CN102405284B

CN102405284B - 设计不可逆抑制剂的算法

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Publication number: CN102405284B
Application number: CN200980144148.XA
Authority: CN
Inventors: J·辛格; R·C·彼得; 牛德强
Original assignee: Xinji Aveiro Meeks Research Inc
Current assignee: Xinji Aveiro Meeks Research Inc
Priority date: 2008-09-05
Filing date: 2009-09-04
Publication date: 2016-01-20
Anticipated expiration: 2029-09-04
Also published as: EP2352827A4; RU2011108531A; AU2009289602A1; IL211553A0; CA2735937A1; AU2009289602B2; KR101341876B1; WO2010028236A1; US20100185419A1; BRPI0918970A2; HK1169139A1; SG193859A1; NZ621143A; CN105574346A; KR20110084169A; NZ603495A; EP2352827A1; JP2012501654A; CN102405284A; RU2542963C2

Abstract

本申请涉及一种设计与目标多肽共价结合的抑制剂的算法和方法。该算法和方法能用于快速有效地将可逆抑制剂转化成不可逆抑制剂。

Description

设计不可逆抑制剂的算法

背景技术

抑制多肽（例如酶）的活性的化合物是重要的治疗剂。大部分抑制剂与其目标多肽可逆结合，并可逆地抑制其目标多肽的活性。

尽管可逆抑制剂已经发展成为有效的治疗剂，但是可逆抑制剂具有某些缺陷。例如许多激酶的可逆抑制剂与ATP-结合位点相互作用。因为ATP-结合位点的结构在激酶中是高度保守的，这对于发展选择性抑制一种或多种期望的激酶的可逆抑制剂具有很大的挑战。此外，因为可逆抑制剂与其目标多肽是分离的，抑制时间可能短于期望值。因而，当使用可逆抑制剂作为治疗剂时，需要比期望的给予更高剂量和/或更频繁地给予，以便实现预期的生物效应。这会产生毒性或导致其它非期望效应。

描述了与其目标多肽共价结合的不可逆抑制剂。相对于可逆的对应物，目标药物的共价不可逆抑制剂用于治疗具有许多重要的优势。延长对目标药物的抑制对于最高药效作用可能是需要的，而不可逆抑制剂可通过永久消除现存目标药物的活性（仅在新目标多肽被合成时会恢复）来提供这种优势。当给予不可逆抑制剂时，不可逆抑制剂的治疗血浆浓度仅需要达到使目标多肽短暂地暴露于抑制剂，其会不可逆地抑制目标的活性。然后血浆水平会快速地下降，同时目标多肽保持失活。这具有以下潜在优势：降低发生治疗活性的最小血浆浓度，最小化多次给药需求，并消除长的血浆半衰期的要求且没有妥协功效（compromisingefficacy）。所有这些事项会降低毒性，因为在高或延长的血浆水平下可能会出现任何脱靶作用（offtargetinteraction）。不可逆抑制剂或许还具有克服药物抗性的优势。

US2007/0082884描述了结构生物信息学在鉴别几个激酶结合位点上的Cys中的应用，这些Cys可用于被小分子抑制剂修饰。文章还描述了与所鉴别的Cys形成共价键的化合物的制备。Panetal.ChemMedChem2(1):58-61(2007)描述了从筛选活动（screeningcampaign）中鉴别能够抑制布鲁顿酪氨酸激酶（BTK）的框架（scaffold），基于该框架制备一系列化合物，和鉴别BTK的共价抑制剂。Wissneretal,J.Med.Chem.48(24):7560-81(2005)描述了一系列化合物的制备方法，所述化合物是血管内皮生长因子受体-2（VEGFR2）激酶的共价不可逆抑制剂。这些化合物含有喹唑啉核心结构和高度反应性的醌。这些参考文献都未描述设计不可逆抑制剂或设计已知可逆抑制剂的不可逆同类物的普遍化方法。这种方法可显著减少开发不可逆抑制剂的时间和成本。

发明内容

本发明涉及设计目标多肽的不可逆抑制剂的算法和方法。通过本文所述的算法和方法设计的不可逆抑制剂与目标多肽侧链的氨基酸形成共价键。目前，使用本发明可以有效地由已知的可逆抑制剂设计不可逆抑制剂。这种方法减少了与药物发现和开发相关的传统筛选和结构活性关系开发方法的时间和成本。该算法和方法包括在候选不可逆抑制剂和目标多肽之间形成键。

该算法和方法包括：A)提供与目标多肽结合位点结合的可逆抑制剂的结构模型，其中，所述可逆抑制剂与结合位点非共价接触；B)当可逆抑制剂与结合位点结合时，鉴别邻近该可逆抑制剂的目标多肽结合位点上的Cys残基；C)建立与目标多肽共价结合的候选抑制剂的结构模型，其中，每个候选抑制剂含有与可逆抑制剂的可取代位置键合的弹头，该弹头含有反应性化学功能（reactivechemicalfunctionality）和可选地使反应性化学功能处于目标多肽结合位点上的Cys残基的键合距离（bondingdistance）之内的连接体；D)确定可逆抑制剂的可取代位置，所述可取代位置使得在候选抑制剂与结合位点结合时，所述弹头的反应性化学功能处于目标多肽结合位点上的Cys残基的键合距离之内；E)对于含有在候选抑制剂与结合位点结合时处于目标多肽结合位点上的Cys残基的键合距离之内的弹头的候选抑制剂，在候选抑制剂与结合位点结合时在结合位点Cys残基的硫原子和弹头的反应性化学功能之间形成共价键。对于在结合位点Cys残基的硫原子和弹头的反应性化学功能之间形成的键，小于约2埃的共价键长度表明该候选抑制剂将会是与目标多肽共价结合的抑制剂。

附图说明

图1A-1Q示出了114个可用于本发明的示例性弹头的结构，以及每个弹头与目标多肽中的Cys残基形成的巯基加合物。在所述巯基加合物中，Cys侧链上的硫原子与弹头和Cys残基的β碳结合，而Cys残基的β碳与R结合。R表示目标多肽的剩余部分。

图2A是c-KIT的ATP-结合位点中化合物1的模型的图像。也显示了目标Cys残基，c-KIT的Cys788。

图2B是c-KIT的ATP-结合位点中化合物1的模型的图像。在此图中，化合物1与c-KIT的Cys788形成共价键。

图3A是FLT3的ATP-结合位点中化合物4的模型的图像。也显示了目标Cys残基，FLT3的Cys828。

图3B是FLT3的ATP-结合位点中化合物4的模型的图像。在此图中，化合物4与FLT3的Cys828形成共价键。

图4A是化合物5在丙肝病毒（HCV）蛋白酶，更具体的是该病毒的NS3/4AHCV蛋白酶组分的结合位点中的模型的图像。也显示了目标Cys残基，HCV蛋白酶的Cys159。

图4B是化合物5在HCV蛋白酶的结合位点中的模型的图像。在此图中，化合物5与HCV蛋白酶的Cys159形成共价键。

图5描述了参考化合物（referencecompound）和化合物2对于EOL-1细胞的细胞增殖的剂量响应抑制。

图6描述了在使用EOL-1细胞的“洗脱”实验中，参考化合物和化合物2对于PDGFR的抑制。

图7描述了用化合物3处理的PDGFR的胰蛋白酶消化的质谱分析结果。结果证实了化合物3与Cys814形成了键。

图8描述了用化合物5处理的NS3/4AHCV蛋白酶的质谱分析结果。结果显示了化合物5处理的HCV蛋白酶在质量上增加了，与蛋白和化合物5之间的加合物的形成一致。其中，Cys159被Ser替换的HCV蛋白酶的突变形式不能形成该加合物。

图9描述了用化合物6处理的HCVNS3/4A蛋白酶的质谱分析结果。结果显示了化合物6处理的HCV蛋白酶在质量上增加了，与蛋白和化合物6之间的加合物的形成一致。其中Cys159被Ser替换的HCV蛋白酶的突变形式不能形成该加合物。

图10A和10B显示了在cKIT磷酸化试验（10A）和测量ERK磷酸化的下游信号转导试验（10B）中，不可逆抑制剂化合物7相对于索拉非尼（sorafenib）的延长抑制cKIT活性的柱状图。

图11描述了用化合物8处理的HCVNS3/4A蛋白酶的质谱分析结果。该结果显示了化合物8处理的HCV蛋白酶在质量上增加了，与蛋白和化合物8之间的加合物的形成一致。

具体实施方式

定义

如本文所用的，“邻近”是指当可逆抑制剂结合到目标多肽时，目标多肽中的氨基酸残基靠近可逆抑制剂。例如，当可逆抑制剂结合到目标多肽时，若氨基酸残基的任何非氢原子是在可逆抑制剂的任何非氢原子的约约约约约约约约约或约之内，即目标多肽中的氨基酸残基邻近可逆抑制剂。当可逆抑制剂结合到目标多肽时，接触可逆抑制剂的目标多肽中的氨基酸残基邻近可逆抑制剂。

如本文所用的，“可取代位置”是指与其它原子或化学基团（例如氢）结合的可逆抑制剂中的非氢原子，其可以被替换和/或移除而不影响可逆抑制剂与目标多肽的结合。

如本文所用的，当可逆抑制剂在目标结合位点的结合模式和滞留时间（residencetime）没有显著变化时，可逆抑制剂的结合“不受影响”。例如当在适合试验中（例如IC50，Ki），抑制剂的效力变化小于1000分之一，小于100分之一或小于10分之一，则可逆抑制剂的结合不受影响。

如本文所用的，“键合距离”是指不大于约不大于约或不大于约的距离。

如本文所用的，“共价键”和“价键”是指两个原子之间通过共用电子（通常是成对的，由键合原子提供）建立的化学键。

如本文所用的，“非共价键”是指不涉及共价键形成的原子和/或分子之间的相互作用。

如本文所用的，“不可逆抑制剂”是通过基本永久共价键（substantiallypermanentcovalentbond）与目标多肽共价键合，并且抑制目标多肽的活性的时间久于蛋白功能寿命（functionallife）的化合物。不可逆抑制剂通常具有时间依赖性的特征，即，目标多肽的抑制程度会随着目标多肽与不可逆抑制剂的接触时间而增强，直至活性消失。当目标多肽被不可逆抑制剂抑制时，其活性的恢复依赖于新蛋白的合成。被不可逆抑制剂抑制的目标多肽的活性在“洗脱（washout）”研究中保持被完全抑制。确定化合物是否为不可逆抑制剂的适宜方法是本领域公知的。例如，可使用以下方法鉴别或确认不可逆抑制：化合物和目标多肽的抑制曲线的动力学分析（例如竞争，反竞争，非竞争），在抑制剂化合物的存在下，使用修饰的蛋白药物目标的质谱法，不连续曝光，也称为“洗脱”研究，使用标记，例如放射性标记的抑制剂，以显示酶的共价修饰，或本领域技术人员已知的其他方法。在特定优选实施方式中，目标多肽具有催化活性，而不可逆抑制剂与非催化残基的Cys残基形成共价键。

如本文所用的，“可逆抑制剂”是与目标多肽可逆结合并抑制目标多肽活性的化合物。可逆抑制剂可与其目标多肽非共价结合或通过包括暂时共价键（transientcovalentbond）的机制结合。被可逆抑制剂抑制的目标多肽活性的恢复可通过从目标多肽上解离可逆抑制剂发生。当可逆抑制剂在洗脱研究中被“洗脱”时，目标多肽活性即恢复。优选的可逆抑制剂是其目标多肽活性的“有效”抑制剂。“有效”可逆抑制剂抑制其目标多肽的活性的IC₅₀为约50μM或更低，约1μM或更低，约100nM或更低，或约1nM或更低，和/或K_i为约50μM或更低，约1μM或更低，约100nM或更低，或约1nM或更低。

术语“IC₅₀”和“抑制浓度50”是本领域公知的术语，表示将感兴趣的生物过程的活性抑制50%的分子浓度，包括但不限于催化活性，细胞活力（cellviability），蛋白翻译活性等。

术语“K_i”和“抑制常数”是本领域公知的术语，是多肽（例如酶）-抑制剂复合物的解离常数。

如本文所用的，“基本永久共价键”是抑制剂和目标多肽之间的共价键，其在生理条件下可坚持比目标多肽功能寿命更久的时间。

如本文所用的，“暂时共价键”是抑制剂与目标多肽之间的共价键，其在生理条件下可坚持比目标多肽功能生命更短的时间。

如本文所用的，“弹头”是含有反应性化学功能或反应性功能基团和可选地含有连接体部分的化学基团。反应性功能基团可与氨基酸残基形成共价键，例如：半胱氨酸（即半胱氨酸侧链的-SH基团），或存在于目标蛋白的结合口袋中的能够被共价修饰的其他氨基酸残基，从而不可逆地抑制目标多肽。下文定义和描述的-L-Y基团提供了共价且不可逆的抑制蛋白的这种弹头基团。

术语“电脑模拟（insilico）”是本领域都理解的术语，是指在计算机上实施的方法和过程，例如，使用计算机建模程序，计算化学，分子图形（moleculargraphics），分子建模等，以便建立计算机模拟。

如本文所用的，术语“计算机建模程序”是指处理蛋白和小分子的可视化和工程的计算机软件程序，包括但不限于计算化学，化学信息学，能量计算，蛋白建模等。这种程序的实例是本领域普通技术人员已知的，本文将提供特定实施例。

如本文所用的，术语“序列比对”是指两个或多个蛋白或核酸序列的排列，其可实现比较和突出它们的相似性（或区别）。序列比对的方法和计算机程序是公知的（例如BLAST）。序列可以用缺口填补（通常表示为破折号）以便如果可能的话，各列含有涉及的序列中相同或相似的符号。

如本文所用的，术语“晶体”是指任何可衍射X射线的分子的三维有序排列。

如本文所用的，术语“原子坐标”和“结构坐标”是指数学坐标（表示为“X”,“Y”和“Z”值），其描述了原子在蛋白的三维模型/结构或实验结构（experimentalstructure）中的位置。

如本文所用的，术语“同源建模”是指由同源物的现有三维结构衍生出大分子三维结构的模型的操作。同源模型是使用计算机程序获得的，其可能改变一些位置上残基的同一性，在这些位置上，感兴趣分子的序列已不同于已知结构分子的序列。

如本文所用的，“计算化学”涉及对分子的物理和化学性质的计算。

如本文所用的，“分子图形”是指优选在计算机屏幕上显示的原子的二维或三维表示法。

如本文所用的，“分子建模”是指用或不用计算机来制造的一个或多个模型，和可选地进行关于配体的结构活性关系的预测的方法或程序。分子建模中使用的方法从分子图形到计算化学。

本发明涉及设计目标多肽（例如酶）的不可逆抑制剂的算法和方法。使用本发明设计的不可逆抑制剂能够有效地、选择性地抑制目标多肽。通常的，本发明是合理的算法和设计方法，其中，通过目标多肽的结构，目标多肽可逆抑制剂的结构，和可逆抑制剂与目标多肽的相互作用来指导设计选择。使用本发明方法设计的不可逆抑制剂或候选不可逆抑制剂包括结合了一个或多个弹头的模板或框架。得到的化合物具有对目标多肽的结合亲合力，一旦结合，弹头与目标多肽结合位点上的Cys残基反应形成共价键，导致目标多肽的不可逆抑制。

本发明提供了设计与目标多肽共价结合的抑制剂的方法。该方法包括提供与目标多肽结合位点结合的可逆抑制剂的结构模型。该可逆抑制剂与结合位点非共价接触。使用结构模型，确认目标多肽结合位点上的Cys残基，其在可逆抑制剂结合到结合位点时邻近该可逆抑制剂。可以确认单个Cys残基，所有Cys残基或所需数量的Cys残基，这些Cys残基在可逆抑制剂结合到结合位点时邻近可逆抑制剂。

建立了一个或多个候选抑制剂的结构模型，其被设计为与目标多肽共价结合。候选抑制剂含有与可逆抑制剂可取代位置结合的弹头。弹头含有反应性化学功能和可选的连接体，所述反应性化学功能能够与Cys残基侧链中的巯基基团反应并形成共价键，所述连接体使反应性化学功能处于目标多肽结合位点中鉴别的Cys残基之一的键合距离之内。鉴别可逆抑制剂的可取代位置，该可取代位置导致在候选抑制剂结合到结合位点时，弹头的反应性化学功能处于目标多肽结合位点中鉴别的Cys残基的键合距离之内。

通过当候选抑制剂结合到结合位点时在结合位点中的Cys残基的硫原子和弹头的反应性化学功能之间形成共价键，来确定含有弹头的候选不可逆抑制剂是否可能是与目标多肽共价结合的抑制剂，以及优选为目标多肽的不可逆抑制剂，所述弹头附着在鉴别的可取代位置上，并在候选抑制剂结合到结合位点时处于目标多肽结合位点中鉴别的Cys残基的键合距离之内。形成于结合位点上的Cys残基的硫原子和弹头的反应性化学功能之间的键的共价键长度约为2.1埃至约1.5埃，或小于约2埃，则表明该候选抑制剂是与目标多肽共价结合的抑制剂。

本发明的方法能使用任何适宜的结构模型，例如物理模型或优选为分子图形实施。该方法可以手动或自动实施。优选地，该方法由电脑模拟实施。

由之前和以下更具体的描述可明显看出，在概念上，本发明的算法和方法包括：A)提供目标和可逆抑制剂；B)鉴别目标半胱氨酸；C)建立含有弹头的候选抑制剂的结构模型；D)确定弹头与目标半胱氨酸的接近度；和E)形成共价键。

A)提供目标和可逆抑制剂

本发明包括提供与目标多肽结合位点结合的可逆抑制剂的结构模型，其中，可逆抑制剂与所述结合位点非共价接触。可以提供并使用与目标多肽结合位点结合的可逆抑制剂的任何适宜的结构模型。通常地，已知的或预先存在的目标多肽的有效可逆抑制剂可用于为使用本发明的设计与目标多肽共价结合的抑制剂提供起点（例如模板或框架）。因而，例如当目标蛋白的可逆抑制剂之前已被鉴别时（例如在文献中报道或通过本领域普通技术人员已知的任何方法鉴别），已知可逆抑制剂可用于构建与抑制剂复合的目标多肽的结构模型。然而，如果希望，可使用新的或之前未知的可逆抑制剂构建与抑制剂复合的目标多肽的结构模型。

算法和方法可使用任何适宜的可逆抑制剂，例如有效可逆抑制剂，弱可逆抑制剂或中等效力的可逆抑制剂，来设计不可逆抑制剂。例如，如实施例8所述的，本发明的算法和方法可通过设计与目标蛋白共价结合的能力来增强可逆抑制剂的效力。在一些实施方式中，所述算法和方法采用有效可逆抑制剂的结构。在其它实施方式中，所述算法和方法可通过设计共价结合来改善效力，并采用弱或中等效力的抑制剂的结构，例如抑制剂的IC₅₀或K_i是≥10nM，≥100nM，约1μM和约10nM之间，约1μM和约100nM之间，约100μM和1μM之间，或约1mM和约1μM之间。

许多适宜的目标多肽的三维结构是已知的并易于从公开来源获得，例如ResearchCollaboratoryforStructuralBioinformaticsProteinDataBank（RCSBPDB可在www.pdb.org上在线使用，也可参见H.M.Bermanetal.;.NucleicAcidsResearch,28pp.235-242(2000)和www.rcsb.org），和worldwideProteinDataBank（wwPDB;Bermanetal,NatureStructuralBiology10(12):980(2003)）。表1中列出了适宜的目标多肽的非限制性列表，其结构可从ProteinDataBank获得。如果希望，可使用任何适宜的方法获得目标蛋白的三维结构。确定结构的适宜方法是本领域公知和常用的，例如液相核磁共振（NMR）谱，固相NMR谱，X射线结晶学等（参见例如Blow，D,OutlineofCrystallographyforBiologists.Oxford:OxfordUniversityPress.ISBN0-19-851051-9(2002).）。

也可使用公知和常用的计算机建模方法，例如同源建模，或基于例如蛋白质一级和二级结构的折叠研究，建立目标多肽的结构模型。建立同源模型的适宜方法是本领域公知的（参见例如，John,B.andSali,A.NucleicAcidRes31(4):3982-92(2003).）。同源建模的适宜程序包括例如Modeler（Accelrys,Inc.SanDiego）和Prime（SchrodingerInc.,NewYork）。例如，如本文实施例3所述的，基于极光激酶（Aurorakinase）的已知结构建立了FLT3激酶的同源模型。表2中列出了适宜的目标多肽的非限制性列表，其序列信息是可以获得的并可用于建立同源模型。优选的结构模型是使用与可逆抑制剂复合的目标多肽，或至少为目标多肽的结合位点的原子坐标建立的。这些与可逆抑制剂复合的许多目标多肽的原子坐标可从ProteinDataBank获得，并可使用X射线结晶学，核磁共振谱，使用同源建模等确定。

类似地，基于已知原子坐标或使用其它适宜方法可建立单独的或与目标多肽复合的可逆抑制剂的结构模型。将抑制剂对接目标蛋白的适宜方法和程序是本领域公知的（参见例如Perolaetal.,Proteins:Structure,Function,andBioinformatics56:235-249(2004).）。通常地，如果与目标多肽复合的可逆抑制剂的结构是未知的，复合物的模型可根据可逆抑制剂合适或可能的结合模式建立。本领域普通技术人员基于例如可逆抑制剂与已知结合模式的其它抑制剂的结构相似性容易地鉴别可逆抑制剂的合适或可能的结合模式。例如，如实施例5所述的，HCV蛋白酶与多于10种不同的抑制剂的复合物结构是已知的，并揭示了这些抑制剂在其与蛋白酶结合的模式中都具有结构相似性。根据可逆抑制剂V-1的可能的结合模式的这些知识，可建立与HCV蛋白酶复合的V-1的结构模型，并用于成功地设计与HCV蛋白酶的Cys159共价结合的不可逆抑制剂。

与目标多肽结合位点结合的可逆抑制剂的结构模型优选是计算机模型。该计算机模型可使用任何适宜软件建立并可视化，例如VIDA^TM，可视化软件，（OpenEyeScientificSoftware,NewMexico)，Insight或Discovery图像分子建模软件（AccelrysSoftwareInc.,SanDiego,CA）。

B)鉴别目标半胱氨酸

本发明包括在可逆抑制剂结合到结合位点时，鉴别邻近该可逆抑制剂的目标多肽结合位点上的Cys残基。使用与可逆抑制剂复合的目标多肽的结构模型，鉴别适宜用于与弹头形成共价键的目标多肽的Cys残基。适宜用于与弹头形成共价键的Cys残基邻近结构模型中的可逆抑制剂。使用任何适宜的确定分子间距离的方法可鉴别在结构模型中邻近可逆抑制剂的Cys残基。在计算机模型中，计算分子间距离的几个程序是本领域公知的，例如VIDA^TM,可视化软件，（OpenEyeScientificSoftware,NewMexico），DiscoveryStudio，可视化软件（Accelrys,Inc.SanDiego）等。

在一个实施例中，确定了目标多肽结合位点上所有Cys残基的所有非氢原子和可逆抑制剂的所有非氢原子之间的分子间距离（例如：以埃计）。邻近可逆抑制剂的Cys残基易于由这些分子间距离鉴别。通常优选地，邻近的Cys残基处于可逆抑制剂的约10埃，约8埃，或约6埃之内。

如果希望，可通过分析目标多肽上Cys残基的可及表面上的变化来鉴别邻近可逆抑制剂的Cys残基。这可通过以下方法实现，例如，在目标多肽与可逆抑制剂复合时，以及目标多肽不与可逆抑制剂复合时，确定目标多肽上Cys残基的可及表面积（例如目标多肽的抑制剂结合位点）。当可逆抑制剂与目标多肽复合时，可及表面积变化的Cys残基可能邻近可逆抑制剂。关于表面可及性参见例如Lee,B.andRichared,F.M.,J.Mol.Biol.55:379-400(1971)。如果希望，这可以通过确定分子间距离得到确认。

C)建立含有弹头的候选抑制剂的结构模型

本发明包括建立被设计为与目标多肽共价结合的候选抑制剂的结构模型，其中，每个候选抑制剂含有与可逆抑制剂的可取代位置结合的弹头。通过在可逆抑制剂可取代位置上添加弹头基团，来设计可与邻近Cys残基形成共价键的候选抑制剂。例如，弹头可与邻近目标多肽上Cys残基的不饱和碳原子键合。在另一实施例中，在可逆抑制剂目标多肽复合物中，可逆抑制剂的部分将Cys残基封闭或部分封闭了。在这种情况中，可逆抑制剂的部分可被去除并用适宜的弹头替换以产生与Cys残基共价结合的抑制剂，该Cys残基被可逆抑制剂封闭或部分封闭。当可逆抑制剂被去除并用弹头替换的部分被去除后不会影响可逆抑制剂的结合时，则这种方法是适宜的。可容易地鉴别被去除且不影响结合的可逆抑制剂的部分，其包括，例如不参与和目标多肽形成氢键，范德华相互作用和/或疏水相互作用的部分。

所述弹头含有反应性化学功能，其可与Cys侧链反应并在反应性化学功能和Cys侧链的硫原子之间形成共价键。弹头可选地含有连接体，该连接体使反应性化学功能处于目标多肽结合位点上Cys侧链的键合距离之内。可根据所期望的与Cys侧链的反应性程度选择弹头。当存在连接体时，连接体用于使反应性化学功能处于目标Cys残基的键合距离之内。例如，当邻近的Cys残基与可逆抑制剂相离过远，而不能将反应性化学功能直接键合到可逆抑制剂的可取代位置上时，可通过适宜的连接体将反应性化学功能与可逆抑制剂的可取代位置键合，所述适宜的连接体例如二价（bivalent）C₁-C₁₈饱和或不饱和，直链或支链的烃链。

适宜的弹头的实例包括本文公开的那些，例如图1中的。一些适宜的弹头符合化学式*-X-L-Y，其中*表示可逆抑制剂的可取代位置的附着点。

X是键或二价C₁-C₆饱和或不饱和，直链或支链的烃链，其中，烃链中任选地一个，两个或三个亚甲基单位可独立地被-NR-，-O-，-C(O)-，-OC(O)-，-C(O)O-，-S-，-SO-，-SO₂-，-C(=S)-，-C(=NR)-，-N=N-，或-C(=N₂)-所替代。

L是共价键或二价C_1-8饱和或不饱和，直链或支链的烃链，其中，L中的一个，两个或三个亚甲基单位可任选且独立地被环丙烯，-NR-，-N(R)C(O)-，-C(O)N(R)-，-N(R)SO₂-，-SO₂N(R)-，-O-，-C(O)-，-OC(O)-，-C(O)O-，-S-，-SO-，-SO₂-，-C(=S)-，-C(=NR)-，-N=N-，或-C(=N₂)-所替代。

Y是氢，任选地被氧，卤素，NO₂，或CN取代的C_1-6脂肪族，或具有0-3个独立地选自氮，氧，或硫的杂原子的，饱和或部分不饱和的3-10元单环或双环，或芳环，其中，所述环被1-4个R^e基团取代；和

每个R^e独立地选自-Q-Z，氧，NO₂，卤素，CN，适宜的离去基团，或任选地被氧，卤素，NO₂，或CN取代的C_1-6脂肪族，其中：

Q是共价键或二价C_1-6饱和或不饱和，直链或支链的烃链，其中，Q中的一个或两个亚甲基单位任选且独立地被-N(R)-，-S-，-O-，-C(O)-，-OC(O)-，-C(O)O-，-SO-，或-SO₂-，-N(R)C(O)-，-C(O)N(R)-，-N(R)SO₂-，或-SO₂N(R)-所替代；和

Z是氢或任选地被氧，卤素，NO₂，或CN取代的C_1-6脂肪族。

在一些实施方式中，X是键，-O-，-NH-，-S-，-O-CH₂-C≡C-，-NH-CH₂-C≡C-，-S-CH₂-C≡C-，-O-CH₂-CH₂-O-，-O-(CH₂)₃-，或-O-(CH₂)₂-C(CH₃)₂-。

在特定实施方式中，L是共价键。

在特定实施方式中，L是二价C_1-8饱和或不饱和，直链或支链的烃链。在特定实施方式中，L是-CH₂-。

在特定实施方式中，L是共价键，-CH₂-，-NH-，-CH₂NH-，-NHCH₂-，-NHC(O)-，-NHC(O)CH₂OC(O)-，-CH₂NHC(O)-，-NHSO₂-，-NHSO₂CH₂-，-NHC(O)CH₂OC(O)-，或-SO₂NH-。

在一些实施方式中，L是二价C_2-8直链或支链的烃链，其中，L具有至少一个双键而L中的一个或两个其它亚甲基单位任选且独立地被-NRC(O)-，-C(O)NR-，-N(R)SO₂-，-SO₂N(R)-，-S-，-S(O)-，-SO₂-，-OC(O)-，-C(O)O-，环丙烯，-O-，-N(R)-，或-C(O)-所替代。

在特定实施方式中，L是二价C_2-8直链或支链的烃链，其中，L具有至少一个双键而L中的至少一个亚甲基单位被-C(O)-，-NRC(O)-，-C(O)NR-，-N(R)SO₂-，-SO₂N(R)-，-S-，-S(O)-，-SO₂-，-OC(O)-，或-C(O)O-所替代，和L中的一个或两个其它亚甲基单位任选且独立地被环丙烯，-O-，-N(R)-，或-C(O)-所替代。

在一些实施方式中，L是二价C_2-8直链或支链的烃链，其中，L具有至少一个双键而L中的至少一个亚甲基单位被-C(O)-所替代，和L中的一个或两个其它亚甲基单位任选且独立地被环丙烯，-O-，-N(R)-，或-C(O)-所替代。

如上所述，在特定实施方式中，L是二价C_2-8直链或支链的烃链，其中，L具有至少一个双键。本领域普通技术人员将识别这种双键可存在于烃链骨架内或可在链骨架“之外”，从而形成烷叉基。通过举例方式，这种具有烷叉支链的L基团包括-CH₂C(=CH₂)CH₂-。因此，在一些实施方式中，L是二价C_2-8直链或支链的烃链，其中，L具有至少一个烷叉双键（alkylidenyldoublebond）。示例性的L基团包括-NHC(O)C(=CH₂)CH₂-。

在特定实施方式中，L是二价C_2-8直链或支链的烃链，其中，L具有至少一个双键而L中的至少一个亚甲基单位被-C(O)-所替代。在特定实施方式中，L是-C(O)CH=CH(CH₃)-，-C(O)CH=CHCH₂NH(CH₃)-，-C(O)CH=CH(CH₃)-，-C(O)CH=CH-，-CH₂C(O)CH=CH-，-CH₂C(O)CH=CH(CH₃)-，-CH₂CH₂C(O)CH=CH-，-CH₂CH₂C(O)CH=CHCH₂-，-CH₂CH₂C(O)CH=CHCH₂NH(CH₃)-，或-CH₂CH₂C(O)CH=CH(CH₃)-，或-CH(CH₃)OC(O)CH=CH-。

在特定实施方式中，L是二价C_2-8直链或支链的烃链，其中，L具有至少一个双键而L中的至少一个亚甲基单位被-OC(O)-所替代。

在一些实施方式中，L是二价C_2-8直链或支链的烃链，其中，L具有至少一个双键而L中的至少一个亚甲基单位被-NRC(O)-，-C(O)NR-，-N(R)SO₂-，-SO₂N(R)-，-S-，-S(O)-，-SO₂-，-OC(O)-，或-C(O)O-所替代，以及L中的一个或两个其它亚甲基单位任选且独立地被环丙烯，-O-，-N(R)-，或-C(O)-所替代。在一些实施方式中，L是-CH₂OC(O)CH=CHCH₂-，-CH₂-OC(O)CH=CH-，或-CH(CH=CH₂)OC(O)CH=CH-。

在特定实施方式中，L是-NRC(O)CH=CH-，-NRC(O)CH=CHCH₂N(CH₃)-，-NRC(O)CH=CHCH₂O-，-CH₂NRC(O)CH=CH-，-NRSO₂CH=CH-，-NRSO₂CH=CHCH₂-，-NRC(O)(C=N₂)C(O)-，-NRC(O)CH=CHCH₂N(CH₃)-，-NRSO₂CH=CH-，-NRSO₂CH=CHCH₂-，-NRC(O)CH=CHCH₂O-，-NRC(O)C(=CH₂)CH₂-，-CH₂NRC(O)-，-CH₂NRC(O)CH=CH-，-CH₂CH₂NRC(O)-，或-CH₂NRC(O)环丙烯-，其中，每个R独立地为氢或任选地被C_1-6脂肪族所取代。

在特定实施方式中，L是NHC(O)CH=CH-，-NHC(O)CH=CHCH₂N(CH₃)-，-NHC(O)CH=CHCH₂O-，-CH₂NHC(O)CH=CH-，-NHSO₂CH=CH-，-NHSO₂CH=CHCH₂-，-NHC(O)(C=N₂)C(O)-，-NHC(O)CH=CHCH₂N(CH₃)-，-NHSO₂CH=CH-，-NHSO₂CH=CHCH₂-，-NHC(O)CH=CHCH₂O-，-NHC(O)C(=CH₂)CH₂-，-CH₂NHC(O)-，-CH₂NHC(O)CH=CH-，-CH₂CH₂NHC(O)-，或-CH₂NHC(O)环丙烯-。

在一些实施方式中，L是二价C_2-8直链或支链的烃链，其中，L具有至少一个叁键。在特定实施方式中，L是二价C_2-8直链或支链的烃链，其中，L具有至少一个叁键而L中的一个或两个其它亚甲基单位任选且独立地被-NRC(O)-，-C(O)NR-，-S-，-S(O)-，-SO₂-，-C(=S)-，-C(=NR)-，-O-，-N(R)-，或-C(O)-所替代。在一些实施方式中，L具有至少一个叁键而L中的至少一个亚甲基单位被-N(R)-，-N(R)C(O)-，-C(O)-，-C(O)O-，或-OC(O)-，或-O-所替代。

示例性L基团包括-C≡C-，-C≡CCH₂N(异丙基)-，-NHC(O)C≡CCH₂CH₂-，-CH₂-C≡C-CH₂-，-C≡CCH₂O-，-CH₂C(O)C≡C-，-C(O)C≡C-，或-CH₂OC(=O)C≡C-。

在特定实施方式中，L是二价C_2-8直链或支链的烃链，其中，L中的一个亚甲基单位被环丙烯所替代，以及L中的一个或两个其它亚甲基单位独立地被-C(O)-，-NRC(O)-，-C(O)NR-，-N(R)SO₂-，或-SO₂N(R)-所替代。示例性的L基团包括-NHC(O)-环丙烯-SO₂-和-NHC(O)-环丙烯-。

如上通常所定义的，Y是氢，任选地被氧，卤素，NO₂，或CN取代的C_1-6脂肪族，或具有0-3个独立地选自氮，氧，或硫的杂原子的，饱和或部分不饱和的3-10元单环或双环，或芳环，其中，所述环被1-4个R^e基团取代，每个R^e独立地选自-Q-Z，氧，NO₂，卤素，CN，或C_1-6脂肪族，其中，Q是共价键或二价C_1-6饱和或不饱和，直链或支链的烃链，其中，Q中的一个或两个亚甲基单位任选且独立地被-N(R)-，-S-，-O-，-C(O)-，-OC(O)-，-C(O)O-，-SO-，或-SO₂-，-N(R)C(O)-，-C(O)N(R)-，-N(R)SO₂-，或-SO₂N(R)-所替代；以及，Z是氢或任选地被氧，卤素，NO₂，或CN取代的C_1-6脂肪族。

在特定实施方式中，Y是氢。

在特定实施方式中，Y是任选地被氧，卤素，NO₂，或CN取代的C_1-6脂肪族。在一些实施方式中，Y是任选地被氧，卤素，NO₂，或CN取代的C_2-6烯基。在其它实施方式中，Y是任选地被氧，卤素，NO₂，或CN取代的C_2-6炔基。在一些实施方式中，Y是C_2-6烯基。在其它实施方式中，Y是C_2-4炔基。

在其它实施方式中，Y是任选地被氧，卤素，NO₂，或CN取代的C_1-6烷基。这种Y基团包括-CH₂F，-CH₂C_l，-CH₂CN，和-CH₂NO₂。

在特定实施方式中，Y是具有0-3个独立地选自氮，氧，或硫的杂原子的饱和3-6元单环，其中，Y被1-4个R^e基团取代，其中，每个R^e如上所定义和本文所述的。

在一些实施方式中，Y是具有1个选自氧或氮的杂原子的饱和3-4元杂环，其中，所述环被1-2个R^e基团取代，其中，每个R^e如上所定义和本文所述的。示例性的这种环包括环氧化物环和环氧丙烷环，其中，每个环被1-2个R^e基团取代，其中，每个R^e如上所定义和本文所述的。

在一些实施方式中，Y是具有1-2个选自氧或氮的杂原子的饱和5-6元杂环，其中，所述环被1-4个R^e基团取代，其中，每个R^e如上所定义和本文所述的。这种环包括哌啶和吡咯烷，其中，每个环被1-4个R^e基团取代，其中，每个R^e如上所定义和本文所述的。在特定实施方式中，Y是其中，每个R，Q，Z和R^e如上所定义和本文所述的。

在一些实施方式中，Y是3-6元碳环，其中，所述环被1-4个R^e基团取代，其中，每个R^e如上所定义和本文所述的。在特定实施方式中，Y是环丙基，环丁基，环戊基，或环己基，其中，每个环被1-4个R^e基团取代，其中，每个R^e如上所定义和本文所述的。在特定实施方式中，Y是其中，R^e如上所定义和本文所述的。在特定实施方式中，Y是任选地被卤素，CN或NO₂所取代的环丙基。

在特定实施方式中，Y是具有0-3个独立地选自氮，氧，或硫的杂原子的部分不饱和的3-6元单环，其中，所述环被1-4个R^e基团取代，其中，每个R^e如上所定义和本文所述的。

在一些实施方式中，Y是部分不饱和的3-6元碳环，其中，所述环被1-4个R^e基团取代，其中，每个R^e如上所定义和本文所述的。在一些实施方式中，Y是环丙烯基，环丁烯基，环戊烯基，或环己烯基，其中，每个环被1-4个R^e基团取代，其中，每个R^e如上所定义和本文所述的。在特定实施方式中，Y是其中，每个R^e如上所定义和本文所述的。

在特定实施方式中，Y是具有1-2个独立地选自氮，氧，或硫的杂原子的部分不饱和的4-6元杂环，其中，所述环被1-4个R^e基团取代，其中，每个R^e如上所定义和本文所述的。在特定实施方式中，Y选自：其中，每个R和R^e如上所定义和本文所述的。

在特定实施方式中，Y是具有0-2个氮的6元芳环，其中，所述环被1-4个R^e基团取代，其中，每个R^e基团如上所定义和本文所述的。在特定实施方式中，Y是苯基，吡啶基，或嘧啶基，其中，每个环被1-4个R^e基团取代，其中每个R^e如上所定义和本文所述的。

在一些实施方式中，Y选自：

其中，每个R^e如上所定义和本文所述的。

在其他实施方式中，Y是具有1-3个独立地选自氮，氧，或硫的杂原子的5元杂芳环，其中，所述环被1-3个R^e基团取代，其中，每个R^e基团如上所定义和本文所述的。在一些实施方式中，Y是具有1-3个独立地选自氮，氧，或硫的杂原子的5元部分不饱和的，或芳环，其中，所述环被1-4个R^e基团取代，其中，每个R^e基团如上所定义和本文所述的。示例性的这种环是异噁唑基，噁唑基，噻唑基，咪唑基，吡唑基，吡咯基，呋喃基，噻吩基，三唑，噻重氮，和噁二唑，其中，所述环被1-3个R^e基团取代，其中，每个R^e基团如上所定义和本文所述的。在特定实施方式中，Y选自：

其中，每个R和R^e如上所定义和本文所述的。

在特定实施方式中，Y是具有0-3个独立地选自氮，氧，或硫的杂原子的，饱和或部分不饱和的8-10元双环，或芳环，其中，所述环被1-4个R^e基团取代，其中，每个R^e如上所定义和本文所述的。根据另一方面，Y是具有1-3个独立地选自氮，氧，或硫的杂原子的，部分不饱和的9-10元双环，或芳环，其中，所述环被1-4个R^e基团取代，其中，每个R^e如上所定义和本文所述的。示例性的这种环是包括2,3-二氢苯并[d]异噻唑，其中，所述环被1-4个R^e基团取代，其中，R^e如上所定义和本文所述的。

如上通常所定义的，每个R^e基团独立地选自-Q-Z，氧，NO₂，卤素，CN，适宜的离去基团，或任选地被氧，卤素，NO₂,或CN取代的C_1-6脂肪族，其中，Q是共价键或二价C_1-6饱和或不饱和，直链或支链的烃链，其中，Q中的一个或两个亚甲基单位任选且独立地被-N(R)-，-S-，-O-，-C(O)-，-OC(O)-，-C(O)O-，-SO-，或-SO₂-，-N(R)C(O)-，-C(O)N(R)-，-N(R)SO₂-，或-SO₂N(R)-所替代；以及Z是氢或任选地被氧，卤素，NO₂，或CN取代的C_1-6脂肪族。

在特定实施方式中，R^e是任选地被氧，卤素，NO₂，或CN取代的C_1-6脂肪族。在其他实施方式中，R^e是氧，NO₂，卤素或CN。在一些实施方式中，R^e是-Q-Z，其中Q是共价键而Z是氢（即R^e是氢）。在其他实施方式中，R^e是-Q-Z，其中，Q是二价C_1-6饱和或不饱和，直链或支链的烃链，其中，Q中的一个或两个亚甲基单位任选且独立地被-NR-，-NRC(O)-，-C(O)NR-，-S-，-O-，-C(O)-，-SO-，或-SO₂-所替代。在其他实施方式中，Q是具有至少一个双键的二价C_2-6直链或支链的烃链，其中，Q中的一个或两个亚甲基单位任选且独立地被-NR-，-NRC(O)-，-C(O)NR-，-S-，-O-，-C(O)-，-SO-，或-SO₂-所替代。在特定实施方式中，R^e基团的Z部分是氢。在一些实施方式中，-Q-Z是-NHC(O)CH=CH₂或-C(O)CH=CH₂。

在特定实施方式中，每个R^e独立地选自氧，NO₂，CN，氟，氯，-NHC(O)CH=CH₂，-C(O)CH=CH₂，-CH₂CH=CH₂，-C≡CH，-C(O)OCH₂Cl，-C(O)OCH₂F，-C(O)OCH₂CN，-C(O)CH₂Cl，-C(O)CH₂F，-C(O)CH₂CN，或-CH₂C(O)CH₃。

在特定实施方式中，R^e是适宜的离去基团，即进行亲核置换的基团。“适宜的离去基团”是容易被期望引入的化学部分（chemicalmoiety）（例如感兴趣的半胱氨酸的巯基部分）取代的化学基团。适宜的离去基团是本领域公知的，例如参见"AdvancedOrganicChemistry",JerryMarch,5^thEd.,pp.351-357,JohnWileyandSons,N.Y。这些适宜的离去基团包括但不限于卤素，烷氧基，磺酰氧基（sulphonyloxy），任选被取代的烷磺酰氧基（alkylsulphonyloxy），任选被取代的烯磺酰氧基（alkenylsulfonyloxy），任选被取代的芳基磺酰氧基（arylsulfonyloxy），酰基，和重氮基部分。适宜的离去基团的实例包括氯，碘，溴，氟，乙酰基，甲烷磺酰氧基（甲磺酰氧基），甲苯磺酰氧基，三氟氧基（triflyloxy），硝基苯基磺酰氧基（nitrophenylsulfonyloxy）（硝苯磺酰氧基，nosyloxy），和溴苯基磺酰氧基（溴苯磺酰氧基，brosyloxy）。

在特定实施方式中，应用以下-L-Y的实施方式和组合：

(a)L是二价C_2-8直链或支链的烃链，其中，L具有至少一个双键和L中的一个或两个其他亚甲基单位任选且独立地被-NRC(O)-，-C(O)NR-，-N(R)SO₂-，-SO₂N(R)-，-S-，-S(O)-，-SO₂-，-OC(O)-，-C(O)O-，环丙烯，-O-，-N(R)-，或-C(O)-所替代；和Y是氢或任选地被氧，卤素，NO₂,或CN取代的C_1-6脂肪族；或

(b)L是二价C_2-8直链或支链的烃链，其中，L具有至少一个双键和L中的至少一个亚甲基单位被-C(O)-，-NRC(O)-，-C(O)NR-，-N(R)SO₂-，-SO₂N(R)-，-S-，-S(O)-，-SO₂-，-OC(O)-，或-C(O)O-所替代；和L中的一个或两个其他亚甲基单位任选且独立地被环丙烯，-O-，-N(R)-，或-C(O)-所取代；和Y是氢或任选地被氧，卤素，NO₂,或CN取代的C_1-6脂肪族；或

(c)L是二价C_2-8直链或支链的烃链，其中，L具有至少一个双键和L中的至少一个亚甲基单位被-C(O)-所替代；和L中的一个或两个其他亚甲基单位任选且独立地被环丙烯，-O-，-N(R)-，或-C(O)-所取代；和Y是氢或任选地被氧，卤素，NO₂,或CN取代的C_1-6脂肪族；或

(d)L是二价C_2-8直链或支链的烃链，其中，L具有至少一个双键和L中的至少一个亚甲基单位被-C(O)-所替代；和Y是氢或任选地被氧，卤素，NO₂,或CN取代的C_1-6脂肪族；或

(e)L是二价C_2-8直链或支链的烃链，其中，L具有至少一个双键和L中的至少一个亚甲基单位被-OC(O)-所替代；和Y是氢或任选地被氧，卤素，NO₂，或CN取代的C_1-6脂肪族；或

(f)L是-NRC(O)CH=CH-，-NRC(O)CH=CHCH₂N(CH₃)-，-NRC(O)CH=CHCH₂O-，-CH₂NRC(O)CH=CH-，-NRSO₂CH=CH-，-NRSO₂CH=CHCH₂-，-NRC(O)(C=N₂)-，-NRC(O)(C=N₂)C(O)-，-NRC(O)CH=CHCH₂N(CH₃)-，-NRSO₂CH=CH-，-NRSO₂CH=CHCH₂-，-NRC(O)CH=CHCH₂O-，-NRC(O)C(=CH₂)CH₂-，-CH₂NRC(O)-，-CH₂NRC(O)CH=CH-，-CH₂CH₂NRC(O)-，或-CH₂NRC(O)环丙烯-；其中R是H或任选地被取代的C_1-6脂肪族；和Y是氢或任选地被氧，卤素，NO₂,或CN取代的C_1-6脂肪族；或

(g)L是-NHC(O)CH=CH-，-NHC(O)CH=CHCH₂N(CH₃)-，-NHC(O)CH=CHCH₂O-，-CH₂NHC(O)CH=CH-，-NHSO₂CH=CH-，-NHSO₂CH=CHCH₂-，-NHC(O)(C=N₂)-，-NHC(O)(C=N₂)C(O)-，-NHC(O)CH=CHCH₂N(CH₃)-，-NHSO₂CH=CH-，-NHSO₂CH=CHCH₂-，-NHC(O)CH=CHCH₂O-，-NHC(O)C(=CH₂)CH₂-，-CH₂NHC(O)-，-CH₂NHC(O)CH=CH-，-CH₂CH₂NHC(O)-，或-CH₂NHC(O)环丙烯-；和Y是氢或任选地被氧，卤素，NO₂,或CN取代的C_1-6脂肪族；或

(h)L是二价C_2-8直链或支链的烃链，其中，L具有至少一个亚烷基双键和L中的至少一个亚甲基单位被-C(O)-，-NRC(O)-，-C(O)NR-，-N(R)SO₂-，-SO₂N(R)-，-S-，-S(O)-，-SO₂-，-OC(O)-，或-C(O)O-所替代，和L中的一个或两个其他亚甲基单位任选且独立地被环丙烯，-O-，-N(R)-，或-C(O)-所替代；和Y是氢或任选地被氧，卤素，NO₂,或CN取代的C_1-6脂肪族；或

(i)L是二价C_2-8直链或支链的烃链，其中，L具有至少一个三键和L中的一个或两个其他亚甲基单位任选且独立地被-NRC(O)-，-C(O)NR-，-N(R)SO₂-，-SO₂N(R)-，-S-，-S(O)-，-SO₂-，-OC(O)-，或-C(O)O-所替代；和Y是氢或任选地被氧，卤素，NO₂,或CN取代的C_1-6脂肪族；或

(j)L是-C≡C-，-C≡CCH₂N(异丙基)-，-NHC(O)C≡CCH₂CH₂-，-CH₂-C≡C-CH₂-，-C≡CCH₂O-，-CH₂C(O)C≡C-，-C(O)C≡C-，或-CH₂OC(=O)C≡C-；和Y是氢或任选地被氧，卤素，NO₂,或CN取代的C_1-6脂肪族；或

(k)L是二价C_2-8直链或支链的烃链，其中，L中的一个亚甲基单位被环丙烯所替代和L中的一个或两个其他亚甲基单位独立地被-NRC(O)-，-C(O)NR-，-N(R)SO₂-，-SO₂N(R)-，-S-，-S(O)-，-SO₂-，-OC(O)-，或-C(O)O-所替代；和Y是氢或任选地被氧，卤素，NO₂,或CN取代的C_1-6脂肪族；或

(l)L是共价键和Y选自：

(i)被氧，卤素，NO₂，或CN取代的C_1-6的烷基；

(ii)任选地被氧，卤素，NO₂，或CN取代的C_2-6的烯基；或

(iii)任选地被氧，卤素，NO₂，或CN取代的C_2-6的炔基；或

(iv)具有1个选自氧或氮的杂原子的饱和3-4元杂环，其中，所述环被1-2个R^e基团取代，其中，每个R^e如上所定义和本文所述的；或

(v)具有1-2个选自氧或氮的杂原子的饱和5-6元杂环，其中，所述环被1-4个R^e基团取代，其中，每个R^e如上所定义和本文所述的；或

(vi)其中，每个R，Q，Z和R^e如上所定义和本文所述的；或

(vii)饱和3-6元碳环，其中，所述环被1-4个R^e基团取代，其中，每个R^e如上所定义和本文所述的；或

(viii)具有0-3个独立地选自氮，氧或硫的杂原子的部分不饱和的3-6元单环，其中，所述环被1-4个R^e基团取代，其中，每个R^e如上所定义和本文所述的；或

(ix)部分不饱和的3-6元碳环，其中，所述环被1-4个R^e基团取代，其中，每个R^e如上所定义和本文所述的；或

(x)其中，每个R^e如上所定义和本文所述的；或

(xi)具有1-2个独立地选自氮，氧或硫的杂原子的部分不饱和的4-6元杂环，其中，所述环被1-4个R^e基团取代，其中，每个R^e如上所定义和本文所述的；或

(xii)其中，每个R和R^e如上所定义和本文所述的；或

(xiii)具有0-2个氮的6元芳环，其中，所述环被1-4个R^e基团取代，其中，每个R^e基团如上所定义和本文所述的；或

(xiv)其中，每个R^e如上所定义和本文所述的；或

(xv)具有1-3个独立地选自氮，氧或硫的杂原子的5元杂芳环，其中，所述环被1-3个R^e基团取代，其中，每个R^e基团如上所定义和本文所述的；或

(xvi)

其中，每个R和R^e如上所定义和本文所述的；或

(xvii)具有0-3个独立地选自氮，氧或硫的杂原子的，饱和或部分不饱和的8-10元双环，或芳环，其中，所述环被1-4个R^e基团取代，其中，每个R^e如上所定义和本文所述的；

(m)L是-C(O)-和Y选自：

(i)被氧，卤素，NO₂，或CN取代的C_1-6的烷基；

(ii)任选地被氧，卤素，NO₂，或CN取代的C_2-6的烯基；或

(iii)任选地被氧，卤素，NO₂，或CN取代的C_2-6的炔基；或

(iv)具有1个选自氧或氮的杂原子的饱和3-4元杂环，其中所述环被1-2个R^e基团取代，其中，每个R^e如上所定义和本文所述的；或

(v)具有1-2个选自氧或氮的杂原子的饱和5-6元杂环，其中所述环被1-4个R^e基团取代，其中，每个R^e如上所定义和本文所述的；或

(vi)其中，每个R，Q，Z和R^e如上所定义和本文所述的；或

(ix)部分不饱和的3-6元碳环，其中，所述环被1-4个R^e基团取代，其中每个R^e如上所定义和本文所述的；或

(x)其中，每个R^e如上所定义和本文所述的；或

(xii)其中，每个R和R^e如上所定义和本文所述的；或

(xiv)其中，每个R^e如上所定义和本文所述的；或

(xvi)

其中，每个R和R^e如上所定义和本文所述的；或

(n)L是-N(R)C(O)-和Y选自：

(i)被氧，卤素，NO₂，或CN取代的C_1-6的烷基；

(ii)任选地被氧，卤素，NO₂，或CN取代的C_2-6的烯基；或

(iii)任选地被氧，卤素，NO₂，或CN取代的C_2-6的炔基；或

(vi)其中，每个R，Q，Z和R^e如上所定义和本文所述的；或

(x)其中，每个R^e如上所定义和本文所述的；或

(xii)其中，每个R和R^e如上所定义和本文所述的；或

(xiv)其中，每个R^e如上所定义和本文所述的；或

(xvi)

其中，每个R和R^e如上所定义和本文所述的；或

(o)L是二价C_1-8饱和或不饱和，直链或支链的烃链；和Y选自：

(i)被氧，卤素，NO₂，或CN取代的C_1-6的烷基；

(ii)任选地被氧，卤素，NO₂，或CN取代的C_2-6的烯基；或

(iii)任选地被氧，卤素，NO₂，或CN取代的C_2-6的炔基；或

(vi)其中，每个R，Q，Z和R^e如上所定义和本文所述的；或

(x)其中，每个R^e如上所定义和本文所述的；或

(xii)其中，每个R和R^e如上所定义和本文所述的；或

(xiv)其中，每个R^e如上所定义和本文所述的；或

(xvi)

其中，每个R和R^e如上所定义和本文所述的；或

(p)L是共价键，-CH₂-，-NH-，-C(O)-，-CH₂NH-，-NHCH₂-，-NHC(O)-，-NHC(O)CH₂OC(O)-，-CH₂NHC(O)-，-NHSO₂-，-NHSO₂CH₂-，-NHC(O)CH₂OC(O)-，或-SO₂NH-；和Y选自：

(i)被氧，卤素，NO₂，或CN取代的C_1-6的烷基；

(ii)任选地被氧，卤素，NO₂,或CN取代的C_2-6的烯基；或

(iii)任选地被氧，卤素，NO₂,或CN取代的C_2-6的炔基；或

(iv)具有1个选自氧或氮的杂原子的饱和3-4元杂环，其中，所述环被1-2个R^e基团取代，其中每个R^e如上所定义和本文所述的；或

(vi)其中，每个R，Q，Z和R^e如上所定义和本文所述的；或

(x)其中，每个R^e如上所定义和本文所述的；或

(xii)其中，每个R和R^e如上所定义和本文所述的；或

(xiv)其中，每个R^e如上所定义和本文所述的；或

(xvi)

其中，每个R和R^e如上所定义和本文所述的；或

(xvii)具有0-3个独立地选自氮，氧或硫的杂原子的，饱和或部分不饱和的8-10元双环，或芳环，其中，所述环被1-4个R^e基团取代，其中，每个R^e如上所定义和本文所述的。

在特定实施方式中，式I的Y基团选自下表3所列的那些，其中，每条波浪线表示分子中剩余部分的附着点。表2中所描述的每个R^e基团独立地选自卤素。

表3示例性的Y基团

在特定实施方式中，R¹是-C≡CH，-C≡CCH₂NH(异丙基)，-NHC(O)C≡CCH₂CH₃，-CH₂-C≡C-CH₃，-C≡CCH₂OH，-CH₂C(O)C≡CH，-C(O)C≡CH，或-CH₂OC(=O)C≡CH。在一些实施方式中，R¹选自-NHC(O)CH=CH₂，-NHC(O)CH=CHCH₂N(CH₃)₂，或-CH₂NHC(O)CH=CH₂。

在特定实施方式中，R¹选自下表4所列的那些，其中，每条波浪线表示分子中剩余部分的附着点。

表4：示例性的R¹基团

其中，每个R^e独立地为适宜的离去基团，NO₂，CN或氧。

含有弹头的候选抑制剂的结构模型可采用任何适宜的方法建立。例如，如本文所述和所例举的，可使用适宜的分子建模程序在三维方向将弹头建立在可逆抑制剂模板上。所述适宜的建模程序包括Discovery和PipelinePilot^TM(分子建模软件，AccelrysInc．，SanDiego，CA)，Combibuild，Combilibmaker3D，(产生化合物文库的软件，TriposLP，St．Louis，MO)，SMOG(小分子计算组合设计程序，DeWitteandShakhnovich，JAm．Chem．Soc．118：11733—11744(1996)；DeWitteetal，J．Am．Chem．Soc．119：4608-4617(1997)；Shimadaetal，ProteinSci.9：765-775(2000)；Maestro^TM，CombiGlide^TM，Glide^TM和Jaguar^TM(建模软件包，LLC．120West45thStreet．NewYork，NY10036-4041))。弹头可附着在邻近目标多肽上的Cys残基的每个可取代位置上，或附着在期望的所选的可取代位置或单个可取代位置上。可使用任何适宜的方法或程序将弹头附着在化合物上，例如FROG(3D构象生成器；Bohmeetal，NucleicAcidsRes．35(网络服务器发行)：W568-W572(2007)．)，Discovery或PiplinePilot^TM(Accelrys，Inc．，SanDiego)，Combilibmaker3D(Tripos，St．Louis)，SMOG(DeWitteandShakhnovich，J.Am.Chem．Soc.118：11733-11744(1996)；DeWitteetal，J．Am．Chem．Soc．119：4608-4617(1997)；Shimadaetal，ProteinSci．9：765-775(2000))，等等。可用例如Discovery手动地，或用自动方式例如PiplinePilot^TM(Accelrys，Inc.，SanDiego)附着弹头。

在一些优选实施方式中，产生了很多候选抑制剂的结构模型。所述结构模型包括弹头附着在不同的可取代位置上的化合物，用至少一种化合物表示在每个可能的可取代位置上的附着。

D)确定弹头与目标半胱氨酸的接近度

本发明包括确定可逆抑制剂的可取代位置，所述可取代位置使得在候选抑制剂结合到结合位点时，弹头的反应性化学功能处于目标多肽结合位点上的Cys残基的键合距离之内。分析候选抑制剂的结构模型以确定可逆抑制剂中的哪些可取代位置使得弹头的反应性化学功能处于目标多肽结合位点上的Cys残基的键合距离之内。可使用任何适宜的确定分子间距离的方法（用或不用约束（constraints））来鉴别结构模型中使得反应性化学功能处于Cys残基的键合距离之内的Cys残基-可取代位置的组合。例如，可使用适宜的计算方法鉴别使得反应性化学功能处于Cys残基的键合距离之内的Cys残基-可取代位置的组合，其中，1)目标多肽是保持固定的（除了Cys侧链是允许伸缩（flex）的），候选抑制剂是保持固定的（除了弹头是允许伸缩的）；2)目标多肽是允许伸缩的，而候选抑制剂是允许伸缩的；3)目标多肽是允许伸缩的，而候选抑制剂是保持固定的（除了弹头是允许伸缩的）；或4)目标多肽是保持固定的（除了Cys侧链是允许伸缩的），而候选抑制剂是允许伸缩的。优选地，目标多肽是保持固定的（除了Cys侧链是允许伸缩的），和候选抑制剂是保持固定的（除了弹头是允许伸缩的）。

适宜的用于鉴别使得反应性化学功能处于Cys残基的键合距离之内的Cys残基-可取代位置的组合的几种计算方法是本领域公知的。例如，适宜用于计算分子间距离，分子动力学，能量最小化，系统构象搜索和手动建模的程序是本领域公知的。适宜的程序包括，例如Discovery和Charmm（Accelrys,Inc.SanDiego），Amber（AmberSoftwareAdministrator,USSF,60016thStreet,Room552,SanFransico,CA94158andambermd.org/）等等。可评估化合物变形能和静电相互作用的计算机程序是本领域可知的，包括例如Gaussian92，C版本（M.J.Frisch,Gaussian,Inc.,Pittsburgh,Pa.）；AMBER，4.0版本（P.A.Kollman,UniversityofCaliforniaatSanFrancisco,Calif.）；QUANTA/CHARMM（Accelrys,Inc.,Burlington,Mass.）。可使用例如计算机工作站执行这些程序。其它适宜的硬件系统和软件包是本领域技术人员已知的。可使用适宜的软件完成候选抑制剂的对接，例如Flexx(Tripos，St.Louis，Missouri)，Glide(Schrodinger,NewYork)，ICM-Pro(Molsoft．California)等等，之后用标准分子力学力场(molecularmechanicsforcefields)例如OPLS-AA，CHARMM或AMBER完成能量最小化和分子动力学。

E)形成共价键

本发明包括在结合位点上的Cys残基的硫原子和弹头的反应性化学功能之间形成共价键。鉴别使得反应性化学功能处于Cys残基的键合距离之内的Cys残基一可取代位置的组合鉴别了可能共价修饰Cys残基的候选抑制剂。但是，模型中的反应性化学功能和Cys侧链的球面接近度(sphericalproximity)本身不足以表明在反应性化学功能和Cys侧链之间将形成共价键。因此，在本发明的算法和方法中，在反应性化学功能和Cys侧链之间形成键，并分析所形成的键的长度。对于在结合位点上的Cys残基的硫原子和弹头的反应性化学功能之间形成的键，约2.1埃-约1.5埃，或优选为小于约2埃的共价键长度表明了该候选抑制剂是将与目标多肽共价结合的抑制剂。优选地，反应性化学功能和Cys侧链之间形成的键的长度是大约2埃，约1.9埃，约1.8埃，约1.7埃，约1.6埃，或约1.5埃。形成键和分析键长的适宜方法和程序是本领域公知的，包括Discovery和Charmm(Accelrys，Inc.SanDiego)，Amber(AmberSoftwareAdministrator，USSF，600l6thStreet，Room552，SanFransico，CA94l58和http：//ambermd.org/)，Guassian(340QuinnipiacSt.Bldg40，WallingfordCT06292USA和www.gaussian.com/)，Qsite(SchrodingerInc.，NewYork)，和共价对接程序(BioSolvlTGmbH，Germanywww.biosolveit.de)，Maestro^TM，MacroModel^TM和Jaguar^TM(建模软件包，LLC.120West45thStreet，NewYork，NY10036-4041)。

如果期望，使用所述方法设计的化合物可作进一步结构分析和/或精修。例如，如果期望，本发明可包括进一步的步骤：当结合位点上的Cys残基的硫原子和弹头的反应性化学功能之间形成共价键时，确定目标多肽的结合位点是否被封闭(即配体，底物或辅助因子不能结合到结合位点上)。可使用目标多肽-不可逆抑制剂(共价结合Cvs残基的复合物)的结构模型来实施该步骤。反应性化学功能和Cys残基之间形成了共价键，则抑制剂和目标多肽的结合可能会变化。但是，在大部分情况中，化合物仍将封闭目标多肽的结合位点并阻止配体、底物或辅助因子结合到结合位点上。共价键形成后抑制剂结合模式的改变，和结合位点是否保持封闭可使用本文公开的适宜的方法和程序通过分析形成共价键之后与目标多肽复合的抑制剂的结构模型来确定。

在另一实施例中，使用本发明设计的化合物可进一步分析偏好或优选特征，例如所形成的共价键的构象。如实施例1和6所述的，Cvs和丙烯酰胺弹头之间形成的共价键可具有酰胺的顺式构象或反式构象，并优选具有反式构象。在另一实施例中，根据弹头和Cys残基的反应形成的产物的能量，优选化合物选自具有类似结构的化合物，并优选具有更低能量的产物。可使用任何适宜的方法确定产物的能量，例如使用量子力学或分子力学。

本发明可用于设计抑制剂，所述抑制剂通过与目标多肽结合位点的Cys残基形成共价键从而与任何期望的目标多肽共价结合。优选地，与根据本发明设计的抑制剂形成共价键的Cys残基在含有目标多肽的蛋白家族中不是保守的。由于Cys残基不是保守的，有可能将抑制蛋白家族中的几个成员的可逆抑制剂随机转化成抑制蛋白家族中更少的成员或甚至单一成员的选择性更高的不可逆抑制剂。

在本发明的一些应用中，目标多肽具有催化活性。例如，目标多肽可以是激酶，蛋白酶，例如病毒蛋白酶，磷酸酶，或其它酶。当目标多肽具有催化活性时，优选地，与根据本发明设计的抑制剂形成共价键的Cys残基不是催化残基。在特定优选实施方式中，使用本发明设计的不可逆抑制剂不是自杀抑制剂或基于机制的抑制剂(mechanism-basedinhibitor)，该抑制剂导致了在催化过程中酶将底物转化成共价失活剂的过程。

优选地，可逆抑制剂结合到目标多肽的位点上，该位点是配体，辅助因子或底物的结合位点。当目标多肽是激酶时，优选地，可逆抑制剂与激酶的ATP结合位点结合或相互作用。例如，可逆抑制剂可与ATP结合位点的铰链区域相互作用。

可使用目标多肽结合位点的完整结构和可逆抑制剂的结构来实施本文所述的算法和方法。任选地，在实施该算法时考虑可逆抑制剂和仅在目标多肽结合位点上的Cys的结构。在这种情况下，Cys残基和可逆抑制剂的三维定向与存在目标多肽结合位点结构的剩余部分时的它们是相同的。一旦通过仅考虑结合位点的Cys设计了不可逆抑制剂或候选不可逆抑制剂，如果期望可考虑结合位点的完整模型以提供其它结构信息和约束(constraints)，可鉴别空间位阻，会减少可使得弹头处于结合位点上Cys的键合距离之内的可取代位置的数量。在本文所述的实施例中，考虑可逆抑制剂和目标多肽结合位点上的Cys的结构来实施该算法。这种方法成功地产生了几种目标多肽的不可逆抑制剂。在实施例所述工作中鉴别的可逆抑制剂的可取代位置的数量很少，所以不需要结合位点的完整模型强加的其它约束，但可以使用。

为方便起见，本文对算法和方法的步骤按顺序进行描述，以便清楚简明地描述本发明。但是，优选地，按所述顺序依次实施所述方法步骤，同时也可按任何适宜的顺序实施。例如，该方法可如此实施：通过在弹头和Cys残基之间形成键从而形成加合物，然后任选地通过连接体将弹头键合到可逆抑制剂的可取代位置上。

含烯酮弹头，不可逆抑制剂和偶联物

本发明还涉及具有含共轭烯酮（conjugatedenone），α,β不饱和羰基的弹头的不可逆抑制剂。本发明还涉及通过共轭烯酮弹头与多肽上的半胱氨酸残基的-SH反应形成的多肽偶联物。烯酮是一类含有-C(O)-CH=CH-结构的反应性功能。该结构可以是部分线性，支化或环形的化学部分。烯酮提供了通常低反应性且不与溶液中半胱氨酸的-SH反应的优势。然而，当烯酮位于多肽上Cys的键合距离内时，烯酮可选择性地与半胱氨酸残基的-SH反应。因此，共轭烯酮可用于提供高选择性的弹头和不可逆抑制剂。

在一方面，含共轭烯酮的弹头具有下式所示结构：

其中，R₁，R₂和R₃独立地为氢，C₁-C₆的烷基，或被-NRxRy取代的C₁-C₆的烷基；Rx和Ry独立地为氢或C₁-C₆的烷基。

示例性的含共轭烯酮的弹头包括I-a至I-h。

本发明涉及含有与目标多肽上的半胱氨酸残基形成共价键的共轭烯酮弹头的不可逆抑制剂，例如使用本发明算法设计的不可逆抑制剂。在一些实施方式中，共轭烯酮弹头具有式I所示结构。在特别实施方式中，共轭烯酮弹头选自I-a，I-b，I-c，I-d，I-e，I-f和I-g。

本发明还涉及通过使多肽与不可逆抑制剂接触从而不可逆地抑制目标多肽的方法，所述多肽含有具有半胱氨酸残基的结合位点，而所述不可逆抑制剂含有共轭烯酮的弹头，其可与目标多肽上的半胱氨酸残基形成共价键，例如使用本发明算法设计的不可逆抑制剂。

本发明还涉及通过含共轭烯酮的弹头与Cys残基的-SH基团的反应形成的多肽偶联物。这种偶联物具有多种用途。例如，在从用含共轭烯酮的弹头的不可逆抑制剂治疗的患者中获得的生物样品中，偶联的目标多肽相对于未偶联的目标多肽的量可用于调整剂量（例如，给药量和/或给药之间的时间间隔）。在一方面，偶联物具有下式所示结构：

X-M-S-CH₂-R

其中：

X是与目标多肽结合位点结合的化学部分，其中，所述结合位点含有半胱氨酸残基。

M是由含共轭烯酮的弹头基团与所述半胱氨酸残基的硫原子共价键合形成的修饰部分；

S-CH₂是所述半胱氨酸的硫-亚甲基侧链；和

R是目标多肽的剩余部分。

在一些实施方式中，含共轭烯酮的弹头是式I，和偶联物是式II：

其中，X是与目标多肽结合位点结合的化学部分，其中，所述结合位点含有半胱氨酸残基；

S-CH₂是所述半胱氨酸的侧链；和

R是目标多肽的剩余部分；

R₁，R₂和R₃独立地为氢，C₁-C₆的烷基，或被-NRxRy取代的C₁-C₆的烷基；Rx和Ry独立地为氢或C₁-C₆的烷基。

在特别实施方式中，所述共轭物具有选自以下式：II-a，II-b，II-c，II-d，II-e，II-f，II-g和II-h所示的结构，其中，X和R如式II所定义的。

实施例

实施例1.不可逆依马替尼（imatinib）

依马替尼是有效的cKIT，PDGFR，ABL和CSFlR激酶的可逆抑制剂。使用本文所述的设计算法，这种可逆抑制剂可被快速有效地转化成cKit，PDGFR和CSFlR激酶的不可逆抑制剂。此外，显示了主题方法可鉴别出不可能容易的将目标的可逆抑制剂快速转化成该目标的不可逆抑制剂的情况，如在依马替尼和目标ABL的确认实施例的情况。

依马替尼

A．cKIT

设计方法

从proteindatabank（worldwidewebrcsb.org）获得了与依马替尼（pdb号IT46）结合的cKIT的X射线复合物的坐标。提取依马替尼的坐标并使用DiscoveryStudio（v2.0.1.7347;AcccelrysInc.,CA）鉴别在与cKIT结合时处于依马替尼20埃之内的蛋白所有的Cys残基。鉴别了7个残基Cys660，Cys673，Cys674，Cys788，Cys809，Cys884和Cys906。然后在依马替尼模板（式I-1）的三维方向开发了15个可取代位置，以确定哪个可被取代为弹头，以便该弹头能与cKIT结合位点的一个Cys残基（Cys660，Cys673，Cys674，Cys788，Cys809，Cys884或Cys906）形成共价键。

设计方法1.1

在这个方法中，可手动将弹头建立在依马替尼模板上，然后使用分子动力学评价弹头与cKit结合位点上的Cys形成键的能力。使用DiscoveryStudio在三维方向上将丙烯酰胺弹头建立在依马替尼模板上。所述依马替尼模板如式I-1所示。检查所生成的化合物结构以确定弹头的位置，并确定弹头是否可到达任何已鉴别的结合位点上的Cys残基。

式I-1

为了对弹头和侧链位置的灵活性进行取样，对弹头和侧链位置实施分子动力学模拟，并进行分析以确定弹头是否处于结合位点上的任何Cys残基的6埃之内，和在弹头和残基之间是否存在空间位阻。在用于分子动力学模拟的DiscoveryStudio的标准动力学级联模拟（StandardDynamicsCascadeSimulations）方案中使用标准设置。使用具有4ps模拟的DiscoveryStudio的MMFF力场。在分子动力学模拟期间，非弹头位置和Cys主链原子的坐标是保持固定的。

这种模拟鉴别了三个接近cKIT的Cys788的模板位置，两个接近cKIT的Cys809的模板位置（表5）。

然后对这五个模板位置进行最终过滤，要求在候选抑制剂和Cys残基（Cys788或Cys809）之间可形成丙烯酰胺反应产物，其包括使用标准分子动力学模拟可形成小于2埃的键。这种约束留下三个模板位置，R₁，R₂和R₄，但是仅有一个Cys残基，Cys788。这些模板位置中，涉及位置R₂和R₄的弹头的键包括顺式构象的弹头的酰胺基，这不是优选的。涉及位置R₁的弹头的键包括反式构象的弹头的酰胺基，这是优选的。

设计方法1.2

在这个方法中，在依马替尼模板上自动建模弹头，然后使用分子对接评价它们与cKit结合位点上的Cys形成键的能力。

使用AccelryesSciTegicPipeline计算方案将弹头建立在依马替尼模板上，这产生了15种可能的虚拟化合物中的13种虚拟化合物。这是由于R₂和R₄以及R₃和R₅（式I-1）由于对称因而是等同的，因此只进一步评估了R₂和R₃。然后在DiscoveryStudio中使用配体制备方案将这些化合物转化成3D。然后使用DiscoveryStudio的CDOCKER方案将这些3D虚拟化合物与cKit的X射线结构对接。使用约束对接算法（constrainteddockingalgorithm），其中，如X射线结构定义的依马替尼的中心（式I-1）作为对接程序的约束。产生了每个虚拟化合物的十个构象，评价每个化合物的最优构象（topconformation）距离cKit结合位点上的Cys的接近度。应用距离过滤器之后（<6埃），发现仅有两种在R₁和R₂具有弹头的化合物接近结合位点上的Cys。这两种化合物都接近Cys788，然后评价它们的键形成能力。蛋白和化合物是保持固定的，但是Cys788的侧链和弹头是无约束的。完成最小化之后，检查新形成的共价键和势能。在R₁位置具有弹头的虚拟化合物被列为最优选的。

如以下详述的，合成了在R₁位置具有丙烯酰胺的两种化合物，化合物1和化合物2，其显示可抑制cKit。

化合物的合成

中间体A的合成

步骤1：3-二甲基氨基-l-吡啶-3-基-丙烯酮：将3-乙酰吡啶（2.5g，20.64mmol）和N,N-二甲基甲酰胺二甲基乙缩醛（3.20ml，24mmol）在乙醇（10mL）中回流过夜。将反应混合物冷却至室温并减压蒸发。将二乙醚（20mL）添加至残留物中并将混合物冷却至0℃。过滤混合物获得3-二甲基氨基-1-吡啶-3-基-丙烯酮（1.9g，10.78mmol），为黄色结晶（产率：52%）。这种物质无需进一步纯化即可用于后续步骤。

步骤2：N-(2-甲基-5-硝基-苯基)-硝酸胍：将2-甲基-5-硝基苯胺（10g，65mmol）溶解在乙醇（25mL）中，将浓HNO₃（4.6mL）逐滴添加到溶液中，之后添加50%的氨腈（cyanamide）水溶液（99mmol）。将反应混合物回流过夜，然后冷却至0℃。过滤混合物并用乙酸乙酯和二乙醚洗涤残留物，并干燥以制备N-(2-甲基-5-硝基-苯基)-硝酸胍（4.25g，产率：34%）。

步骤3：2-甲基-5-硝基苯基-(4-吡啶-3-基-嘧啶2-基)-胺：在3-二甲基氨基-l-吡啶-3-基-丙烯酮（1.70g，9.6mmol）和N-(2-甲基-5-硝基-苯基)-硝基胍（2.47g，9.6mmol）的2-丙醇（20mL）悬浮液中加入NaOH（430mg，10.75mmol），并将制得的混合物回流24h。将反应混合物冷却至0℃，并对沉淀物进行过滤。将固体残留物悬浮在水中并过滤，然后用2-丙醇和二乙醚洗涤，干燥。分离得到0.87g（2.83mmol）的2-甲基-5-硝基苯基-(4-吡啶-3-基-嘧啶2-基)-胺（产率：30%）。

步骤4：4-甲基-N-3-(4-吡啶-3-基-嘧啶2-基)-苯-l,3-二胺（中间体A）：在剧烈搅拌条件下，将SnCl₂·2H₂O（2.14g，9.48mmol）的浓盐酸（8mL）溶液添加至2-甲基-5-硝基-苯基-(4-吡啶-3-基-嘧啶2-基)-胺（0.61g，1.98mmol）中。搅拌30分钟之后，将混合物倒入碎冰中，用K₂CO₃调成碱性，用乙酸乙酯（50ml）萃取三次。合并有机相，用MgSO₄干燥并蒸发至干燥。用二氯甲烷重结晶制得252.6mg（0.91mmol）的4-甲基-N-3-(4-吡啶-3-基-嘧啶2-基)-苯-l,3-二胺（产率：46%），为灰白色固体。

化合物1的合成

化合物1

步骤1：4-(丙烯酰胺)苯甲酸：将4-氨基苯甲酸（1.40g，10mmol）的DMF（10mL）和吡啶（0.5ml）溶液冷却至0℃。在该溶液中添加丙烯酰氯（0.94g，10mmol）并将制得的混合物搅拌3小时。将混合物倒入200ml水中，过滤获得的白色固体，用水和醚洗涤。在高真空中干燥，获得了1.8g目标产物，其可用于下一步且无需纯化。

步骤2：将4-(丙烯酰胺)苯甲酸（82mg，0.43mmol）和中间体A（100mg，0.36mmol）在氮气下搅拌溶解在吡啶（4ml）中。向该溶液中添加1-丙烷环磷酸酐（1-propanephosphonicacidcyclicanhydride，0.28g，0.43mmol），并将制得的溶液在室温下搅拌过夜。将溶剂蒸发至小体积然后倒入50ml冷水。过滤得到固体，并获得黄色粉末。通过柱层析（95:5CHCl₃：MeOH）纯化粗产物得到了30mg的4-丙烯酰胺-N-(4-甲基-3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基)苯甲酰胺（化合物1），为白色粉末。MS(M+H+):251.2;¹HNMR(DMSO-D₆,300MHz)δ(ppm):10.42(s,1H),10.11(s,1H),9.26(d,1H,J=2.2Hz),8.99(s,1H),8.68(dd,1H,J=3.0和1.7Hz),8.51(d,1H,J=5.2Hz),8.48(m,1H),8.07(d,1H,J=1.7Hz),7.95(d,2H,J=8.8Hz),7.79(d,2H,J=8.8Hz),7.45(m,3H),7.19(d,1H,J=8.5Hz),6.47(dd,1H,J=16.7和9.6Hz),6.30(dd,H,J=16.7和1.9Hz),5.81(dd,1H,J=9.9和2.2Hz),2.22(s,3H)。

化合物2的合成

4-丙烯酰胺-N-(4-甲基-3-(4-吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基-3-(三氟甲基)苯甲酰胺

化合物2

1)4-丙烯酰胺-3-硝基苯甲酸甲酯

在室温下将甲基碘化物（1.4g，9.86mmol）逐滴添加到搅拌的4-硝基-3-(三氟甲基)苯甲酸（1.0g，4.25mmol）和碳酸钾（1.5g，10.85mmol）的30mLDMF溶液中。在室温下将混合物搅拌过夜。添加二乙醚（120mL）并用水洗涤混合物，用Na₂SO₄干燥，过滤并减压浓缩，获得1.0g粗4-硝基-3-(三氟甲基)苯甲酸甲酯。在温室下，在氢气（40psi）中，将0.87g（3.49mmol）4-硝基-3-(三氟甲基)苯甲酸甲酯和0.2g10%的Pd/C在30mL甲醇溶液中搅拌过夜。过滤混合物并减压浓缩获得0.8g粗4-氨基-3-(三氟甲基)苯甲酸甲酯，为白色固体。在0℃将丙烯酰氯（0.35mL,3.65mmol）添加到0.8g的4-氨基-3-(三氟甲基)苯甲酸甲酯和三乙胺（0.9g,8.9mmol）的40mL二氯甲烷溶液中。室温搅拌3小时之后，用饱和NaHCO₃水溶液和饱和NaCl水溶液依次洗涤该溶液。用Na₂SO₄干燥该二氯甲烷溶液并真空浓缩获得粗产物，其通过使用1%CH₃OH-CH₂Cl₂的硅胶层析进一步纯化，获得0.818mg标题化合物，为白色固体。

2)4-丙烯酰胺-3-硝基苯甲酸

向搅拌的甲基-4-丙烯酰胺-3-硝基苯甲酸（0.8g，2.93mmol）的20mLTHF溶液中添加20mL的1N的LiOH溶液。用10%HCl水溶液将制得的溶液酸化至pH为1，然后用三份40mL的乙酸乙酯萃取。用饱和NaCl水溶液洗涤合并的乙酸乙酯萃取物，用Na₂SO₄干燥，过滤并真空浓缩至干燥，获得0.75g标题化合物，为白色固体。

3)4-丙烯酰胺-N-(4-甲基-3-(4-吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基-3-(三氟甲基)苯甲酰胺

向搅拌的N-(4-甲基-3-(4-吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯胺（87mg,0.31mmol）和4-丙烯酰胺-3-(三氟甲基)苯甲酸的10mL吡啶溶液中添加250mg（0.39mmol）1-丙基磷酸环酐（propylphosphonicanhydride）。制得的溶液在室温下搅拌72小时。在真空下去除溶剂并用50mL水搅拌残留物，通过过滤分离获得黄色固体。使用5%CH₃OH-CH₂Cl₂的硅胶色谱纯化粗产物，获得101mg标题化合物。¹HNMR(DMSO-d₆,300MHz)δ(ppm):10.41(s,1H),9.90(s,1H),9.28(d,1H),8.98(s,1H),8.69(d,1H),8.68(dd,1H),8.49(m,1H),8.29(s,1H),8.24(d,1H),8.08(d,1H),7.79,(m,3H),7.23(d,1H),6.59(dd,1H),6.28(dd,1H),5.81(dd,1H),2.24(s,3H)。

cKIT抑制试验

使用人重组cKIT（购自Millipore，目录号14-559）测试作为c-KIT抑制剂的化合物，并监测荧光素标记的肽底物（1.5μM）的磷酸化。在100mMHEPES(pH7.5)，10mMMnCl₂，1mMDDT，0.015%Brij-35（聚环氧乙烯月桂酰醚）和300μMATP中，有和没有检验化合物条件下，进行反应。通过添加ATP启动反应并在室温下孵育1小时。通过添加含有100mMHEPES（pH7.5），30mMEDTA，0.015%Brij-35和5%DMSO的终止缓冲液终止反应。使用电泳迁移率通过电荷分离磷酸化和未磷酸化的底物。形成的产物与对照孔比较以确定酶活性的抑制或增强。化合物1和化合物2的c-KIT抑制数据如表6所提供的。

B．PDGFR

设计方法

使用如上所述的与依马替尼（pdb号：1T46）结合的cKIT的X射线复合物的坐标，建立了PDGFR-α激酶（Uniprot号：P16234）的同源模型。利用所示的cKIT-PDGFRα比对，用DiscoveryStudio的BuildHomology模块建立同源模型。然后在依马替尼模板的三维方向开发了15个可取代位置，以确定哪个可被取代为弹头，以便该弹头与结合位点上的Cys形成共价键。该方法鉴别了三个模板位置，R₁，R₂和R₄，和能够与丙烯酰胺弹头形成共价键的Cys814。在这些模板位置中，涉及位置R₂和R₄的弹头的键包括弹头的酰胺基团的顺式构象，这不是优选的。涉及位置R₁的弹头的键包括弹头的酰胺基团的反式构象，这是优选的。

CKIT：人CKIT（SEQIDNO：1）

PDGFRALPHA：人PDGFα受体（SEQIDNO：2）

PDGFR抑制试验

方法A：

使用Z′-LYTE^TM生化试验程序或类似生化试验，采用与InvitrogenCorp（InvitrogenCorporation,1600FaradayAvenue,Carlsbad,California,CA;worldwidewebinvitrogen.com/downloads/Z-LYTE_Brochure_1205.pdf）描述基本类似的方式测试作为PDGFR抑制剂的化合物。Z′-LYTE^TM生化试验采用基于荧光的、偶联酶模式，并基于磷酸化和未磷酸化的肽对于蛋白酶剪切（proteolyticcleavage）不同的敏感性。

在0.1μM和1μM下平行检验化合物1。化合物1显示出对PDGFR-α的中等抑制，在1μM下抑制76%，和在0.1μM下抑制29%。

方法B

简而言之，在含有20mMTris，pH7.5，5mMMgCl₂，1mMEGTA，5mMβ-甘油磷酸，5%甘油（10X原液，KB002A）和0.2mMDTT（DS00lA）的1X激酶反应缓冲液中制备PDGFRα（PV3811）酶的10X原液，1.13XATP（AS00lA）和Y12-Sox肽底物（KCZl00l）。将5μL酶和0.5μL体积的50%DMSO和用50%DMSO制备的连续稀释的化合物在Corning（#3574）384孔，白色，非结合表面微孔板（Corning，NY）中在27℃预孵育30分钟。添加45μLATP/Y9或Y12-Sox肽底物混合物启动激酶反应，并在60分钟内每30-9秒在BioTek（Winooski，VT）的Synergy⁴微板阅读仪中在λ_ex360/λ_em485下进行监测。基于每个试验的结论，检验每个孔的过程曲线的线性反应动力学和拟合统计（fitstatistics）（R²，95%置信区间，绝对平方和（absolutesumofsquares））。由相对荧光单位对时间（分钟）作图的斜率来确定每次反应的起始速率（0分钟至20+分钟），然后针对抑制剂浓度作图，由log[抑制剂]对响应，GraphPad软件的GraphPadPrism（SanDiego,CA）中的变量斜率模型来估算IC₅₀。[PDGFRα]=2-5nM，[ATP]=60μM和[Y9-Sox肽]=10μM（ATPK_Mapp=61μM）。

化合物1和化合物2的PDGFR抑制数据如表7所列的。

化合物1的PDGFR质谱分析

在化合物1的存在下实施PDGFR-α的质谱分析。将PDGFR-α蛋白（Invitrogen：PV3811提供）与1μM，10μM和100μM的化合物1孵育60分钟。特别地，将1μL0.4μg/μL的PDGFR-α（InvitrogenPV3811）原液（50mMTrisHClph7.5，150mMNaCl，0.5mMEDTA，0.02%TritonX-100，2mMDTT，50%甘油）添加至9μL化合物1的10%DMSO中（终浓度为1μM，10μM和100μM）。60分钟之后，添加9μL50mM的重碳酸铵，3.3μL在50mM重碳酸铵中的6mM的碘乙酰胺，和1μL35ng/μL的胰蛋白酶终止反应。

通过质谱（MALDI-TOF）分析10μM胰蛋白酶消化物，在PDGFR-α蛋白中发现的五个半胱氨酸残基中，四个半胱氨酸残基鉴别为被碘乙酰胺修饰，同时第五个半胱氨酸残基被化合物1修饰。胰蛋白酶消化物的质谱分析和与PDGFR-α蛋白中Cys814位点共价结合的化合物1一致。胰蛋白酶消化物的MS/MS分析证实了化合物1存在于Cys814处。

EOL-1细胞增殖试验

将购自DSMZ（ACC386）的EOL-1细胞维持在RPMI（Invitrogen#21870）+10%FBS+1%青霉素/链霉素（Invitrogen#15140-122）中。对于细胞增殖试验，将完全培养基中的细胞置于96孔板中（密度为2×10⁴细胞/孔），并用500nM-10pM的化合物平行孵育72小时。通过用AlamarBlue试剂（Invitrogencat#DALl100）测量代谢活性从而测试细胞增殖。与AlamarBlue在37℃孵育8小时之后，在590nm处读取吸光度，并使用GraphPad计算细胞增殖的IC₅₀。参考化合物和化合物2对EOL-1细胞的细胞增殖的剂量响应抑制如图5所描述的。

EOL-1细胞洗脱试验

EOL-1细胞生长在完全培养基的悬浮液中，并添加化合物至每个样品的2×10⁶细胞1小时。1小时之后，使细胞成团，去除培养基并用无化合物的培养基替换。每2小时洗涤细胞并用新鲜的无化合物培养基重悬。在特定时间点收集细胞，并在细胞提取缓冲液中裂解，每条泳道点样15μg总蛋白裂解物。通过用SantaCruz抗体sc-12910的westernblot测试PDGFR的磷酸化。该实验的结果如图6所描述的，其中，显示了相对于DMSO对照和可逆参考化合物，在“洗脱”0小时和4小时之后，化合物2在EOL-1细胞中维持了PDGFR的酶抑制。

C.CSF1R

设计方法

使用如上所述的与依马替尼（pdb号：1T46）结合的cKIT的X射线复合物的坐标，建立了CSF1R激酶（Uniprot号：P07333）的同源模型。利用所示的cKIT-CSF1R比对，用DiscoveryStudio的BuildHomology模块建立同源模型。然后在依马替尼模板的三维方向开发了15个可取代位置，以确定哪个可被取代为弹头，以便该弹头与结合位点上的Cys形成共价键。该方法鉴别了两个模板位置（R₁和R₂），和能够与丙烯酰胺弹头形成键的Cys774。

CKIT：人CKIT（SEQIDNO：1）

CSF1R：人SCF1R（SEQIDNO：3）

CSF1R抑制试验

使用Z′-LYTE^TM生化试验程序或类似生化试验，采用与InvitrogenCorp（InvitrogenCorporation,1600FaradayAvenue,Carlsbad,California,CA）描述基本类似的方式测试作为PDGFR抑制剂的化合物。在50mMHEPESpH7.5，0.01%BRIJ-35，10mMMgCl₂，1mMEGTA中制备2×CSF1R(FMS)/Tyr01肽混合物。最终的l0μL激酶反应液是由0.2-67.3ngCSF1R（FMS）和在50mMHEPESpH7.5，0.01%BRIJ-35，10mMMgCl₂，1mMEGTA中的2μMTyr01肽组成。激酶反应液孵育1小时之后，添加5μL以1:128稀释的显色剂B。

化合物1在10μM显示出对CSF1R有72%的抑制，而化合物2在10μM显示出对CSF1R有89%的抑制。

质谱分析数据

使用质谱分析确定化合物2是否是CSF1R的共价修饰剂。在胰蛋白酶消化之前将CSF1R（0.09μg/μl）与过量10X的化合物2（Mw518.17）孵育3小时。化合物孵育之后以碘乙酰胺作为烷基化试剂。对于胰蛋白酶消化物，2μl部分（0.09μg/μl）用10μl的0.1%TFA稀释，之后将microC18ZipTipping直接用于MALDI目标，使用α氰基-4-羟基肉桂酸作为基质（5mg/ml，在0.1%的TFA：乙腈为50：50中)。

对于胰蛋白酶消化物，设备设置为具有1800的脉冲提取（pulsedextraction）设置的反射模式。使用激光BiolabsPepMix标准（1046.54，1296.69，1672.92，2093.09，2465.20）完成校准。对于CID/PSD分析，使用光标选择肽以设置离子门时间控制（iongatetiming）和破碎发生在激光功率高约20%，并以He作为CID的碰撞气体。使用曲线场反射的P14R破碎校准完成碎片校准。CSF1R胰蛋白酶消化物的数据库搜索可正确验证它。引入化合物2修饰（518.17）也可验证预期的目标多肽NCIHR（SEQIDNO：8）（MH+642.31+518.17=1160.48）仅以修饰肽存在。该肽信号（1160.50）的PSD分析给出了足够碎片以便数据库MS/MS离子搜索能证实该肽序列。

D.ABL

设计方法

使用如上所述的与依马替尼（pdb号：1T46）结合的cKIT的X射线复合物的坐标，建立了ABL激酶（Uniprot号：P00519）的同源模型。利用所示的cKIT-ABL比对，用DiscoveryStudio的BuildHomology模块建立同源模型。然后在依马替尼模板的三维方向开发了15个可取代位置，用于放置丙烯酰胺弹头，以便其与结合位点上的Cys形成共价键。该方法未鉴别出模板位置或能够修饰的适宜Cys。

CKIT：人CKIT（SEQIDNO：1）

ABL：人ABL（SEQIDNO：4）

实施例2.不可逆尼罗替尼(Nilotinib)

尼罗替尼是有效的ABL，cKIT，PDGFR和CSFlR激酶的可逆抑制剂。使用本文所述的基于结构的设计算法，尼罗替尼可被快速有效地转化成抑制cKIT和PDGFR的不可逆抑制剂。

尼罗替尼

尼罗替尼模板（II-1）

A.ABL

从proteindatabank（worldwidewebrcsb.org）获得与Abl（pdb号3CS9）结合的尼罗替尼的X射线复合物的坐标。提取尼罗替尼的坐标并鉴别在与ABL结合时处于尼罗替尼20埃之内的蛋白所有的Cys残基。然后在尼罗替尼模板（II-1）的三维方向开发14个可取代位置，以确定哪个可被取代为成氯乙酰胺弹头，以便其与结合位点上的Cys形成共价键。该方法未鉴别出模板位置或能够修饰的适宜Cys。

B.PDGRα

使用与ABL结合的尼罗替尼的X射线结构（pdb号3CS9）作为模板，建立了PDGRα激酶（Uniprot号：P16234）的同源模型。利用所示的ABL-PDGRα比对，用DiscoveryStudio的BuildHomology模块建立同源模型。然后在尼罗替尼模板（II-1）的三维方向开发了14个可取代位置，以确定哪个可被取代为弹头，以便该弹头与结合位点上的Cys形成共价键。该方法鉴别了一个模板位置（R₁₁），和能够与氯乙酰胺弹头形成共价键的Cys（Cys814）。合成了化合物3，其在R₁₁处含有氯乙酰胺。

PDGFRALPHA：人PDGFα受体（SEQIDNO：2）

ABL：人ABL（SEQIDNO：4）

C.CSF1R

使用与ABL结合的尼罗替尼的X射线结构（pdb号3CS9）作为模板建立了CSF1R激酶（Uniprot号：P07333）的同源模型。利用所示的ABL-CSF1R比对，用DiscoveryStudio的BuildHomology模块建立同源模型。然后在尼罗替尼模板（II-1）的三维方向开发了14个可取代位置，以确定哪个可被取代为弹头，以便该弹头与结合位点上的Cys形成共价键。该方法鉴别了一个模板位置（R₁₁），和能够与氯乙酰胺弹头形成键的Cys（Cys774）。

CSF1R：人CSF1R（SEQIDNO：3）

ABL：人ABL（SEQIDNO：4）

D.cKIT

使用与ABL结合的尼罗替尼的X射线结构（pdb号3CS9）作为模板建立了cKIT激酶（Uniprot号：P10721）的同源模型。利用所示的ABL-cKIT比对，用DiscoveryStudio的BuildHomology模块建立同源模型。然后在尼罗替尼模板（II-1）的三维方向开发了14个可取代位置，以确定哪个可被取代为氯乙酰胺弹头，以便该弹头与结合位点上的Cys形成共价键。这种约束留下了一个模板位置（R₁₁），和一个Cys（Cys788）。

CKIT：人CKIT（SEQIDNO：1）

ABL：人ABL（SEQIDNO：4）

化合物3的合成

路线3-A

中间体C

a)NH₂CN，EtOH/HCl，90℃，15h，b)DMF-DMA，乙醇，回流，16h，c)NaOH/EtOH，回流，16h

步骤-1：向搅拌的苯胺酯（5g，30.27mmol）的乙醇（12.5mL）溶液中添加浓HNO₃（3mL），之后在室温下添加50%氨腈水溶液（1.9g，46.0mmol）。将反应混合物在90℃下加热16h，之后冷却至0℃。过滤沉淀出固体，并用乙酸乙酯（10mL），二乙醚（10mL）洗涤，干燥获得相应的胍（4.8g，76.5%），为淡粉色固体，其无需进一步纯化即可使用。

步骤-2：将搅拌的3-乙酰基吡啶（10.0g，82.56mmol）和N,N-二甲基甲酰胺二甲基乙缩醛（12.8g，96.00mmol）的乙醇（40mL）溶液回流16h。然后冷却至室温并减压浓缩获得粗物质。将残留物置于醚中（10mL），冷却至0℃并过滤获得相应的烯酰胺（enamide）（7.4g，50.8%），为黄色结晶固体。

步骤-3：将搅拌的胍衍生物（2g，9.6mmol），烯酰胺衍生物（1.88g，10.7mmol）和NaOH（0.44g，11.0mmol）的乙醇（27mL）溶液在90℃回流48h。然后将反应混合物冷却并减压浓缩获得残留物。将残留物置于乙酸乙酯（20mL）中并用水（5mL）洗涤。分离有机层和水层，独立处理，分别获得相应的酯和中间体C。当沉淀出白色固体时冷却水层并用1.5N的HCl（pH~3-4）酸化。过滤沉淀物，干燥并通过与甲苯（2x10mL）共沸蒸馏去除过量的水，以获得中间体C（0.5g），为暗黄色固体。1HNMR(DMSO-d₆,400MHz)δ(ppm):2.32(s,3H),7.36(d,J=10.44Hz,1H),7.53(d,J=6.84Hz,1H),760-7.72(m,2H),8.26(s,1H),8.57(d,J=6.84Hz,1H),8.64(d,J=10.28Hz,1H),8.70-8.78(bs,1H),9.15(s,1H),9.35(s,1H)。用盐水（3mL）洗涤有机萃取物，干燥（Na₂SO₄）并减压浓缩获得中间体C的酯，为粗固体。通过柱层析（SiO₂，60-120目，MeOH/CHCl₃：10/90）进一步纯化获得中间体C的酯（0.54g），为黄色固体。

路线3-B

a)(BOC)₂O，DMAP，Et₃N，THF，b)H₂，Pd/C，CH₃OH

步骤-1：向搅拌的硝基苯胺（0.15g，0.7mmol）的THF（0.3mL）溶液中添加Et3N（0.11mL，0.73mmol）和DMAP（0.05g，0.44mmol）。在其中添加BOC酸酐（0.33mL，1.52mmol）并使反应物回流5h。然后冷却反应混合物，用THF稀释（15mL）并用盐水（5mL）洗涤。分离有机相，用Na₂SO₄干燥，过滤并减压浓缩获得粗物质。通过柱层析（SiO₂，230-400目，己烷/EtOAc：8/2）进一步纯化粗产物，获得相应的双Boc保护的苯胺（0.25g，88%），为白色结晶固体，其无需进一步纯化即可用于下一步。

步骤-2：将Boc保护的苯胺（0.25g，0.62mmol）的MeOH（5mL）溶液在10%Pd/C（0.14g，0.13mmol）下，在20℃氢化（H₂，3Kg）12h。将反应混合物通过短的减压浓缩获得相应的苯胺，为灰白色固体（0.18g，77.6%）。1HNMR(CD₃OD,400MHz)δ(ppm):1.36(s,18H),6.84-6.87(m,1H),6.95-6.97(m,2H)。

路线3-C

a)HATU，DIEA，CH₃CN，85℃，16h，b)TFA/CH₂C1₂，0℃至室温，3h

步骤1：在乙腈中，在HATU，DIEA的存在下，将中间体C与双boc保护的苯胺偶联可得到相应的酰胺

步骤2：在二氯甲烷中，通过用TFA在0℃处理酰胺，然后加热至室温可以完成Boc基团的去保护获得中间体D。

在N₂存在下，在0℃，向搅拌的中间体D（0.1g，0.22mmol)的THF（10mL）溶液中添加Et₃N（0.033g，0.32mmol）。搅拌并逐滴添加氯乙酰氯（0.029g，0.26mmol），反应混合物至室温搅拌12h。减压浓缩反应混合物获得残留物，将其置于EtOAc（10mL）中。用水（2mL）洗涤该溶液，再用EtOAc（2x10mL）萃取水层。合并EtOAc部分并用盐水（2mL）洗涤。之后用Na₂SO₄干燥，过滤EtOAc溶液并减压浓缩获得粗残留物，然后通过柱层析（SiO₂，60-120目，CHCl₃/MeOH：9/1）纯化，获得暗黄色固体III-14（50mg，43%）。1HNMR(DMSO-d₆)δppm:2.34(s,3H),4.30(s,2H),7.42-7.48(m,4H),7.73-7.75(m,1H),8.05-8.10(m,1H),8.24(d,J=2.2Hz,1H),8.29(s,1H),8.43(d,J=8.04Hz,1H),8.54(d,J=5.16Hz,1H),8.67(dd,J=1.6&4.76Hz,1H),9.16(s,1H),9.26(d,J=2.2Hz,1H),9.89(s,1H),10.50(s,1H);LCMS:m/e541.2(M+l)

目标抑制

使用实施例1所述的cKIT抑制试验或PDGFR抑制试验，评价化合物3抑制cKIT或PDGFR的能力。数据显示了化合物3是有效的cKIT（IC₅₀=0.7nM）和PDGFR（IC₅₀=9nM）的抑制剂。（表8）

PDGFR质谱分析

在化合物3的存在下对PDGFR-α实施质谱分析。胰蛋白酶消化之前，将PDGFR-α（43pmols）与过量10X的化合物3（434pmols）孵育3小时。化合物孵育之后以碘乙酰胺作为烷基化试剂。对于胰蛋白酶消化物，5μl部分（7pmols）用10μl0.1%TFA稀释，之后将microC18ZipTipping直接用于MALDI目标，使用α氰基-4-羟基肉桂酸作为基质（5mg/ml，在0.1%TFA：乙腈为50：50中）。

通过质谱仪（MALDI-TOF）分析胰蛋白酶消化物。胰蛋白酶消化物的质谱分析和与PDGFR-α蛋白的Cys814共价结合的化合物3一致（图7）。胰蛋白酶消化物的MS/MS分析证实了化合物3存在于Cys814处。

c-KIT质谱分析

在化合物3的存在下对c-KIT实施质谱分析。特别地，胰蛋白酶消化之前，将c-KIT激酶（86pmols）与过量10X的化合物3（863pmols）孵育3小时。化合物孵育之后以碘乙酰胺作为烷基化试剂。对于胰蛋白酶消化物，5μl部分（14pmols）用10μl0.1%TFA稀释，之后将microC18ZipTipping直接用于MALDI目标，使用α氰基-4-羟基肉桂酸作为基质（5mg/ml，在0.1%TFA：乙腈为50：50中）。

通过质谱仪（MALDI-TOF）分析胰蛋白酶消化物。胰蛋白酶消化物的质谱分析和与c-KIT蛋白的两个目标半胱氨酸残基Cys788（主）和Cys808（次）共价结合的化合物3一致。

cKIT洗脱试验

将GIST430细胞（参见Baueretal,CancerResearch,66(18):9153-9161(2006)）接种在6孔微板上（密度为8×10⁵细胞/孔），第二天以用完全培养基稀释的1μM的化合物3处理90分钟。90分钟之后，去除培养基并用无化合物的培养基洗涤细胞。每2小时洗涤细胞并重悬在新鲜的无化合物培养基中。在特定时间点收集细胞，并用附加了Roche完全蛋白酶抑制剂片剂（Roche11697498001）和磷酸酶抑制剂（Roche04906837001）的细胞提取缓冲液（InvitrogenFNN0011）裂解，每个泳道点样10μg总蛋白裂解液。用CellSignalingTechnology的pTyr(4G10)抗体和总kit抗体通过westernblot测试c-KIT的磷酸化。结果如表9所描述的，其中显示了在“洗脱”0小时和6小时之后，化合物3维持了在GIST430细胞中的c-KIT酶抑制。

实施例3.不可逆VX-680

VX-680是FLT3激酶的有效可逆抑制剂。使用本文所述的基于结构的设计算法，VX-680可被快速有效地转化成FLT-3的不可逆抑制剂。

VX-680

通过VX-680与相关的极光激酶的结合模式的推论，确定了VX-680与Flt3的结合模式，因为极光激酶与VX-680复合物的晶体结构已被确定。使用AccelrysDiscoveryStudio（DiscoveryStudiov2.0.1.7347,AccelrysInc）中的蛋白建模组件，用极光激酶（pdb号2F4J）的x-射线结构建立FLT3的同源模型。用于模型构建的比对是基于FLT3和极光激酶的x-射线复合物的结构比对。这两个蛋白之间高度的结构类似性，以及结合位点位置的高度类似性进一步支持了同源建模策略。

FLT3（IRJB）和极光激酶/VX-680复合物（2FB4）之间的结构比对具有256个结构等效位置，RMSD为

链1：人极光激酶（SEQIDNO：5）

链2：人RAF（SEQIDNO：6）

Flt3与VX680的同源模型鉴别了Flt3中的六个Cys残基，它们处于结合的VX680的20埃之内（Cys694，Cys695，Cys681，Cys828，Cys807和Cys790）。然后在VX680模板（式III-1）的三维方向开发了7个可取代位置，以确定哪个可被取代为弹头，以便该弹头与所鉴别的FLT3结合位点上的Cys残基之一形成共价键。在三维方向上，使用DiscoveryStudio将弹头建立在VX-680模板上，检查所得到的化合物的结构以确定弹头是否能够到达结合位点上的Cys。

式III-1

为了对弹头和侧链位置的灵活性进行取样，对弹头和侧链位置实施标准分子动力学模拟，并检查以观察弹头是否处于任何所鉴别的结合位点上的Cys残基的6埃之内。在用于分子动力学模拟的DiscoveryStudiov2.0.1.7347（AccelrysInc）方案的标准动力学级联模拟方案中使用标准设置。在分子动力学模拟期间，非弹头位置和Cys主链原子的坐标是保持固定的。

这样鉴别了接近Cys828的3个模板位置（R₄，R₆和R₇）（表10）。对这些模板位置进行最终过滤，要求在候选抑制剂和Cys828之间可形成丙烯酰胺反应产物，其包括使用标准分子动力学模拟可形成小于2埃的键。全部的三个位置都成功地符合了这种约束。合成了化合物4，其在R₇位置上含有丙烯酰胺。

化合物4的合成

步骤1.4,6-二氯-2-甲磺酰基嘧啶

在搅拌和冰浴中，将4,6-二氯-2-(甲硫基)吡啶（24g，0.123mol）溶解在500mlCH₂Cl₂中。在40min内缓慢添加间氯过氧苯甲酸（约0.29mol）。将反应混合物搅拌4h，并用CH₂Cl₂稀释，然后用50%的Na₂S₂O₃/NaHCO₃溶液处理。用饱和NaCl水溶液洗涤有机相，用MgSO₄干燥，然后过滤。在真空下去除溶剂，产生约24g的标题化合物，为淡紫色固体。

步骤2.N-(4-巯基苯基)氨基甲酸叔丁酯

将4-氨基硫酚（25g，0.2mol）溶解在250mlEtOAc中。用冰浴冷却溶液，并在搅拌下逐滴添加二叔丁基二碳酸酯（48g，0.22mol）。搅拌1h之后，添加饱和NaHCO₃水溶液（200ml）。将反应混合物搅拌过夜。用水，饱和NaCl水溶液洗涤有机相，用MgSO₄干燥，然后过滤。在真空下去除溶剂，产生约68g黄色的油，其用己烷处理以产生约50g标题化合物，为黄色固体。

步骤3.4-(4,6-二氯嘧啶-2-基硫)苯基氨基甲酸叔丁酯

将在150mlt-BuOH中的N-(4-巯基苯基)氨基甲酸叔丁酯（5g，0.022mol）和4,6-二氯-2-甲磺酰基嘧啶（5g，0.026mol）混合物加热回流1h然后添加NaOAc（0.5g）。再将反应物加热回流14h。在真空下去除熔剂并将残留物溶解在乙酸乙酯中。用K₂CO₃溶液和饱和NaCl水溶液依次洗涤有机相，用MgSO₄干燥，然后过滤。去除溶剂，产生约5g标题化合物，为黄色固体。

步骤4.4-(4-氯-6-(3-甲基-lH-吡唑-5-基氨基)嘧啶-2-基硫)苯基氨基甲酸叔丁酯

将在1mlDMF中的4-(4,6-二氯嘧啶-2-基硫)苯基氨基甲酸叔丁酯（l00mg，0.27mmol），3-甲基-5-氨基-lH-吡唑（28.7mg，0.3mmol），二异丙基乙胺（41.87mg）和NaI（48.6mg，0.324mmol）溶液在85℃加热4h。之后冷却并用20mL乙酸乙酯稀释，用水和饱和NaCl水溶液依次洗涤有机相，用MgSO₄干燥，然后过滤。在真空下去除溶剂，产生约120mg粗产物，通过硅胶（30%的EtOAc/己烷）纯化产生64mg标题化合物。

步骤5.4-(4-(3-甲基-lH-吡唑-5-基氨基)-6-(4-甲基哌嗪-1-基)嘧啶-2-基硫)苯基氨基甲酸叔丁酯

将4-(4-氯-6-(3-甲基-lH-吡唑-5-基氨基)嘧啶-2-基硫)苯基氨基甲酸叔丁酯（61mg，0.14mmol）和1ml甲基哌嗪的混合物在110℃加热2h。用20mL乙酸乙酯稀释反应混合物。用水洗涤有机相，用MgSO₄干燥，然后过滤。在真空下去除溶剂，产生约68.2mg粗产物，为淡棕色固体，通过硅胶（30%EtOAc/己烷）纯化获得49.5mg标题化合物。MS(M+H⁺)：497.36。

步骤6.2-(4-氨基苯硫基)-N-(3-甲基-lH-吡唑-5-基氨基)-6-(4-甲基哌嗪-1-基)嘧啶-4-胺

用2ml5N的HCl处理4-(4-(3-甲基-lH-吡唑-5-基氨基)-6-(4-甲基哌嗪-l-基)嘧啶-2-基硫)苯基氨基甲酸叔丁酯（44.5mg）的5mlMeOH溶液。当TLC显示出没有剩余起始物质时，用乙酸乙酯稀释反应混合物。用NaHCO₃和饱和NaCl水溶液洗涤有机相，用MgSO₄干燥，然后过滤。在真空下去除溶剂，获得约32.1mg标题化合物。¹HNMR(300MHz,DMSO-d₆):δ11.68(s,1H),9.65(s,1H),9.25(s,1H),7.60(d,2H),7.45(d,2H),6.00(s,1H),5.43(s,1H),2.38(m,4H),2.20(m,2H),2.05(m,2H),1.52(s,6H),MS(M+H⁺)：397.18。

步骤7.N-(4-(4-(3-甲基-lH-吡唑-5-基氨基)-6-(4-甲基哌嗪-l-基)嘧啶-2基硫)苯基)丙烯酰胺

在0℃下，将丙烯酰氯（6.85mL，7.33mg，0.081mmol）添加至2-(4-氨基苯硫基)-N-(3-甲基-lH-吡唑-5-基)-6-(4-甲基哌嗪-l-基)嘧啶-4-胺（32.1mg，0.081mmol）的3mlCH₂Cl₂溶液中。30min之后用乙酸乙酯稀释反应混合物。用NaHCO₃溶液，饱和NaCl水溶液洗涤有机相，用MgSO₄干燥，然后过滤。去除溶剂，产生粗产物，通过硅胶纯化获得20mg产物。MS(M+H⁺)：451.36。

生化检验

在FLT3生化试验中，化合物4抑制FLT3磷酸化的IC₅₀为2.2nM。在该试验中VX-680具有10.7nM的IC₅₀。

FLT3生化试验

连续读数的激酶试验用于测量化合物抗活性FLT-3酶的活性。按基本类似于供应商所述的方式实施该试验（Invitrogen,Carlsbad,CA,worldwidewebinvitrogen.com/content.cfm?pageid=11338）。简而言之，在含有20mMTris，pH7.5，5mMMgCl₂，1mMEGTA，5mMβ-甘油磷酸，5%甘油（10X原液,KB002A）和0.2mMDTT（DS001A）的1X激酶反应缓冲液中制备Invitrogen或BPSBioscience（PV3660或40301）的KDR的10X原液，或FLT-3（PV3182）酶，1.13XATP（AS00lA）和Y9-Sox或Y12-Sox肽底物（KCZl00l）。将5μL酶和0.5μL体积的50%DMSO和用50%DMSO制备的连续稀释的化合物在Corning（#3574）384孔，白色，非结合表面微孔板（Corning，NY）中在27℃预孵育30分钟。添加45μLATP/Y9或Y12-Sox肽底物混合物启动激酶反应，并在60分钟内每30-90秒在BioTek（Winooski，VT）的Synergy4微板阅读仪中在λ_ex360/λ_em485下进行监测。基于每个试验的结论，检验每个孔的过程曲线的线性反应动力学和拟合统计（R²，95%置信区间，绝对平方和)。由相对荧光单位对时间（分钟）作图的斜率来确定每次反应的起始速率（0分钟至20+分钟），然后针对抑制剂浓度作图，由log[抑制剂]对响应，GraphPad软件的GraphPadPrism（SanDiego,CA）中的变量斜率模型估算IC₅₀。

最优的方案中使用的[试剂]：

[PDGFRα]=2-5nM，[ATP]=60μM和[Y9-Sox肽]＝10μM（ATPK_Mapp=61μM）

[FLT-3]=15nM，[ATP]=500μM和[Y5-Sox肽]=10μM（ATPK_Mapp=470μM）

质谱分析

在胰蛋白酶消化之前，将Flt3与过量100X的化合物4孵育3小时。化合物孵育之后以碘乙酰胺作为烷基化试剂。对于胰蛋白酶消化物，5μl部分（7pmols）用10μl0.1%的TFA稀释，之后将microC18ZipTipping直接用于MALDI目标，使用α氰基-4-羟基肉桂酸作为基质（5mg/ml，在0.1%TFA：乙腈为50：50中）。

质谱设备设置为具有1800的脉冲提取设置的反射模式。使用激光BiolabsPepMix标准（1046.54，1296.69，1672.92，2093.09，2465.20）完成校准。对于CID/PSD分析，使用光标选择肽以设置离子门时间控制和破碎发生在激光功率高约20%，并以He作为CID的碰撞气体。使用曲线场反射的P14R破碎校准完成碎片校准。

附着有化合物4的具有序列ICDFGLAR（SEQIDNO：9）的胰蛋白酶肽的修饰形式在1344.73处形成了峰。对照消化物未显示出1344峰的证据，这代表化合物4修饰了肽。

实施例4.不可逆博塞泼维（boceprevir）

博塞泼维是有效的丙肝病毒（HCV）蛋白酶的可逆抑制剂。使用本发明所述的基于结构的设计算法，博塞泼维可被快速有效地从HCV蛋白酶的可逆抑制剂转化成不可逆抑制剂。

从proteindatabank获得与HCV蛋白酶（pdb号2OC8）结合的博塞泼维的X射线复合物的坐标。提取博塞泼维的坐标，并鉴别处于博塞泼维20埃之内的蛋白所有的Cys残基。这样鉴别了五个残基Cys16，Cys47，Cys52，Cys145和Cys159。然后在博塞泼维模板（IV-1）的三维方向开发4个可取代位置，以确定哪个可被取代为弹头，以便其与博塞泼维结合位点上的Cys形成共价键。使用AccelrysDiscoveryStudiov2.0.1.7347（AccelrysInc，CA）在博塞泼维模板（IV-1）的三维方向上建立丙烯酰胺弹头，并检查得到的化合物结构，以观察弹头是否能够到达所鉴别的HCV蛋白酶结合位点上的Cys残基之一。

式IV-1

为了对弹头和侧链位置的灵活性进行取样，我们对弹头和侧链位置实施标准分子动力学模拟，并检查以观察弹头是否处于任何所鉴别的结合位点上的Cys残基的6埃之内。这样鉴别了接近Cys159的2个模板位置（R₁和R₃）（表11）。对这两个模板位置进行最终过滤，要求在候选不可逆抑制剂和Cys159之间可形成反应产物，其包括使用标准分子动力学模拟可形成小于2埃的键。这种约束留下1个模板位置R₃。合成了化合物5，其在生化试验（HCV蛋白酶FRET试验）中显示出具有1.3μM的IC_50-APP，并在复制子细胞试验中显示出抑制HCV复制的EC50为230nM。

化合物5的合成

化合物5

按照以下所述步骤和中间体制备化合物5。

路线4-A

步骤1：中间体4a

向(1R,2S,5S)-3-叔丁基2-甲基6,6-二甲基-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-2,3-二羧酸酯（0.30g，1.1mmol）的4mL的THF/MeOH（1:1）溶液中添加1NLiOH水溶液（2.0mL）。室温搅拌10小时之后，用1.0N的HCl中和反应混合物。真空下蒸发有机溶剂，用1.0N的HCl将剩余的水相酸化至pH~3，并用EtOAc萃取。用盐水洗涤有机层，用无水硫酸镁干燥。去除溶剂之后，获得0.28g中间体1a：MSm/z:254.2(ES-)。

步骤2：中间体4b

在室温搅拌下，向步骤1的产物（0.28g，1.0mmol）和3-氨基-4-环丁基-2-羟基丁酰胺（0.27g，1.3mmol）的10.0ml无水乙腈溶液中添加HATU（0.45g，1.2mmol）和DIEA（0.5ml，3.0mmol）。TLC分析指示10小时之后发生的偶联反应完成了。添加50ml份的EtOAc并用NaHCO₃水溶液和盐水洗涤混合物。分离有机层并用Na₂SO₄干燥。去除溶剂之后，将粗产物进行硅胶层析（洗脱液：EtOAc/己烷）。获得总共0.4g标题化合物（88%）。MSm/z:432.2(ES+,M+Na)。

步骤3：中间体4c

将步骤2的产物（0.40g，1.0mmol）溶解在5mL含4NHCl的二恶烷中。在室温下将混合物搅拌1小时。去除溶剂之后，倒入10mL份DCM，之后蒸发至干燥。添加DCM之后蒸发的这个过程重复四次以获得固体残留物，其可直接用于下一步：MSm/z:310.1(M+H⁺)。

步骤4：中间体4d

在室温搅拌下，向步骤3的产物（0.10g，0.28mmol）和(S)-3-(叔丁氧基羰基氨基)-2-(3-叔丁基脲基)丙酸（0.10g，0.33mmol）的3.0mL无水乙腈溶液中添加HATU（125mg，0.33mmol）和DIEA（0.17mL，1.0mmol）。1小时之后，添加15mlEtOAc并用NaHCO₃水溶液和盐水洗涤混合物。分离有机层并用Na₂SO₄干燥。去除溶剂之后，将粗产物进行硅胶层析（洗脱液：EtOAc/己烷)，以提供103mg标题化合物(60%)。MSm/z:595.2(M+H⁺)。

步骤5：中间体4e

将步骤4的产物（75mg，0.12mmol）溶解在3mL的4NHCl的二恶烷中，并在室温下搅拌反应1小时。去除溶剂之后，倒入3-mL份的DCM，之后蒸发至干燥。添加DCM之后蒸发的这个过程重复三次以获得淡棕色固体，并可直接用于下一步：MSm/z:495.2(M+H⁺)。

步骤6：中间体4f

按照步骤2所述的程序将丙烯酸（13.6mg，0.19mmol）和步骤5的产物和HATU（65mg，0.17mmol）偶联，以提供标题化合物（60mg，粗产物）。MSm/z:549.3(M+H⁺)。

步骤7：将步骤6的粗产物（60mg，0.11mmol）溶解在5mL二氯甲烷中，之后添加戴斯-马丁氧化剂（Dess-Martinperiodinane）（60mg，0.15mmol）。将制得的溶液在室温下搅拌1小时。然后去除溶剂并将残留物进行硅胶层析（洗脱液：EtOAc/庚烷），以提供13mg化合物5。MSm/z:547.2(M+H⁺)。

质谱分析

在化合物5的存在下，使用以下方案对HCV实施质谱分析：HCVNS3/4A野生型（wt）与相对于蛋白10X倍过量的化合物5孵育1小时。2μl部分的样品用10μl、0.1%的TFA稀释，之后将microC4ZipTipping直接用于MALDI目标，使用芥子酸作为解吸基质（10mg/ml，在0.1%TFA：乙腈为50：50中）。设备设置为具有24500的脉冲提取设置的线性模式，并以去铁肌红蛋白（apomyoglobin）作为校准设备的标准。与无化合物5的蛋白相比，用化合物5孵育的蛋白明显反应产生了新的物质，其比HCV蛋白酶重大约547Da，并与化合物5的质量547Da一致。

使用突变形式的HCV蛋白酶（其中，Cys159突变成Ser）对化合物5进行附加的分析，显示了化合物5并未修饰突变的HCV蛋白酶。

单链HCV蛋白酶（wt）肽的表达和纯化

将单链蛋白水解结构域（NS4A_21-32-GSGS-NS_33-631）（GSGS披露为SEQIDNO：10）克隆到pET-14b（Novagen，Madison，WI）中并转化进DH10B细胞（Invitrogen）。将制得的质粒转化到大肠杆菌BL21（Novagen）中进行之前所述的蛋白表达和纯化(1,2)。简而言之，使培养物在37℃，在含有100μg/mL的氨苄西林的LB培养基上生长直至在600nm处的光密度（OD600）达到1.0，并通过添加异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）至1mM进行诱导。在18℃再孵育20h之后，在6000×g离心10min收集细菌，并将其重悬在含有50mMNa₃PO₄，pH8.0，300mMNaCl，5mM2-巯基乙醇，10%甘油，0.5%聚乙二醇苯基醚CA630和由1mM苯甲磺酰氟化物，0.5μg/mL亮肽素，胃酶抑素A和2mM苄脒组成的蛋白酶抑制剂混合物的裂解缓冲液中。通过冻融法裂解细胞，之后超声处理。通过在12,000×g离心30min去除细胞碎片。通过0.45-μm过滤器（Corning）进一步澄清悬浮物，然后加载到装填NiSO₄的HiTrap螯和柱（AmershamPharmaciaBiotech）上。用100至500mM线性梯度的咪唑溶液洗脱结合蛋白。将所选部分通过Ni²⁺柱色谱并在10%的十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶上进行分析。在12%的SDS-PAGE凝胶上分辨纯化蛋白，然后转移到硝酸纤维素膜上。使用针对NS3的单克隆抗体通过westernblot分析蛋白。通过使用化学发光试剂盒（Roche）并以偶联辣根过氧化物酶的羊抗鼠抗体（Pierce）作为第二抗体使蛋白可视化。将蛋白分装并储存在80℃。

HCV蛋白酶和C159S变体的克隆和表达

通过PCR生成NS4A/NS3的突变DNA片段并克隆进pET表达载体。转化到BL21感受态细胞之后，用IPTG诱导表达2小时。使用亲和柱之后用排阻色谱纯化带His标签的融合蛋白。

生化试验

使用HCV蛋白酶FRET试验测定HCVNS3/4A1b酶（IC50_APP）。以下方案用于生成“表观”IC50值（IC50_APP）。不受任何特定理论的限制，认为与IC50值相反，IC50_APP可为依赖时间的抑制提供更有用的指示，从而更能代表结合亲和力。方案是改良的基于FRET的试验（v_03），其发展用于评估针对野生型和HCVNS3/4AIb蛋白酶的C159S，A156S，A156T，D168A，D168V，R155K突变体的化合物有效性，等级次序和抗性谱，如下：在50mMTris-HCl，pH7.5，5mMDTT，2%CHAPS和20%甘油中制备Bioenza（MountainView，CA）的NS3/4A蛋白酶的10X原液和Anaspec（SanJose，CA）的1.13X5-FAM/QXL^TM520FRET肽底物。点入0.5μL体积的50%DMSO和用50%DMSO制备的连续稀释的化合物之后，将5μL的每种酶添加到Corning（#3575）384孔，黑色，微孔板（Corning，NY）中。添加酶之后通过添加45μL的FRET底物立即启动蛋白酶反应，并在60-90分钟内在BioTek（Winooski，VT）的Synergy4微板阅读仪中，在λ_ex485/λ_em520下进行监测。基于每个试验的结论，检验每个孔的过程曲线的线性反应动力学和拟合统计（R²，95%置信区间，绝对平方和)。由相对荧光单位对时间（分钟）作图的斜率来确定每次反应的起始速率（0分钟至15+分钟），然后针对抑制剂浓度作图，作为无抑制剂和无酶对照的百分比，由log[抑制剂]对响应，GraphPad软件的GraphPadPrism（SanDiego，CA）中的变量斜率模型估算表观IC50。

在该试验中化合物5抑制HCV蛋白酶的IC50为1.3μM。

复制子试验

使用复制子衍生的荧光酶活性来测验化合物以评估化合物的抗病毒活性和细胞毒性。该试验使用了细胞系ET（luc-ubi-neo/ET），它是人Huh7肝瘤细胞系，其包含具有稳定荧光素酶（Luc）报告基因和三个细胞培养适应性突变的HCVRNA复制子。

ET细胞系在Dulbecco′s改良必需培养基（DMEM），10%胎牛血清(FBS)，1%青霉素-链霉素（pen-strep），1%谷氨酰胺，1%非必需氨基酸，400μg/mL的G418中，在37℃下，在5%CO₂的培养箱中生长。所有的细胞培养试剂都购自Invitrogen（Carlsbad）。细胞被胰蛋白酶化（1%胰蛋白酶：EDTA），并按5×10³细胞/孔的密度接种在用于细胞数目（细胞毒性）或抗病毒活性评估的白色96孔试验板（Costar）上。按6个3倍浓度梯度添加化合物并在DMEM，5%FBS，1%pen-strep，1%谷氨酰胺，1%非必需氨基酸中进行试验。每次试验中包括人干扰素α-2b（PBLBiolabs,NewBrunswick,NJ）作为阳性对照化合物。当细胞仍处于培养生长中（subconfluent）时，添加化合物之后细胞培养72h。按照供应商的说明，使用Steady-Glo荧光素酶试验系统（Promega,Madison,WI），通过分析复制子衍生的荧光素酶活性测量抗病毒活性。通过细胞活力检测试验（CellTiterBlueAssay，Promega）确定每孔中的细胞数目。通过计算可适用的EC50（抑制50%病毒复制的有效浓度），EC90（抑制90%病毒复制的有效浓度），IC50（减少50%细胞生存的浓度）和SI50（选择性指数：EC50/IC50）值衍生出化合物图谱。

在该试验中，化合物5抑制活性的EC_{50_APP}为230nM。

实施例5.丙肝病毒蛋白酶的不可逆抑制剂

化合物V-1是有效的HCV蛋白酶的可逆抑制剂（通过实施例4所述的生化试验测定的IC_{50_APP}为0.4nM）

从proteindatabank（worldwidewebrcsb.org）获得与HCV蛋白酶（pdb号2OC8）结合的博塞泼维的X射线复合物的坐标。用超过10个与其结合的小分子肽基抑制剂确定HCV蛋白酶的晶体结构，在它们的结合模式上有明显的结构类似性。博塞泼维的结构可用于使用DiscoveryStudio为HCV蛋白酶中V-1结构的建模。

鉴别了模型中所有处于V-120埃之内的蛋白的Cys残基。这样鉴别了5个残基Cys16，Cys47，Cys52，Cys145和Cys159。然后在V-1的三维方向开发出4个可取代位置（使用V-2模板），以确定哪个可取代为弹头，以便该弹头与所鉴别的HCV蛋白酶结合位点上的Cys残基形成共价键。在三维方向，使用DiscoveryStudio（AccelrysInc，CA）将弹头建立在模板上，并检查得到的化合物的结构，以观察弹头是否能够到达所鉴别的结合位点上的Cys残基之一。

式V-2

为了对弹头和侧链位置的灵活性进行取样，对弹头和侧链位置实施标准分子动力学模拟，并检查以观察弹头是否处于任何所鉴别的结合位点上的Cys残基的6埃之内。这样鉴别了接近Cys159的2个模板位置（R₁和R₃）。然后对这两个模板位置进行最终过滤，要求在候选不可逆抑制剂和Cys159之间可形成丙烯酰胺反应产物，其包括使用标准分子动力学模拟可形成小于2埃的键。这种约束留下1个模板位置R₃。

合成了化合物6，其显示为有效的HCV蛋白酶抑制剂（IC50为0.4nM），并显示出在Cys159上修饰了HCV蛋白酶（图4）。

化合物6的合成

N-[(l,l-二甲基乙氧基)羰基]-3-[(2-丙烯酰基)氨基]-L-丙氨酰-(4R)-4-[(7-甲氧基-2-苯基-4-喹啉)氧]-L-脯氨酰-1-氨基-2-乙基-N-(苯磺酰)-(lR,2S)-环丙烷羧酰胺：按照如下所述的步骤和中间体制备标题化合物。

中间体5-1

乙基-1-[[[(2S,4R)-1-[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]-4-[(7-甲氧基-2-苯基-4-喹啉)氧]-2-吡咯烷基]羰基]氨基]-2-乙烯基-(lR,2S)-环丙烷羧酸酯：在搅拌下，向(1R,2S)-l-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯甲苯磺酸（2.29g，7.0mmol）和N-Boc(2S,4R)-(2-苯基-7-甲氧基喹啉-4-氧)脯氨酸（3.4g，7.3mmol）的100mlDCM溶液中加入HATU（3.44g，9.05mmol)，然后加入DIEA（3.81ml，21.9mmol）。在室温下将混合物搅拌2小时。起始物质完全消耗之后，用盐水洗涤反应混合物两次，并用MgSO₄干燥。去除溶剂之后，将粗产物进行硅胶层析（己烷∶EtOAc=2∶1）。获得3.45g的标题化合物：R_f0.3（EtOAc∶己烷=2∶1）；MSm/z:602.36(M+H⁺)。

中间体5-2

l-[[[(2S,4R)-l-[(l,l-二甲基乙氧基)羰基]-4-[(7-甲氧基-2-苯基-4-喹啉)氧]-2-吡咯烷基]羰基]氨基]-2-乙烯基-(1R,2S)-环丙烷羧酸：向中间体5-1产物（1.70g，2.83mmol）的140mlTHF/H2O/MeOH（9:5:1.5）溶液中添加单水合氢氧化锂（0.95g，22.6mmol）。室温下搅拌24小时，用1.0NHCl中和反应混合物。真空蒸发有机溶剂，使用1.0NHCl将剩余的水相酸化至pH~3并用EtOAc萃取。用盐水洗涤有机层，用无水硫酸镁干燥。去除溶剂之后，获得1.6g标题化合物：R_f0.2（EtOAc∶MeOH=10∶1）；MSm/z:574.36(M+H⁺)。

中间体5-3

N-(1,1-二甲基乙氧基)羰基)-(4R)-4-[(7-甲氧基-2-苯基-4-喹啉)氧]-L-脯氨酰-l-氨基-2-乙烯基-N-(苯磺酰)-(lR,2S)-环丙烷羧酰胺：向中间体5-2产物（1.24g，2.16mmol）的20mlDMF溶液中添加HATU（0.98g，2.58mmol）和DIEA（1.43ml，8.24mmol），将混合物搅拌1小时之后添加苯磺酰胺（1.30g，8.24mmol），DMAP（1.0g，8.24mmol）和DBU（1.29g，8.4mmol）的15mlDMF溶液。再继续搅拌4小时。用EtOAc稀释反应混合物并用水性NaOAc缓冲液（pH~5，2x10ml），NaHCO₃溶液和盐水洗涤。用MgSO₄干燥和去除溶剂之后，通过添加一份DCM沉淀纯的产物。浓缩过滤物并使用己烷/EtOAc（1:1-1:2）将残留物进行硅胶层析。获得了共0.76g标题化合物：R_f0.3(EtOAc:己烷=3:1),MSm/z:713.45(M+H⁺),735.36(M+Na⁺)。

中间体5-4

(4R)-4-[(7-甲氧基-2-苯基-4-喹啉)氧]-L-脯氨酰-l-氨基-2-乙烯基-N-(苯磺酰)-(lR,2S)-环丙烷羧酰胺：向中间体5-3产物的30mlDCM溶液中逐滴添加15mlTFA。室温下将混合物搅拌2小时。去除溶剂之后，倒入20ml份的DCM，之后蒸发至干燥。将添加DCM之后蒸发的这个过程重复四次。添加甲苯（20ml）然后通过蒸发去除至干燥。此循环重复两次获得残留物，其固化成0.9g白色粉末，为标题化合物的TFA盐。用NaHCO₃中和小份的TFA盐样品获得标题化合物：R_f0.4(DCM:MeOH=10:1);MSm/z:613.65(M+H⁺)。

中间体5-5

N-[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]-3-[[(9H-氟-9-基甲氧基)羰基]氨基]-L-丙氨酰-(4R)-4-[(7-甲氧基-2-苯基-4-喹啉)氧]-L-脯氨酰-l-氨基-2-乙烯基-N-(苯磺酰)-(lR,2S)-环丙烷羧酰胺：在室温搅拌下，向中间体5-4产物（0.15g，0.178mmol）和N-Boc-3-(Fmoc)氨基-L-丙氨酸（0.107g，0.25mmol）的3.0mlDMF的溶液中添加HATU（85.1mg，0.224mmol）和NMM（N-甲基吗啉）（90.5mg，0.895mmol）。TLC分析指示了发生的偶联反应在1小时之后完成。倒入20ml份的EtOAc，并用缓冲液（pH~4，AcONa/AcOH），NaHCO₃和盐水洗涤混合物，用MgSO₄干燥。去除溶剂之后，将粗油产物进行硅胶层析（洗脱液：己烷/EtOAc）。获得总共0.12g标题化合物：R_f0.4(EtOAc:己烷=1:1);MSm/z:1021.56(M+H⁺)。

中间体5-6

N-[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]-3-氨基-L-内氨酰-(4R)-4-[(7-甲氧基-2-苯基-4-喹啉)氧]-L-脯氨酰-l-氨基-2-乙烯基-N-(苯磺酰)-(lR,2S)-环丙烷羧酰胺：将110mg中间体5-5产物（0.108mmol）的1mlDMF与12%的哌啶的溶液在室温下搅拌1.5小时，然后在高真空下蒸发至干燥。用己烷/醚（4:1）研碎残留物以生成70mg标题化合物：R_f0.25(EtOAc:MeOH=10:1);MSm/z:798.9(M+H⁺)。

化合物6

N-[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]-3-[(2-丙烯酰)氨基]-L-丙氨酰-(4R)-4-[(7-甲氧基-2-苯基-4-喹啉)氧]-L-脯氨酰-l-氨基-2-乙烯基-N-(苯磺酰)-(lR,2S)-环丙烷羧酰胺：在0℃将丙烯酰氯（11μL，0.132mmol）逐滴添加至搅拌的含有3当量三乙胺的69mg中间体5-6产物的3mlDCM溶液中。将反应混合物在室温下搅拌1.5h，然后用10mlDCM稀释。用盐水洗涤制得的溶液两次并用硫酸镁干燥。去除溶剂获得粗产物，通过硅胶色谱进行纯化，首先用己烷/EtOAc（1∶3-1∶5）洗脱，然后用DCM-甲醇(50∶1-25∶1))洗脱。获得共36mg标题化合物：R_f0.25(DCM:MeOH=25:1);MSm/z:892.55(M+H⁺)。

质谱分析

质谱分析显示了WT蛋白酶的修饰，但没有显示C159S突变体的修饰，其支持了化合物6对目标Cys的特定修饰。

在检验化合物的存在下实施了对HCV野生型或HCV变体C159S的质谱分析。将100pmolsHCV野生型（BioenzaCA）与化合物孵育1h和3h，且化合物6比蛋白过量10倍。1μl部分样品（总体积为4.24μl）用10μl0.1%的TFA稀释，之后将microC4ZipTipping直接用于MALDI目标，使用芥子酸作为解吸基质(10mg/ml在0.1%TFA:乙腈50:50)。在ShimadzuBiotechAximaTOF（ShimadzuInstruments）基质辅助激光解吸/电离飞行时间（MALDI-TOF）质谱仪上进行分析。用100pmolsHCV蛋白酶的HCVC159S突变体与比蛋白过量10倍的化合物6孵育3h执行相同程序。

完整的HCV蛋白出现在24465的MH+处，其具有相应的大约多200Da的芥子酸（基质）加成物。出现了化学当量的化合物6（MW为852Da）的引入，产生了大约多850-860Da的新质量峰（25320-25329的MH+）（图9）。这与单个分子的化合物6的引入一致。在10X浓度化合物存在时，甚至在1h之后即发生明显的反应，在10X浓度时，3h之后接近完全转化。酶的C159S变体并未显示出任何修饰的证据，这确认了化合物修饰了Cys159。

质谱分析确认了化合物6加成到HCV蛋白酶导致了853道尔顿的质量变化，这证实了HCV蛋白酶和化合物的加成物的形成。此外，化合物6没有与HCV蛋白酶的突变体形成加成物，该突变体中Cys159变成了Ser，如所预期的基于具有丙烯酰胺弹头与Cys和Ser的不同的反应性。这些数据证实了本文所述方法可用于设计HCV蛋白酶的特定不可逆抑制剂。

生化和细胞数据

用如实施例4所述的生化和复制子试验检验了化合物6。在生化试验中化合物6具有2.8nM的IC_{50_APP}，在复制子试验中具有174nM的EC50。

实施例6.不可逆索拉非尼（Sorafenib）

索拉非尼是有效的cKIT激酶结构域的可逆抑制剂。使用本文所述的设计算法，索拉非尼可被快速有效地转化成cKIT的不可逆抑制剂。

索拉非尼

使用与B-Raf结合的索拉非尼的X射线结构作为模板（pdb号1UWH）建立了cKIT激酶（Uniprot号P10721）的同源模型。利用以下所示的cKIT-B-RAF比对，用DiscoveryStudio的BuildHomology模块建立同源模型。然后在索拉非尼模板（式VI-1）的三维方向开发了10个可取代位置，以确定哪个可被取代为弹头，以便该弹头与结合位点上的Cys残基形成共价键。该方法鉴别了两个模板位置（R₉和R₁₀），和能够与丙烯酰胺弹头形成共价键的Cys（Cys788）。但是，涉及位置R₉的键采用顺式酰胺，这不是优选的，而涉及位置R₁₀的键能够形成反式酰胺，这是更优选的。合成了化合物7，其检验了在R₁₀位置上具有弹头的重要性。

RAF：人RAF（SEQIDNO：7）

CKIT：人CKIT（SEQIDNO：11）

式VI-1

化合物7的合成

4-(4-(3-(4-丙烯酰胺-3-(三氟甲基)苯基)脲基)苯氧基)-N-甲基吡啶酰胺

步骤1.N-4-氨基-2-三氟甲基苯基亚胺基二碳酸C,C′-二叔丁酯

在温室搅拌下，向4-硝基-2-三氟甲基苯胺（4.12g，20mmol）的1,4-二恶烷（50mL）溶液中添加4-DMAP（1.22g，10mmol）和Boc酸酐（13.13g，50mmol）。将反应混合物在110℃加热2h。冷却反应混合物，减压浓缩并将残留物溶解在EtOAc（25mL）中。并用10%柠檬酸溶液（5mL），水（5mL）和饱和NaCl（2mL）水溶液洗涤。用Na₂SO₄干燥之后减压浓缩获得残留物，其通过柱层析（SiO₂，60-120，石油醚/乙酸乙酯为6/4）纯化获得5.3g（13mmol）双Boc中间体，为淡黄色固体。将材料溶解在50mL甲醇中。在氮气下，向该溶液中添加乙酸（3mL），之后添加铁粉（1.71g，19.4g-原子）。将反应混合物在70℃加热2h，冷却至室温，通过床过滤。减压浓缩过滤物并用EtOAc（30mL）稀释残留物。用水（2mL）和饱和NaCl水溶液（2mL）洗涤，并用Na₂SO₄干燥。减压浓缩获得残留物，通过柱层析（SiO₂，60-120，石油醚/乙酸乙酯为6/4）进一步纯化获得3.19g标题化合物，为灰白色固体。

步骤2.4-(4-(3-(4-氨基-3-(三氟甲基)苯基)脲基)苯氧基)-N-甲基吡啶酰胺

向搅拌的N-4-氨基-2-三氟甲基苯基亚胺基二碳酸C,C′-二叔丁酯（0.5g，1.32mmol）和Et3N（0.6mL，5.97mmol）的甲苯（5mL）溶液中加入光气（20%甲苯溶液，0.91mL，1.85mmol）。将反应混合物加热回流16h，然后冷却至室温。添加4-(4-氨基苯氧基)-N-甲基-2-吡啶羧酰胺（0.32g，1.32mmol）至反应混合物中，加热回流2h。在通风橱中用水（5mL）淬灭反应混合物之后，用EtOAc（2x20mL）萃取。用饱和NaCl水溶液（15mL）洗涤乙酸乙酯萃取物，用Na₂SO₄干燥，并减压浓缩得到0.62g标题化合物。

步骤3.4-(4-(3-(4-丙烯酰胺-3-(三氟甲基)苯基)脲基)苯氧基)-N-甲基吡啶酰胺

在0℃，向搅拌的4-(4-(3-(4-氨基-3-(三氟甲基)苯基)脲基)苯氧基)-N-甲基吡啶酰胺（0.1g，0.22mmol）和吡啶（0.035g，0.45mmol）的DMF（5mL）溶液中添加丙烯酰氯（0.03g，0.33mmol）。使反应回至室温再搅拌12h，用冰冷水（10mL）淬灭并用EtOAc（2x20mL）萃取。用饱和NaCl溶液水溶液（5mL）洗涤乙酸乙酯萃取物，用Na₂SO₄干燥，并减压浓缩获得粗CNX-43。先通过中性氧化铝柱层析，然后通过制备HPLC纯化粗产物，获得18mg标题化合物，为白色固体。¹HNMR(MeOD)δppm:2.94(s,3H),5.82(d,J=10.0Hz,1H),6.37(dd,J=1.76&17.16Hz,1H),6.50(dd,J=10.28&17.16Hz,1H),7.06(dd,J=2.6&5.94Hz,1H),7.11-7.15(m,2H),7.45(d,J=8.64Hz,1H),7.56-7.61(m,3H),7.67(dd,J=2.24&8.48Hz,1H),8.0(s,1H),8.45-8.55(m,1H);LCMS:m/e501(M+2)

生化检验

索拉非尼针抑制cKIT磷酸化的IC50为50.5nM，而化合物7抑制cKIT磷酸化的IC50为31nM。使用实施例1所述的针对cKIT的试验实施生化检验。

GIST882细胞试验

将GIST430细胞接种在6孔微板上的完全培养基中，密度为8×10⁵细胞/孔。第二天用完全培养基稀释的1μM化合物处理90分钟。90分钟之后，去除培养基并用无化合物的培养基洗涤细胞。每2小时洗涤细胞并重悬在新鲜的无化合物培养基中。在特定时间点收集细胞，并用附加了Roche完全蛋白酶抑制剂片剂（Roche11697498001）和磷酸酶抑制剂（Roche04906837001）的细胞提取缓冲液（InvitrogenFNN0011）裂解，通过28.5规格（gauge）注射器混合10次剪切裂解物。测量蛋白浓度，每个泳道点样10μg总蛋白裂解物。用CellSignalingTechnology的pTyr（4G10）抗体和总kit抗体通过westernblot测试cKIT磷酸化。

在1微摩尔浓度检验了索拉非尼和化合物7的GIST882细胞系的细胞活性。两种化合物都抑制了cKIT自磷酸化，也抑制了ERK的下游信号传导。为了理解是否存在不可逆抑制剂的延长抑制，洗涤细胞至无化合物。对于可逆抑制剂，索拉非尼，ckit的抑制活性和下游信号传导被克服，而化合物7的不可逆抑制剂持续了至少8小时。这些数据支持了不可逆抑制剂化合物7的作用时间的优越性高于可逆抑制剂索拉非尼。

质谱分析

在胰蛋白酶消化之前，将c-KIT（15pmols）与过量10X的化合物7（150pmols）孵育3h。化合物孵育之后，以碘乙酰胺作为烷基化试剂。还制备了未添加化合物7的对照样品。对于胰蛋白酶消化物，2μl部分（3.3pmols）用10μl0.1%的TFA稀释，之后将microC18ZipTipping直接用于MALDI目标，使用α氰基-4-羟基肉桂酸作为基质（5mg/ml，在0.1%TFA:乙腈为50:50中）。

设备

对于胰蛋白酶消化物，设备设置为具有2200的脉冲提取设置的反射模式。使用激光BiolabsPepMix标准（1046.54，1296.69，1672.92，2093.09，2465.20）完成校准。对于CID/PSD分析，使用光标选择肽以设置离子门时间控制和破碎发生在激光功率高约20%，并以He作为CID的碰撞气体。使用曲线场反射的P14R破碎校准完成碎片校准。

预期被化合物7修饰的肽具有序列NCIHR（SEQIDNO：8），并观察到1141.5的MH+。（化合物7的单一同位素质量为499.15）。相比之下，不包含化合物7的cKIT的对照消化物显示出完全没有这个质量峰。数据还表明了可能存在肽的修饰，该肽具有序列ICDFGLAR（SEQIDNO：9）。

实施例7.丙肝病毒蛋白酶的不可逆抑制剂

如实施例5所述的，化合物V-1是有效的HCV蛋白酶的可逆抑制剂。使用HCV蛋白酶中的V-1的建模结构（参见实施例5），鉴别了模型中处于V-120埃之内的蛋白所有的Cys残基。这样鉴别了五个残基Cys16，Cys47，Cys52，Cys145和Cys159。然后在V-1的三维方向开发了4个可取代位置，它们可被取代为烯酮弹头，以便该弹头与HCV蛋白酶结合位点上被确认的Cys残基形成共价键。使用AccelrysDiscoveryStudio（AccelrysInc,CA）在三维方向，在模板（式V-2）上建立弹头，并检查得到的化合物的结构，以观察弹头是否能够到达所鉴别的结合位点上的Cys残基之一。

为了对弹头和侧链位置的灵活性进行取样，对弹头和侧链位置实施标准分子动力学模拟，并检查以观察弹头是否处于任何所鉴别的结合位点上的Cys残基的6埃之内。这样鉴别了接近Cys159的2个模板位置（R₁和R₃）。然后对这两个模板位置进行最终过滤，要求在候选不可逆抑制剂和Cys159之间可形成烯酮反应产物，其包括使用标准分子动力学模拟可形成小于2埃的键。这种约束留下1个模板位置R₃。

合成了化合物8，其显示出是HCV蛋白酶的有效抑制剂（IC_50-APP<0.5nM），并显示出在Cys159上对HCV蛋白酶进行了修饰。

化合物8

化合物8的合成

化合物8

(S)-l-((2S,4R)-2-((lR,2S)-l-(环丙基磺氨甲酰)-2-乙烯基环丙基氨甲酰)-4-(7-甲氧基-2-苯基喹啉-4-基氧)吡咯烷-l-基)-7-甲基-l,5-二氧代辛-6-en-2-基氨基甲酸叔丁酯：按照以下步骤和中间体制备标题化合物：

中间体8-1：

向中间体5-2（0.9g，1.57mmol）的6mlDMF溶液中添加CDI（0.28g，1.7mmol）。将混合物搅拌1小时，之后添加环丙基磺胺（0.25g，2.0mmol）,DBU（0.26ml，1.8mmol）和DIEA（0.9ml，5mmol）的2mlDMF溶液。将制得的混合物在60℃搅拌10小时。用EtOAc稀释反应混合物并用水性NaOAc缓冲液（pH~5，2x10ml），NaHCO₃溶液和盐水洗涤。用Na₂SO₄干燥和去除溶剂之后，使用己烷/EtOAc（1:1-1:2）将残留物进行硅胶层析。获得了共0.8g中间体8-1：R_f0.3(EtOAc:己烷=3:1),MSm/z:677.2(M+H⁺)。

中间体8-2：

将中间体8-1（0.8g，1.18mmol）溶解在5ml4NHCl的二恶烷中，并在室温下搅拌反应1小时。去除溶剂之后，倒入20ml份DCM之后蒸发至干燥。将添加DCM之后蒸发的这个过程重复三次，获得中间体8-2，为它的HCl盐。MSm/z:577.2(M+H⁺)。

中间体8-3：

在-78℃下，向N-Boc-焦谷氨酸（0.23g，1.0mmol）的10.0ml无水THF溶液中缓慢添加2-甲基-l-丙烯基)溴化镁（0.5M的THF溶液，5mL，2.5mmol）。反应混合物在-78℃搅拌1h。添加1NHCl（2.5ml）水溶液并将混合物缓慢加热至室温。通过1NHCl调整pH至~3。然后真空去除THF并通过DCM（3X20mL）萃取剩余水相。用Na₂SO₄干燥有机相，过滤和去除溶剂以提供粗产物。

化合物8：(S)-l-((2S,4R)-2-((lR,2S)-l-(环丙基磺氨甲酰)-2-乙烯基环丙基氨甲酰)-4-(7-甲氧基-2-苯基喹啉-4-基氧)吡咯烷-1-基)-7-甲基-l,5-二氧代辛-6-en-2-基氨基甲酸叔丁酯：按照合成化合物6中的中间体5-5所述的偶联反应，通过使用HATU偶联中间体8-2和中间体8-3制备标题化合物。

共获得了70mg标题化合物（65%）：R_f0.5(EtOAc);MSm/z:844.2(M+H⁺)。

生化数据

按实施例4所述的生化试验检验化合物8，显示出其是HCV蛋白酶的有效抑制剂（IC_{50_APP}<0.5nM）

质谱分析

按实施例5所述的实施质谱分析。分析确认了化合物8加成到HCV蛋白酶上导致了大约844道尔顿的质量变化，这证实形成了HCV蛋白酶和化合物的加成物。（图11）

实施例8.通过共价改善有效性

这个实施例证实了将设计算法和方法应用于由具有中等或弱的有效性的可逆抑制剂设计有效的不可逆抑制剂。

8.A.Btk激酶的抑制剂

化合物9是Btk激酶的弱的可逆抑制剂（在生化试验中IC₅₀为8.6μM）。使用本文所述的基于结构的设计算法，化合物9被快速有效地转化成Btk的不可逆抑制剂。

化合物9

使用Btkapo结构（pdb号：1K2P）和EGFR抑制剂（pdb号：2RGP）的共结晶结构的对接方法和DiscoveryStudio（DiscoveryStudiov2.0.1.7347,AccelrysInc）中蛋白建模组件获得了化合物9在Btk中的结合模式。

化合物9与Btk的结合模型鉴别了五个Cys残基（Cys464，Cys481，Cys502，Cys506和Cys527），它们处于化合物9的20埃之内。但是在三维结构中，5个半胱氨酸中有四个（Cys464，Cys502，Cys506和Cys527）被侧链或蛋白骨架所封闭。由于空间位阻不容易接近这些半胱氨酸。因此，只有一个半胱氨酸（Cys481）是可以够到的，并处于优选距离之内。在三维方向，在化合物9模板上开发了一个可取代位置（式VIII-I中的R₁）。使用DiscoveryStudio将弹头（丙烯酰胺）建立在化合物9的模板上，并使用AccelrysDiscoveryStudiov2.0.1.7347（AccelrysInc）将得到的化合物结构对接进Btk。检查最终的三维结构以确定弹头是否能够到达结合位点上的Cys（距Cys不超过6埃）。

式VIIIA-1

该方法确认了化合物9模板上所选的R₁位置接近Cys481，且距离小于6埃。在候选抑制剂和Cys481之间形成了丙烯酰胺反应产物，其包括使用标准分子动力学模拟形成了小于2埃的键。这个位置成功地符合了这种约束。

使用以下所述的方法和试验，合成了在R₁位置上含有丙烯酰胺的化合物10，其显示出是有效的Btk激酶抑制剂，并且在生化试验中的IC₅₀为1.8nM。相对于化合物9（IC₅₀8.6μM），其在有效性上明显改善。在Romas细胞试验中还评价了化合物10的活性。因为在生化试验中化合物9是弱的Btk抑制剂，预期其在细胞试验中不具有任何抑制活性。但是，当使用浓度为1μM时，化合物10在Ramos细胞中显示出抑制了85%的Btk信号传导。这些数据显示了本发明的算法和方法可用于改善弱可逆抑制剂的有效性（化合物9），以及有效的不可逆抑制剂（化合物10）在细胞中具有活性。

化合物10的合成

N-{3-[6-(4-苯氧基苯基氨基)-嘧啶-4-基氨基]苯基}-2丙烯酰胺

化合物10

在室温下搅拌3-[6-(4-苯氧基苯基氨基)-嘧啶-4-基氨基]苯胺（250mg，0.7mmol）和三乙胺（180mg，1.75mmol）的5mLTHF溶液。将丙烯酰氯（80mg，0.9mmol）添加至反应混合物中，并在室温下搅拌1h。真空蒸发去除溶剂并通过使用EtOAc/DCM溶剂体系的硅胶快速色谱纯化粗产物提供了115mg（40%产量）的标题化合物，为浅色固体。MS(m/z):MH⁺=424.¹HNMR(DMSO):9.14(s,1H),9.10(s,1H),8.22(s,1H),7.89(s,1H),7.52(d,2H,J=9.0Hz),7.35-6.92(m,11H),6.42(dd,1H,J₁=10.1Hz,J₂=16.9Hz),6.22(dd,1H,J₁=1.9Hz,J₂=16.9Hz),6.12(s,1H),5.70(dd,1H,J₁=1.9Hz,J₂=10.1Hz)ppm。

针对Btk的有效性测试的咬封盖试验方案（OmniaAssayProtocol）

以下方案描述了连续读数的激酶试验以测量化合物针对活性形式的Btk酶的固有有效性。最优的试验平台的机制如供应商（Invitrogen,Carlsbad,CA）在www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Drug-Discovery/Target-and-Lead-Identification-and-Validation/KinaseBiology/KB-Misc/Biochemical-Assays/Omnia-Kinase-Assays.html所述的。简而言之，在含有20mMTris，pH7.5，5mMMgCl₂，1mMEGTA，5mMβ-甘油磷酸，5%甘油（10X原液，KB002A）和0.2mMDTT（DS00lA）的1X激酶反应缓冲液中制备Invitrogen的5nMBtk的10X原液，1.13X40μMATP（AS00lA）和10μM（ATPKMapp~36mM）Tyr-Sox偶联的肽底物（KCZ1001）。将5μL酶和0.5μL体积的50%DMSO和用50%DMSO制备的连续稀释的化合物在Corning（#3574）384孔，白色，非结合表面微孔板（Corning,NY）中，27℃下，预孵育30分钟。添加45μLATP/Tyr-Sox肽底物混合物启动激酶反应，并在60分钟内每30-90秒在BioTek（Winooski,VT）的Synergy⁴微板阅读仪中，在λ_ex360/λ_em485下进行监测。基于每个试验的结论，检验每个孔的过程曲线的线性反应动力学和拟合统计（R²，95%置信区间，绝对平方和）。由相对荧光单位对时间(分钟)作图的斜率来确定每次反应的起始速率（0分钟~30分钟），然后针对抑制剂浓度作图，由log[抑制剂]对响应，GraphPad软件的GraphPadPrism(SanDiego,CA)中变量斜率模型估算IC₅₀。

BtkRamos细胞试验

在Romas人伯吉特（Burkitt）淋巴瘤细胞中测试化合物CNX-85。使Ramos细胞生长在T225烧瓶的悬浮液中，向下旋转，重悬在50ml的无血清培养基中，孵育1小时。将化合物添加至无血清培养基中的Ramos细胞中，至终浓度为1，0.1，0.01或0.001μM。将Ramos细胞与化合物孵育1小时，再洗涤并重悬在100μl无血清培养基中。然后用lμg羊F(ab′)2抗人IgM刺激细胞，并在冰中孵育10分钟以激活B细胞受体信号传导途径。10分钟之后，用PBS洗涤细胞一次并用Invitrogen细胞提取缓冲液在冰中裂解细胞。16μg来自裂解物的总蛋白点样在凝胶中，并在印染（blot）中用探针探测Btk底物PLCγ2的磷酸化。

8.B.HCV蛋白酶的抑制剂

化合物11是HCV蛋白酶的弱可逆抑制剂（在生化试验中IC₅₀为165nM）。使用本发明所述的基于结构的设计算法，化合物11可被快速有效地转化成HCV蛋白酶的不可逆抑制剂。

化合物11

确定了与超过10个小分子肽基抑制剂复合的HCV蛋白酶的结晶结构，在三种抑制剂结合模式中存在明显的结构类似性。从proteindatabank（worldwidewebrcsb.org）中获得了带有博塞泼维的复合物的X射线结构（pdb号2OC8），并用于使用DiscoveryStudio为HCV蛋白酶中的化合物11进行的结构建模。

鉴别了处于模型中对接化合物20埃之内的所有HCV蛋白酶的Cys残基。这样鉴别了五个残基Cys16，Cys47，Cys52，Cys145和Cys159。然后，在化合物11模板（式VIIIB-1的R₁）的三维方向开发了一个可取代位置，以确定它是否可被取代为弹头，以便该弹头与HCV蛋白酶结合位点上已鉴别的Cys残基形成共价键。在模板（式VIIIB-1）的三维方向上建立弹头（丙烯酰胺），而可逆抑制剂的其余部分保持不变。检查得到的化合物的结构，以观察弹头是否能够到达所鉴别的结合位点上的Cys残基之一。

为了对弹头和侧链位置的灵活性进行取样，对弹头和侧链位置实施了标准分子动力学模拟，并检查以观察弹头是否处于任何所鉴别的结合位点上的Cys残基的6埃之内。这个方法确认了模板上的R₁位置接近Cys159。然后对这个位置进行最终过滤，要求在候选抑制剂和Cys159之间可形成丙烯酰胺反应产物，其包括使用标准分子动力学模拟可形成小于2埃的键。化合物12满足了这种约束。

如以下所述，合成了化合物12，其显示出是有效的HCV蛋白酶抑制剂。

化合物12的合成

(2S,4R)-l-(2-丙烯酰胺乙酰)-4-(7-甲氧基-2-苯基喹啉-4-基氧)-N-((lR,2S)-l-(苯磺酰氨甲酰)-2-乙烯基环丙基)吡咯烷-2-羧酰胺：

化合物12（CNX-221）

按照以下所述步骤和中间体制备标题化合物。

中间体8.B-1

l-[[[(2S,4R)-l-[(l,l-二甲基乙氧基)羰基]-4-[(7-甲氧基-2-苯基-4-喹啉)氧]-2-吡咯烷基]羰基]氨基]-2-乙烯基-(lR,2S)-环丙烷羧酸乙酯：在搅拌下，向(1R,2S)-l-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯甲苯磺酸（2.29g，7.0mmol）和N-Boc(2S,4R)-(2-苯基-7-甲氧基喹啉-4-氧)脯氨酸（3.4g，7.3mmol）的100mlDCM溶液中搅拌添加HATU（3.44g，9.05mmol)，之后添加DIEA（3.81ml，21.9mmol）。将混合物在室温下搅拌2小时。起始物质完全消耗之后，用盐水洗涤反应混合物两次，并用MgSO₄干燥。去除溶剂之后，将粗产物进行硅胶层析（己烷:EtOAc=2:1）。获得3.45g的标题化合物：R_f0.3(EtOAc:己烷=2:1);MSm/z:602.36(M+H⁺)。

中间体8.B-2

l-[[[(2S,4R)-l-[(l,l-二甲基乙氧基)羰基]-4-[(7-甲氧基-2-苯基-4-喹啉)氧]-2-吡咯烷基]羰基]氨基]-2-乙烯基-(1R,2S)-环丙烷羧酸：向中间体8.B-1产物（1.70g，2.83mmol）的140mlTHF/H₂O/MeOH（9:5:1.5）溶液中添加单水合氢氧化锂（0.95g，22.6mmol）。室温搅拌24小时之后，用1.0NHCl中和反应混合物。真空蒸发有机溶剂，使用1.0NHCl将剩余水相酸化至pH~3并用EtOAc萃取。用盐水洗涤有机层，用无水硫酸镁干燥。去除溶剂之后，获得1.6g标题化合物：R_f0.2(EtOAc:MeOH=10:1);MSm/z:574.36(M+H⁺)。

中间体8.B-3

N-(l,l-二甲基乙氧基)羰基)-(4R)-4-[(7-甲氧基-2-苯基-4-喹啉)氧]-L-脯氨酰-l-氨基-2-乙烯基-N-(苯磺酰)-(lR,2S)-环丙烷羧酰胺：向中间体8.B-2产物（1.24g，2.16mmol）的20mlDMF溶液中添加HATU（0.98g，2.58mmol）和DIEA（1.43ml，8.24mmol），将混合物搅拌1小时之后添加苯磺酰胺（1.30g，8.24mmol），DMAP（1.0g，8.24mmol）和DBU（1.29g，8.4mmol）的15mlDMF溶液。再继续搅拌4小时。用EtOAc稀释反应混合物，并用水性NaOAc缓冲液（pH~5,2x10ml），NaHCO₃溶液和盐水洗涤。用MgSO₄干燥并去除溶剂之后，通过添加一份DCM沉淀纯的产物。浓缩过滤物并使用己烷/EtOAc（1:1-1:2）将残留物进行硅胶层析。共获得0.76g标题化合物：R_f0.3(EtOAc:己烷=3:1),MSm/z:713.45(M+H⁺),735.36(M+Na⁺)。

中间体8.B-4

(4R)-4-[(7-甲氧基-2-苯基-4-喹啉)氧]-L-脯氨酰-l-氨基-2-乙烯基-N-(苯磺酰)-(lR,2S)-环丙烷羧酰胺：向中间体8.B-3产品的30mlDCM溶液中逐滴添加15mlTFA。将混合物在室温下搅拌2小时。去除溶剂之后，倒入20-ml份DCM，之后蒸发至干燥。将添加DCM之后蒸发的这个过程重复四次。添加甲苯（20ml）然后通过蒸发至干燥将其去除。该循环重复两次获得残留物，其被固化成0.9g白色粉末，为标题化合物的TFA盐。用NaHCO₃中和小份TFA盐的样品获得标题化合物：R_f0.4(DCM:MeOH=10:1);MSm/z:613.65(M+H⁺)。

中间体8.B-5

(2S,4R)-l-(2-叔丁氧基羰基氨乙酰基)-4-(7-甲氧基-2-苯基喹啉-4-基氧)-N-((lR,2S)-l-(苯磺酰氨甲酰)-2-乙烯基环丙基)吡咯烷-2-羧酰胺：在室温搅拌下，向中间体8.B-4产物（0.10g，0.15mmol）和N-Boc-甘氨酸（0.035g，0.20mmol）的3.0mL乙腈溶液中添加HATU（85.1mg，0.22mmol）和DIEA（0.09mL，0.5mmol）。将反应混合物搅拌2h。LC-MS和TLC分析指示了偶联反应的完成。倒入20-mLEtOAc并用缓冲液（pH~4,AcONa/AcOH），NaHCO₃和盐水洗涤混合物，用Na₂SO₄干燥。去除溶剂之后，将粗产物进行硅胶层析（洗脱液：EtOAc/己烷）。共获得0.11g标题化合物：R_f0.2(EtOAc:己烷=2:1);MSm/z:770.3(M+H⁺)。

中间体8.B-6

(2S,4R-l-(2-氨乙酰)-4-(7-甲氧基-2-苯基喹啉-4-基氧)-N-((lR,2S-l-(苯磺酰氨甲酰)-2-乙烯基环丙基)吡咯烷-2-羧酰胺：将中间体8.B-5产物（0.11g，0.13mmol）溶解在2mL4NHCl的二恶烷中，并将反应物在室温下搅拌1小时。去除溶剂之后，倒入3-mL份DCM之后蒸发至干燥。将添加DCM之后蒸发的这个过程重复三次，获得化合物中间体6，为其HCl盐（0.10g）。MSm/z:670.2(M+H⁺)。

化合物12（CNX-221）

(2S,4R-l-(2-丙烯酰胺乙酰基)-4-(7-甲氧基-2-苯基喹啉-4-基氧)-N-((lR,2S-l-(苯磺酰氨甲酰)-2-乙烯基环丙基)吡咯烷-2-羧酰胺(1-27)：按照中间体8.B-5所述的偶联反应，使用HATU通过偶联中间体8.B-6和丙烯酸制备标题化合物。共获得0.10g标题化合物87%：R_f0.5(5%MeOH的DCM);MSm/z:724.3(M+H⁺)。

生化和细胞数据

用实施例4所述的复制子试验检验化合物12。在该试验中化合物12具有204nM的EC50，而在该试验中可逆的化合物11具有大于3000nM的EC50。

野生型和突变的NS3/4A1b酶的HCV蛋白酶FRET试验（IC50）

方案是InVitroResistanceStudiesofHCVSerineProteaseInhibitors,2004,JBC,vol.279,No.17,ppl7508-17514中改良的基于FRET的试验(v_02)。测试了化合物针对HCVNS3/4A1b蛋白酶的A156S，A156T，D168A和D168V突变体的固有有效性，如下：在50mMHEPES，pH7.8，100mMNaCl，5mMDTT和20%甘油中制备Bioenza（MountainView,CA）的NS3/4A蛋白酶的10X原液和Anaspec（SanJose,CA）的1.13X5-FAM/QXL^TM520FRET肽底物。将5μL每种酶与0.5μL体积的50%DMSO和用50%DMSO制备的连续稀释的化合物在Corning（#3575）384孔，黑色，非处理微孔板（Corning,NY）中，在25℃下，预孵育30min。通过添加45μLFRET底物启动蛋白酶反应，并在120分钟内在BioTek(Winooski,VT)的Synergy⁴微板阅读仪中在λ_ex487/λ_em514下通过Quad⁴单色器（monochromoters）进行监测。基于每个试验的结论，检验每个孔的过程曲线的线性反应动力学和拟合统计（R²,95%置信区间，绝对平方和）。由相对荧光单位对时间（分钟）作图的斜率来确定每次反应的起始速率（0分钟至30+分钟），然后针对抑制剂浓度作图，由log[抑制剂]对响应，GraphPad软件的GraphPadPrism（SanDiego,CA）中的变量斜率模型估算IC₅₀。结果如表12所列。

表12.

数据显示了含有与HCV蛋白酶共价结合的弹头的化合物12是野生型和突变的HCV蛋白酶的有效抑制剂，而可逆化合物11不是。

本文引用所有的专利，公开申请和参考文献的教导全部引入本文作为参考。当参照其例举实施方式特定显示和描述本发明时，本领域技术人员应该理解可做出形式和细节上的多种变化而不会偏离所附权利要求所包括的本发明范围。

Claims

1.一种设计与目标多肽共价结合的抑制剂的方法，其特征在于，该方法包括：

A)提供与目标多肽结合位点结合的可逆抑制剂的三维的结构模型，其中，所述可逆抑制剂与结合位点非共价接触；

B)当可逆抑制剂与结合位点结合时，鉴别邻近该可逆抑制剂的目标多肽结合位点上的Cys残基；

C)提供至少一种与目标多肽潜在共价结合的候选抑制剂的三维的结构模型，其中，每个候选抑制剂含有与可逆抑制剂的可取代位置键合的弹头，该弹头含有反应性化学功能和可选的连接体；

D)当候选抑制剂与结合位点结合时，确定所述候选抑制剂的弹头的反应性化学功能是否处于目标多肽结合位点上的Cys残基的键合距离之内；

E)对于含有在候选抑制剂与结合位点结合时处于目标多肽结合位点上的Cys残基的键合距离之内的弹头的候选抑制剂，在候选抑制剂与结合位点结合时在结合位点上的Cys残基的硫原子和弹头的反应性化学功能之间形成共价键，其中小于2埃的共价键长度表明该候选抑制剂是与目标多肽共价结合的抑制剂；并且

其中，所述方法通过电脑模拟实施。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，在含有目标多肽的蛋白家族中，所述Cys残基不是保守的。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述多肽具有催化活性。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，结合位点是底物或辅助因子的结合位点。

5.根据权利要求3所述的方法，其中，所述Cys残基不是催化残基。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，该方法还包括：

F)在结合位点上的Cys残基的硫原子和弹头的反应性化学功能之间形成共价键时，确定该结合位点是否被阻塞。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，E)中在共价键形成的过程中，其中，弹头和Cys残基的侧链是柔性的，而候选抑制剂和结合位点的剩余结构是固定的。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，在B)中，当可逆抑制剂与结合位点结合时，鉴别目标多肽结合位点上的每个邻近可逆抑制剂的Cys残基。

9.根据权利要求1所述的方法，其中，C)中所述候选抑制剂的结构模型包括多个候选抑制剂的模型，其中，在所述多个的每个成员中，弹头与不同的可取代位置键合。

10.根据权利要求1所述的方法，其中，所述目标多肽是激酶。

11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述可逆抑制剂与ATP结合位点相互作用。

12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述可逆抑制剂与ATP结合位点的铰链区域相互作用。

13.根据权利要求10所述的方法，其中，所述激酶是蛋白激酶。

14.根据权利要求10所述的方法，其中，所述激酶是脂质激酶。

15.根据权利要求1所述的方法，其中，所述目标多肽是蛋白酶。

16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述蛋白酶是病毒蛋白酶。

17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述病毒蛋白酶是HCV蛋白酶。

18.根据权利要求15所述的方法，其中，所述蛋白酶是半胱天冬酶。

19.根据权利要求15所述的方法，其中，所述蛋白酶是蛋白酶体或蛋白酶体的部分。

20.根据权利要求1所述的方法，其中，所述目标多肽是磷酸二酯酶。

21.根据权利要求1所述的方法，其中，所述目标多肽是脱乙酰酶。

22.根据权利要求1所述的方法，其中，所述目标多肽是热激蛋白。

23.根据权利要求1所述的方法，其中，所述目标多肽是G蛋白偶联受体。

24.根据权利要求1所述的方法，其中，所述目标多肽是转移酶。

25.根据权利要求1所述的方法，其中，所述目标多肽是金属酶。

26.根据权利要求1所述的方法，其中，所述目标多肽是核激素受体。

27.根据权利要求1所述的方法，其中，该方法进一步包括化合物结构的精修，以调整与Cys残基-SH基团的反应性。

28.根据权利要求1所述的方法，其中，使用从晶体结构或溶液结构获得的结构信息建立所述三维结构模型。

29.根据权利要求28所述的方法，其中，所述三维结构模型是同源模型。

30.根据权利要求28所述的方法，其中，所述三维结构模型使用计算方法建立。

31.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法通过使用一种或多种计算方法实施。

32.根据权利要求1所述的方法，其中，所述多肽具有催化活性，所述可逆抑制剂抑制所述多肽的活性并具有50μM或更小的IC₅₀。

33.根据权利要求1所述的方法，其中，所述多肽具有催化活性，所述可逆抑制剂抑制所述多肽的活性并具有50μM或更小的K_i。

34.根据权利要求1所述的方法，其中，所述目标多肽是突变或药物抗性蛋白。

35.根据权利要求1所述的方法，其中，所述可逆抑制剂是具有1μM或更小的IC₅₀或K_i的有效可逆抑制剂。

36.根据权利要求1所述的方法，其中，所述可逆抑制剂抑制目标多肽并具有1mM和1μM之间的IC₅₀或K_i的弱的或中等有效性。

37.根据权利要求36所述的方法，其中，相对于可逆抑制剂，与目标多肽共价结合的抑制剂具有改善的抑制目标多肽的有效性。

38.一种设计与目标多肽共价结合的抑制剂的方法，其特征在于，该方法包括：

B)当可逆抑制剂与结合位点结合时，鉴别目标多肽结合位点上邻近可逆抑制剂的Cys残基；

C)提供弹头基团的三维的结构模型，该弹头含有反应性化学功能，该反应性化学功能能够与Cys残基反应并在结合位点上的Cys残基的硫原子和弹头基团的反应性化学功能之间形成共价键；

D)鉴别任选地通过连接体可键合弹头基团的可逆抑制剂的可取代位置，以便在结合位点上的Cys残基的硫原子和弹头基团的反应性化学功能之间形成的键具有小于的键长；

E)通过连接体或键，将弹头基团键合到可逆抑制剂的可取代位置上，其中，所述键为共价键；并且

其中，所述方法通过电脑模拟实施。

39.一种不可逆抑制剂，该不可逆抑制剂包括与目标多肽的结合位点结合的化学部分以及一个弹头，其中，所述弹头为下式

其中，R₁，R₂和R₃独立地为氢，C₁-C₆烷基，或被-NRxRy取代的C₁-C₆烷基；和

Rx和Ry独立的为氢或C₁-C₆烷基。

40.一种多肽偶联物，其中，所述偶联物是含共轭烯酮弹头的不可逆抑制剂和含有半胱氨酸的多肽的反应产物，且所述偶联物为下式

X-M-S-CH₂-R

其中：

X是与目标多肽结合位点结合的化学部分，其中，所述目标多肽结合位点含有半胱氨酸残基；

M是由含共轭烯酮的弹头与所述半胱氨酸残基的硫原子共价键合形成的修饰部分；

S-CH₂是所述半胱氨酸残基的硫-亚甲基侧链；和

R是所述目标多肽的剩余部分，其中，所述共轭烯酮的弹头包括下式

其中，其中，R₁，R₂和R₃独立地为氢，C₁-C₆烷基，或被-NRxRy取代的C₁-C₆烷基；和

Rx和Ry独立的为氢或C₁-C₆烷基。

41.根据权利要求40所述的多肽偶联物，其中，所述偶联物为下式：

其中，X是与目标多肽结合位点结合的化学部分，其中，所述目标多肽结合位点含有半胱氨酸残基；

S-CH₂是所述半胱氨酸残基的侧链；

R是所述目标多肽的剩余部分；

R₁，R₂和R₃独立地为氢，C₁-C₆烷基，或被-NRxRy取代的C₁-C₆烷基；和

Rx和Ry独立地为氢或C₁-C₆烷基。