CN102399752A - 心脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体mcf1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医学领域，公开了心脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体mcf1及其应用。一株分泌心脏型脂肪酸结合蛋白的杂交瘤细胞株MCF1，与2011年9月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C201170。所述的杂交瘤细胞株MCF1分泌的心脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体mcf1，该单抗效价高、特异性强。所述的心脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体mcf1可在检测或纯化人心脏型脂肪酸结合蛋白中的应用。

Description

心脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体mcf1及其应用

技术领域

本发明属于生物医学领域，涉及心脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体mcf1及其应用。

背景技术

脂肪酸结合蛋白(FABPs)是一组多源性的小分子细胞内蛋白质，分子量为12～16KDa，广泛分布于哺乳动物的小肠、肝、脂肪、心、脑、骨骼肌等多种细胞中。有小肠型(I-FABP)、心肌型(H-FABP)、肝脏型(L-FABP)、肾脏型(K-FABP)等亚型。不同型FABP的序列有较大的同源性。心脏型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)分子量为14～15KDa，等电点(PI)为5.1，可将脂肪酸从细胞质膜向发生酯化和氧化的部位运输，从而进入线粒体的能量代谢体系之中，使脂肪酸在此氧化分解并最终生成三磷酸腺苷(ATP)，为心肌收缩提供能量。人H-FABP由132个氨基酸残基组成，在心肌中含量丰富，约占心脏全部可溶性蛋白的4％～8％，每克湿重心肌中含H-FABP约(0.52±0.06)mg。正常人的血浆和尿中不含有H-FABP或含量甚少。当心肌细胞受损时可快速释放到血和尿中。由于各型FABP具有各自特异的抗原决定簇，可以通过免疫学方法将H-FABP与其他型FABP相区分。随着FABP测定方法的研究和临床的应用，H-FABP已成为早期心肌损伤诊断的标志物(中国实验诊断学，2005年2月第9卷第1期)。

发明内容

本发明的目的是提供分泌心脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

本发明的另一目的是提供心脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体。

本发明的又一目的是提供心脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体的应用。

一株分泌心脏型脂肪酸结合蛋白的杂交瘤细胞株MCF1，与2011年9月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C201170。

所述的保藏号为CCTCC NO：C201170的杂交瘤细胞株MCF1分泌的心脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体mcf1。

所述的保藏号为CCTCC NO：C201170的杂交瘤细胞株MCF1分泌的心脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体mcf1在检测或纯化人心脏型脂肪酸结合蛋白中的应用。

所述的保藏号为CCTCC NO：C201170的杂交瘤细胞株MCF1分泌的心脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体mcf1在制备人心脏型脂肪酸结合蛋白检测试剂中的应用。

所述的人心脏型脂肪酸结合蛋白检测试剂优选检测检测人心脏型脂肪酸结合蛋白的Western Blot试剂、ELISA检测试剂、胶体金检测试剂。

一种检测人心脏型脂肪酸结合蛋白的胶体金试纸条，以权利要求2所述的抗人心脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体mcf1做检测线抗体，羊抗鼠IgG作为质控线，胶体金标记的单克隆抗体mcf2作为显色抗体，按照常规方法制备组装得到；其中所述的单克隆抗体mcf2由保藏号为CCTCC NO.C201181的杂交瘤细胞株分泌的抗人心脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体。

一种检测人心脏型脂肪酸结合蛋白的双夹心ELISA试剂盒，包含辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体mcf2，抗人心脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体mcf1包被的酶标板、PBST、TMB显色液、2mol/L H₂SO₄；其中所述的单克隆抗体mcf2由保藏号为CCTCC NO.C201181的杂交瘤细胞株分泌的抗人心脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体。

本发明的有益效果：

本发明利用纯化的人H-FABP(心脏型脂肪酸结合蛋白)作为免疫原，经过皮下免疫、常规细胞融合、筛选及克隆化，获得了一株能够稳定分泌抗H-FABP单克隆抗体的杂交瘤细胞株MCF1(CCTCC NO：C201170)。经ELISA、免疫印迹等方法鉴定，该杂交瘤细胞所分泌的单克隆抗体mcf1能够特异性识别H-FABP(Hytest公司)，效价高、特异性强。

本发明H-FABP单克隆抗体mcf1的应用如下：

(1)应用该抗体可Western Blot检测心肌组织的H-FABP表达。

(2)应用该抗体可建立金标试剂盒快速检测各种体液如血液、血浆、血清、尿的H-FABP的水平。

(3)应用该抗体可建立ELISA检测试剂盒定量检测各种体液如血液、血浆、血清、尿的H-FABP的水平。

(4)应用该抗体制备免疫亲和层析柱，来分离纯化H-FABP蛋白。

(5)应用该抗体进行免疫组化检测心肌组织中H-FABP蛋白表达量。

本发明还进一步确认了所述的单克隆抗体mcf1在体外用于检测体液或组织中H-FABP的表达。例如用于检测各种体液如血液、血浆、血清及尿液的H-FABP的水平；还可以测定各种疾病如急性心肌梗死等急性心肌损伤疾病H-FABP的表达水平，作为临床诊断或辅助诊断的一个标志物。本发明制得的人H-FABP单克隆抗体mcf1，为H-FABP的基础研究和临床研究提供了有利的工具。

附图说明：

图1心肌粗提液Sephadex G75凝胶过滤柱层析洗脱曲线。

图2心肌粗提液Sephadex G75经凝胶过滤柱层析后各组分(Tricine)-SDS-PAGE电泳，

A：第36号管开始于M15000附近出现清晰蛋白条带，

B：第41管至71管均可见M15000附近有清晰蛋白条带，

C：第91管之后M15000附近蛋白条带明显变浅。

图3心脏型脂肪酸结合蛋白QSepharose Fas t Flow阴离子交换柱层析洗脱曲线。

图4纯化的心脏型脂肪酸结合蛋白电泳结果，

A：制备的心脏型脂肪酸结合蛋白，B：经Sephadex G75凝胶过滤柱层析后收集液。

图5制备的心脏型脂肪酸结合蛋白Western Blot分析

A：经Sephadex G75凝胶过滤柱层析后收集液；B：制备的心脏型脂肪酸结合蛋白。

图6为Western Blot检测mcf1单克隆抗体与H-FABP的特异性反应，

其中泳道1为纯化的H-FABP 2μg蛋白+mcf1单克隆抗体，

泳道2为Hytest的H-FABP 2μg蛋白+mcf1单克隆抗体，

泳道3为脑组织匀浆液8μg蛋白+mcf1单克隆抗体，

泳道4为骨骼肌匀浆液8μg蛋白+mcf1单克隆抗体。

图7为Western Blot检测F2单克隆抗体与H-FABP的特异性反应，

其中泳道1为骨骼肌匀浆液8μg蛋白+mcf 2单克隆抗体，

泳道2为脑组织匀浆液8μg蛋白+mcf 2单克隆抗体，

泳道3为Hytest的H-FABP 2μg蛋白+mcf 2单克隆抗体，

泳道4为纯化的H-FABP 2μg蛋白+mcf 2单克隆抗体。

图8为金标试剂盒检测Hytest-H-FABP蛋白结果，

其中第1，2条为检测阴性对照，

第3，4条为检测10ng/ml Hytest-H-FABP蛋白，

第5，6条为检测20ng/ml Hytest-H-FABP蛋白。

生物材料保藏信息

杂交瘤细胞株MCF1，于2011年9月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏地点为中国武汉武汉大学，保藏号为CCTCC NO：C201170。

杂交瘤细胞株MCF2，于2011年9月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏地点为中国武汉武汉大学，保藏号为CCTCC NO.C201181。

具体实施方式

实施例1.H-FABP纯化

心脏型脂肪酸结合蛋白纯化：80g人左心室肌(来自于江苏省人民医院器官捐赠者)于400mL缓冲液A(15mmol/L磷酸盐缓冲液，10mmol/L β-巯基乙醇，pH 7.0)中匀浆。匀浆液4℃，2600g离心10min，沉淀用150mL缓冲液A重悬。4℃，2600g离心10min，合并2次离心后上清液，4℃，75600g离心120min，离心后上清液用400g/L(NH₄)₂SO₄盐析，4℃，10000g，离心25min，上清液再以800g/L(NH₄)₂SO₄盐析，4℃，10000g，离心25min。弃上清，沉淀以10mL缓冲液A溶解，于缓冲液A中4℃透析过夜，得到10mL粗提液，蛋白定量。5mL粗提液于已用缓冲液A平衡的SephadexG-75柱(2.0cm×100cm)中层析，收集流出液，测定各管收集液A 280值，至A值低于0.05时停止收集。将收集液进行蛋白电泳，电泳条件为：三羟甲基氨基甘氨酸(Tricine)-SDS-PAGE，分离胶浓度为16％，积层胶浓度为10％，浓缩胶浓度为4％，30mA恒流电泳2h。凝胶以考马斯亮蓝染色，Bio-Rad凝胶成像系统分析。结果显示：在第31～86管出现蛋白峰(见图1)，电泳显示其主蛋白条带位于10000～17000，本实施例制备的心脏型脂肪酸结合蛋白相对分子质量约为15000(见图2)，将31～86管合并，共计得到收集液50mL(1.9g/L)。

Q Sepharose Fas t Flow柱(20mL)用缓冲液B(5mmol/L咪唑，1mmol/L乙二胺四乙酸，2mmol/L β-巯基乙醇，pH 7.0)平衡后，以50mL上述收集液上样，缓冲液B洗柱，以AKTA蛋白纯化系统监测流出液A280值，待平衡后，以缓冲液B和20mmol/L NaCl进行梯度洗脱，洗脱总量为3倍柱体积，流速0.5mL/min。监测流出液A280值，合并蛋白峰管1-101(见图3)。合并液以Mr 35000聚乙二醇包埋行浓缩处理，以缓冲液B透析12h，共获得6mL纯化的心脏型脂肪酸结合蛋白(1.8g/L)(见图4)。

Western Blot检测：参照文献(汪家政，范明.蛋白质技术手册[M].北京：北京科学出版社，2002，166-184)进行。纯化的心脏型脂肪酸结合蛋白经Tricine-SDS-PAGE电泳，以30mA恒流过夜转膜，牛奶封闭。加一抗为鼠抗人心脏型脂肪酸结合蛋白抗体H86101M(BIODESIGN公司)，以1∶600稀释，室温反应1h，洗涤三次。随后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG(SIGMA公司)室温反应1h，洗涤三次，ECL两种底物1∶1等体积混合后将其覆盖在膜表面使其均匀，用保鲜膜把膜包起来，在暗室中将X光片覆盖在膜的上面，显影，定影。结果显示：在Mr15000附近位置有特异性印迹条带(见图5)，提示纯化的蛋白系心脏型脂肪酸结合蛋白。

实施例2.杂交瘤细胞系的建立

步骤1、免疫动物

选8-12周龄与骨髓瘤细胞同种系的Balb/c小鼠(上海斯莱克实验动物有限公司)，用实施例1纯化的120μl H-FABP(含蛋白质100μg)与120μl福氏完全佐剂(SIGMA公司)充分混匀，注入小鼠腹腔内，每隔2周100μg/只的H-FABP与等量福氏不完全佐剂(SIGMA公司)充分混匀，注入小鼠腹腔内加强免疫，共3～4次。采用间接ELISA法检测免疫小鼠血清中H-FABP蛋白多抗的效价，效价高者进行下一步的细胞融合。

步骤2、细胞融合

无菌制备H-FABP免疫的小鼠脾细胞悬液，与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0(来源于中科院上海细胞库)以6∶1的比例在PEG1450(SIGMA公司)作用下融合，融合按常规法(Nature.1975；256：495-497)，用1ml PEG，1分钟内缓慢加完，反应时间为90秒，无血清的DMEM(Gibco BRL公司)培养基终止反应，1000rpm离心10min，HAT(H次黄嘌呤、A氨基蝶呤、T胸腺嘧啶核苷，(Gibco BRL公司)完全DMEM培养基调细胞浓度至1x10⁶/ml，加入已预先铺有饲养细胞(Balb/c小鼠的腹腔巨噬细胞)的96孔培养板，100μl/ml，于37℃，5％CO₂培养箱中培养，每隔3天观察并换液，10天后以HT DMEM(Gibco BRL公司)培养基换液，1周后换完全DMEM培养基。

步骤3、间接酶联免疫吸附试验(ELISA)筛选阳性杂交瘤细胞

以纯化H-FABP(1μg/ml)包被酶标96孔板，37℃反应2小时或4℃过夜；3％牛血清白蛋白(BSA)封闭，4℃过夜，加入待检杂交瘤细胞(上述步骤2制得的细胞)培养上清，37℃孵育1小时，SP2/0培养上清为阴性对照；辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG(SIGMA公司)37℃孵育1小时；TMB底物液显色10min，2M H₂SO₄终止反应。每步完成均用含0.05％Tween20的PBS充分洗涤，Ultra Microplate Reader((EL808 Ultra Microplate Reader BIO-TEK Instruments，Inc.，Winooski，VT)测OD450值。所测的OD450比阴性对照高10倍的克隆，进行亚克隆化，并进行扩增冻存。

步骤4、阳性杂交瘤细胞的克隆化-采用有限稀释法

将上述步骤3筛选得到的细胞用HT DMEM培养基稀释至每孔1个细胞，铺于U型96孔细胞培养板，4小时内镜下观察每孔实际细胞数，记录单个细胞孔，待其长成克隆且ELISA鉴定抗体分泌呈阳性，即获得单抗分泌株，大量扩增并冻存，长期传代培养后，以相同的方法再次克隆化鉴定之，从而获得了稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株MCF1和MCF2。杂交瘤细胞株MCF1和MCF2于2011年9月6日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号分别为CCTCCNO.C201170和CCTCC NO.C201181。

实施例3.体外培养法制备单克隆抗体

将已经建立的阳性杂交瘤细胞MCF1(CCTCC NO.C201170)和MCF2(CCTCC NO.C201181)分别扩大培养，待细胞浓度达10⁵/ml时停止换液，持续培养直至细胞全部死亡。收集培养上清，1500rpm，离心10分钟，上清含有高水平的单克隆抗体，-20℃保存备用。

实施例4.体内诱生腹水法制备单抗

挑选经产Balb/c小鼠，腹腔内注射0.5ml液体石蜡(SIGMA公司)，7天后每只小鼠腹腔内注射0.5ml含2×10⁵的MCF1(CCTCC NO.C201170)或MCF2(CCTCC NO.201181)杂交瘤细胞，7-10天后视小鼠腹部膨胀程度收集腹水，4℃离心，2500rpm离心20min，收集上清，分别得到单克隆抗体mcf1和单克隆抗体mcf2，将两种单抗分别分装并放置-70℃保存备用。实施例5单克隆抗体的特性鉴定

步骤1、滴度测定

取实施例4制备的小鼠腹水做等比稀释，以H-FABP(Hytest公司)为检测抗原，间接ELISA法(同实施例2步骤3)测定实施例4制备的单克隆抗体mcf1和单克隆抗体mcf2的滴度，并以SP2/0诱生的小鼠腹水为阴性对照，ELISA检测的结果均为1∶10⁶。

步骤2、单克隆抗体IgG亚类鉴定

取MCF1和MCF2杂交瘤细胞培养上清，用小鼠单克隆抗体分型试剂(SIGMA公司)进行。

具体方法如下：

(1)在已包被H-FABP蛋白(实施例1制备)的ELISA板中分别加入MCF1和MCF2杂交瘤细胞培养上清，室温孵育2小时。

(2)用含0.05％Tween 20的PBS洗板三次。分别加入羊抗鼠的IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3(SIGMA公司)(用PBST 1∶2000稀释)各100μl/孔，每个样品双复孔。室温孵育30分钟。

(3)用含0.05％Tween 20的PBS洗板三次。加入HRP偶联的兔抗羊IgG(SIGMA公司)(用PBST做1∶20000稀释)，100μl/孔，室温孵育30分钟。

(4)用含0.05％Tween 20的PBS洗板三次，TMB底物显色10min。

(5)2M H₂SO₄终止反应。

(6)ELISA Reader测OD450值，判断单抗IgG亚类。

结果表明，MCF1和MCF2杂交瘤分泌的单抗mcf1和mcf2均为IgG1亚类免疫球蛋白。

步骤3、单抗的纯化

将实施例4制备的两种H-FABP单抗腹水mcf1和mcf2分别用0.01mol/L，pH 7.4的PBS对倍稀释。利用Protein A(Amersham Pharmacia Biotech公司)亲和层析的方法(按说明书操作)纯化H-FABP蛋白的单克隆抗体。将纯化的抗体进行SDS-PAGE电泳，按常规方法进行(分离胶为12.5％，浓缩胶为4.5％)。纯化的抗体放-70℃保存备用。

步骤4、单抗稳定性的测定

复苏杂交瘤细胞，收集传代3、4、5次数的细胞上清，并用ELISA方法检测其效价。结果显示，效价稳定，表明MCF1(CCTCC NO.C201170)和MCF2(CCTCC NO.201181)细胞株不同传代次数的细胞均能够稳定的产生单克隆抗体。

步骤5、单克隆抗体反应特异性

(1)间接ELISA方法(同实施例2步骤3)检测所得的两种单克隆抗体mcf1和mcf2与实施例1纯化的H-FABP和购买的Hytest的H-FABP特异性反应。实验结果见表1。结果表明，单抗mcf1和单抗mcf2与实施例1纯化的H-FABP和Hytest公司的H-FABP均有特异性反应，且OD值高于9F3(Fatty Acid Binding Protein(FABP)，目录编号：4F29-9F3，Hytest公司)

表1  ELISA检测mcf1和mcf2单抗与纯化H-FABP和Hytest-H-FABP的特异性反应

(2)Western Blot免疫印迹实验检测本发明单抗与纯化的H-FABP蛋白(实施例1制备)和Hytest H-FABP蛋白结合反应：

按常规方法在Bio-Rad电转移系统中将凝胶蛋白带转移到PVDF膜上(Millipore公司)，用5％脱脂奶粉4℃封闭过夜，加入由实施例4制备的H-FABP单抗，室温反应1h，洗涤三次。随后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG(SIGMA公司)室温反应1h，洗涤三次，ECL两种底物1∶1等体积混合后将其覆盖在膜表面使其均匀，用保鲜膜把膜包起来，在暗室中将X光片覆盖在膜的上面，显影，定影。结果显示：单抗mcf1和单抗mcf2与H-FABP蛋白有较强的特异性反应；而与脑组织、骨骼肌组织无交叉反应(图6、图7)。表明本发明获得的、由MCF1和MCF2细胞株产生的两株抗人H-FABP单克隆抗体mcf1和mcf2可特异性与H-FABP分子发生强烈的结合反应，可应用于H-FABP的检测。

步骤6抗体滴度测定

以Hytest的H-FABP为检测抗原，间接ELISA法(同实施例2步骤3)测定实施例5步骤3纯化的两种单抗mcf1和mcf2的滴度，并以稀释液作为阴性对照，以Hytest公司H-FABP抗体为阳性对照。实验结果表明：间接ELISA检测的抗体滴度是1∶10⁶以上，且MCF1和MCF2制备的抗体mcf1和mcf2OD值高于Hytest公司的H-FABP抗体9F3(见表2)。

表2  间接ELISA检测mcf1和mcf2单抗滴度

实施例6、两株单抗制备金标试纸条检测H-FABP蛋白

步骤1、检测线制备：

取杂交瘤细胞MCF1(CCTCC NO.C201170)制备的抗人H-FABP单克隆抗体mcf1做检测线抗体，以缓冲液(10％海藻糖，6％甲醇)稀释为1mg/mL；用划膜仪将抗体划在硝酸纤维素膜上，浓度为1μl/cm形成检测线，真空干燥。

步骤2、质控线制备：

羊抗鼠IgG(SIGMA公司)用缓冲液(10％海藻糖，6％甲醇)稀释为0.5mg/mL；用划膜仪将抗体划在硝酸纤维素膜上，浓度为0.5μl/cm形成质控线，真空干燥。

步骤3、显色抗体的金标记：

用0.1M K₂CO₃调节纳米金溶液至pH 8.2。于100mL纳米金溶液中逐滴加杂交瘤细胞MCF2(CCTCC NO.C201181)制备的单克隆抗体mcf2 3mg，搅拌5min，静置30min。再加入25mL 5％BSA+20mM Tris-HCl(pH 8.2)，4℃封闭过夜，得反应液。反应液于4℃，4000g，离心30min，沉淀用125mL 1％BSA+20mM Tris-HCl(pH 8.2)重悬，重复离心两次，离心速度依次为3000g、2000g得沉淀。用1200μl重悬液(30％海藻糖，1％BSA，0.01％Tween-20，0.02％NaN3，20mMTris-HCl，pH 8.2)悬浮沉淀，得金标抗体。

步骤4、金标垫制备及喷垫：

膜处理液配制：0.25％Triton X-100，0.15mM NaCl，0.05M Tris(pH 7.5)；聚酯纤维膜(S&S公司)在膜处理液中浸泡1h，真空干燥；以2μl/cm，将金标抗体喷印在金标垫上。

步骤5、试纸条装配：

将样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水纸按顺序粘贴在单面压敏胶的塑料板上，在硝酸纤维素膜上设有检测线抗体和质控线抗体；切割6cm宽度粘贴后的塑料板，装入检测卡；用带有干燥剂的热封锡箔袋包装，室温保存。

步骤6、检测：

将Hytest-H-FABP用1％BSA-PBST稀释至0ng/ml，10ng/ml，20ng/ml。将样品100μl滴加入加样孔，15min时观察，判读试纸条检测结果的标准为：阳性，检测线处和质控线处均有显色条带；阴性，检测线处无显色条带，质控线处有显色条带。实验结果见(见附图8)。结果表明，mcf1和mcf2单抗能组合金标试纸盒检测H-FABP蛋白。

实施例7、两株单抗双夹心ELISA方法检测H-FABP蛋白

步骤1、杂交瘤细胞MCF2(CCTCC NO.C201181)制备的单克隆抗体mcf2标记辣根过氧化物酶

取2mg单抗mcf2在0.05mol/L碳酸盐缓冲液(pH 9.5)中，4℃透析12小时，期间换三次透析液。取2mg辣根过氧化物酶(Roche公司)溶于0.5ml去离子水中，加入0.5ml 0.06mol/L过碘酸钠(SIGMA公司)，混匀后4℃避光反应30分钟。加入0.5ml 0.16mol/L乙二醇(SIGMA公司)，置室温避光反应30分钟。将透析后抗体和辣根过氧化物酶以1∶1(质量比)的比例混合后在0.05mol/L碳酸盐缓冲液(pH 9.5)中透析过夜，换透析液三次，取出透析卡中标记抗体，加0.2ml浓度为5mg/ml硼氢化钠(SIGMA公司)，4℃放置3小时，加入等体积饱和硫酸铵，4℃放置1小时，离心机3000g 4℃离心30分钟，弃上清，沉淀加50％硫酸铵溶液洗涤，离心机3000g 4℃离心30分钟，弃上清，沉淀加1ml PBS(0.15mol/L氯化钠，0.02mol/L磷酸钠缓冲液pH 7.4)溶解，装入透析卡(PIERCE公司)于PBS透析20小时以上，换4次透析液，取出透析卡中标记抗体，离心机10000g 4℃离心30分钟，弃沉淀，取上清用紫外分光光度计测定波长280nm及波长403nm的光密度值分别为OD280nm和OD403nm，根据公式计算标记物抗体量(mg/ml)＝(OD280nm-OD403nm×0.3)×0.62，标记物辣根过氧化物酶量(mg/ml)＝OD403nm×0.4。

步骤2、杂交瘤细胞MCF1(CCTCC NO.C201170)制备的单克隆抗体mcf1包被酶标板

取MCF1(CCTCC NO.C201170)制备的单抗mcf1溶于包被液(0.05mol/L碳酸盐缓冲液PH9.6)中至终浓度为10μg/ml，每孔100μl加入96孔可拆酶标板，4℃过夜。洗涤液洗3遍，每孔加300μl 1％牛血清白蛋白的PBST，4℃封闭过夜。洗涤液洗3遍，-20℃保存。

步骤3、检测H-FABP蛋白

取已包被抗体包被板。洗涤液洗3遍，每孔加100μl用PBST稀释成浓度为1000、100、10、0ng/ml的H-FABP(Hytest公司)37℃孵育1小时。洗涤液洗3遍，每孔加100μl 1∶2000稀释的辣根过氧化物酶标记的单抗mcf2，37℃孵育30分钟。洗涤液洗5遍，每孔加100μl TMB显色液(KPL公司)，37℃孵育10分钟。每孔加50μl 2mol/L H₂O₄终止反应，用酶标仪于双波长450nm读数。实验结果见表3。结果表明，mcf1和mcf2单抗能组合成双夹心ELISA检测H-FABP蛋白。

表3  mcf1和mcf2双单抗夹心ELISA检测Hytest-H-FABP结果

Claims (7)

1.一种分泌心脏型脂肪酸结合蛋白的杂交瘤细胞株MCF1，与2011年9月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C201170。

2.权利要求1所述的杂交瘤细胞株MCF1分泌的抗人心脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体mcf1。

3.权利要求2所述的心脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体mcf1在检测或纯化人心脏型脂肪酸结合蛋白中的应用。

4.权利要求2所述的心脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体mcf1在制备人心脏型脂肪酸结合蛋白检测试剂中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述的人心脏型脂肪酸结合蛋白检测试剂为检测检测人心脏型脂肪酸结合蛋白的Western Blot试剂、ELISA检测试剂或胶体金检测试剂。

6.一种检测人心脏型脂肪酸结合蛋白的胶体金试纸条，其特征在于以权利要求2所述的抗人心脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体mcf1做检测线抗体，羊抗鼠IgG作为质控线，胶体金标记的单克隆抗体mcf2作为显色抗体，按照常规方法制备组装得到；其中所述的单克隆抗体mcf2由保藏号为CCTCC NO.C201181的杂交瘤细胞株分泌的抗人心脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体。

7.一种检测人心脏型脂肪酸结合蛋白的双夹心ELISA试剂盒，其特征在于包含辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体mcf2，抗人心脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体mcf1包被的酶标板、PBST、TMB显色液、2mol/L H₂SO₄；其中所述的单克隆抗体mcf2由保藏号为CCTCC NO.C201181的杂交瘤细胞株分泌的抗人心脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体。

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