CN102396541A - 一种微生物农药复配杀菌剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种枯草芽孢杆菌与代森锰锌农药复配的杀菌剂，以及其可湿性粉剂剂型的配方及其制备方法。所述杀菌剂的有效活性成分由质量百分比95%-99%的枯草芽孢杆菌原粉和1%-5%代森锰锌组成；在所述有效活性成分中再加入润湿剂1-10份、填充材料40-50份和载体1-10份，在流化床气流粉碎机中粉碎至200目以上即制成可湿性粉剂；本发明复配杀菌剂中枯草芽孢杆菌与代森锰锌的增效作用明显，减少了农药对环境的污染以及在果实中的残留量并且能保证杀菌效果，能有效防治黄瓜灰霉病等，并且延缓了病原菌抗药性的增强；.本发明杀菌剂制备方法简单，生产成本低。
Description
技术领域
本发明涉及一种微生物农药复配杀菌剂，尤其是枯草芽孢杆菌与代森锰锌农药复配的杀菌剂，本发明还涉及枯草芽孢杆菌与代森锰锌农药复配的可湿性粉剂及其制备方法。
技术背景
在现在农业生产中，由于过量使用化学农药造成了农业生态环境日趋恶化；农业生产效率低下；生态环境的严重污染和植物病害的抗药性增强；对人类的健康也产生了影响。而生物农药具备对环境的污染少；易被其他生物或自然因素分解破坏；在环境中不易累积等优点。生物农药主要包括生物杀虫剂、杀菌剂和生态农药等。其中，以枯草芽孢杆菌为主要成分的细菌杀菌剂应用很广泛。20世纪50年代，以色列Gutter等首次报道了枯草芽孢杆菌对柑橘果实病原菌的拮抗作用（Gutter,1953）；美国迄今已有4株枯草芽孢杆菌生防菌株获得环保局商品化或有限商品化生产应用的许可，其中的QST713菌株被美国AgraQuest公司开发出活菌制剂杀菌剂Serenade，并于2000年通过美国环保局的登记，用于防治蔬菜、樱桃、葡萄、和葫芦等叶部病害。
目前为了提高细菌杀菌剂的杀菌效率，人们通常采用细菌杀菌剂与可兼容的化学农药进行复配，复配使用化学农药不仅可以发挥化学药剂杀菌抑菌速度快、防治效果稳定的优势，同时还具有保持生防微生物在植物根、叶周围的定殖和分泌抗生素等特点。通过复配协同作用达到优势互补、用量减少、防效增强的目的，因此用生防微生物与化学农药复配来防病具有广阔的应用推广前景。
代森锰锌是一种优良的保护性杀菌剂，属于低毒农药。化学名称为乙撑双二硫代氨基甲酸锰和锌离子的配位络合物。它可以为植物提供Zn元素，增强植物抵抗病害的能力，从而相对地起到杀菌作用。它主要防治蔬菜霜霉病、炭疽病、褐斑病等。但是高剂量的使用不仅影响了作物的生境，同时使病菌的耐药能力增强。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种用量少、防治效果强的微生物农药复配杀菌剂。
本发明解决上述技术问题采取的技术方案：
一种微生物农药复配杀菌剂，其有效活性成分由质量百分比95%-99%的枯草芽孢杆菌原粉和1%-5%代森锰锌组成。
所述枯草芽孢杆菌原粉是在用常规方法培养好的枯草芽孢杆菌发酵液中加入发酵液质量10%-20%的环糊精，进行喷雾干燥制得，所述枯草芽孢杆菌原粉中活菌体数为150-200亿/g。
一种微生物农药复配可湿性杀菌粉剂，其包括如下重量份的组分：
有效活性成分 10-50份
润湿剂 1-10份
填充材料 40-50份
载体 1-10份；
所述有效活性成分由质量百分比95%-99%的枯草芽孢杆菌原粉和1%-5%代森锰锌组成。
所述润湿剂由质量比为3：1的SHX和D-500组成。
所述填充材料为高岭土、硅藻土或膨润土。
所述载体为白炭黑或轻质碳酸钙。
一种制备上述微生物农药复配可湿性杀菌粉剂的方法，其具体步骤为：
（1）在用常规方法培养好的枯草芽孢杆菌发酵液中加入发酵液质量10%-20%的环糊精，进行喷雾干燥，得到原粉；
（2）按质量比原粉：代森锰锌=95-99：1-5添加代森锰锌，混合得有效活性成分；
（3）按如下重量份称取各组分，混合均匀得混合粉：
有效活性成分 10-50份
润湿剂 1-10份
填充材料 40-50份
载体 1-10份；
所述润湿剂由质量比为3：1的SHX和D-500组成；所述填充材料为高岭土、硅藻土或膨润土；所述载体为白炭黑或轻质碳酸钙。
（4）将所述混合粉通过流化床气流粉碎机粉碎，即得枯草芽孢杆菌和代森锰锌复配可湿性杀菌粉剂。
本发明采用上述技术方案取得的有益效果是：
1.本发明复配杀菌剂中枯草芽孢杆菌与代森锰锌的增效作用明显，与其组成的各种单剂相比，提高了杀菌能力；
2.本发明复配杀菌的可湿性粉剂中代森锰锌的含量仅占0.5%-2.5%，减少了它对环境的污染以及在果实中的残留量并且能保证杀菌效果，能有效防治黄瓜灰霉病等，并且延缓了病原菌抗药性的增强；
3.本发明杀菌剂制备方法简单，生产成本低。
（一）枯草芽孢杆菌与代森锰锌复配制剂的增效作用试验
称取一定量的代森锰锌，分别用无菌水和枯草芽孢杆菌的无菌发酵滤液溶解代森锰锌配制成3.3mg/ml、2.5 mg/ml、2 mg/ml、1.7 mg/ml、1.4 mg/ml、1.25 mg/ml、1 mg/ml、0. 7 mg/ml的带药溶液。采用平板扩散法检测抑菌活性：将3ml菌数为3.3×107的灰霉病菌孢子悬液加入到50℃的300ml的PDA固体培养基内，混匀倒板。冷却后进行活性测定。根据效价标准曲线计算各配比的抑菌效价比值。
效价比值=复配溶液的效价/（A溶液的效价+B溶液的效价）
表1 枯草芽孢杆菌与代森锰锌复配制剂的增效效价比值 表1 枯草芽孢杆菌与代森锰锌复配制剂的增效效价比值
注：“A”代表枯草芽孢杆菌发酵液；“B”代表代森锰锌溶液；“B-2.5”代表浓度为2.5mg/ml的代森锰锌溶液；“复配-3.3”代表用枯草芽孢杆菌发酵液配制的代森锰锌浓度为3.3mg/ml 的溶液；“A+B”代表枯草芽孢杆菌发酵液效价与代森锰锌药液效价之和。
从表1中可以看出，对不同浓度枯草芽孢杆菌的无菌发酵液溶解代森锰锌配制的复配溶液，当复配浓度为2mg/ml时，它的效价比值最大，复配溶液的效价是两个单剂溶液效价之和的2.15倍。而各复配溶液中从抑菌活性效价比较上发现复配溶液的效价比两个单剂效价之和有显著地提高。
（二）枯草芽孢杆菌与代森锰锌复配制剂的协同增效作用试验
分别制成浓度如表2所示的枯草芽孢杆菌和代森锰锌PDA培养基，以PDA培养基平板作为空白对照（即为CK），用直径8mm的打孔器在培养好灰霉病菌的平板上切下带菌的培养基块，即为菌饼，将菌饼带菌丝的一面接种到培养基中央。将各个处理置于25℃培养箱中培养。定期观察菌落的形态并用十字交叉法测量菌落的直径，直到CK长满平皿为止，计算抑制生长率。
抑制生长率（%）=（CK净生长量-处理净生长量）/CK净生长量×100，其中：
CK净生长量=空白对照PDA培养基上培养的菌落直径-8mm（菌饼原有的直径）；
处理净生长量=处理浓度平板上菌落的直径-8mm（菌饼原有的直径）；
假设枯草芽孢杆菌单剂和代森锰锌单剂的EC50值为a和b，用共毒因子法评价两者的增效作用时选择5个配比，即为等效线法中相加作用线的六等分点，具体方法为先配置两个单剂的EC50溶液，再按体积比1:5、1:2、1:1、2:1、5:1混合即得到不同的配比混剂。再按着上述方法测定。
共毒因子=（混剂实际抑制率-混剂理论抑制率）/混剂理论抑制率×100
其中共毒因子大于20，表示有增效作用；小于等于20表示有拮抗作用；-20～20表示相加作用。
表2 各单剂对灰霉病菌的抑制作用
| 浓度（mg/ml） | 抑制生长率（%） | |
| 枯草芽孢杆菌 | 0.1 | 53.8 |
| 0.05 | 49.3 | |
| 0.025 | 46.2 | |
| 0.0125 | 43.1 | |
| 代森锰锌 | 0.01 | 83.8 |
| 0.0625 | 66.4 | |
| 0.125 | 52.3 | |
| 0.25 | 45.7 | |
| 0.5 | 29.5 | |
| 1 | 16.2 | |
| 2 | 2.8 | |
| CK | --- | --- |
将各个单剂浓度转化为对数，将菌丝生长抑制率转化为几率值进行线性回归，得到EC50值。
表3 各单剂的毒力回归方程
| 毒力回归方程 | 相关系数 | EC50(mg/ml) | |
| 枯草芽孢杆菌 | Y=0.1274x+0.378 | R2=0.990 | 0.051 |
| 代森锰锌 | Y=0.5288x+0.5243 | R2=0.9922 | 0.37 |
枯草芽孢杆菌的EC50为0.051mg/ml；代森锰锌的EC50值为0.37mg/ml。再计算共毒因子。
表4 各单剂之间的增效作用
从表3中可以看出，枯草芽孢杆菌与代森锰锌各个复配溶液的共毒因子均大于20，说明两者复配后对灰霉病菌的生长抑制作用存在着协同增效作用。复配后的抑菌效果优于各个单剂的效果。
（三）复配杀菌剂防治黄瓜灰霉病的田间防效试验
田间防效实验设计：总共设4个处理，每个处理设定3个区，共12个区，随机排列，中间、四周设保护区间隔。采用喷雾法防治黄瓜灰霉病。具体处理如下：处理1采用清水喷施叶面；处理2是75%的代森锰锌可湿性粉剂稀释500倍进行叶面喷施；处理3是将复合的可湿性杀菌粉剂稀释500倍进行叶面喷施处理；处理4是将复合的可湿性杀菌粉剂稀释1000倍后进行叶面喷施处理。每隔两周（14天）进行一次叶面喷施，在整个黄瓜生长时期共进行6次喷施处理。同时记录发病级数，计算病情指数及其防效。
其中黄瓜灰霉病的病情分级标准：
0 级：无病斑；
1 级：病斑面积占整个叶面积 5％以下；
3 级：病斑面积占整个叶面积 6％-10％；
5 级：病斑面积占整个叶面积 11％-20％；
7 级：病斑面积占整个叶面积 21％-50％；
9 级：病斑面积占整个叶面积 50％以上。
病情指数=∑（各级病叶数×相对级数值）×100/调查总叶数×9
防治效果（%）=（CK—PT）/ CK×100
式中：CK——空白对照病情指数;
PT——不同处理病情指数
表4 复配可湿性杀菌剂田间防效
| 处理 | 稀释倍数 | 病情指数 | 防效(%) |
| CK清水 | -- | 19.43Aa | -- |
| 代森锰锌 | 500 | 13.59Bb | 30.07 |
| 复配杀菌剂 | 500 | 8.72Cc | 55.12 |
| 复配杀菌剂 | 1000 | 14.03Bb | 27.79 |
注：表中调查数据为3次重复的病指平均数。
从田间防效试验中可以看出，复配杀菌剂稀释500倍时的防治效果达到了55.12%，比代森锰锌浓度稀释500倍时的防治效果要高，复配杀菌剂稀释1000倍时的防治效果与代森锰锌溶液相比无明显差异。使用时选择稀释复配杀菌剂500倍的浓度，既能显著地提高杀菌能力，又能减少代森锰锌的使用量。
综上所述，本发明所述的枯草芽孢杆菌与代森锰锌复配的可湿性杀菌粉剂可以有效地防治黄瓜灰霉病，其制作方法简单，成本低，易于实施。
具体实施方式
实施例1
（1）将枯草芽孢杆菌BAB-1菌株(保藏号：CGMCCNo.2099)接种到NB液体培养基中，培养12小时后，菌株达到对数生长期，以5%的接种量转接于50mL的PB液体培养基(每升含牛肉膏5g、NaCl 5g、蛋白胨10g、1000mL水、pH7.0-7.2)内，培养38h后95%的菌体形成芽孢，即得到枯草芽孢杆菌的发酵液,在上述发酵液中加入发酵液质量10%的β-环糊精，进行喷雾干燥，得到枯草芽孢杆菌原粉，原粉中活菌体数为150-200亿/g；
（2）按质量比原粉：代森锰锌=95：5添加代森锰锌，混合得有效活性成分；
（3）按如下重量份称取各组分，混合均匀得混合粉：
有效活性成分 10份
由质量比为3：1的SHX和D-500组成的润湿剂 5份
高岭土 45份
轻质碳酸钙5份；
（4）将所述混合粉通过流化床气流粉碎机粉碎至200目以上，即得枯草芽孢杆菌和代森锰锌复配可湿性杀菌粉剂。
实施例2
（1）将枯草芽孢杆菌BS-03菌株(保藏号：CGMCCNo.3038)接种到NB培养基中，培养12小时后，菌株达到对数生长期，以5%的接种量转接于50mL的PB液体培养基(每升含牛肉膏5g、NaCl 5g、蛋白胨10g、1000mL水、pH7.0-7.2)内，培养38h后95%的菌体形成芽孢，即得到枯草芽孢杆菌的发酵液,在上述发酵液中加入发酵液质量10%的β-环糊精，进行喷雾干燥，得到枯草芽孢杆菌原粉，原粉中活菌体数为150-200亿/g；
（2）按质量比原粉：代森锰锌=99：1添加代森锰锌，混合得有效活性成分；
（3）按如下重量份称取各组分，混合均匀得混合粉：
有效活性成分 30份
由质量比为3：1的SHX和D-500组成的润湿剂 10份
硅藻土 50份
白炭黑10份；
（4）将所述混合粉通过流化床气流粉碎机粉碎至200目以上，即得枯草芽孢杆菌和代森锰锌复配可湿性杀菌粉剂。
实施例3
（1）将枯草芽孢杆菌sf-628菌株(保藏号：CGMCCNo.1772)接种到NB培养基中，培养12小时后，菌株达到对数生长期，以5%的接种量转接于50mL的PB液体培养基(每升含牛肉膏5g、NaCl 5g、蛋白胨10g、1000mL水、pH7.0-7.2)内，培养38h后95%的菌体形成芽孢，即得到枯草芽孢杆菌的发酵液,在上述发酵液中加入发酵液质量10%的β-环糊精，进行喷雾干燥，得到枯草芽孢杆菌原粉，原粉中活菌体数为150-200亿/g；
（2）按质量比原粉：代森锰锌=97：3添加代森锰锌，混合得有效活性成分；
（3）按如下重量份称取各组分，混合均匀得混合粉：
有效活性成分 50份
由质量比为3：1的SHX和D-500组成的润湿剂 1份
膨润土 40份
白炭黑 1份；
（4）将所述混合粉通过流化床气流粉碎机粉碎至200目，即得枯草芽孢杆菌和代森锰锌复配可湿性杀菌粉剂。
Claims (7)
1.一种微生物农药复配杀菌剂，其特征在于其有效活性成分由质量百分比95%-99%的枯草芽孢杆菌原粉和1%-5%代森锰锌组成。
2.根据权利要求1所述的微生物农药复配杀菌剂，其特征在于所述枯草芽孢杆菌原粉是在用常规方法培养好的枯草芽孢杆菌发酵液中加入发酵液质量10%-20%的环糊精，进行喷雾干燥制得，所述枯草芽孢杆菌原粉中活菌体数为150-200亿/g。
3.一种微生物农药复配可湿性杀菌粉剂，其特征在于其包括如下重量份的组分：
有效活性成分 10-50份
润湿剂 1-10份
填充材料 40-50份
载体 1-10份；
所述有效活性成分由质量百分比95%-99%的枯草芽孢杆菌原粉和1%-5%代森锰锌组成。
4.根据权利要求2所述的可湿性杀菌粉剂，其特征在于所述润湿剂由质量比为3：1的SHX和D-500组成。
5.根据权利要求2所述的可湿性杀菌粉剂，其特征在于所述填充材料为高岭土、硅藻土或膨润土。
6.根据权利要求2所述的可湿性杀菌粉剂，其特征在于所述载体为白炭黑或轻质碳酸钙。
7.一种制备权利要求2所述的微生物农药复配可湿性杀菌粉剂的方法，其特征在于其具体步骤为：
（1）在用常规方法培养好的枯草芽孢杆菌发酵液中加入发酵液质量10%-20%的环糊精，进行喷雾干燥，得到原粉；
（2）按质量比原粉：代森锰锌=95-99：1-5添加代森锰锌，混合得有效活性成分；
（3）按如下重量份称取各组分，混合均匀得混合粉：
有效活性成分 10-50份
润湿剂 1-10份
填充材料 40-50份
载体 1-10份；
所述润湿剂由质量比为3：1的SHX和D-500组成；所述填充材料为高岭土、硅藻土或膨润土；所述载体为白炭黑或轻质碳酸钙；
（4）将所述混合粉通过流化床气流粉碎机粉碎，即得枯草芽孢杆菌和代森锰锌复配可湿性杀菌粉剂。
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