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CN102421793A - 具有延迟开花期或抑制生长功能的多肽，编码所述多肽的多核苷酸及其用途 - Google Patents

具有延迟开花期或抑制生长功能的多肽，编码所述多肽的多核苷酸及其用途 Download PDF

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CN102421793A
CN102421793A CN2010800178038A CN201080017803A CN102421793A CN 102421793 A CN102421793 A CN 102421793A CN 2010800178038 A CN2010800178038 A CN 2010800178038A CN 201080017803 A CN201080017803 A CN 201080017803A CN 102421793 A CN102421793 A CN 102421793A
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CN
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polypeptide
seq
plant
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nucleotide sequence
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CN2010800178038A
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南洪基
朴景睦
李东熙
金正植
林平玉
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POSTECH Academy Industry Foundation
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POSTECH Academy Industry Foundation
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Abstract

本发明涉及一种具有延迟开花和/或抑制生长功能的多肽，编码所述多肽的多核苷酸及其用途。具体地讲，本发明涉及一种具有延迟开花和/或抑制生长功能的多肽，编码上述多肽的多核苷酸，一种用于生产具有延迟开花表型的植物的方法，一种用于生产具有生长受抑制的表型的植物的方法，一种选择的转基因植物，一种用于筛选能延迟植物开花或抑制生长的材料的方法。

Description

具有延迟开花期或抑制生长功能的多肽,编码所述多肽的多核苷酸及其用途
技术领域
本发明涉及一种调控赤霉素信号传导途径，能够延迟开花时间，并且抑制植物生长的多肽，编码所述多肽的多核苷酸及其用途。
背景技术
赤霉素，植物中存在的多种激素之一，最初是从真菌菌株藤仓赤霉菌(Gibberellafujikuroi)，一种导致水稻backanae病的病原体中分离的。
在植物中，赤霉素(GA)与植物生长素相互作用，促进幼茎组织伸长，激活种子中的α-淀粉酶以便促进发芽，并且参与打破休眠。另外，GA可用于控制开花时间。例如，在用GA处理时，可诱导需要低温或光周期的植物形成花蕾。具体地讲，即使植物没有授粉，GA仍能促进坐果和果实生长。因此，在农业和花卉栽培中，GA被应用于各种植物，表现出多种效果，包括，例如，对于秋大麦、桃、梨、苹果和葡萄，可取代低温作用而诱导开花，对于菊科植物，可诱导花蕾形成，诱导夏菊、仙客来和樱草开花，诱导菠菜和烟草发芽，打破茄子、牛蒡、萝卜和油菜的冬眠，以及生物合成淀粉酶，用于生产啤酒和麦芽。另外，在用GA的生物合成抑制剂ancyumidol(A-Rest)或多效唑(Bonzi)处理时，植物会变小和变坚固，因此，它们不容易被风暴吹落。
最近，人们一直致力于在分子水平上研究GA的生理学现象。在这种研究的早期阶段，分析了会导致绿色进化的矮化变体(降低高度的(rth)，dwarf-1(dl)，anther ear1(An1)-玉米；半矮生(sd-1)，Dwarf1，dl-qu；ls，le，na-菜豆)，或过渡生长的突变体(la cry3-菜豆；procera(pro)-番茄；slender(sln)-大麦；SLN-菜豆)，以便加深有关植物对GA应答的研究。2000年之后，随着这些基因被克隆(rth(Peng et al.，1999，Nature 400：256-261)，dl(Spray et al.，1996，PNAS 93：10515-10518)，an1(Bensen et al.，4995，Plant Cell 7：75-84)，sd-1(Sasaki et al.，2002，Nature 416：701-702)，dwarf1(Ashikari et al.，1999，PNAS 67：11638-11643)，el(Lester ea al，1997，Pl ant Cell 9：1435-1443)，na(Davidson et al，2003，PlantPhysiol.131：335-344))，参与GA合成、识别和应答的基因开始被探明。这些研究通过分子学以及遗传学的方法在作为模型的拟南芥上被进一步的系统性展开。
特别是，大量筛选突变体对GA的应答(具有低GA应答的矮化突变体、用GA处理时恢复成野生型的突变体、具有组成型GA应答的细长突变体)导致了参与GA合成的基因的发现(GA1，GA4，GA5等)，参与GA的信号传导途径的基因的发现(杂合三聚体G蛋白，GAI，RGA，SPY，SLY等)以及参与GA应答的基因的发现(GA-MYB，α-淀粉酶)。另外，最近在水稻中发现的GA激素受体(GID1：Uefuchi-Tanaka et al.，2005，Nature 437：693-698)，极大促进了对GA分子机理的理解。目前，人们继续致力于揭示这些基因之间的相互关系，以便GA信号传导途径可以在分子水平上被综合性和系统性地理解(Schwechheimer et al.，2008Curr.Opin.Plant Biol.，10：461-465)。
另外，已知GA在开花控制方面起着重要作用。拟南芥的开花时间是通过诸如光照、温度、光周期等的外部信号和诸如养分、激素等的内部信号之间的相互作用调控的。具体地讲，已知有四个途径调控开花期：光周期途径，自发途径，春化，和赤霉素(GA)途径(Mouradov et al.，2002，Plant Cell，14：S111-130)。更具体地说，所述GA-缺陷型突变体gal在单一条件下不会开花(Wilson et al.，1992，PlantPhysiol.100：403-408)，因此，GA被认为在单一条件下在控制开花时间方面发挥重要作用。GA调控开花时间的潜在分子机制是激活目的基因，即开花促进因子1(FPF1)(Kania et al.，1997，Plant Cell 9：1327-1337)，GA-MYB(Gocal，et al.，2001，Plant Physiol.，127：1682-1693)和SOC1(Moon et al.，2003，Plant J.，35：613-623)，以提高LFY的转录活性(Blazquez，et al.，1998，Plant Cell 10：791-800)。
在作物育种中，调控成体大小和开花时间是非常重要的。在20世纪60年代(1960s)的亚洲，生长调控导致了作物产量如此地大幅度提高，以至于由此带来了一场绿色革命。另外，在欧洲，生长调节因子被用于预防植物受到风灾和低温的损害。因此，生长调控与农产品的收成密切相关。另外，开花时间的调控使得能够在一年中的任何时间确定收获时间，并且培育收获时间不依赖于环境因素的品种。为此，生物工程领域的研究人员在通过遗传学的操作调控开花时间方面付出了巨大努力。
本发明就是在上述背景下完成的。
发明内容
技术问题
因此，本发明的一个目的是提供一种具有延迟开花和/或抑制植物生长功能的多肽。
本发明的另一个目的是提供一种编码上述多肽的多核苷酸。
本发明的另一个目的是提供一种用于生产具有延迟开花表型的植物的方法。
本发明的另一个目的是提供一种用于生产具有生长受抑制表型的植物的方法。
本发明的另一个目的是提供一种利用所述多核苷酸筛选转基因植物的方法。
本发明的另一个目的是提供一种用于筛选延迟开花或生长抑制诱导子(inducer)的方法。
技术解决方案
根据一个方面，本发明涉及一种在植物中具有延迟开花和/或抑制生长(矮化)功能的多肽。
正如在下面的例子中将要说明的，利用激活标记法(Weigel et al.，2000，PlantPhysiology，122：1003-1013；该文献全文被收做本文参考)生产并且选择具有延迟开花表型和/或生长受抑制表型的拟南芥(Arabidopsis thaliana)转化体。通过TAIL-PCR(Thermal Asymmetric Interlaced Polymerase Chain Reaction；Liu et al.，1995，Plant J.8：457-463；该文献全文被收做本文参考)克隆所述拟南芥转化体中负责延迟开花和/或抑制生长的基因，并且确定为可编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的SEQ.ID.NO.1所示核苷酸序列。RNA凝胶印迹法也被用于确定所述延迟开花和/或生长受抑制的表型是否是由所述基因的超量表达所致。最后，当携带所述基因的重组表达载体被导入其中时，发现这种拟南芥表现出与通过激活标记法生产的转基因植物有相同的延迟开花和/或生长受抑制的表型。
具体地讲，在植物中具有延迟开花和/或抑制生长功能的多肽是下列多肽之一：
(a)具有SEQ.ID.NO.2所示完整的氨基酸序列的多肽；
(b)包括SEQ.ID.NO.2所示氨基酸序列主要部分的多肽；和
(c)本质上类似于(a)或(b)所述多肽的多肽。
如以上所用的以及包括权利要求书在内的以下所有内容中，短语“诱导延迟开花和/或抑制生长的功能”用于表示当本发明的基因(例如，具有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的基因)超量表达时，导致所述延迟开花和/或受抑制的生长表型表达的功能。
如以上所用的以及包括权利要求书在内的以下所有描述中，短语或术语“包括SEQ.ID.NO.2所示氨基酸序列主要部分的多肽”，被定义为其所包含的SEQ.ID.NO.2所示氨基酸序列多肽的部分，其长度足以使之仍保有与由SEQ.ID.NO.2所示氨基酸序列组成的多肽相同的开花延迟和/或生长抑制所必须的功能。任何多肽，只要它保留了所述开花延迟和/或生长抑制的必要功能，都满足本发明要求，而因此其长度或活度(例如，开花延迟和/或生长抑制)并不重要。就是说，即使其活性低于SEQ.ID.NO.2完整多肽，只要具有延迟开花和/或抑制生长的必要功能的任何多肽都可以包含在“包括SEQ.ID.NO.2所示氨基酸序列主要部分的多肽”的范围内，而与其序列长度无关。本领域技术人员，即熟悉本发明相关的现有技术的人员可以理解，包括SEQ.ID.NO.2所示氨基酸序列的多肽若缺失或添加突变体，仍然可保留开花延迟和/或生长抑制功能。因此，包括SEQ.ID.NO.2所示氨基酸序列，但是删除了N-或C-末端区的多肽仍然是有功能的。本领域普遍接受的观点是，即使删除了其N-末端区或C-末端区，突变体多肽仍然可保留完整多肽的功能。当然，如果删除的N-或C-末端区相当于所述多肽功能所必须的基序，则所述删除的多肽就失去了完整多肽的功能。不过，如何区分无活性多肽和活性多肽是本领域技术人员所熟知的。另外，缺少除N-或C-末端区之外的某部分的突变体多肽仍然可保留完整多肽的功能。另外，本领域技术人员可方便地验证这种缺失突变体是否仍然保留了完整多肽的功能。特别地，按照本发明披露的SEQ.ID.NO.1所示核苷酸序列和SEQ ID NO：2所示氨基酸序列，以及进一步经过明确验证的当SEQ ID NO：1所示核苷酸序列组成的基因超量表达时，所述转基因拟南芥表现出延迟开花和/或生长受抑制的表型的例子，显而易见，本领域技术人员可以确定包括SEQ.ID.NO.2所示氨基酸序列的多肽的缺失突变体是否仍然具备所述完整多肽的功能。因此，在本发明中，必须理解的是“包括SEQ.ID.NO.2所示氨基酸序列主要部分的多肽”表示可以由本领域技术人员根据本发明的方案制备的、保留了所述开花延迟或生长抑制功能的任何缺失突变体。
如以上所用的以及包括权利要求书在内的以下所有内容中，短语“本质上类似于(a)或(b)所述多肽的多肽”，表示具有至少一个被替换的氨基酸残基、但仍然保留了SEQ.ID.NO.2所示完整氨基酸序列的功能，即开花延迟和/或生长抑制功能的突变体。类似地，如果具有至少一个氨基酸残基被替换的突变体仍然表现出所述开花延迟和/或生长抑制功能，其活性或替换百分比并不重要。换言之，无论突变体多肽的活性比包括SEQ.ID.NO.2所示完整氨基酸序列的多肽低多少，或与包括SEQ.ID.NO.2所示完整氨基酸序列的多肽相比，无论突变体多肽具有多少个被替换的氨基酸残基，只要它表现出所述开花延迟和/或生长抑制功能，所述突变体多肽仍然属于本发明的范畴。即使所述完整多肽的相应残基的至少一个氨基酸残基被替换，如果所述替换的氨基酸残基与所述相应的残基在化学上等同的话，所述突变体多肽仍然可保留完整多肽的功能。例如，当丙氨酸，一种疏水性氨基酸，被类似的疏水性氨基酸，例如，甘氨酸，或被更疏水的氨基酸，例如，缬氨酸，亮氨酸或异亮氨酸替换时，包括所述替换的氨基酸残基的多肽仍然保留了所述完整多肽的功能，即使它(它们)具有较低的活性。类似地，由带负电荷的氨基酸，例如，谷氨酸和天冬氨酸之间的替换形成的，包括替换的氨基酸残基的多肽，仍然可保留完整多肽的功能，即使具有较低的活性。另外，该原则也适用于替换发生在带正电荷的氨基酸之间的突变体多肽。例如，包括赖氨酸替换精氨酸的替换突变体多肽，仍然具有完整多肽的功能，即使其活性较低。另外，在其N-或C-末端区包括替换的氨基酸的多肽仍然保留了完整多肽的功能。本领域技术人员显而易见的是，现有技术可以制备保留了包括SEQ.ID.NO.2所示氨基酸序列的多肽的开花延迟和/或生长抑制功能的、其中具有至少一替换代的氨基酸残基的突变体多肽。另外，本领域技术人员可以确定替换突变体多肽是否仍然保留了完整多肽的功能。另外，因为本发明披露了SEQ ID NO：1所示核苷酸序列和SEQ ID NO：2所示氨基酸序列，并且提供了当由SEQ ID NO：1所示核苷酸序列组成的基因超量表达，或表现出开花延迟和/或生长抑制表型的转基因拟南芥被明确验证的例子，显而易见的是，本领域技术人员可轻易地制备“本质上类似于(a)或(b)所述多肽的多肽”。因此，“本质上类似于(a)或(b)所述多肽的多肽”被理解成包括所有具有开花延迟或生长抑制功能的多肽，尽管其中存在至少一个替换的氨基酸。
尽管“本质上类似于(a)或(b)所述多肽的多肽”表示具有至少一个替换的氨基酸残基，但仍然保留了所述开花延迟或生长抑制功能的任何突变体，从活性角度来看，与SEQ.ID.NO.2所示氨基酸序列具有更高同源性的多肽是更优选的。有用的多肽与所述野生型多肽具有60％或以上的同源性，最优选具有100％的同源性。
更具体地讲，更优选的序列同源性为60％，61％，62％，63％，64％，65％，66％，67％，68％，69％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％和99.9％，其优选度的增高顺序按数值升高的次序排列。99.9％的序列同源性说明在具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽上仅有一个氨基酸被替换。
因为“本质上类似于(a)或(b)所述多肽”的多肽包括本质上类似于“包括SEQ.ID.NO.2所示氨基酸序列主要部分的多肽”的多肽，并且本质上类似于“具有与SEQ.ID.NO.2完全一致的氨基酸序列的多肽”的多肽，以上说明同时适合本质上类似于“具有SEQ.ID.NO.2所示完整的氨基酸序列的多肽”的多肽和本质上类似于“包括SEQ.ID.NO.2所示氨基酸序列主要部分的多肽”的多肽两种情况。
根据其另一方面，本发明涉及一种编码上述多肽的分离的多核苷酸。在本文中，术语“上述多肽”意在不仅包括具有SEQ.ID.NO.2所示氨基酸序列的多肽，包括SEQ.ID.NO.2所示氨基酸序列主要部分的多肽，和本质上类似于所述肽的多肽，在所述优选实施方案中，还包括保留了所述开花延迟和/或生长抑制功能的所有多肽。因此，本发明的多核苷酸包括编码具有开花延迟和/或生长抑制功能、并且保留了所述完整的SEQ.ID.NO.2所示氨基酸序列或其氨基酸序列的主要部分的多肽的分离多核苷酸，和编码本质上类似于所述多肽的多肽的分离多核苷酸。另外，本发明的多核苷酸包括编码与SEQ.ID.NO.2所示氨基酸序列具有同源性的多肽的所有分离多核苷酸。如果揭示了一种氨基酸序列，本领域技术人员即可根据氨基酸序列轻易地制备编码氨基酸序列的多核苷酸。
从活性角度看，本发明的多核苷酸优选包括SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的一部分。更优选的是包括SEQ ID NO：1所示完整的核苷酸序列。在本文中，短语“包括部分SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的多核苷酸”表示其序列长度足以在植物中确保延迟开花和/或抑制生长功能的多核苷酸。只要它保留了具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽的必要功能，任何多肽都可以采用，即使其活性低于所述完整多肽，即所述具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽。
在本发明中，短语“分离的多核苷酸”在这里意在包括所有化学合成的多核苷酸、从活体，特别是拟南芥中分离的多核苷酸、以及包括修饰过的核苷酸的多核苷酸，无论是单链或双链RNA或DNA。因此，cDNAs、化学合成的多核苷酸、和从活体，特别是拟南芥中分离的基因组DNAs，都属于“分离的多核苷酸”的范围。基于SEQ.ID.NO.2所示氨基酸序列，和编码其氨基酸序列的SEQ.ID.NO.1所示核苷酸序列，以及本领域公知的技术，相应的cDNAs和化学合成的多核苷酸的制备和gDNA的分离，可以由本领域技术人员轻易实现。
根据其另一个方面，本发明涉及一种包括或本质上类似于部分SEQ.ID.NO.1所示核苷酸序列的多核苷酸。在这里，短语“包括部分SEQ.ID.NO.1所示核苷酸序列的多核苷酸”表示其序列长度足以鉴定和/或分离植物(具体如拟南芥)中具有开花延迟和/或生长抑制功能的基因的多核苷酸。短语“本质上类似于部分SEQ.ID.NO.1所示核苷酸序列的多核苷酸”表示与SEQ.ID.NO.1所示核苷酸序列相比，包括至少一个替换的核苷酸残基，并且其序列依赖性结合能力足以在包括拟南芥在内的植物中鉴定和/或分离具有开花延迟和/或生长抑制功能的基因。只要披露了SEQ.ID.NO.1所示核苷酸序列，本领域技术人员可在此基础上轻易地实现在拟南芥或其他有机体中鉴定和/或分离具有开花延迟和/或生长抑制功能的基因。因此，本发明的多核苷酸意在包括所有的其长度或序列依赖性结合能力足以在包括拟南芥在内的植物中鉴定和/或分离具有开花延迟和/或生长抑制功能的基因的多核苷酸，而与长度和与SEQ.ID.NO.1所示核苷酸序列的序列同源性无关。
为了作为探针来验证未知基因是否具有与已知基因相同的核苷酸序列或用于分离未知基因，一般已知这样的多核苷酸必须包括30个或更多推论的核苷酸残基。因此，本发明的多核苷酸优选包括出自SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的30个或更多连续的核苷酸残基。不过，出自SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的30个或更少推论的核苷酸残基组成的多(或寡)肽仍然属于本发明的范畴。其原因是，如果它与部分SEQ.ID.NO.1所示核苷酸序列具有100％的同源性，所述多(或寡)核苷酸尽管短，但足以从拟南芥或其他生物中鉴定和/或分离具有开花延迟和/或生长抑制功能的基因，并且所述鉴定和/或分离条件(缓冲液pH，浓度等)是严格的。根据本文披露的本发明的内容，本领域技术人员可轻易构建和检测长度为30个或更少碱基的多核苷酸，以便从拟南芥或其他生物中鉴定和/或分离具有开花延迟和/或生长抑制功能的基因，并且可利用构建的多核苷酸，从拟南芥或其他生物中轻易鉴定和/或分离具有开花延迟和/或生长抑制功能的基因。
如以上所用以及包括权利要求书在内的所有以下描述中，术语“植物”意在包括当其生物量减少时，能够产生对人类有益结果的所有植物。这种植物的最直接的例子包括抑制各种作物生长的杂草，盆栽植物，显花植物等。另外，为食用更简便，运输更方便等等起见，食用植物也可归入被考虑植物的范围。更具体地讲，所述植物的例子包括生长在可耕地上的杂草，盆栽植物如蔷薇、松树、瑞士五针松、竹子等，显花植物如剑兰、非洲菊、香石竹、菊属、百合、郁金香等，谷类植物如水稻、小麦、大麦、玉米、菜豆、马铃薯、赤豆、燕麦、粟等，蔬菜植物如拟南芥、大白菜、萝卜、胡椒、草莓、番茄、西瓜、黄瓜、甘蓝、香瓜、南瓜、大葱、洋葱、胡萝卜等，经济作物如人参、烟草、棉花、芝麻、甘蔗、甜菜、紫苏、花生、加拿大油菜(canola)，果实如苹果、梨、枣、桃、猕猴桃、葡萄、橘子、柿子、李子、杏、香蕉等，和饲料植物如黑麦草、红三叶草、鸭茅、苜蓿、牛尾覃、多年生黑麦草，但不限于上述植物。
另外，在本文中，术语“植物”必须被理解成不仅包括成体植物，还包括可发育成成体植物的植物细胞、组织和种子。
根据其再一个方面，本发明涉及一种用于生产具有延迟开花和/或生长受抑制表型的植物的方法。
术语“延迟开花”的所有语法形式和拼写方法变化均表示在提供相同的培养条件，如温度、光照和黑暗时间周期等条件下，开花时间晚于野生型植物。
术语“抑制生长”的所有语法形式和拼写方法变化均用于表示一种植物的生物量低于其野生型的生物量，优选茎秆和/或叶片的生物量。在这里，生物量可以被理解为表示植物器官如叶、茎等的重量、长度和/或大小。
本发明用于生产具有延迟开花和/或生长受抑制的表型的植物的方法包括(I)超量表达具有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列或类似于SEQ ID NO：1所示序列的核苷酸序列的基因，和(II)选择诱导了延迟开花和/或生长受抑制表型的植物。
在本文中，术语“超量表达”的所有语法形式和拼写方法变化均表示在提供相同的培养条件，如温度，光照和黑暗时间周期等时，基因的表达水平高于野生型植物的表达水平。
在本文中，短语“具有类似于SEQ ID NO：1所示序列的核苷酸序列的基因”用于表示SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的基因的同系物，包括虽然根据不同的进化途径形成了各种植物物种从而具有不同核苷酸的序列、但却保留了开花延迟和/或生长抑制功能的所有基因。更优选与SEQ ID NO：1所示核苷酸序列具有更高同源性的基因。当然，100％的序列同源性是最优选的。与SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的同源性的下限，优选为60％。更具体地讲，更优选的序列同源性为60％，61％，62％，63％，64％，65％，66％，67％，68％，69％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％and 99％，其优选度增高的顺序按数值增高的次序排列。
具有类似于SEQ ID NO：1所示序列的核苷酸序列的基因的另一个优选例子是因为密码子简并产生的基因的功能性等同物。所述基因的功能性等同物包括编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽的多核苷酸。
在本发明的方法中，所述超量表达步骤(I)优选包括将编码本发明多肽的多核苷酸转化入植物体内。
在本文中，术语“转化”的所有语法形式和拼法变化，均表示无论采用何种方法将外源多核苷酸(编码一种具有诱导开花延迟和/或生长抑制的功能的多肽)导入宿主植物，更准确地讲导入植物细胞，导致所述宿主植物发生遗传学改变。一旦导入宿主植物，所述外源多核苷酸可整合到所述宿主植物的基因组中或者是独立的，本发明包括这两种情形。
用外源多核苷酸转化植物可以通过本领域公知的典型方法实现(Methods ofEnzymology，Vol.153，1987，Wu and Grossman ed.，Academic Press)。
为了进行转化，可将外源多核苷酸插入载体，如质粒或病毒，它们被用作将所述外源多核苷酸携带到植物体内的运输工具。另外，所述重组载体可被转化入农杆菌(Agrobacterium bacteria)，它被用作将DNA输送到植物体内的介体(Chilton et al.，1977，Cell 11：263：271)。另外，外源多核苷酸也可直接导入植物体内(Lorz et al.，1985，Mol.Genet.199：178-182)。
一个广泛使用的植物转化方法是将获得了外源多核苷酸的根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)转染到小植株，植物细胞或种子中。本领域技术人员可以将其培养并且使所述转染的植物细胞或种子生长成成熟的有机体。
所述转化步骤优选通过下述优选方式实现：(a)将编码本发明多肽的多核苷酸以可操作地连接方式插入包括调控核苷酸序列的表达载体，以便构建重组表达载体，和(b)将所述重组载体导入宿主植物，以便提供转基因植物。
优选的是，所述转化步骤包括将编码本发明多肽的多核苷酸以可操作地连接方式插入包括调控核苷酸序列的表达载体，以便构建重组表达载体，用所述重组表达载体转化农杆菌(Agrobacterium sp.)，并且将转化的农杆菌转染到植物体内。更优选的是，所述转化的农杆菌是转化的根瘤农杆菌。
术语“调控核苷酸序列”必须被理解成包括对所研究的基因表达有影响的所有序列。调控核苷酸序列的例子包括前导序列、增强子、启动子、起始密码子、终止密码子、复制起点、核糖体结合位点等。
在本文中，术语“可操作地连接”或“被可操作地连接”，用于表示调控序列与其他核苷酸序列功能性连接，以便调控该核苷酸序列的转录和/或翻译。例如，如果启动子影响位于该载体上所研究的基因转录，该基因就是可操作地连接的。
作为可用于本发明的启动子序列，它们可以是诱导型或组成型。组成型启动子的例子包括CaMV启动子，CsVMV启动子，和Nos启动子。诱导型启动子(启动子的活性是通过诱导物诱导的，以便表达可操作地连接的基因)的例子包括酵母-铜金属硫蛋白启动子(Mett et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，90：4567，1993)，取代的苯磺酰胺诱导型In2-1和In2-2启动子(Hershey et al.，Plant Mol.Biol.，17：679，1991)，糖皮质激素响应因子(GRE)(Schena et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，88：10421，1991)，乙醇-诱导型启动子(Caddick et al.，Nature Biotech.，16：177，1998)，来自核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亚基(ssRUBISCO)的光-诱导型启动子(Coruzzi et al.，EMBO J.，3：1671，1984；Broglie et al.，Science，224：838，1984)，manopine合成酶启动子(Velten et al.，EMBO J.，3：2723，1984)，胭脂碱合成酶(NOS)and章鱼碱合成酶(OCS)启动子，和热休克启动子(Gurley et al.，Mol.Cell.Biol.，6：559，1986；Severin et al.，Plant Mol.Biol.，15：827，1990)。
重组载体可具有选择性标记基因。在本文中，术语“标记基因”用于表示编码可用于选择包含该基因的植物或植物细胞的特征的基因。标记基因可以是抗生素抗性或除草剂抗性的。可用于本发明的选择性标记基因的例子包括腺甙脱氨酶基因、二氢叶酸还原酶基因、潮霉素-B-磷酸转移酶基因、胸苷激酶基因、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶和草铵膦乙酰基转移酶基因。
在本发明的实施方案中，将由SEQ ID NO.1的碱基序列组成的基因插入表达载体pCambia1302，以便构建重组载体pCambia1302-SIL1，再将该重组载体转化入根瘤农杆菌，然后将转化的根瘤农杆菌转染到拟南芥体内。
在考虑本发明的实施方案时，所述转化步骤优选包括用由SEQ ID NO.1的碱基序列组成的基因，更优选用包括所述基因的重组载体，特别是pCambia1302-SIL1转化植物，最优选将携带pCambia1302-SIL1的根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)转染到植物体内。
所述选择步骤(II)可以通过以下方式实现：在生长步骤(I)的转基因或转化植物之后，用肉眼或利用同时导入所述植物体内的选择性标记基因选择植物。
根据其又一个方面，本发明涉及通过本发明的方法生产的具有延迟开花和/或生长受抑制表型的植物。本发明的植物被理解成包括转基因植物，其中，延迟开花和/或生长受抑制的表型是通过具有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列或具有类似于SEQ ID NO：1所示序列的核苷酸序列的基因超量表达诱导的。
根据其又一个方面，本发明涉及一种利用上述本发明的多核苷酸作为标记基因选择转基因植物的方法。
本发明的选择转基因植物的方法包括(I)用一种携带目的基因，即编码能够在植物体内诱导开花延迟和/或生长抑制的多肽的上述多核苷酸和携带调控核苷酸的表达载体转化植物，和(II)区分开花延迟和/或生长抑制诱导的植物突变体和未诱导的植物。
在本文中，术语“目的基因”被定义为编码所研究的产物的多核苷酸序列，他可以是天然的或突变体(即RNA或多肽)。所述目的基因可以是编码天然产物或所希望的突变体的截短的，融合的或标记形式的cDNA或gDNA。
用一种表达载体转化植物的步骤(I)可以通过以下方式实现：将所述表达载体转化入农杆菌(Agrobacterium spp.)并且将转化的农杆菌转染到植物体内。上述农杆菌优选是根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)。
此外，有关选择转基因植物的方法的进一步说明，可以参考关于生产具有延迟开花表型的植物的方法的相应方法描述。
根据其又一个方面，本发明涉及用于筛选延迟植物开花的诱导物的方法.
根据本发明的另一方面，本发明涉及用于筛选植物生长抑制诱导子的方法。
所述方法包括(I)用化学或生物学物质处理植物，和(II)检测可导致由SEQ IDNO.1所示序列相同或相似的核苷酸序列组成的基因进行表达的诱导子。
术语“由类似于SEQ ID NO：1所示序列的核苷酸序列组成的基因”如上文所述。
所述处理步骤(I)可以通过以下方式实现：让所述植物与化合物接触或采用在生产延迟开花的植物的方法时所披露的有关生物工程技术的说明来进行。
所述植物诱导子候选物的例子包括SEQ ID NO.1所示正义核苷酸序列，携带所述正义核苷酸序列的重组载体，和用所述重组载体转化的根瘤农杆菌。
发明成果
正如迄今所披露的，提供了在植物中具有诱导开花延迟和/或生长抑制功能的多肽，和编码所述多肽的多核苷酸。还提供了用于生产表现出延迟开花表型的转基因植物，用于生产表现出受抑制的生长表型的转基因植物，用于选择所述转基因植物，用于筛选在植物中具有诱导开花延迟或生长抑制功能的试剂的相应的方法。
附图说明
图1是表现在长日照(LD)/短日照(SD)条件下培养时，哥伦比亚野生型拟南芥(Co1-0(wt))和开花延迟-诱导的拟南芥突变体(sill-lD)花轴形成时间的照片。可以看出，与野生型相比，在LD/SD条件下，sill-lD突变体的开花时间明显推迟。DAP(种植后天数)。
图2是表现图1所示结果的曲线图。在该曲线图中，在开花时丛生叶的数量是按照在长日照和短日照条件下培养的植物示出的。另外，还示出了抽薹时间，它是播种后至抽薹所需时间。
图3是表示野生型和sill-lD突变体成体大小的照片。当其完全长成时，sill-lD突变体的高度为其野生型高度的一半。
图4是整合在表现出延迟开花和/或受抑制的生长表型的转基因拟南芥基因组中的活化标记载体pSKI015的示意图。pSKI015被插入所述拟南芥基因组中At5g10950的上游。在该示意图中，4x35S Enh表示四个连续的35S增强子，BarR表示产生Basta除草剂抗性的基因，Amp R表示氨苄青霉素抗性基因，而Col E1 Ori表示大肠杆菌(E.coli)复制起点。
图5表示拟南芥的At5g10950基因结构。该基因包括7个由1185个核苷酸残基组成的外显子，和6个内含子。
图6表示由拟南芥的At5g10950编码的蛋白的氨基酸序列。所述蛋白由395个氨基酸组成，用方框圈出了推测的核定位信号。它们是通过计算机辅助的序列分析确定的。
图7表示通过RNA凝胶印迹分析的野生型和sill-lD突变体中位于T-DNA附近的At5g10950基因的表达方式。将28S rRNA用作对照。sill-lD突变体中At5g10950的表达水平显著提高。
图8表示用pCambia 1302-SIL1转化的拟南芥保卫细胞中SIL1的表达位置。第一幅图片提供了保卫细胞的光学显微照片。第二幅图片示出了来自SIL1和GFP融合蛋白的绿色荧光。第三幅图片中蓝色荧光表示用DAPI染色的细胞核。将以上三幅图片重叠，在第四幅图片中形成绿色和蓝色荧光的复合图像。
图9是表示野生型和sill-lD突变体在各种赤霉素(GA)浓度下下胚轴生长的曲线图。野生型的下胚轴长度随着GA浓度提高而增加。与其野生型相比，GA-诱导的sill-lD下胚轴生长明显减弱。
图10是表示用多效唑(PAC)——一种GA生物合成抑制剂处理时，野生型和sill-lD突变体的萌发效率的曲线图。野生型和sill-lD突变体的萌发效率随着PAC浓度提高均有降低，而其对sill-lD突变体产生了较高的PAC-诱导萌发抑制作用。
具体实施方式
<实施例1>表现出延迟开花和/或生长受抑制的表型的拟南芥转化体的制备和 选择
按照Weigel et al.(Weigel et al.，2000，Plant Phtsiology，122：1003-1013)的方法制备和选择表现出延迟开花和/或生长受抑制的表型的拟南芥转化体。
参见图4，通过电穿孔将包括位于T-DNA右臂的四个CaMV 35S增强子和赋予Basta抗性的bar基因(phophinithricin acetylltransferase基因)的激活标记载体pSK1015(Weigel et al.，2002，Plant Physiol.，122；1003-1013；由Weigel Lab.Germany惠赠)导入根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciences)菌株ABI(Lazo et al.，1991，Biotechnology 9：963-967；由Amassino Lab.U.S.A.惠赠)，然后在含有卡那霉素和羧苄青霉素的培养基上选择所述转化体。然后，通过花浸渍方法(Clough et al.，1998，Plant J.，16：735-743)，将用pSK1015转化的农杆菌菌株转染到哥伦比亚野生型拟南芥中。转化的拟南芥株在有Basta除草剂的条件下培养，以便获得种子，这些种子随后在温室中在23℃生长成5,000个T1系。其中，选择一个用肉眼测量已出现延迟开花和生长受抑制的表型的品系，并且命名为sill-lD(short internode and lateflowering1)。其后，选择的转基因拟南芥(sill-lD)和哥伦比亚野生型拟南芥(Col(wt))在各自的生长室中，在23℃下培养，黑暗/光照周期为16/8。参见图1和2，表现出延迟开花表型的转基因拟南芥sill-lD，其特征在于，与野生型相比，所述植物在长日照和短日照两种条件下的开花时间均较晚，开花时有更多叶子。另外，参见图3，sill-lD的生长受到抑制，因此，其高度仅为其野生型高度的一半。
<实施例2>鉴定转基因植物中的超量表达基因
进行TAIL-PCR实验(Liu et al.，1995，Plant J.8：457-463)，以便克隆在实施例1选择的转基因拟南芥中负责延迟开花和/或受抑制的生长表型的基因。
为了进行该PCR，使用分别具有SEQ ID NOS：3-5所示核苷酸序列的三个随机引物(AD1，AD2，AD3)和分别具有SEQ ID NOS：6-8所示核苷酸序列的三个特异性引物(AT1，AT2，AT3)。PCR是在有Takara Extaq的条件下，在2700热循环仪，Applied Biosystems中进行的。
TAIL-PCR实验由三个反应步骤组成，每一个步骤分别在以下条件下进行的。
(第一步PCR)
在该PCR中，将从实施例1的转基因拟南芥中提取的基因组DNA(Dellaportaet al.，1983，Plant Mol.Biol.Rep.1：19-21)用作模板，并且将总反应体积设定为25μL。每一个PCR在三个试管(AD1，AD2，或AD3)中进行。在PCR的第一个步骤中，各成分的最终浓度和反应循环的次数和条件如下。
(最终浓度)
模板DNA：100ng
AT1 0.2μM
AD1，AD2，或AD3引物2μM
dNTP混合物：0.8mM
Taq酶：0.5U
(第一步PCR反应循环)
PCR始于一轮93℃，1min和95℃，1min以及五轮94℃，30sec，62℃，1min和72℃，2.5min，随后是94℃，30sec和25℃，3min。然后，用3分钟或更长时间将温度逐渐提高到72℃，并且在72℃保持2.5min，此后重复进行15轮94℃，10sec，68℃，1min，72℃，2.5min，94℃，10sec，68℃，1min，72℃，2.5min，94℃，10sec，44℃，1min，和72℃，2.5min，然后是72℃，1min。
(第二步PCR)
为了用作PCR第二步的模板，将从50μL第一步PCR反应混合物中取出的1μL放入49μL无菌水中以1/50的比例稀释。采用与第一步反应相同的随机引物，并且将总反应体积设定为25μL。在第二步PCR中，各成分的最终浓度和反应循环的次数和条件如下。
(最终浓度)
模板DNA：1μL
AT2 0.2μM
AD1，AD2，或AD3引物：2μM
DNTP混合物：0.8mM
Taq酶：0.5U
(反应循环的次数和条件)
PCR是以如下方式进行的：12轮94℃，10sec，64℃，1min，72℃，2.5min，94℃，10sec，64℃，1min，72℃，2.5min，94℃，10sec，44℃，1min和72℃，2.5min，随后是72℃，1min。
(第三步PCR)
在该PCR中，将从25μL第二步PCR反应混合物中取出的1μL放入9μL无菌水中以1/10的比例稀释。采用与第一步相同的随机引物，并且将总反应体积设定为50μL。在第三步PCR中，各成分的最终浓度和反应循环的次数和条件如下。
(最终浓度)
模板DNA：1μL
AT 30.2μM
AD1，AD2，或AD3引物：2μM
dNTP混合物：0.8mM
Taq酶：1U
(反应循环的次数和条件)
PCR是以如下方式进行的：20轮94℃，15sec，44℃，1min and 72℃，2.5min，随后是72℃，1min。
在所述三步PCR结束之后，对所获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，并且从所述凝胶中分离。使用测序仪(ABI3730；Applied Biosystem Inc.)测定其核苷酸顺序。根据测定的核苷酸顺序，从拟南芥基因组数据库中发现了离所述增强子最近的开放阅读框。参见图4，发现所述基因被插在拟南芥基因组中At5g10950启动子附近。所述基因包括七个外显子(图5)并且由编码395个氨基酸的1185个核苷酸组成(图6)。在这里，所述基因和蛋白分别被命名为SIL1基因和SIL1蛋白。
<实施例3>通过RNA凝胶印迹分析SIL1基因的超量表达
为了验证所述转基因拟南芥(sill-lD)是否超量表达SIL1基因，用SIL1cDNA片段作为探针，进行了RNA凝胶印迹分析。分别从哥伦比亚野生型拟南芥(Col-O(wt))和例1制备的转基因拟南芥sill-lD中分离出总RNA，使用TRIzol-Reagent(Invitrogen)，按照生产商的说明进行。然后，在1.2％甲醛-琼脂糖凝胶上对30μg每一种RNA提取物进行分离，并且利用真空转移系统(GE healthcare Bioscience)转移到尼龙膜(Hybond N+，GE healthcare Bioscience)上。所述尼龙膜在UV-交联剂(Stratagene)上接受UV照射，并且在65℃下干燥1小时。用放射性标记的探针处理尼龙膜，并且在65℃下，在church and Gilbert溶液(25mM磷酸钠，1mM EDTA，7％SDS，1％BSA)中杂交16小时。所述探针是用GeneAmp 2700(Applied Biosystems)通过PCR由拟南芥cDNA合成的，使用SEQ ID NO：9所示正向引物(0.2μM)和SEQ ID NO：10所示反向引物和dNTP(各2.5mM)。在95℃开始，变性3min之后，PCR是以如下方式进行的：35轮94℃变性，15sec，53℃退火，30sec和72℃延伸，1.5min，随后是72℃延伸，7min。所述PCR产物在100V电压下，在1％琼脂糖凝胶中电泳1小时，并且用凝胶回收试剂盒(Qiagen)从凝胶中回收SIL1。使用随机启动试剂盒(GE healthcare Bioscience，USA)按照生产商的使用手册，用5μLdCTP(1mCi/μL，PerkinElmer)标记该DNA。杂交之后，在65℃下用含有2x SSC(氯化钠/柠檬酸钠)和0.2％SDS(十二烷基硫酸钠)的溶液洗涤所述尼龙膜10min，用含有1x SSC和0.1％SDS的溶液洗涤10min，最后用含有0.1x SSC and 0.1％SDS的溶液洗涤。洗涤过的尼龙膜对BAS胶片曝光2天，并且用磷屏影像分析仪(BAS2000，Fuji，Japan)分析。结果参见图7。
参见图7，在所述哥伦比亚拟南芥中SIL1mRNA表达极低，而其在转基因拟南芥(sill-lD)的表达水平明显更高。
<实施例4>携带SIL1-的表达载体和转化体的构建及细胞内表达
为了确定在实施例1中产生的转基因拟南芥的表型是否因为SIL1基因的超量表达所致，首先，将SIL1基因插入pCambia 1302(Caberra，Australia；Hajdukiewicz etal，1994，Plant Mol.Biol.25：989-994)并且使之表达。为此，利用GEM T easy vector试剂盒(Promega)，将实施例3中由拟南芥cDNA扩增的SIL1探针DNA亚克隆到T载体上。然后，用2μL(10U/μL)NheI和SpeI消化2μg所述克隆，同时在37℃下，用2μL(10U/μL)SpeI处理2μg的pCambia 1302两小时。使用凝胶洗脱试剂盒从所述凝胶中纯化SIL1基因的1.19kb DNA片段和pCambia 1302的10.5kb片段，并且在存在1μL(1μg/μL)的T4连接酶(Roche)的条件下，在16℃下，用6小时时间将它们连接在一起。通过电穿孔将携带所述被鉴定的SIL1基因(命名为pCambia1302-SIL1)的重组载体导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)AGL1菌株，随后在含有卡那霉素的培养基中选择。利用花浸渍方法(Clough et al.，Plant J.，16(6)：735-743，1998)，将获得了pCambia 1302-SIL1克隆的农杆菌菌株转染到哥伦比亚野生型拟南芥中。然后，将来自转染的拟南芥的种子放置在含有15μg/ml潮霉素的培养基中生长，以便选择转基因植物。在生长箱中生长所述转基因拟南芥，并且分析开花延迟和生长抑制方式。再现了与sill-lD突变体中出现的相同的延迟衰老的表型，表明所述延迟开花和生长受抑制的表型是由于SIL1基因的激活。从所述转基因植物的一个系中采取叶片，用1μg/μL DAPI(4′，6-二脒基-2-苯基吲哚)处理，并且在荧光显微镜(Axio Vert 200；Carl Zeiss，Gottingen)下观察。SIL1-GFP(用于绿色荧光蛋白)的荧光信号证实了所述蛋白，如DAPI在细胞核内的定位，表明SIL1起着细胞核因子的作用。
<实施例5>分析sill-lD突变体就下胚轴长度而论对GA的应答
如在实施例1中所述，在长日照和短日照两种条件下，sill-lD均表现出延迟开花和受抑制生长的表型，具有深绿色叶子。在大多数情况下，这些现象是在植物的GA应答或GA生物合成水平低时出现。因此，验证sill-lD对GA的应答。为此，在含有1％琼脂糖和不同浓度的GA的1/2Gamborg B5培养基(Duchefa)中，在白光照射下生长之后，测量15个小植株的下胚轴长度。参见图9，在白光照射下，野生型(Col)的下胚轴生长随着GA浓度提过而增强。相反，与野生型相比，sill-lD对GA的应答是表现出下胚轴缩短，这表明就下胚轴生长而言，sill-lD对GA的应答降低了。
<实施例6>分析sill-lD突变体就萌发而论对多效唑的应答
众所周知的是，GA参与了萌发和下胚轴生长，参见实施例5。下胚轴生长或成体高度与细胞伸长相关。一般，GA，植物生长素和油菜素内酯(BA)均参与细胞伸长，而植物激素，如GA和ABA负责萌发。至于对GA的应答，则不同现象的分子机理不同。因此，为了支持延迟开花和/或矮化表型是因为sill-lD对GA的缺陷型应答这一事实，用多效唑(PAC)处理野生型(Col)和sill-lD，多效唑可抑制GA生物合成，并且比较其萌发效率。参见图10，在用0.35mg/L PAC处理时，所述野生型表现出几乎100％的发芽率，而sill-lD的发芽率保持在50％左右。一般，当GA的生物合成被PAC抑制时，萌发效率降低，对GA的应答减弱。这表明在萌发作用方面sill-lD对GA的应答减弱。综上所述，以上数据表明，SIL1的超量表达对GA应答有影响，会导致生长抑制和开花延迟。
序列表
附录
Figure IDA0000101055130000011
Figure IDA0000101055130000021
Figure IDA0000101055130000031
Figure IDA0000101055130000051

Claims (24)

1.一种在植物中具有延迟开花和/或抑制生长的功能的、选自下列一组的多肽：
(a)具有SEQ ID NO：2所示完整的氨基酸序列的多肽；
(b)包括SEQ ID NO：2所示氨基酸序列主要部分的多肽；和
(c)本质上类似于(a)或(b)的多肽。
2.如权利要求1所述的多肽，其中，所述多肽本质上类似于(a)或(b)所述多肽，与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列具有80％或以上的序列同源性。
3.如权利要求1所述的多肽，其中，所述多肽本质上类似于(a)或(b)所述多肽，与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列具有90％或以上的序列同源性。
4.如权利要求1所述的多肽，其中，所述多肽本质上类似于(a)或(b)所述多肽，与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列具有95％或以上的序列同源性。
5.一种编码权利要求1-4中任意一项所述多肽的多核苷酸。
6.一种选自下列一组的多核苷酸：
(a)包含SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的一部分的多核苷酸；和
(b)本质上类似于SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的一部分的多核苷酸。
7.将权利要求6所述多核苷酸用于鉴定或分离能够在植物体内诱导开花延迟和/或抑制生长的基因的用途。
8.用于生产具有延迟开花和/或生长受抑制的表型的植物的方法，包括：
(I)超量表达具有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列或类似于SEQ ID NO：1所示序列的核苷酸序列的基因；和
(II)选择诱导了延迟开花和/或生长受抑制的表型的植物。
9.如权利要求8所述的方法，其中，所述核苷酸序列类似于SEQ ID NO：1所示序列，与SEQ ID NO：1所示核苷酸序列具有90％或以上的序列同源性。
10.如权利要求8所述的方法，其中，所述超量表达步骤(I)包括将权利要求5所述多核苷酸转化入植物体内。
11.如权利要求10所述的方法，其中，所述转化步骤包括(a)将编码权利要求5所述多肽的多核苷酸插入包括调控核苷酸序列的表达载体，以便构建重组表达载体，和(b)将所述重组载体导入宿主植物。
12.如权利要求10所述的方法，其中，所述转化步骤包括将权利要求5中编码所述多肽的多核苷酸插入一种表达载体，以便构建重组表达载体，用所述重组表达载体转化农杆菌，并且将转化后的农杆菌转染到植物体内。
13.如权利要求10所述的方法，其中，所述转化步骤包括用携带由SEQ ID NO：1所示核苷酸序列组成的基因的重组载体转化农杆菌(Agrobacterium sp)，并且将转化后的农杆菌转染到植物体内。
14.一种用于生产具有生长受抑制的表型的植物的方法，包括：
(I)超量表达具有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列或类似于SEQ ID NO：1所示序列的核苷酸序列的基因；和
(II)选择诱导了延迟开花和/或生长受抑制的表型的植物。
15.如权利要求14的方法，其中，所述核苷酸序列类似于SEQ ID NO：1所示序列，与SEQ ID NO：1所示核苷酸序列具有90％或以上的序列同源性。
16.如权利要求14的方法，其中，所述超量表达步骤(I)包括将权利要求5所述多核苷酸转化入植物体内。
17.如权利要求14的方法，其中，所述转化步骤包括(a)将权利要求5中编码所述多肽的多核苷酸插入包括调控核苷酸序列的表达载体，以便构建重组表达载体，和(b)将所述重组载体导入宿主植物。
18.如权利要求14的方法，其中，所述转化步骤包括将权利要求5中编码所述多肽的多核苷酸插入一种表达载体，以便构建重组表达载体，用所述重组表达载体转化农杆菌，并且将转化过的农杆菌转染到植物体内。
19.如权利要求14的方法，其中，所述转化步骤包括用携带有由SEQ ID NO：1所示核苷酸序列组成的基因的重组载体转化农杆菌，并且将转化过的农杆菌转染到植物体内。
20.一种选择转基因植物的方法，包括：
(I)用一种携带目的基因，即权利要求5所述多核苷酸，和调控核苷酸的表达载体转化植物，和
(II)鉴别已被诱导延迟开花和/或抑制生长的植物突变体。
21.如权利要求20所述的方法，其中，所述转化步骤(I)包括将所述表达载体转化入农杆菌，并且将转化过的农杆菌转染到植物体内。
22.如权利要求20所述的方法，其中，所述转化步骤(I)包括用携带有由SEQ IDNO：1所示核苷酸序列组成的基因的重组载体转化农杆菌，并且将转化过的农杆菌转染到植物体内。
23.一种通过权利要求8-13中任意一项所述的方法生产的、表现出延迟开花表型的植物。
24.一种通过权利要求14-19中任意一项所述的方法生产的、表现出生长受抑制的表型的植物。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111705074A (zh) * 2020-05-18 2020-09-25 河南大学 一种利用转基因技术培育短蔓花期延迟西瓜新种质的方法

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101282409B1 (ko) * 2011-11-02 2013-07-04 서울대학교산학협력단 고추 유래의 ＣａＳＤ1 유전자 및 이의 용도
KR101383340B1 (ko) * 2012-06-15 2014-04-10 건국대학교 산학협력단 애기장대 슛 시스템에서 성장 및 발달을 조절하는 방법
KR101494499B1 (ko) * 2012-09-13 2015-02-24 포항공과대학교 산학협력단 Ａｂｉ３단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 식물체의 개화 조절용 조성물
KR101929281B1 (ko) 2016-05-19 2019-03-15 삼성디스플레이 주식회사 전자 장치

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003018628A1 (en) * 2001-08-22 2003-03-06 Genomine Inc. Gene controlling flowering time and method for controlling flowering time in plants using the gene
WO2004058980A2 (en) * 2002-12-24 2004-07-15 Cropdesign N.V. Plants having modified growth characteristics and a method for making the same
WO2005092919A1 (en) * 2004-03-29 2005-10-06 Postech Foundation Flowering time-controlling gene cog2 isolated from arabidopsis thaliana
CN101014614A (zh) * 2004-07-12 2007-08-08 克罗普迪塞恩股份有限公司 具有改良生长特性的植物及其制备方法
WO2007113532A2 (en) * 2006-03-31 2007-10-11 Plant Bioscience Limited Prediction of heterosis and other traits by transcriptome analysis
US20080104729A1 (en) * 1999-06-14 2008-05-01 Conner Timothy W Nucleic acid molecules and other molecules associated with plants
RU2006138576A (ru) * 2004-04-02 2008-05-10 КРОПДИЗАЙН Н.Фи. (BE) Растения с улучшенными характеристиками роста и способ их получения

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9602796D0 (en) * 1996-02-12 1996-04-10 Innes John Centre Innov Ltd Genetic control of plant growth and development
KR100637341B1 (ko) * 2003-02-20 2006-10-23 재단법인서울대학교산학협력재단 식물의 개화시기 조절 유전자 및 이를 이용한 식물의개화시기 조절 방법
KR100792169B1 (ko) * 2006-01-20 2008-01-07 재단법인서울대학교산학협력재단 전사인자 ＡｔＭＹＢ４４의 유전자 전이를 통한 광엽화, 개화지연 및 환경스트레스 저항성이 강화된 식물체
EP2023712A4 (en) * 2006-06-15 2009-07-08 Progeny Advanced Genetics PROCESS FOR REPRODUCING MILK
KR20100095867A (ko) * 2009-02-23 2010-09-01 포항공과대학교 산학협력단 청색광 인지 능력이 증대 또는 억제된 식물체의 제조 방법

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080104729A1 (en) * 1999-06-14 2008-05-01 Conner Timothy W Nucleic acid molecules and other molecules associated with plants
WO2003018628A1 (en) * 2001-08-22 2003-03-06 Genomine Inc. Gene controlling flowering time and method for controlling flowering time in plants using the gene
WO2004058980A2 (en) * 2002-12-24 2004-07-15 Cropdesign N.V. Plants having modified growth characteristics and a method for making the same
WO2005092919A1 (en) * 2004-03-29 2005-10-06 Postech Foundation Flowering time-controlling gene cog2 isolated from arabidopsis thaliana
RU2006138576A (ru) * 2004-04-02 2008-05-10 КРОПДИЗАЙН Н.Фи. (BE) Растения с улучшенными характеристиками роста и способ их получения
CN101014614A (zh) * 2004-07-12 2007-08-08 克罗普迪塞恩股份有限公司 具有改良生长特性的植物及其制备方法
WO2007113532A2 (en) * 2006-03-31 2007-10-11 Plant Bioscience Limited Prediction of heterosis and other traits by transcriptome analysis

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MAGOME HIROSHI ET AL: "dwarf and delayed-flowering 1, a novel Arabidopsis mutant deficient in gibberellin biosynthesis because of overexpression of a putative AP2 transcription factor", 《 PLANT JOURNAL》 *
STEVENJ.CLOUGH ET AL: ""Floral dip:a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana", 《THE PLANT JOURNAL》 *
STEVENJ.CLOUGH ET AL: ""Floral dip:a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana", 《THE PLANT JOURNAL》, vol. 16, no. 6, 31 December 1998 (1998-12-31), pages 735, XP002132452, DOI: doi:10.1046/j.1365-313x.1998.00343.x *
YAMADA,K. ET AL: "Arabidopsis thaliana unknown protein (At5g10950) mRNA, complete cds", 《GENBANK: AY096725.1》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111705074A (zh) * 2020-05-18 2020-09-25 河南大学 一种利用转基因技术培育短蔓花期延迟西瓜新种质的方法

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