学报：自然科学版》.2009,第34卷(第4期),第495页1.2 SPME取样和2 结果分析与讨论. * |
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