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CN102424826B - 一种芒属植物Genic-SSR标记的制备方法及应用 - Google Patents

一种芒属植物Genic-SSR标记的制备方法及应用 Download PDF

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CN102424826B CN 201110443963 CN201110443963A CN102424826B CN 102424826 B CN102424826 B CN 102424826B CN 201110443963 CN201110443963 CN 201110443963 CN 201110443963 A CN201110443963 A CN 201110443963A CN 102424826 B CN102424826 B CN 102424826B
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胡小虎
胡中立
游永宁
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Abstract

本发明公开了一种芒属植物Genic-SSR标记的制备方法及应用，其步骤是：A、芒属植物转录组序列的获得：选取芒属植物的幼嫩叶片，分别提取总RNA，得到转录组Reads，去除载体RNA序列污染，拼接，获得芒属植物转录组序列；B、芒属植物ESR序列中SSR位点的鉴定：采用SSR检索软件对得到的非冗余Unigene-EST序列进行SSR位点查找，重复基序为2-6个碱基，获得一系列含有SSR位点信息的Unigene序列；C、芒属植物Genic-SSR引物的设计：依据得到的含有SSR位点的Unigene序列，采用引物设计软件进行引物设计，获得一系列Genic-SSR引物。方法简单，效率高，操作简便，获得的标记数量巨大，通过转录组测序获得EST序列，为重要能源植物芒草的遗传学研究及分子改良等奠定基础。

Description

一种芒属植物Genic-SSR标记的制备方法及应用
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，更具体涉及一种芒属植物Genic-SSR标记的制备方法，同时还涉及一种芒属植物Genic-SSR标记的用途。
技术背景
芒属植物属于禾本科C4多年生草本植物，主要包括芒、五节芒、荻、南荻、奇岗，集中分布在亚洲东部及东南部。芒属植物具有生命力强、光合利用效率高、抗逆性强等特点，可用于制药、造纸、水土保持和生态修复等。随着人类对能源需求的不断提高，全球能源储量的不断减少，芒属植物作为一种潜在的能源植物越来越受到人们的高度关注。目前，在欧美实现广泛种植的奇岗，年产可达每年10～40吨/公顷，被用于火力发电和燃料乙醇生产。随着芒属植物的遗传多样性研究、遗传选育改良及遗传图谱绘制等工作的不断深入，对芒属植物分子标记的需求也越来越大。通过遗传改良或重要基因的挖掘可有效提高芒属能源植物的产量、抗逆性、广适性。因此，挖掘芒属植物的分子遗传标记，对芒属植物研究意义重大。
简单序列重复(simple sequence repeat，SSR)是一类1-6bp核苷酸基序构成的重复序列，广泛分布于真核生物基因组的编码区、非编码区，SSR标记利用简单序列重复的侧翼保守序列设计引物，经过PCR扩增，根据条带的大小来反映DNA序列的多态性。与其它分子标记如RFLP、AFLP、ISSR等相比，SSR标记具有多态性高、共显性遗传、重复性好、特异性强等特点，近年来成为遗传多样性研究、遗传作图、重要功能基因定位、分子辅助育种等领域应用最多的一种标记。传统SSR标记的开发，一般使用文库筛选法、磁珠富集法以及利用NCBI中已有EST数据库信息挖掘等。其中，前两种方法费时费力、开发成本高，第三种方法又依赖于现有NCBI中EST数据，对于EST测序少的物种其应用很有限。
截止到2011年11月21日，在NCBI数据库中可以检索到的芒属植物EST序列仅有5条，难以满足开发EST-SSR标记的需要；而现有研究中，芒属植物分子标记开发只局限在利用磁珠法或建立文库挖掘，无法满足现今芒属植物研究需求，因此，通过转录组测序获得大量EST序列信息，利用生物信息学挖掘SSR标记成为了一种高效的技术手段。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种芒属植物Genic-SSR标记的制备方法，方法易行，操作简便，通过转录组测序获得EST序列，挖掘SSR位点信息、设计引物，构建芒属植物特异性Genic-SSR标记体系，为重要能源植物芒草的遗传学研究及分子改良等奠定基础。
本发明的另一个目的是在于提供了一种芒属植物Genic-SSR标记在芒属植物遗传多样性研究中的应用，由于Genic-SSR标记的数量多且稳定性好，分析结果准确可靠。
本发明通过以下技术方案实现：
一种芒属植物Genic-SSR标记的制备方法，其步骤是：
1)、芒属植物转录组序列的获得：
选取芒属植物五个种(芒、五节芒、荻、南荻、奇岗)的幼嫩叶片，分别提取总RNA，采用转录组测序方法(Illumina Solexa HiSeq2000)，得到转录组Reads，去除载体等RNA序列污染，利用拼接软件(如SOAP、iAssembler等)完成序列拼接，最终获得芒属植物五个种的非冗余Unigene-EST序列。所述的芒属植物为芒、五节芒、荻、南荻、奇岗其中的任意一种。
2)、芒属植物ESR序列中SSR位点的鉴定：
采用SSR检索软件(如：可选择SSR hunter、BatchPrimer3.0、MISA等)对上述步骤(1)得到的非冗余Unigene-EST序列进行SSR位点查找。检索的限定条件为：重复基序为2-6个碱基，且重复单元数依次大于6次，5次，4次，4次，3次；对于中间被≤50bp的间隔碱基打断的复合型SSR计为一个SSR位点，从而获得一系列含有SSR位点信息的Unigene序列(请见表1)。
表1测序产生的Unigene-EST统计信息
  种名(简写)   Unigene数目/条   设计引物总数/条   SSR总数/个
  南荻(LT)   64663   2347   3381
  荻(TS)   103114   2916   4463
  芒(MS)   97043   2576   3925
  五节芒(MF)   67323   2351   3425
  奇岗(MG)   70021   2153   3211
3)、芒属植物Genic-SSR引物的设计：
依据上述步骤(2)得到的含有SSR位点的Unigene序列，采用引物设计软件(Primer3.0、Primer Premier 5.0等)进行引物设计，获得一系列Genic-SSR引物(请见表1、表2)。引物设计参数主要包括：引物长度为18-25bp，退火温度为50-65℃，GC含量为45-65％，PCR扩增产物长度为90-300bp。
4)、芒属植物Genic-SSR引物的扩增与筛选：
选取用于转录组测序的五个材料，用于检测芒属植物Genic-SSR标记的扩增状况以及可转移性。选取五个材料的幼叶50-100mg置于2.0ml离心管中，液氮冷却后，用研磨棒迅速将样品碾磨成粉末状。基因组提取利用TIANGEN植物基因组DNA提取试剂盒(DP305-03)。利用1％(质量体积比)的琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的质量。
采用上述步骤(3)合成的引物，以五个材料的基因组DNA进行扩增，以检测引物设计的可靠性、扩增模式及其通用性。根据扩增结果，筛选可有效扩增的芒属Genic-SSR引物。依据扩增结果，筛选出可以稳定扩增的Genic SSR引物60对，具体见表2。
表2本发明中设计合成的芒属植物Genic-SSR引物序列
  引物名称  重复基序   上游引物(5’-3’)   下游引物(5’-3’)
  ms-It-1  (CGATGA)3   CACCAGTGTTGGATGCTGAC   TGTTGTCTAGCCTCCCGTCT
  ms-It-2  (GA)9   ACACTGTCCCAAATCCTTCC   AAGAAATCTCACTCCTCTCCCC
  ms-It-3  (CGTGCT)3   CTCACAGGACAAGAGAGGGG   GCATTCCAAAAGCATCCAGT
  ms-It-4  (GCT)5   TGGAGCTGTGATCCTCTTCC   CGGCTCAAAAACCACAAAAT
  ms-It-5  (GCA)5   TCCAATCTAACCTCGTTGCC   TGAGGTCTCGAACTGCAAAA
  ms-It-6  (AGG)5   CACCGTCGAGTAGGGTGG   CTGACGAGGGCACCAGAC
  ms-It-8  (GCTGGT)3   ACCGGGGTCAGGAAGTAGAA   TGTTCGTCTACAACGCCACT
  ms-It-9  (CTCCGC)3   CCAGCTTCTCCCACACCC   CACCGAAGAGCCCCTCTC
  ms-It-10  (GTACGA)3   CTTGCAGTGCCTCCGTATG   CCTCATCGTCGACTTCAACA
  ms-It-12  (AGAGAC)3   AGTGATGGAACTGCTGGAGG   CTTTGAGCGTCGATCCATTT
  ms-It-13  (CAG)6   TGATGGTGTTGGTGATTTGG   ATTTGCTGTTGCTGCTGTTG
  ms-It-18  (TCACTA)3   TGGCTCCCACTATCACTTCC   CTTGCTGCAACAGATGGAAA
  ms-It-19  (CCT)5   CATGGACTCGGATCAGGACT   CGAGGAGGAACTTGGTGGAT
  ms-It-20  (CT)15   GCAGGTTGCGATCCTAAGAC   GATCACCTGAAAAGGCAAGC
  ms-It-21  (CGCCA)4   CCAAGCTCTAAACAGGCTCG   GATGGGAGTTTACGTGGGG
  ms-It-23  (GCACCG)3   CAACCTCCTCTCCCTGATGA   AGACGGAGATGAATCGTTGG
  ms-It-24  (CGC)5   CATGGTTGAGTTCTACGCCC   AGAAGAGGATGGTGGGGAAG
  ms-It-26  (GAG)5   GGTCCATGACGAAGTCGAAG   CCCGGAGTTCTACTGCTACG
  ms-It-27  (GAGC)4   AAACATGCGTGCTTTGACTG   TTGCCTCTTTCGTGCTACCT
  ms-It-28  (CTG)5   ACCACCAAAACCAAACGAAG   TAGAGGGGAAGAAGGGGAAG
  ms-It-29  (CCTT)4   GGTCTAATCGCCCCGTAGAT   CCCTTTACTCCCGAGGAGAC
  mf-ts-1  (AG)7   CAGATGAGACCAGCAGTGGA   ACGCCAGTCAACCATCTCTT
  mf-ts-2  (AC)6   ACAGGGAGAGGGGAGAAGAA   TCCATCGTTTTCTGGTGTGA
  mf-ts-4  (CCGCCT)3   GTGCTCTTCCGCCTGAACTA   TCCTCCTCCTCACCATCATC
  mf-ts-5  (TCCGCG)4   CAAATGGTCGTCCCAAAGAC   AGAGGAAGAATGGGTGGGAG
  mf-ts-6  (GCGACG)3   ATGGCTACCACTCAGTTCGC   GTCGTCGTCCTCTTCAAGG
  mf-ts-9  (TGCATC)3   ACCGTCCATCCATCTGTAGC   GCTTCCTGGACGACTCTGTT
  mf-ts-10  (GAC)5   CTCGAGCGAGCTGTTCATTT   TGAAGATACCGTGGAGGAGG
  mf-ts-11  (CGA)5   CTTGTCCCTCTTCACCAAGC   CCTTTCTTCCAGTGGCTCAA
  mf-ts-13  (GAA)5   CCAGAGGGATAGGAGGAGGA   CACGTGTAGCAGGTCCTGAA
  mf-ts-14  (GCC)5   GCTCTCCGAGGTCGTGTC   CCTGTCTGAGGATGGTCCC
  mf-ts-15  (CTC)9   ACGTCCTTCTTTCTGCTGGA   CGTCTCTGCTCCTGGCTTTA
  mf-ts-16  (CGT)6   GGAACGGGGAAACCTCTG   TCTCTTCTCTTCTCCGTCGC
  mf-ts-17  (CGG)5   AAAGGGTACGGCACTGAGGT   GCAACGTGAACTCTGTCTGC
  mf-ts-18  (GC)6   GAGGGGATCTAGATGAGGGC   CCAGCTCGTTTCTTCCTCAG
  mf-ts-19  (GCA)5   CGTCTGCGACACAAGAACAT   ATGATGTTGCTGGCCTTGAT
  mf-ts-21  (CAC)5   GGACACCTACACGGTCACCT   CTGCTGGCTGGTGGTGTT
  mf-ts-22  (CGC)5   CATGGTTGAGTTCTACGCCC   AGAAGAGGATGGTGGGGAAG
  mf-ts-23  (TCTTCA)3   CGCACAAAAGAATGCATCAC   GGAACGCCACTTTCTAGCAC
  mf-ts-24  (GGA)5   ACCAGCACCGTCATCATCAG   GAACAGGTTGCCGGTGTATC
  mf-ts-25  (CTC)5   CTACGACCGCTGCTGCTAGT   TCTCCATACTGCTCTGGGCT
  mf-ts-28  (CGG)5   TTCCGATCTCAAGGACCAAC   AACCCTCCTGTCCATGATGA
  mf-ts-29  (CTCTTC)3   CTGCAAGTTTCTTTGCCCTC   TCTGAAAAGTGGTGGTGTGC
  mg-1  (AG)8   ATCAGAGAGAGGCACCTGGA   GAGTGAGGAGATGACCCGAC
  mg-2  (AC)10   AGAAACGTGAAACCTGCTGAA   AAGCTGACAGCACAACAACG
  mg-5  (CTCATC)4   GGCGGATAATCAGCAAGTGT   GAAGAGTGGCTGGGTTGAAG
  mg-6  (GGC)5   GGAGAGTGAGAGCAGGGTTG   GTTGCCACAAATCTGGCTG
  mg-7  (CCTGAA)3   ACCAAGACCAAATCTGCCAC   ACACAGCTACATCGGGTTCC
  mg-8  (CA)6   AACTCTTTTACAACGTCAATTTGC   CAGCCTTTGGTTAGAGCACC
  mg-17  (AG)6   AATAGGAGGCTGGCTGGTTT   GCAATTTGCTCCTGCACATA
  mg-18  (AG)13   GCAGCAGAGAGGAGAGGAGA   CCCGTCGTGTTGATGTACTG
  mg-19  (GTGGCA)3   TCTCCTCCAGGTTCACCATC   AGGTGCAAATCATCTACCGC
  mg-21  (CTG)6   ACAGGAACGGAGGAACTTGA   GATACGCCGTCGCTGAAG
  mg-22  (TG)7   GATCGCTCCTTCCATTGTGT   AATCTCAAGTCCTCCTCCCC
  mg-23  (TCA)6   TGAGATTCCTCCCTCCATTG   GCGCTCTACTCCAGGAAAAA
  mg-25  (ATA)6   GCCCCTCAGATGGTTGAATA   TGTGGTACATCTCCCTGCAA
  mg-26  (CCT)5   GTCACTCTCCCCTCCCATTC   TGCACCCTTTACGAACTCCT
  mg-27   (TA)6   CCATGGCTAAGCCTCACTTC   GCGCACACACACACACTACT
  mg-29   (GGCGCG)3   AGCGTAAGAGGGAGGATGGT   GGAGCTCCTCCTCGGTGT
  mg-30   (GGC)7   TTGACGGTGACGATGAGGTA   TCAAATCTCATCAGTTCCCAAA
一种芒属植物Genic-SSR标记在芒属植物遗传多样性分析中的应用，其步骤是：
1)、实验材料：
选取芒属及河八王属共17份材料，用于检测芒属植物Genic-SSR标记在芒属植物遗传多样性分析中的有效性，具体材料信息，详见表3。
表3本发明中用于进行引物筛选及遗传多样性分析的材料信息
  材料编号   属-种/品种名   材料来源   种类信息
  1   芒属-芒   湖北省鄂州市长岭镇   野生种
  2   芒属-芒   湖北省鄂州市长岭镇   野生种
  3   芒属-细叶芒   武汉大学种质资源圃   栽培种
  4   芒属-斑叶芒   武汉大学种质资源圃   栽培种
  5   芒属-晨光芒   武汉大学种质资源圃   栽培种
  6   芒属-花叶芒   武汉大学种质资源圃   栽培种
  7   芒属-五节芒   湖北省鄂州市梁子岛   野生种
  8   芒属-五节芒   湖北省鄂州市梁子岛   野生种
  9   芒属-芒   湖北省鄂州市梁子岛   野生种
  10   芒属-芒   湖北省鄂州市梁子岛   野生种
  11   芒属-荻   湖北省鄂州市长岭镇   野生种
  12   芒属-荻   湖北省鄂州市梁子岛   野生种
  13   芒属-南荻   湖南省岳阳市洞庭湖   野生种
  14   芒属-南荻   湖北省郧县   野生种
  15   芒属-奇岗   武汉大学种质资源圃北京来源   栽培种
  16   芒属-奇岗   武汉大学种质资源圃南京来源   栽培种
  17   河八王属-河八王   湖北省鄂州市长岭镇   野生种
2)、基因组提取：
每份材料选取幼嫩叶片约50-100mg置于2.0ml离心管中，液氮冷却后，用研磨棒迅速碾磨，反复冷却碾磨直至成粉末。利用TIANGEN植物基因组DNA提取试剂盒提取基因组。利用1％(质量体积比)的琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的质量。
3)、Genic-SSR引物扩增：
利用实施例1中筛选的Genic-SSR引物，扩增上述步骤(2)获得的基因组DNA。采用扩增体系如下：
15ul扩增体系中含有：1x PCR buffer、MgCl21.6mmol/L，dNTPs(鼎国)100pmol/L，正反向引物0.5umol/L，基因组模板DNA50ng及Taq DNA聚合酶(鼎国)0.5U。
在bio-RAD热循环仪上(America)进行扩增，PCR扩增程序为：
a、94℃预变性4min；
b、94℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸45s；
c、72℃延伸6min；
d、16min，5min。
扩增得到的PCR产物直接加入6X loading buffer 10ul，置于热循环仪95℃变性5min，冰浴5min，于6％(质量体积比)聚丙烯酰胺变性凝胶电泳，电泳参数为3000v、60mA、68W恒功率电泳40min，采用银染方法显色，拍照记录结果。图1为引物mf-ts-9、mf-ts-10扩增结果。
在17份供试材料中，60对Genic-SSR共扩增了245个位点，平均每对引物4.1个位点。并且大多数SSR引物在不同种属间均可以有效扩增，可转移率71％-100％，平均可转移率为97.5％，说明Genic-SSR在芒属及其近缘属中具有很高的通用性，可用于进一步的多样性分析。
4)、Genic-SSR引物扩增结果统计及遗传多样性分析：
根据实施例1中的步骤(3)扩增结果，按照扩增条带有带计为1，无带计为0，得到一个0、1二元矩阵，将其输入NTSYS-pc软件处理分析，以SIMQUAL子程序计算样本间的Jaccard相似系数，然后基于相似系数矩阵，利用SHAN子程序UPGMA算法进行聚类分析。聚类分析结果见图2。
以UPGMA算法对供试材料进行聚类分析，结果表明河八王与其他芒属植物的遗传距离最大(cofficient＝0.71)，说明Genic-SSR可以明确区分芒属及河八王属；另外，芒属的各个种并没有明显的聚类为一个亚群，如：材料11-荻与芒聚为一个分支，材料12-荻与材料13-南荻聚为一个分支，说明在芒属内各个种间具有丰富的多样性以及遗传上的相似性。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
方法简单，效率高，操作简便，获得的标记数量巨大，本发明得到的Genic-SSR标记比AFLP、SRAP、ISSR等标记更加稳定可靠。通过转录组测序获得EST序列，挖掘SSR位点信息、设计引物，构建芒属植物特异性Genic-SSR标记体系，为重要能源植物芒草的遗传学研究及分子改良等奠定基础。
附图说明
图1为一种引物mf-ts-9(左)和mf-ts-10(右)对17份材料的扩增情况，M为pBR322maker。
本发明中的引物mf-ts-9和mf-ts-10对17份材料的扩增情况。
图2为一种引物分析芒属及河八王属17份材料的相似系数聚类图。
本发明的引物分析芒属及河八王属17份材料的相似系数聚类图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细描述。
实施例1：
本实施例为芒属植物Genic-SSR标记的制备及筛选方法，主要包括以下主要步骤：
1、芒属植物EST序列的获得：
选取芒属植物五个种(芒、五节芒、荻、南荻、奇岗)的幼嫩叶片，提取总RNA，采用标准的Solexa测序方法，获到转录组Reads，采用Repeat Masker去除载体等RNA序列污染，利用SOAP拼接软件完成序列拼接，最终获得五套芒属植物的非冗余Unigene-EST序列，详见表1。
表1测序产生的Unigene-EST统计信息
  种名(简写)   Unigene数目/条   设计引物总数/条   SSR总数/个
  南荻(LT)   64663   2347   3381
  荻(TS)   103114   2916   4463
  芒(MS)   97043   2576   3925
  五节芒(MF)   67323   2351   3425
  奇岗(MG)   70021   2153   3211
2、芒属植物EST序列中SSR位点的筛选：
采用微卫星搜索软件MISA，对上述步骤(1)得到的五套非冗余Unigene-EST序列进行SSR位点检索，检索限制条件包括：引物长度为18-25bp，退火温度为50-65℃，GC含量为45-65％，PCR扩增产物长度为90-300bp；检索得到一系列Genic-SSR位点，见表1。
3、芒属植物Genic-SSR引物的设计与合成：
依据上述步骤(2)得到的Genic-SSR，利用EMBOSS软件，预测芒与南荻、五节芒与荻共有的引物，结合Unigene-EST侧翼区域序列，应用Primer3.0软件进行引物设计，引物设计的主要参数包括：GC含量45-65％，Tm值45-65℃，引物长度18-25bp，预期扩增产物长度90-300bp。最后随机选取芒与南荻共有、五节芒与荻共有、奇岗的各30对(共90对)引物进行合成。
4、芒属植物Genic-SSR引物的扩增与筛选：
选取用于转录组测序的五个材料，用于检测芒属植物Genic-SSR标记的扩增状况以及可转移性。选取五个材料的幼叶50-100mg置于2.0ml离心管中，液氮冷却后，用研磨棒迅速将样品碾磨成粉末状。基因组提取利用TIANGEN植物基因组DNA提取试剂盒(DP305-03)。利用1％(质量体积比)的琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的质量。
采用上述步骤(3)合成的引物，以五个材料的基因组DNA进行扩增，以检测引物设计的可靠性、扩增模式及其通用性。根据扩增结果，筛选可有效扩增的芒属Genic-SSR引物。
本实例中，对各材料基因组DNA进行PCR扩增时，采用下述扩增体系：
15ul扩增体系中含有：1x PCR buffer、MgCl21.6mmol/L，dNTPs(鼎国)100pmol/L，正反向引物0.5umol/L，基因组模板DNA50ng及Taq DNA聚合酶(鼎国)0.5U。
在bio-RAD热循环仪上(America)进行扩增，PCR扩增程序为：
a、94℃预变性4min；
b、94℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸45s；
c、72℃延伸6min；
d、16min，5min。
PCR扩增反应完成后，直接向PCR产物中加入6×loading buffer 10ul混匀，置于热循环仪95℃变性5min，冰浴5min，于8％(质量体积比)变性聚丙烯酰胺凝胶检测，电泳参数为3000v、60mA、68W恒功率电泳40min，采用银染方法显色，拍照记录结果。依据扩增结果，筛选出可以稳定扩增的Genic-SSR引物60对，具体见表2。
表2本发明中设计合成的芒属植物Genic-SSR引物序列
  引物名称  重复基序   上游引物(5’-3’)   下游引物(5’-3’)
  ms-It-1  (CGATGA)3   CACCAGTGTTGGATGCTGAC   TGTTGTCTAGCCTCCCGTCT
  ms-It-2  (GA)9   ACACTGTCCCAAATCCTTCC   AAGAAATCTCACTCCTCTCCCC
  ms-It-3  (CGTGCT)3   CTCACAGGACAAGAGAGGGG   GCATTCCAAAAGCATCCAGT
  ms-It-4  (GCT)5   TGGAGCTGTGATCCTCTTCC   CGGCTCAAAAACCACAAAAT
  ms-It-5  (GCA)5   TCCAATCTAACCTCGTTGCC   TGAGGTCTCGAACTGCAAAA
  ms-It-6  (AGG)5   CACCGTCGAGTAGGGTGG   CTGACGAGGGCACCAGAC
  ms-It-8  (GCTGGT)3   ACCGGGGTCAGGAAGTAGAA   TGTTCGTCTACAACGCCACT
  ms-It-9  (CTCCGC)3   CCAGCTTCTCCCACACCC   CACCGAAGAGCCCCTCTC
  ms-It-10  (GTACGA)3   CTTGCAGTGCCTCCGTATG   CCTCATCGTCGACTTCAACA
  ms-It-12  (AGAGAC)3   AGTGATGGAACTGCTGGAGG   CTTTGAGCGTCGATCCATTT
  ms-It-13  (CAG)6   TGATGGTGTTGGTGATTTGG   ATTTGCTGTTGCTGCTGTTG
  ms-It-18  (TCACTA)3   TGGCTCCCACTATCACTTCC   CTTGCTGCAACAGATGGAAA
  ms-It-19  (CCT)5   CATGGACTCGGATCAGGACT   CGAGGAGGAACTTGGTGGAT
  ms-It-20  (CT)15   GCAGGTTGCGATCCTAAGAC   GATCACCTGAAAAGGCAAGC
  ms-It-21  (CGCCA)4   CCAAGCTCTAAACAGGCTCG   GATGGGAGTTTACGTGGGG
  ms-It-23  (GCACCG)3   CAACCTCCTCTCCCTGATGA   AGACGGAGATGAATCGTTGG
  ms-It-24  (CGC)5   CATGGTTGAGTTCTACGCCC   AGAAGAGGATGGTGGGGAAG
  ms-It-26  (GAG)5   GGTCCATGACGAAGTCGAAG   CCCGGAGTTCTACTGCTACG
  ms-It-27  (GAGC)4   AAACATGCGTGCTTTGACTG   TTGCCTCTTTCGTGCTACCT
  ms-It-28  (CTG)5   ACCACCAAAACCAAACGAAG   TAGAGGGGAAGAAGGGGAAG
  ms-It-29  (CCTT)4   GGTCTAATCGCCCCGTAGAT   CCCTTTACTCCCGAGGAGAC
  mf-ts-1  (AG)7   CAGATGAGACCAGCAGTGGA   ACGCCAGTCAACCATCTCTT
  mf-ts-2  (AC)6   ACAGGGAGAGGGGAGAAGAA   TCCATCGTTTTCTGGTGTGA
  mf-ts-4  (CCGCCT)3   GTGCTCTTCCGCCTGAACTA   TCCTCCTCCTCACCATCATC
  mf-ts-5  (TCCGCG)4   CAAATGGTCGTCCCAAAGAC   AGAGGAAGAATGGGTGGGAG
  mf-ts-6  (GCGACG)3   ATGGCTACCACTCAGTTCGC   GTCGTCGTCCTCTTCAAGG
  mf-ts-9  (TGCATC)3   ACCGTCCATCCATCTGTAGC   GCTTCCTGGACGACTCTGTT
  mf-ts-10  (GAC)5   CTCGAGCGAGCTGTTCATTT   TGAAGATACCGTGGAGGAGG
  mf-ts-11  (CGA)5   CTTGTCCCTCTTCACCAAGC   CCTTTCTTCCAGTGGCTCAA
  mf-ts-13  (GAA)5   CCAGAGGGATAGGAGGAGGA   CACGTGTAGCAGGTCCTGAA
  mf-ts-14  (GCC)5   GCTCTCCGAGGTCGTGTC   CCTGTCTGAGGATGGTCCC
  mf-ts-15  (CTC)9   ACGTCCTTCTTTCTGCTGGA   CGTCTCTGCTCCTGGCTTTA
  mf-ts-16  (CGT)6   GGAACGGGGAAACCTCTG   TCTCTTCTCTTCTCCGTCGC
  mf-ts-17  (CGG)5   AAAGGGTACGGCACTGAGGT   GCAACGTGAACTCTGTCTGC
  mf-ts-18  (GC)6   GAGGGGATCTAGATGAGGGC   CCAGCTCGTTTCTTCCTCAG
  mf-ts-19  (GCA)5   CGTCTGCGACACAAGAACAT   ATGATGTTGCTGGCCTTGAT
  mf-ts-21  (CAC)5   GGACACCTACACGGTCACCT   CTGCTGGCTGGTGGTGTT
  mf-ts-22  (CGC)5   CATGGTTGAGTTCTACGCCC   AGAAGAGGATGGTGGGGAAG
  mf-ts-23  (TCTTCA)3   CGCACAAAAGAATGCATCAC   GGAACGCCACTTTCTAGCAC
  mf-ts-24  (GGA)5   ACCAGCACCGTCATCATCAG   GAACAGGTTGCCGGTGTATC
  mf-ts-25  (CTC)5   CTACGACCGCTGCTGCTAGT   TCTCCATACTGCTCTGGGCT
  mf-ts-28  (CGG)5   TTCCGATCTCAAGGACCAAC   AACCCTCCTGTCCATGATGA
  mf-ts-29  (CTCTTC)3   CTGCAAGTTTCTTTGCCCTC   TCTGAAAAGTGGTGGTGTGC
  mg-1  (AG)8   ATCAGAGAGAGGCACCTGGA   GAGTGAGGAGATGACCCGAC
  mg-2  (AC)10   AGAAACGTGAAACCTGCTGAA   AAGCTGACAGCACAACAACG
  mg-5  (CTCATC)4   GGCGGATAATCAGCAAGTGT   GAAGAGTGGCTGGGTTGAAG
  mg-6  (GGC)5   GGAGAGTGAGAGCAGGGTTG   GTTGCCACAAATCTGGCTG
  mg-7  (CCTGAA)3   ACCAAGACCAAATCTGCCAC   ACACAGCTACATCGGGTTCC
  mg-8  (CA)6   AACTCTTTTACAACGTCAATTTGC   CAGCCTTTGGTTAGAGCACC
  mg-17  (AG)6   AATAGGAGGCTGGCTGGTTT   GCAATTTGCTCCTGCACATA
  mg-18  (AG)13   GCAGCAGAGAGGAGAGGAGA   CCCGTCGTGTTGATGTACTG
  mg-19  (GTGGCA)3   TCTCCTCCAGGTTCACCATC   AGGTGCAAATCATCTACCGC
  mg-21  (CTG)6   ACAGGAACGGAGGAACTTGA   GATACGCCGTCGCTGAAG
  mg-22  (TG)7   GATCGCTCCTTCCATTGTGT   AATCTCAAGTCCTCCTCCCC
  mg-23  (TCA)6   TGAGATTCCTCCCTCCATTG   GCGCTCTACTCCAGGAAAAA
  mg-25   (ATA)6   GCCCCTCAGATGGTTGAATA   TGTGGTACATCTCCCTGCAA
  mg-26   (CCT)5   GTCACTCTCCCCTCCCATTC   TGCACCCTTTACGAACTCCT
  mg-27   (TA)6   CCATGGCTAAGCCTCACTTC   GCGCACACACACACACTACT
  mg-29   (GGCGCG)3   AGCGTAAGAGGGAGGATGGT   GGAGCTCCTCCTCGGTGT
  mg-30   (GGC)7   TTGACGGTGACGATGAGGTA   TCAAATCTCATCAGTTCCCAAA
实施例2：
一种芒属植物Genic-SSR标记在芒属植物遗传多样性分析中的应用，其步骤是：
1、实验材料：
选取芒属及河八王属共17份材料，用于检测芒属植物Genic-SSR标记在芒属植物遗传多样性分析中的有效性，具体材料信息，详见表3。
表3本发明中用于进行引物筛选及遗传多样性分析的材料信息
  材料编号   属-种/品种名   材料来源   种类信息
  1   芒属-芒   湖北省鄂州市长岭镇   野生种
  2   芒属-芒   湖北省鄂州市长岭镇   野生种
  3   芒属-细叶芒   武汉大学种质资源圃   栽培种
  4   芒属-斑叶芒   武汉大学种质资源圃   栽培种
  5   芒属-晨光芒   武汉大学种质资源圃   栽培种
  6   芒属-花叶芒   武汉大学种质资源圃   栽培种
  7   芒属-五节芒   湖北省鄂州市梁子岛   野生种
  8   芒属-五节芒   湖北省鄂州市梁子岛   野生种
  9   芒属-芒   湖北省鄂州市梁子岛   野生种
  10   芒属-芒   湖北省鄂州市梁子岛   野生种
  11   芒属-荻   湖北省鄂州市长岭镇   野生种
  12   芒属-荻   湖北省鄂州市梁子岛   野生种
  13   芒属-南荻   湖南省岳阳市洞庭湖   野生种
  14   芒属-南荻   湖北省郧县   野生种
  15   芒属-奇岗   武汉大学种质资源圃北京来源   栽培种
  16   芒属-奇岗   武汉大学种质资源圃南京来源   栽培种
  17   河八王属-河八王   湖北省鄂州市长岭镇   野生种
2、基因组提取：
每份材料选取幼嫩叶片约50-100mg置于2.0ml离心管中，液氮冷却后，用研磨棒迅速碾磨，反复冷却碾磨直至成粉末。利用TIANGEN植物基因组DNA提取试剂盒提取基因组。利用1％(质量体积比)的琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的质量。
3、Genic-SSR引物扩增：
利用实施例1中筛选的Genic-SSR引物，扩增上述步骤(2)获得的基因组DNA。采用扩增体系如下：
15ul扩增体系中含有：1x PCR buffer、MgCl21.6mmol/L，dNTPs(鼎国)100pmol/L，正反向引物0.5umol/L，基因组模板DNA50ng及Taq DNA聚合酶(鼎国)0.5U。
在bio-RAD热循环仪上(America)进行扩增，PCR扩增程序为：
a、94℃预变性4min；
b、94℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸45s；
c、72℃延伸6min；
d、16min，5min。
扩增得到的PCR产物直接加入6Xloading buffer 10ul，置于热循环仪95℃变性5min，冰浴5min，于6％(质量体积比)聚丙烯酰胺变性凝胶电泳，电泳参数为3000v、60mA、68W恒功率电泳40min，采用银染方法显色，拍照记录结果。图1为引物mf-ts-9、mf-ts-10扩增结果。
在17份供试材料中，60对Genic-SSR共扩增了245个位点，平均每对引物4.1个位点。并且大多数SSR引物在不同种属间均可以有效扩增，可转移率71％-100％，平均可转移率为97.5％，说明Genic-SSR在芒属及其近缘属中具有很高的通用性，可用于进一步的多样性分析。
4、Genic-SSR引物扩增结果统计及遗传多样性分析：
根据实施例1中的步骤(3)扩增结果，按照扩增条带有带计为1，无带计为0，得到一个0、1二元矩阵，将其输入NTSYS-pc软件处理分析，以SIMQUAL子程序计算样本间的Jaccard相似系数，然后基于相似系数矩阵，利用SHAN子程序UPGMA算法进行聚类分析。聚类分析结果见图2。
以UPGMA算法对供试材料进行聚类分析，结果表明河八王与其他芒属植物的遗传距离最大(cofficient＝0.71)，说明Genic-SSR可以明确区分芒属及河八王属；另外，芒属的各个种并没有明显的聚类为一个亚群，如：材料11-荻与芒聚为一个分支，材料12-荻与材料13-南荻聚为一个分支，说明在芒属内各个种间具有丰富的多样性以及遗传上的相似性。

Claims (2)

1.一种芒属植物Genic-SSR标记的制备方法，其步骤是：
1）、芒属植物转录组序列的获得：
选取芒属植物的幼嫩叶片，分别提取总RNA，采用转录组测序方法，得到转录组Reads，去除载体RNA序列污染，利用拼接软件完成序列拼接，最终获得芒属植物五个种的非冗余Unigene-EST序列；
2）、芒属植物EST序列中SSR位点的鉴定：
采用SSR检索软件对上述步骤（1）得到的非冗余Unigene-EST序列进行SSR位点查找，检索的限定条件为：重复基序为2-6个碱基，且重复单元数依次大于6次，5次，4次，4次，3次；对于中间被≤50bp的间隔碱基打断的复合型SSR计为一个SSR位点，获得一系列含有SSR位点信息的Unigene序列；
3）、芒属植物Genic-SSR引物的设计：
依据上述步骤（2）得到的含有SSR位点的Unigene序列，采用引物设计软件进行引物设计，获得一系列Genic-SSR引物，引物设计参数主要包括：引物长度为18-25bp，退火温度为50-65℃，GC含量为45-65%，PCR扩增产物长度为90-300bp；
4）、芒属植物Genic-SSR引物的扩增与筛选：
选取用于转录组测序的五个材料，用于检测芒属植物Genic-SSR标记的扩增状况以及可转移性；选取五个材料的幼叶50-100mg置于2.0ml离心管中，液氮冷却后，用研磨棒迅速将样品碾磨成粉末状，基因组提取利用TIANGEN植物基因组DNA提取试剂盒，利用1%质量体积比的琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的质量；
采用上述步骤（3）合成的引物，以五个材料的基因组DNA进行扩增，以检测引物设计的可靠性、扩增模式及其通用性；根据扩增结果，筛选可有效扩增的芒属Genic-SSR引物；依据扩增结果，筛选出可以稳定扩增的Genic-SSR引物60对，具体如下：
ms-lt-1
F:CACCAGTGTTGGATGCTGAC
R:TGTTGTCTAGCCTCCCGTCT
ms-lt-2
F:ACACTGTCCCAAATCCTTCC
R:AAGAAATCTCACTCCTCTCCCC
ms-lt-3
F:CTCACAGGACAAGAGAGGGG
R:GCATTCCAAAAGCATCCAGT
ms-lt-4
F:TGGAGCTGTGATCCTCTTCC
R:CGGCTCAAAAACCACAAAAT
ms-lt-5
F:TCCAATCTAACCTCGTTGCC
R:TGAGGTCTCGAACTGCAAAA
ms-lt-6
F:CACCGTCGAGTAGGGTGG
R:CTGACGAGGGCACCAGAC
ms-lt-8
F:ACCGGGGTCAGGAAGTAGAA
R:TGTTCGTCTACAACGCCACT
ms-lt-9
F:CCAGCTTCTCCCACACCC
R:CACCGAAGAGCCCCTCTC
ms-lt-10
F:CTTGCAGTGCCTCCGTATG
R:CCTCATCGTCGACTTCAACA
ms-lt-12
F:AGTGATGGAACTGCTGGAGG
R:CTTTGAGCGTCGATCCATTT
ms-lt-13
F:TGATGGTGTTGGTGATTTGG
R:ATTTGCTGTTGCTGCTGTTG
ms-lt-18
F:TGGCTCCCACTATCACTTCC
R:CTTGCTGCAACAGATGGAAA
ms-lt-19
F:CATGGACTCGGATCAGGACT
R:CGAGGAGGAACTTGGTGGAT
ms-lt-20
F:GCAGGTTGCGATCCTAAGAC
R:GATCACCTGAAAAGGCAAGC
ms-lt-21
F:CCAAGCTCTAAACAGGCTCG
R:GATGGGAGTTTACGTGGGG
ms-lt-23
F:CAACCTCCTCTCCCTGATGA
R:AGACGGAGATGAATCGTTGG
ms-lt-24
F:CATGGTTGAGTTCTACGCCC
R:AGAAGAGGATGGTGGGGAAG
ms-lt-26
F:GGTCCATGACGAAGTCGAAG
R:CCCGGAGTTCTACTGCTACG
ms-lt-27
F:AAACATGCGTGCTTTGACTG
R:TTGCCTCTTTCGTGCTACCT
ms-lt-28
F:ACCACCAAAACCAAACGAAG
R:TAGAGGGGAAGAAGGGGAAG
ms-lt-29
F:GGTCTAATCGCCCCGTAGAT
R:CCCTTTACTCCCGAGGAGAC
mf-ts-1
F:CAGATGAGACCAGCAGTGGA
R:ACGCCAGTCAACCATCTCTT
mf-ts-2
F:ACAGGGAGAGGGGAGAAGAA
R:TCCATCGTTTTCTGGTGTGA
mf-ts-4
F:GTGCTCTTCCGCCTGAACTA
R:TCCTCCTCCTCACCATCATC
mf-ts-5
F:CAAATGGTCGTCCCAAAGAC
R:AGAGGAAGAATGGGTGGGAG
mf-ts-6
F:ATGGCTACCACTCAGTTCGC
R:GTCGTCGTCCTCTTCAAGG
mf-ts-9
F:ACCGTCCATCCATCTGTAGC
R:GCTTCCTGGACGACTCTGTT
mf-ts-10
F:CTCGAGCGAGCTGTTCATTT
R:TGAAGATACCGTGGAGGAGG
mf-ts-11
F:CTTGTCCCTCTTCACCAAGC
R:CCTTTCTTCCAGTGGCTCAA
mf-ts-13
F:CCAGAGGGATAGGAGGAGGA
R:CACGTGTAGCAGGTCCTGAA
mf-ts-14
F:GCTCTCCGAGGTCGTGTC
R:CCTGTCTGAGGATGGTCCC
mf-ts-15
F:ACGTCCTTCTTTCTGCTGGA
R:CGTCTCTGCTCCTGGCTTTA
mf-ts-16
F:GGAACGGGGAAACCTCTG
R:TCTCTTCTCTTCTCCGTCGC
mf-ts-17
F:AAAGGGTACGGCACTGAGGT
R:GCAACGTGAACTCTGTCTGC
mf-ts-18
F:GAGGGGATCTAGATGAGGGC
R:CCAGCTCGTTTCTTCCTCAG
mf-ts-19
F:CGTCTGCGACACAAGAACAT
R:ATGATGTTGCTGGCCTTGAT
mf-ts-21
F:GGACACCTACACGGTCACCT
R:CTGCTGGCTGGTGGTGTT
mf-ts-22
F:CATGGTTGAGTTCTACGCCC
R:AGAAGAGGATGGTGGGGAAG
mf-ts-23
F:CGCACAAAAGAATGCATCAC
R:GGAACGCCACTTTCTAGCAC
mf-ts-24
F:ACCAGCACCGTCATCATCAG
R:GAACAGGTTGCCGGTGTATC
mf-ts-25
F:CTACGACCGCTGCTGCTAGT
R:TCTCCATACTGCTCTGGGCT
mf-ts-28
F:TTCCGATCTCAAGGACCAAC
R:AACCCTCCTGTCCATGATGA
mf-ts-29
F:CTGCAAGTTTCTTTGCCCTC
R:TCTGAAAAGTGGTGGTGTGC
mg-1
F:ATCAGAGAGAGGCACCTGGA
R:GAGTGAGGAGATGACCCGAC
mg-2
F:AGAAACGTGAAACCTGCTGAA
R:AAGCTGACAGCACAACAACG
mg-5
F:GGCGGATAATCAGCAAGTGT
R:GAAGAGTGGCTGGGTTGAAG
mg-6
F:GGAGAGTGAGAGCAGGGTTG
R:GTTGCCACAAATCTGGCTG
mg-7
F:ACCAAGACCAAATCTGCCAC
R:ACACAGCTACATCGGGTTCC
mg-8
F:AACTCTTTTACAACGTCAATTTGC
R:CAGCCTTTGGTTAGAGCACC
mg-17
F:AATAGGAGGCTGGCTGGTTT
R:GCAATTTGCTCCTGCACATA
mg-18
F:GCAGCAGAGAGGAGAGGAGA
R:CCCGTCGTGTTGATGTACTG
mg-19
F:TCTCCTCCAGGTTCACCATC
R:AGGTGCAAATCATCTACCGC
mg-21
F:ACAGGAACGGAGGAACTTGA
R:GATACGCCGTCGCTGAAG
mg-22
F:GATCGCTCCTTCCATTGTGT
R:AATCTCAAGTCCTCCTCCCC
mg-23
F:TGAGATTCCTCCCTCCATTG
R:GCGCTCTACTCCAGGAAAAA
mg-25
F:GCCCCTCAGATGGTTGAATA
R:TGTGGTACATCTCCCTGCAA
mg-26
F:GTCACTCTCCCCTCCCATTC
R:TGCACCCTTTACGAACTCCT
mg-27
F:CCATGGCTAAGCCTCACTTC
R:GCGCACACACACACACTACT
mg-29
F:AGCGTAAGAGGGAGGATGGT
R:GGAGCTCCTCCTCGGTGT
mg-30
F:TTGACGGTGACGATGAGGTA
R:TCAAATCTCATCAGTTCCCAAA
所述的芒属植物为芒、五节芒、荻、南荻和奇岗。
2.权利要求1所述的60对芒属植物Genic-SSR引物在芒属植物遗传多样性分析中的应用；所述的芒属植物为芒、五节芒、荻、南荻、奇岗。
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