CN102406098B - 一种降解玉米赤霉烯酮的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种降解玉米赤霉烯酮的方法，是用黑曲霉的发酵产物来降解发霉谷物中的玉米赤霉烯酮，其中所述的黑曲霉的发酵产物为发酵液干粉。本发明应用黑曲霉的发酵产物对玉米赤霉烯酮进行降解，可以有效地降解发霉谷物中的玉米赤霉烯酮，从而恢复发霉谷物的应用价值。同时本发明通过在体外模拟胃肠道环境下测定黑曲霉发酵产物对ZEN的降解效果，摸索出黑曲霉发酵产物对ZEN的最佳降解条件，为进一步将其开发为生物解毒剂，用于谷物和饲料中ZEN的降解提供了坚实的基础。

Description

一种降解玉米赤霉烯酮的方法

技术领域

本发明属于生物脱毒技术领域，具体涉及一种降解玉米赤霉烯酮的方法，即用黑曲霉的发酵产物来降解玉米赤霉烯酮。

背景技术

玉米赤霉烯酮(Zearalenone，简称ZEN)，是由镰刀菌属(Fusarium)的产毒菌，如禾谷镰刀菌(F.graminearum)和三线镰刀菌(F.tricinctum)等代谢生产的有毒物质，广泛存在于霉变的玉米、高粱、小麦、燕麦、大麦等谷类作物以及奶制品中。玉米赤霉烯酮具有雌激素作用，主要作用于生殖系统，可使家畜、家禽和实验小鼠产生雌性激素亢进症，妊娠期的动物(包括人)食用含玉米赤霉烯酮的食物可引起流产、死胎和畸胎等危害。而饲料和食品生产中所用的谷物(如玉米、小麦)是玉米赤霉烯酮产生的最好基质。2009年奥特奇对我国的谷物原料的调查报告显示，玉米赤霉烯酮的检出率为88.7％，最大值达到7772.3ppb，远远超出了我国饲料的限量标准。因此，一方面要预防玉米赤霉烯酮产毒菌感染谷物，另一方面还要探索如何通过生物学方法来降解去除谷物中已有的玉米赤霉烯酮，使这些谷物还可用于其它的领域，产生一定经济价值。

目前，已有一些利用酵母菌、粉红黏帚霉及根霉、毛霉的发酵产物来降解玉米赤霉烯酮的研究报道(Orsolya Molnar，Systematic and Applied Microbiology，2004，27(6)：661～671；Jan U，Applied and EnvironmentalMicrobiology，2007，73(2)：637～642)。同时，关于酶降解玉米赤霉烯酮的报道也不少，例如螺旋聚孢属中的Clonostachysrosea可将玉米赤霉烯酮转化为另一种毒性较低的化合物，而其中起作用的是一种水解酶(Naoko TakahashiAndo，Biochem J.，2002，Jul y 365(7)：1-6)。但目前尚未见关于黑曲霉发酵产物降解玉米赤霉烯酮的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种黑曲霉的发酵产物在降解玉米赤霉烯酮(以下简称ZEN)中的应用。通过在体外模拟动物胃肠道环境下测定黑曲霉的发酵产物对ZEN标准品和发霉玉米中ZEN的降解效果，确定黑曲霉的发酵产物对ZEN的降解条件，为进一步开发ZEN生物解毒剂奠定了基础。

申请人在本发明利用黑曲霉的发酵产物来降解玉米赤霉烯酮。

所述的黑曲霉可选用购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，分类命名为黑曲霉(Aspergillus niger)，保藏号：CGMCC 3.316。

所述的黑曲霉发酵产物为发酵液干粉。

黑曲霉的发酵液干粉对发霉谷物中的玉米赤霉烯酮进行降解。

本发明的降解玉米赤霉烯酮的方法，优选的黑曲霉发酵液干粉添加量的重量百分比为0.2％，在37℃、pH2.0条件下降解1.5h；或是发酵液干粉添加量的重量百分比为0.2％，在37℃、pH6.5条件下降解3.0h。

本发明应用黑曲霉的发酵产物对玉米赤霉烯酮进行降解，可以有效地降解发霉谷物中的玉米赤霉烯酮，从而恢复发霉谷物的应用价值。同时本发明通过在体外模拟胃肠道环境下测定黑曲霉发酵产物对ZEN的降解效果，摸索出黑曲霉发酵产物对ZEN的最佳降解条件，为进一步将其开发为生物解毒剂，用于谷物和饲料中ZEN的降解提供了坚实的基础。

具体实施方式

本发明所应用的试剂可以应用任一款市售产品，例如玉米赤霉烯酮(ZEN)的标准品购于sigma公司，ZEN高灵敏度检测试剂盒Zearalenone Veratox购自英国NEOGEN公司。所用到的缓冲液的配制方法如下：

1、pH6.5的PBS：KCl：0.2g  KH₂PO4：0.204g  Na₂HPO₄·2H₂O：1.442gNaCl：8.066g溶解于1000ml蒸馏水中，调节pH值为6.5；

2、pH2.0的PBS：KCl：0.2g  KH₂PO₄：0.204g  Na₂HPO₄·2H₂O：1.442gNaCl：8.066g溶解于1000ml蒸馏水中，调节pH值为2.0；

3、胃蛋白酶溶液液：准确称取胃蛋白酶(1∶10000)1.333g，溶于10ml pH2.0的PBS溶液中，充分搅拌使其完全溶解；

4、胰蛋白酶溶液液：准确称取胰蛋白酶(1∶250)1.0g，溶于10ml pH6.5的PBS溶液中，充分搅拌使其完全溶解。

下面结合具体实施例对本发明的方法进行详细描述。

实施例1：黑曲霉发酵产物的制备

1、斜面培养

在装有PDA培养基(马铃薯20％，葡萄糖2％，琼脂2％)的试管中接入黑曲霉菌种CGMCC 3.316，30℃静置培养3～5d。

2、孢子悬液的制备

将斜面培养基上的黑曲霉孢子用无菌水洗下，并稀释至约1×10⁹个/ml，制成孢子悬浮液。

3、一级种子液制备：

在500ml摇瓶中加入l00mlPDY培养基(马铃薯20％，葡萄糖2％，酵母膏1％)，按照8％的接种量接入孢子悬浮液，25℃，120～150r/min，培养2d。

4、固体发酵

按比例称取稻草粉50％，(NH₄)₂SO₄ 8％，麸皮42％，再加入约4.9倍固体物质体积的水，充分混匀，灭菌，即制得固体发酵培养基。

按照10％的接种量接种一级种子液，混匀后，将物料均匀铺放在培养盒内发酵培养48h。0-10h时，维持发酵温度为32-38℃，10-38h时发酵温度为37℃，38-48h时发酵温度为32-35℃，48h发酵结束，自然补给氧气，环境湿度控制在约60％以上。

5、黑曲霉发酵液干粉制备

发酵结束后，将发酵液充分混匀，检测酶活，进闪蒸干燥塔干燥，进口温度85℃，出口温度48-50℃，干燥10s，40目粉碎，即得到黑曲霉发酵液干粉。

实施例2：黑曲霉发酵产物对ZEN标准品的降解作用

1、黑曲霉发酵产物的添加量对ZEN标准品降解率的影响

根据食糜在动物胃肠中停留时间，分别测定在模拟动物胃、肠道环境下黑曲霉发酵产物添加量对ZEN标准品的降解率，确定最佳添加量。

1.1在模拟胃液中黑曲霉发酵产物添加量对ZEN降解率的影响

在三角瓶中添加灭菌后的pH2.0PBS缓冲液24ml，加入胃蛋白酶溶液0.25ml，浓度为50ppm的ZEN标准品0.25ml，分别加入0.05％，0.10％，0.15％，0.2％，0.3％，0.4％(质量比)黑曲霉发酵液干粉，每组两个重复，37℃，震荡培养4h，培养结束后，4500r/min离心，上清用漏斗过滤后收集，作为上清中ZEN待测液；沉淀中加入25ml的蒸馏水，剧烈震荡5min，过滤收集滤液，作为沉淀解吸附ZEN的待测液。样品测定前于4℃冰箱保存。利用ZEN高灵敏度检测试剂盒测定上清及沉淀中ZEN含量，并计算黑曲霉发酵产物对ZEN的降解率，实验结果见表1。

1.2在模拟肠液中黑曲霉发酵产物添加量对ZEN降解率的影响

在三角瓶中添加灭菌后的pH6.5PBS缓冲液24ml，加入胰蛋白酶溶液0.25ml，浓度为50ppm的ZEN标准品0.25ml，分别加入0.05％，0.10％，0.15％，0.2％，0.3％，0.4％(质量比)黑曲霉发酵液干粉，每组两个重复，37℃，震荡培养8h，培养结束后的处理如步骤2.1中所述，实验结果见表2。

表1体外模拟胃环境下黑曲霉发酵产物添加量对ZEN标准品降解率的影响

干粉添加量％	0.05	0.1	0.15	0.2	0.3	0.4
							ZEN降解率％	6.2	8.9	13.3	19.1	18.3	18.8

表2体外模拟肠环境下黑曲霉发酵产物添加量对ZEN标准品降解率的影响

干粉添加量％	0.05	0.1	0.15	0.2	0.3	0.4
							ZEN降解率％	20.2	27.9	34.1	41.9	42.2	42.5

由表1，表2可以看出，当黑曲霉发酵液干粉添加量低于0.2％时，随着添加量的增加，ZEN降解率不断提高；当添加量高于0.2％时，随着添加量的增加，ZEN降解率趋于稳定，所以黑曲霉发酵产物的最适添加量为0.2％。

2、黑曲霉发酵产物的降解时间对ZEN标准品降解率的影响

在模拟动物胃、肠道环境下，分别测定最适添加量的黑曲霉发酵产物在不同降解时间时对ZEN的降解率，以确定黑曲霉发酵产物的最佳降解时间。

2.1在模拟胃液中黑曲霉发酵产物对ZEN降解时间的确定

在三角瓶中添加灭菌后的pH2.0PBS缓冲液24ml，加入胃蛋白酶溶液0.25ml，浓度为50ppm的ZEN标准品0.25ml，加入0.2％(质量比)的黑曲霉发酵液干粉，37℃，震荡培养，分别在15min，30min，45min，60min，90min，120min时测定上清及沉淀中的ZEN含量，每组两个重复，分别计算黑曲霉发酵产物对ZEN的降解率，实验结果见表3。

2.2在模拟肠液中黑曲霉发酵产物对ZEN降解时间的确定

在三角瓶中添加灭菌后的pH6.5PBS缓冲液24ml，加入胰蛋白酶溶液0.25ml，浓度为50ppm的ZEN标准品0.25ml，加入0.2％(质量比)的黑曲霉发酵液干粉，37℃，震荡培养，分别在30min，60min，90min，120min，180min，240min时测定上清及沉淀中的ZEN含量，每组两个重复，其他步骤同2.1，实验结果见表4。

表3体外模拟胃环境下黑曲霉发酵产物降解时间对ZEN标准品降解率的影响

降解时间/min	15	30	45	60	90	120
							ZEN降解率％	5.2	9.1	12.7	15.9	19.1	20.8

表4体外模拟肠环境下黑曲霉发酵产物降解时间对ZEN标准品降解率的影响

降解时间/min	30	60	90	120	180	240
							ZEN降解率％	14.9	18.2	24.7	32.5	41.2	43.8

由表3，表4可以看出，黑曲霉发酵液干粉添加量为0.2％时，随着降解时间的延长，ZEN的降解率不断提高；在体外模拟胃环境中，当降解时间≥90min时，ZEN的降解率趋于稳定；在体外模拟肠环境中，降解时间≥3h时，ZEN的降解率趋于稳定。

综上所述，黑曲霉发酵产物降解ZEN标准品的最佳条件为：黑曲霉发酵液干粉添加量0.2％，37℃，pH2.0，降解1.5h；37℃，pH 6.5，降解3.0h，ZEN标准品的总降解率最高，达到60.3％。其中降解率的计算公式如下：

总降解率：在体外模拟胃、肠道环境下黑曲霉发酵产物对ZEN的降解率之和

实施例3黑曲霉发酵产物对发霉玉米中ZEN的降解作用

1、发霉玉米中ZEN总量测定

发霉玉米粉碎后过20目筛，根据英国NEOGEN公司Zearalenone Veratox(ZEN高灵敏度检测试剂盒)要求的测定方法测定ZEN含量为：1536.78ppb

2、缓冲液配制

PBS(pH6.5)：KCl：0.2g KH₂PO₄：0.204g Na₂HPO₄·2H₂O：1.442gNaCl：8.066g溶解于1000ml蒸馏水中，调节pH值为6.5

PBS(pH2.0)：KCl：0.2g KH₂PO₄：0.204g Na₂HPO4·2H₂O：1.442gNaCl：8.066g溶解于1000ml蒸馏水中，调节pH值为2.0

胃蛋白酶溶液液：准确称取胃蛋白酶(1∶10000)1.333g，溶于10ml pH2.0的PBS溶液中，充分搅拌使其完全溶解。

胰蛋白酶溶液液：准确称取胰蛋白酶(1∶250)1.0g，溶于10ml pH6.5的PBS溶液中，充分搅拌使其完全溶解。

3、黑曲霉发酵产物的添加量对发霉玉米中ZEN降解率的影响

根据食糜在动物胃肠中停留时间，分别测定在模拟动物胃、肠道环境下，黑曲霉发酵产物添加量对发霉玉米中ZEN的降解率的影响，确定黑曲霉发酵液干粉的最佳添加量。

3.1黑曲霉发酵产物添加量在模拟胃液中对ZEN降解率的影响

在三角瓶中添加灭菌后的pH2.0PBS缓冲液24ml，加入胃蛋白酶溶液0.25ml，发霉玉米10g，分别加入0.05％，0.10％，0.15％，0.2％，0.3％，0.4％(质量比)黑曲霉发酵液干粉，同时增设对照组，只加入发霉玉米，每组两个重复，37℃，震荡培养4h，培养结束后，4500r/min离心，上清用漏斗过滤后收集，作为上清中ZEN待测液；沉淀中加入70％甲醇25ml，剧烈震荡5min，过滤收集滤液，作为沉淀解吸附ZEN待测液。测定前于4℃冰箱保存。利用ZEN高灵敏度检测试剂盒测定上清及沉淀中ZEN含量，并计算黑曲霉发酵产物对ZEN的降解率，实验结果见表5。

3.2黑曲霉发酵产物的添加量在模拟肠液中对ZEN降解率的影响

三角瓶中添加灭菌后的pH6.5PBS缓冲液24ml，加入胰蛋白酶溶液0.25ml，发霉玉米10g，分别加入0.05％，0.10％，0.15％，0.2％，0.3％，0.4％(质量比)黑曲霉发酵液干粉，同时增设对照组，只加入发霉玉米，每组两个重复，在37℃，震荡培养8h，培养结束后的处理如步骤3.1中所述，实验结果见表6。

表5体外模拟胃环境下黑曲霉发酵产物添加量对发霉玉米中ZEN降解率的影响

干粉添加量％	0.05	0.10	0.15	0.20	0.30	0.40
							ZEN降解率％	6.1	8.7	12.9	17.9	18.3	18.5

表6体外模拟肠环境下黑曲霉发酵产物添加量对发霉玉米中ZEN降解率的影响

干粉添加量％	0.05	0.10	0.15	0.20	0.30	0.40
							ZEN降解率％	20.1	26.9	33.7	41.1	42.2	42.5

由表5，表6可以看出，当黑曲霉发酵液干粉添加量低于0.2％时，随着添加量的增加，发霉玉米中ZEN的降解率不断提高；当添加量高于0.2％时，ZEN的降解率趋于平衡，所以黑曲霉发酵产物的最适添加量为0.2％。

4、黑曲霉发酵产物降解时间对发霉玉米中ZEN降解率的影响

在模拟动物胃、肠道环境下，分别测定最适添加量的黑曲霉发酵产物在不同降解时间时对ZEN的降解率，以确定黑曲霉发酵产物的最佳降解时间。

4.1在模拟胃液中黑曲霉发酵产物对发霉玉米中ZEN降解时间的确定

在三角瓶中添加灭菌后的pH2.0PBS缓冲液24ml，加入胃蛋白酶溶液0.25ml，发霉玉米10g，加入0.2％的黑曲霉发酵液干粉，37℃，震荡培养，分别在15min，30min，45min，60min，90min，120min时测定上清及沉淀中的ZEN含量，同时增设对照组，只加入发霉玉米，每组两个重复，分别计算黑曲霉发酵产物对发霉玉米中ZEN的降解率，实验结果见表7。

4.2在模拟肠液中黑曲霉发酵产物对发霉玉米中ZEN降解时间的确定

三角瓶中添加灭菌后的pH6.5PBS缓冲液24ml，加入胰蛋白酶溶液0.25ml，发霉玉米10g，加入0.2％的黑曲霉发酵液干粉，37℃，震荡培养，分别在30min，60min，90min，120min，180min，240min时测定上清及沉淀中的ZEN含量，每组两个重复，其他步骤同4.1，实验结果见表8。

表7体外模拟胃环境下黑曲霉发酵产物降解时间对中ZEN降解率的影响

降解时间/min	15	30	45	60	90	120
							ZEN降解率％	5.6	9.8	11.9	15.2	19.6	20.8

表8体外模拟肠环境下黑曲霉发酵产物降解时间对ZEN降解率的影响

降解时间/min	30	60	90	120	180	240
							ZEN降解率％	15.1	18.9	24.5	31.7	39.2	41.7

由表7，表8可以看出，黑曲霉发酵液干粉添加量为0.2％时，随着降解时间的延长，发霉玉米中ZEN的降解率不断提高，在体外模拟胃环境中，当降解时间≥90min时，ZEN的降解率趋于稳定；在体外模拟肠环境中，降解时间≥3h时，ZEN的降解率趋于稳定。

综上所述，黑曲霉发酵产物降解发霉玉米中ZEN的最佳条件为：黑曲霉发酵液干粉添加量0.2％(质量比)；37℃，pH2.0，降解1.5h；37℃，pH6.5，降解3.0h，发霉玉米中ZEN的总降解率最高，达到58.8％。

Claims (1)

1.一种降解玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于，是用黑曲霉发酵液干粉对发霉谷物中的玉米赤霉烯酮进行降解，其中黑曲霉发酵液干粉在发霉谷物中添加量的重量百分比为0.2%，在37℃、pH2.0条件下降解玉米赤霉烯酮1.5h；或是黑曲霉发酵液干粉在发霉谷物中添加量的重量百分比为0.2%，在37℃、pH6.5条件下降解玉米赤霉烯酮3.0h；所述的黑曲霉发酵液干粉，其制备方法包括如下步骤：

1）斜面培养：

在装有PDA培养基的试管中接入黑曲霉菌种CGMCC 3.316，30℃静置培养3～5d；

2）孢子悬液的制备：

将斜面培养基上的黑曲霉孢子用无菌水洗下，并稀释至约1×10⁹个/ml，制成孢子悬浮液；

3）一级种子液制备：

在500ml摇瓶中加入lOOml PDY培养基，按照8%的接种量接入孢子悬浮液，25℃，120～150r／min，培养2d；所述的PDY培养基由20％马铃薯、2％葡萄糖和1％酵母膏制成；

4）固体发酵：

按比例称取稻草粉50％，(NH₄)₂SO₄ 8％，麸皮 42％，再加入4.9倍固体物质体积的水，充分混匀，灭菌，即制得固体发酵培养基；

按照10%的接种量接种一级种子液，混匀后，将制备的物料均匀铺放在培养盒内发酵培养48h；0-10h时，维持发酵温度为32-38℃，10-38h时发酵温度为37℃，38-48h时发酵温度为32-35℃，48h发酵结束，自然补给氧气，环境湿度控制在60％以上；

5）黑曲霉发酵液干粉制备：

发酵结束后，将发酵液充分混匀，检测酶活，进闪蒸干燥塔干燥，进口温度85℃，出口温度48-50℃，干燥10s，40目粉碎，即得到黑曲霉发酵液干粉。