CN102382879A

CN102382879A - 荧光假单胞菌lamp检测试剂及试剂盒

Info

Publication number: CN102382879A
Application number: CN2011103211797A
Authority: CN
Inventors: 苏秀榕; 应琪; 周君; 李成华; 张春丹; 李晔
Original assignee: Ningbo University
Current assignee: Zhejiang Power Technology Co Ltd
Priority date: 2011-10-21
Filing date: 2011-10-21
Publication date: 2012-03-21
Anticipated expiration: 2031-10-21
Also published as: CN102382879B

Abstract

本发明公开了荧光假单胞菌LAMP检测试剂及试剂盒，该荧光假单胞菌LAMP检测试剂是构建出扩增效率和特异性好的5条引物F3：GCGCGAATACTTCAAGTCCA、B3：GTACAGCTGCGAAGTCTGC、Y-LB：TCAACCACGGGGAGCAT、FIP：AGGTGGGGTTGCTGCTGTAGAGGTCAACCTGCTGTATGTGA、BIP：TGCCCAAGACCATCCTTTCCAAACAGTTCGTTGGTGTCCG，该荧光假单胞菌LAMP检测试剂及试剂盒克服了常规PCR费时，对设备要求高等缺点，由该5条特异性引物组成的试剂及试剂盒可对样品中的荧光假单胞菌进行快速准确的定性检测，具有特异性好、简单易操作、结果直观和成本低廉等优点。

Description

荧光假单胞菌LAMP检测试剂及试剂盒

技术领域

本发明涉及荧光假单胞菌的检测技术，具体涉及荧光假单胞菌LAMP检测试剂及试剂盒。

背景技术

荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens Migula）系假单胞菌属，4℃时繁殖速度快，是水产品生产、贮藏和销售过程中最易污染而引起腐败甚至人类疾病的微生物之一，也是3月份、5月份海洋陆源排污口的优势菌。假单胞菌的检测方法主要包括血清学检测(DAS-ELISA)、逆转录－聚合酶链式反应（PCR）技术和环介导等温扩增技术（LAMP）。如公告号为CN101403001的发明专利，就公开了由反应液、Bst DNA聚合酶、稳定液、样品预处理液、显色液和阳性对照液组成的试剂盒，用LAMP方法检测铜绿假单胞菌，其中反应液含有外引物和内引物的2对引物，其依赖于能够识别靶序列上6个特异区域的2对引物和一种具解旋功能且呈瀑布式扩增的Bst DNA聚合酶，在等温条件下可高效、快速和特异的扩增靶序列。由于LAMP呈瀑布式扩增，因此其扩增效率非常高；同时，LAMP识别靶序列上6～8个特异性位点，其特异性也很强；LAMP只在60℃～65℃进行恒温扩增，只要水浴锅即可，无需特殊的仪器，操作非常简单；而且LAMP的整个检测反应只需1.5 h～2.5 h，检测周期非常短。目前还没有研究建立特异、灵敏以及操作简单的荧光假单胞菌LAMP检测试剂及试剂盒。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种对荧光假单胞菌具有特异性高、检测周期短、成本低廉和操作简单的RT-LAMP检测试剂及及试剂盒。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：荧光假单胞菌LAMP检测试剂，

包括特异性引物溶液，特异性引物溶液为F3 / B3引物溶液、FIP / BIP引物溶液和Y-LB引物溶液，所述F3 / B3引物溶液含有序列为F3：5′-GCGCGAATAC TTCAAGTCCA - 3′、B3：5′-GTACAGCTGC GAAGTCTGC - 3′的特异性引物；所述FIP / BIP引物溶液含有序列为FIP：5′-AGGTGGGGTT GCTGCTGTAG AGGTCAACCT GCTGTATGTG A - 3′、BIP：5′-TGCCCAAGAC CATCCTTTCC AAACAGTTCG TTGGTGTCCG - 3′的特异性引物；所述Y-LB引物溶液含有序列为：5′-TCAACCACGG GGAGCAT- 3′的特异性引物。

上述引物系选择荧光假单胞菌的cDNA序列为靶目标，应用PRIMEREXPLORER V4（http://primerexplorer.jp/eLAMP4.0.0/index.htmL）软件设计合成，将设计的多对引物进行反应时间和反应温度进行优化试验，得到最合适的反应条件。该荧光假单胞菌的cDNA序列的的核苷酸序列为：

ATGTCAAAAG TAAAAGACAA AGCTGGAAGC GGCGAAATAC CAGCGACTTT AAGGATCGTC CTATCCCGGA TTAAGGAGGG TTTATTTAGA GTGGGTCCAT GAGATTAAGG ACCTACCTTC ATCAGATCAG TCCCGTATTT TCCAGTCCTG AAGCCGCCAG CAGGTTGCTG CGTCTGTTCG CGCTCATTCT TTTGGTTGGT ATCCTCGGAG CCGTCTACAA CTTCCTCAAC TCCACCCTCA GCAACGACAT TTCCCGGCGC CGCGGCTACA TGAGCAGCGC CATCGCCGAA GCCCAGACCT TCTTCACCAG CCGCGAGGCC TTGCTGGAAA GCCTCAGCCT GTCCGCGGTA CGCCGCTCCA AGCAGGCCCA GGCCCTGGTG TACCTGCCCT CCACCGAAGA

ACTGCACCTG CAACTGGGCG ACCTCGATGA CCCGTGGAGC ATCTGGCTAA GTGTACGCAT GCGCGAATAC TTCAAGTCCA AGCAGGTCAA CCTGCTGTAT GTGAGCCCCG GTCCCGAGGC CCGGGTCATG CGCCTCTACA GCAGCAACCC CACCTCCCCC AACCTGCCCA AGACCATCCT TTCCAAGCTT GAGGCGCTCA ACCACGGGGA GCATCCGGAC ACCAACGAAC TGTGGCTCAC CGACCCGTCC ACGCAGACTT CGCAGCTGTA CATTTTCACC CGGCTCGACG AGCGCACCGA TGACTCCGGC TGGCTGGGCC TGGAAATGGA TGGGCGGGAA GTGCTCAAGG CCCTCAGCGA CCAGAGCGCC GGCGAGTTCA TGATGTTCAA CTCCGAAGGC GCGCTGCTGT TCACCAACAC CCCGGCCGGG CGCCTAGGGC AGGCCCTGCA ACAACTGCAA GGCAGCAACT TCTTCGGTTT CGTCGGCAGC CGCTGGTGGC CCGATCACCT GGTGATCCGC AAGCAACTGA TGACCTCCGA CTGGCAACTG GTCTACTCCT TCAGCCTGCA GTCGCTGCTG ATCGCGCTCT GGCCCCAGCT GGCCGGCGCG CTGGTGTTCT GCCTGTTCAG CATCAGCCTG ATCTGCCTGC TGACCCGCCG CATCGAGCAC CGCTTCATCA CTCCTGCGCT GAGCCGTATC CAGGCGCTGG TCGAGAGCGA GCTGTTCAGC CGCGACGTGA TCCAGACCGC GCCCGTAGCC TTGTGCGTGC TGCGGCGTAC CGATGGCCAG GTGGTCCTGG AAAACACCCT GGCGCAGCAG TGGCTGGGCG ACGGCATCGA ACGGGAAATA CTCTGCGCCG GCTGGATCCA GCAAGCCTTC AAGAGCCACG AGCCGAACCG TTTCGACTAC TTCGAGACCG CCGACGGGCG TCACCTTTAT CTGAGCTCCG TGCCCACCCG CTACAAGGGT GAAGACGTGT TGTTCTGCGC CTTCAGTGAC ATCGTAACCT GA 1412。

所述F3 / B3引物溶液中F3引物和B3引物的浓度都为5μM；所述FIP / BIP引物溶液中FIP引物和BIP引物的浓度都为10μM；所述Y-LB引物溶液中Y-LB引物的浓度为10μM。

由所述的荧光假单胞菌LAMP检测试剂组成的试剂盒，由下述组份组成：阳性对照液、阴性对照液、10×ThermoPol 反应缓冲液、浓度为25 mM的 MgCl2溶液、浓度为10 mM的 dNTP液、浓度为8 U /μL 的Bst DNA 聚合酶液、引物浓度都为5μM的F3 / B3引物溶液、引物浓度都为10μM的FIP / BIP引物溶液、引物浓度为10μM的Y-LB引物溶液和双蒸水。

上述荧光假单胞菌LAMP检测试剂组成的试剂盒中，所述的10×ThermoPol 反应缓冲液为250μL，所述的MgCl2溶液为200μL，所述的dNTP液为200μL，所述的Bst DNA 聚合酶液为100μL，所述的F3 / B3引物溶液为80μL，所述的FIP / BIP引物溶液为160μL，所述的Y-LB引物溶液为80μL，所述的双蒸水为1.5mL。

与现有技术相比，本发明的优点在于本发明的荧光假单胞菌LAMP检测试剂是构建出上述扩增效率和特异性好的5条F3、B3、Y-LB、FIP、BIP引物，克服了常规PCR费时，对设备要求高等缺点，由该5条特异性引物组成的试剂及试剂盒可对样品中的荧光假单胞菌进行快速准确的定性检测，具有特异性好、简单易操作、结果直观和成本低廉等优点。具体优点如下：

1、本发明与常规PCR的检测试剂相比，具有特异、敏感的优点； LAMP技术的关键是针对靶基因的6～8个区域设计5条特异引物，当引物完全识别靶序列结合区并匹配的情况下才能顺利进行，这一点实现了该技术的高度特异性。

2、本发明与常规PCR的检测试剂相比，操作简单，无需昂贵设备。LAMP反应只需要一个简单的恒温水浴锅，不需要昂贵的PCR仪，操作简单，成本低廉，易于在现场操作或基层推广应用。

3、本发明与常规PCR的检测试剂相比，具有检测周期短的优点。该方法采用一种具有解旋功能且呈瀑布式扩增的Bst DNA聚合酶，呈恒温扩增，不需要PCR仪升降温的时间，也无需DNA凝胶电泳观察，所以检测时间非常短，扩增效率非常高。常规PCR的样品检测时间一般4小时以上，而本发明的检测时间在1.5 h～2.5 h左右。

4、本发明与常规PCR的检测试剂相比，结果无需PCR电泳等复杂的后处理程序，根据反应体系是否出现沉淀现象，用肉眼就可以快速定性判断LAMP结果，具有结果直观、判定难度小的优点。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。

1、设计引物：选择荧光假单胞菌的cDNA为靶目标，应用PRIMEREXPLORER V4软件，设计引物（包括所述5条F3、B3、Y-LB、FIP、BIP），引物的合成由上海生工生物工程有限公司完成。将引物与靶目标比对，常规筛选试验和分析，得到特异、敏感、稳定的上述F3、B3、Y-LB、FIP、BIP的5条引物；将设计合成的5条引物进行反应时间和温度优化实验后，确定扩增效率和特异性最好的反应条件。

2、反应温度优化：设计梯度LAMP反应程序，反应温度依次为：61℃，63℃，65℃，在这几个温度中优化出63℃为最佳反应温度。

3、适宜Mg²⁺浓度选择：反应体系中的Mg²⁺（2.5 mM）的添加量依次为：0μL，2.0μL，4.0μL，6.0μL，在这几个梯度浓度中优化出 Mg²⁺添加量为2.0μL。

4、时间梯度：设计反应时间梯度LAMP反应程序，每管按照上述优化体系加入LAMP体系，反应时间分别取30 min，45 min，60 min，75 min，优化出最佳反应时间60min。

5、反应体积梯度：设计反应体积梯度LAMP反应程序，依次为：12.5μL，15.0 μL，17.5μL，20.0μL，22.5μL，25μL，在这几个梯度体积中优化出25μL反应体积。

、特异性检测：选取荧光假单胞菌，短小芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌，苏云金芽孢杆菌，威尔氏李斯特菌等其他6种常见腐败细菌用于LAMP特异性验证，反应体系和条件同上，结果只有荧光假单胞菌为阳性，空白对照及其余5株均是阴性。

、灵敏度试验：将荧光假单胞菌标准菌株GIM 1.209和含有该菌特异片段的质粒10倍倍比稀释，取各稀释度进行LAMP和PCR扩增反应，2%的琼脂糖凝胶电泳，LAMP方法的检测限为3.47 拷贝 / 反应，PCR方法的检测限为3.47×10² 拷贝 / 反应。细菌LAMP方法的检测限为4.3 个菌 / 反应，PCR方法的检测限为4.3 ×10²个菌 / 反应。

8、稳定性和重复性试验：在评估LAMP检测荧光假单胞菌方法中的组内和组间试验的重现性、稳定性时，用阳性样品和阴性样品，在同样反应条件下，反复进行LAMP检测，每次试验的每个样品做6个平行的反应管，重复12次，结果：上述5条引物的扩增样品平行试验阳性结果稳定，重复性好。

9、对样品的检测、对比试验和验证试验：对无菌大黄鱼样品、感染荧光假单胞菌的大黄鱼样品以及感染腐败希瓦氏菌，短小芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌，苏云金芽孢杆菌的鱼类样品，提取DNA模板（具体常规提取方法在此不作叙述）进行LAMP检测，结果表明，感染荧光假单胞菌的大黄鱼样品呈阳性。

10、荧光假单胞菌LAMP标准化试剂和检测程序：

10.1标准化检测试剂盒组份

溶液I	80μL
		溶液II	80μL
溶液III	250μL
		溶液IV	200μL
溶液V	200μL
		溶液VI	160μL
溶液VII	80μL
		溶液VIII	80μL
溶液 Ⅸ	100μL
		溶液 Ⅹ	1.5mL

注释，溶液I ：阳性对照；溶液II ：阴性对照：溶液III：10×ThermoPol 反应缓冲液；溶液IV：MgCl2（浓度25 mM）；溶液V：dNTP（浓度10 mM）；溶液VI：引物FIP / BIP（浓度10μM）；溶液VII：引物F3 / B3（浓度5μM）；溶液VIII：引物Y-LB（浓度10μM）；溶液Ⅸ：Bst DNA 聚合酶（浓度8 U /μL）；溶液Ⅹ：双蒸水1.5mL；引物F3 / B3、引物FIP / BIP和引物Y-LB就为检测荧光假单胞菌的特异性试剂。ThermoPol 反应缓冲液、dNTP液、Bst DNA 聚合酶液购于TaKaRa公司。

10.2检测体系：

体系组成	使用量（μL）
		模板	1
10×ThermoPol 反应缓冲液	2.5
		MgCl₂（25 mM）	2
dNTP（10 mM）	2
		FIP / BIP（10μM）	1.6
F3 / B3（5μM）	0.8
		Y-LB（10μM）	0.8
Bst DNA 聚合酶（8 U /μL）	1
		双蒸水	13.3

模板可为未知DNA、阳性对照和阴性对照；阳性对照：含有荧光假单胞菌特异片断的质粒；阴性对照为双蒸水；检测标准：有无沉淀生成。

10.3 操作方法

（1）取0.1～10克组织样品，按1：10（克：mL）加入蒸馏水，充分研磨匀浆，2000 r/min，离心10 min。

（2）上清液12000 r/min，离心20 min，沉淀加入100μL双蒸水煮沸，12000 r/min，4℃，离心10 min，上清液备用，为未知DNA模板。

（3）取一支200 μL PCR反应管，向反应管中加入下列反应物：

	检测管（μL）	阳性对照（μL）	阴性对照（μL）
				阳性对照	/	1	/
阴性对照	/	/	1
				未知DNA	1	/	/
溶液III	2.5	2.5	2.5
				溶液IV	2	2	2
溶液V	2	2	2
				溶液VI	1.6	1.6	1.6
溶液VII	0.8	0.8	0.8
				溶液VIII	0.8	0.8	0.8
溶液 Ⅸ	1	1	1
				溶液 Ⅹ	13.3	13.3	13.3

反应温度为63℃，反应时间60min，反应完毕，检测管中若与阳性对照一样产生沉淀，那么该组织样品中宿有荧光假单胞菌。

<110>宁波大学

<120>荧光假单胞菌LAMP检测试剂及试剂盒

<160> 6

<170> PatentIn version 3.1

<210>1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>根据荧光假单胞菌的cDNA设计的特异性引物

<400>1

GCGCGAATAC TTCAAGTCCA 20

<210>2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>根据荧光假单胞菌的cDNA设计的特异性引物

<400>2

GTACAGCTGC GAAGTCTGC 19

<210> 3

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>根据荧光假单胞菌的cDNA设计的特异性引物

<400>3

AGGTGGGGTT GCTGCTGTAG AGGTCAACCT GCTGTATGTG A 41

<210>4

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>根据荧光假单胞菌的cDNA设计的特异性引物

<400>4

TGCCCAAGAC CATCCTTTCC AAACAGTTCG TTGGTGTCCG 40

<210>5

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>根据荧光假单胞菌的cDNA设计的特异性引物

<400>5

TCAACCACGG GGAGCAT 17

<210>6

<211>1412

<212> DNA

<213>荧光假单胞菌

<400>6

atgtcaaaag taaaagacaa agctggaagc ggcgaaatac cagcgacttt aaggatcgtc 60

ctatcccgga ttaaggaggg tttatttaga gtgggtccat gagattaagg acctaccttc 120

atcagatcag tcccgtattt tccagtcctg aagccgccag caggttgctg cgtctgttcg 180

cgctcattct tttggttggt atcctcggag ccgtctacaa cttcctcaac tccaccctca 240

gcaacgacat ttcccggcgc cgcggctaca tgagcagcgc catcgccgaa gcccagacct 300

tcttcaccag ccgcgaggcc ttgctggaaa gcctcagcct gtccgcggta cgccgctcca 360

agcaggccca ggccctggtg tacctgccct ccaccgaaga actgcacctg caactgggcg 420

acctcgatga cccgtggagc atctggctaa gtgtacgcat gcgcgaatac ttcaagtcca 480

agcaggtcaa cctgctgtat gtgagccccg gtcccgaggc ccgggtcatg cgcctctaca 540

gcagcaaccc cacctccccc aacctgccca agaccatcct ttccaagctt gaggcgctca 600

accacgggga gcatccggac accaacgaac tgtggctcac cgacccgtcc acgcagactt 660

cgcagctgta cattttcacc cggctcgacg agcgcaccga tgactccggc tggctgggcc 720

tggaaatgga tgggcgggaa gtgctcaagg ccctcagcga ccagagcgcc ggcgagttca 780

tgatgttcaa ctccgaaggc gcgctgctgt tcaccaacac cccggccggg cgcctagggc 840

aggccctgca acaactgcaa ggcagcaact tcttcggttt cgtcggcagc cgctggtggc 900

ccgatcacct ggtgatccgc aagcaactga tgacctccga ctggcaactg gtctactcct 960

tcagcctgca gtcgctgctg atcgcgctct ggccccagct ggccggcgcg ctggtgttct 1020

gcctgttcag catcagcctg atctgcctgc tgacccgccg catcgagcac cgcttcatca 1080

ctcctgcgct gagccgtatc caggcgctgg tcgagagcga gctgttcagc cgcgacgtga 1140

tccagaccgc gcccgtagcc ttgtgcgtgc tgcggcgtac cgatggccag gtggtcctgg 1200

aaaacaccct ggcgcagcag tggctgggcg acggcatcga acgggaaata ctctgcgccg 1260

gctggatcca gcaagccttc aagagccacg agccgaaccg tttcgactac ttcgagaccg 1320

ccgacgggcg tcacctttat ctgagctccg tgcccacccg ctacaagggt gaagacgtgt 1380

tgttctgcgc cttcagtgac atcgtaacct ga 1412

Claims

1.荧光假单胞菌LAMP检测试剂，包括特异性引物溶液，所述特异性引物溶液为F3 / B3引物溶液、FIP / BIP引物溶液和Y-LB引物溶液，其特征在于所述的F3/ B3引物溶液含有序列为F3：GCGCGAATAC TTCAAGTCCA、B3：GTACAGCTGC GAAGTCTGC的特异性引物； FIP / BIP引物溶液含有序列为FIP：AGGTGGGGTT GCTGCTGTAG AGGTCAACCT GCTGTATGTG A、BIP：TGCCCAAGAC CATCCTTTCC AAACAGTTCG TTGGTGTCCG的特异性引物； Y-LB引物溶液含有序列为：TCAACCACGG GGAGCAT的特异性引物。

2.如权利要求1所述的荧光假单胞菌LAMP检测试剂，其特征在于所述F3/B3引物溶液中F3引物和B3引物的浓度都为5μM；所述FIP/BIP引物溶液中FIP引物和BIP引物的浓度都为10μM；所述Y-LB引物溶液中Y-LB引物的浓度为10μM。

3.由权利要求1所述的荧光假单胞菌LAMP检测试剂组成的试剂盒，其特征在于由下述组份组成：阳性对照液、阴性对照液、10×ThermoPol 反应缓冲液、浓度为25mM的 MgCl2溶液、浓度为10mM的 dNTP液、浓度为8U/μL 的Bst DNA 聚合酶液、引物浓度都为5μM的F3 / B3引物溶液、引物浓度都为10μM的FIP / BIP引物溶液、引物浓度为10μM的Y-LB引物溶液和双蒸水。

4.如权利要求3所述的荧光假单胞菌LAMP检测试剂组成的试剂盒，其特征在于所述的10×ThermoPol 反应缓冲液为250μL，所述的MgCl2溶液为200μL，所述的dNTP液为200μL，所述的Bst DNA 聚合酶液为100μL，所述的F3 / B3引物溶液为80μL，所述的FIP / BIP引物溶液为160μL，所述的Y-LB引物溶液为80μL，所述的双蒸水为1.5mL。